專利名稱：：具有增強(qiáng)的生物活性的重組干擾素-β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物活性蛋白質(zhì)化學(xué)的一般領(lǐng)域。更具體地，其涉及經(jīng)突變而改變的干擾素-(J類似物，所述類似物通過(guò)替換、缺失或修飾半胱氨酸、天冬酰胺和其他殘基而與天然蛋白不同。2.
背景技術(shù)：
：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)干擾素-P可用于治療人類疾病，特別是多發(fā)性硬化。多發(fā)性石更化(multiplesclerosis,MS)是慢性、經(jīng)常致殘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在神經(jīng)纖維周圍的保護(hù)鞘破碎時(shí)發(fā)生。約30%的MS患者患有該疾病的復(fù)發(fā)緩解形式，其中癥狀在突發(fā)后完全或部分消失，其后為可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的穩(wěn)定期。FDA已批準(zhǔn)施用p干擾素(干擾素-p或IFN-p)來(lái)治療復(fù)發(fā)緩解形式的MS。目前，已上市用于治療MS的三種干擾素-p產(chǎn)品Betaseron⑧、Avonex⑧和Rebif,每年的合并銷售額超過(guò)30億美元。對(duì)更有效的IFN-P產(chǎn)品及其更高效的生產(chǎn)方法的需求一直存在。已經(jīng)開發(fā)了重組DNA(rDNA)技術(shù)來(lái)促進(jìn)大規(guī)模生產(chǎn)基于干擾素-p的藥物。重組DNA分子是在活細(xì)胞外通過(guò)將天然或合成DNA區(qū)段與能在活細(xì)胞中復(fù)制的DNA分子連接而構(gòu)建的DNA分子，或由于其復(fù)制而產(chǎn)生的分子。重組DNA技術(shù)使得可以大皿生產(chǎn)天然的或經(jīng)突變改變的蛋白質(zhì)。這些技術(shù)中特別需要解決的一個(gè)問(wèn)^i人P干擾素(其氨基酸序列在圖1中提供(SEQIDNO:1))在17、31和141位含有半胱氨酸殘基(Gene(1980)10:11-15和Nature(1980)285:542-547)，它們能在一些生產(chǎn)步驟中形成分子間或分子內(nèi)連接。這些連接可在變性IFN-p的復(fù)性過(guò)程中形成，導(dǎo)致不期望的錯(cuò)誤折疊結(jié)構(gòu)和聚集體。在通過(guò)rDNA技術(shù)以微生物制備IFN-p的過(guò)程中，已經(jīng)觀察到由于這種分子間連接而在含有高濃度IFN-P的提取物中形成IFN-P的二聚體和寡聚體。這種多聚體形成使得IFN-p的純化和分離十分費(fèi)力費(fèi)時(shí)，并需要純化和分離方法中的若干額外步驟，例如在純化過(guò)程中還原蛋白質(zhì)和將其重新氧化以恢復(fù)其原始構(gòu)象，由此增加了形成不正確的二硫鍵的可能性。此外，這種多聚體形成與低的比生物活性相關(guān)。為了解決這些問(wèn)題，已經(jīng)開發(fā)了精細(xì)rDNA技術(shù)，以便以如下方式改變孩i生物生產(chǎn)的生物活性IFN-p蛋白類似物，其中所述方式為所述改變不會(huì)對(duì)IFN-p蛋白的生物活性產(chǎn)生不良影響，但是可以降低或消除其形成分子間交聯(lián)或或如下分子內(nèi)鍵接的能力，其中所迷分子內(nèi)^^將導(dǎo)致蛋白質(zhì)采取不期望的三級(jí)結(jié)構(gòu)(例如降低蛋白質(zhì)活性的構(gòu)象)。定向誘變技術(shù)已成功地用于制備突變的生物活性蛋白類似物(本文中"蛋白類似物"指合成的蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)被遺傳修飾和/或化學(xué)修飾和/或熱修飾，并且該蛋白質(zhì)保留親本蛋白的生物活性)，該類似物保留其親本蛋白的期望活性，但缺乏形成分子間連接或不期望的分子內(nèi)二硫鍵的能力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，17位半胱氨酸殘基缺失或被其他M酸替換的IFN-P生物活性蛋白的合成蛋白類似物具有期望的活性和特征。具體地，干擾素-plb(IFN-plb)——一種IFN-P的合成重組蛋白類似物—是17位半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替換的生物活性蛋白。作為微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，IFN-plb是未糖基化的。它還具有N末端曱硫氨酸缺失。IFN-卩l(xiāng)b已經(jīng)制備成成功上市的藥物Betaseron⑧，它顯示對(duì)MS的治療和控制有效。該蛋白類似物、其生產(chǎn)材料和技術(shù)、其作為治療劑的制劑及其用于治療MS的用途在大量美國(guó)專利及申請(qǐng)中描述并要求保護(hù)，包括1986年5月13日授權(quán)的專利No.4,588,585;1988年4月12日授權(quán)的專利No.4,737,462以及1990年9月25日授權(quán)的專利No.4，959，314，其中每篇均就其對(duì)這些特征的公開內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。用于藥物的IFN-p的大M^莫生產(chǎn)還可以在哺乳動(dòng)物來(lái)源(特別是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞)中進(jìn)行。這種IFN-p類似物(稱為IFN-pla)缺少IFN-Plb的Ser17突變，并且是糖基化的。IFN-Pla被制備成治療產(chǎn)6品，作為Avonex和Rebif上市。像多數(shù)治療劑一樣，持續(xù)期望鑒定和生產(chǎn)更有效的生物活性劑。對(duì)于基于IFN-p的藥物，具有提高的生物活性的IFN-p類似物將是期望的。此外，一些IFN-p藥物制劑(包括Betaseron)含有人白蛋白(HA或HAS)——一種常用的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。HA是一種人血液制品，其供給日益減少。因此，最近期望不含HA的藥物制劑，穩(wěn)定且有效的無(wú)HA的IFN-p制劑將是期望的。一般地，需要能用或不用HA進(jìn)行配制的生物活性提高的IFN-p組合物以及產(chǎn)生這些組合物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供純化且分離的重組人干擾素-P蛋白類似物來(lái)解決這些需求，所述蛋白類似物含有其中25位(根據(jù)天然干擾素-P編號(hào))天冬酰胺通過(guò)突變而被天冬氨酸殘基替換的IFN-P。使用rDNA技術(shù)，通過(guò)提供編碼Asp25IFN-P的基因以及將此基因引入細(xì)胞(如微生物細(xì)胞或真核細(xì)胞(如CHO細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)以在這些細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)Asp25IFN-p蛋白類似物的表達(dá)，引入該Asn25Asp突變。在一些實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的rDNA還包括啟動(dòng)子序列。該重組干擾素-P蛋白類似物不含天然Asn25IFN-p，并以相對(duì)于IFN-plb而言提高的水平顯示IFN-j5(例如IFN-(5lb)的生物活性。這種蛋白類似物在無(wú)HA時(shí)穩(wěn)定，并可配制成無(wú)HA或含HA的治療性組合物。該重組的干擾素-P蛋白類似物除Asp25IFN-j5蛋白類似物以外還可包含其分解產(chǎn)物，例如圖2所示的Isoasp25和Imide25蛋白變體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，重組Asp25IFN-p是合成的人干擾素-plb蛋白類似物，其中17位的半胱氨酸(根據(jù)天然干擾素-p編號(hào))缺失或被中性氨基酸(特別是絲氨酸)替換，并且25位的天冬酰胺被重組改變?yōu)樘於彼?。在這個(gè)實(shí)施方案中，Asp25IFN-P具有N末端甲硫氨酸缺失，并且是未糖基化的。具體地，Asp25IFN-P可具有如圖3所示的一級(jí)氨基酸序列(SEQIDNO:2)。該人干擾素-P蛋白類似物可以^^用在至少約6.5的pH(優(yōu)選約6.9至約7.1，最優(yōu)選約7的pH)進(jìn)行的還原型Lys-C內(nèi)切蛋白酶測(cè)定法來(lái)表征。在此pH范圍內(nèi)進(jìn)行的Lys-C消化在特定位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)，而不改變樣品中分解產(chǎn)物的相對(duì)量。該消化所得到的肽片段可通過(guò)反相(RP)HPLC進(jìn)一步分離并通過(guò)Edman測(cè)序來(lái)鑒定。本發(fā)明還提供了該活性蛋白類似物化合物配制在治療性組合物中的制劑，包括含HA和無(wú)HA的制劑，及其生產(chǎn)和使用方法。在結(jié)合附圖閱讀以下對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述以后，本發(fā)明的這些及其他目的和特征將更為清楚。附圖簡(jiǎn)述圖1是人IFN-p氨基紗列(SEQIDNO:1)的圖示。圖2M示Asp25IFN-P分解途徑的示意圖，顯示了才艮據(jù)天然IFN-p編號(hào)第25位的天冬氨酸殘基。圖3是Asp25IFN-J51b縣,列(SEQIDNO:2)的圖示，顯示了本發(fā)明Asn25Asp突變的位點(diǎn)和Lys-C切割位點(diǎn)。圖4A顯示Asp25IFN-j3lb和Asn25IFN-卩l(xiāng)b的還原型Lys-C肽圖譜。圖4B顯示圖4A的圖鐠的一部分的放大圖。圖5A顯示Asp25IFN-Plb和Asp25IFN-plb高溫處理樣品的還原型Lys-C肽圖譜。圖5B顯示圖5A的圖譜的一部分的放大圖。圖6顯示Asn25IFN-plb、Asp25IFN-plb和Asp25IFN-卩l(xiāng)b高pH處理樣品的MonoS陽(yáng)離子交換(CEX)HPLC。本發(fā)明具體實(shí)施方案描述現(xiàn)通過(guò)若干實(shí)施方案描述本發(fā)明的化合物、組合物、材料以及相關(guān)的技術(shù)和用途。所述實(shí)施方案的重要特性和特征在文章的結(jié)構(gòu)中展示。盡管將結(jié)合這些實(shí)施方案描述本發(fā)明，但應(yīng)該理解，本發(fā)明不旨在僅限于這些實(shí)施方案。相反，旨在涵蓋可包括在所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的替>^方案、l奮改方案和等同方案。在以下描述中，/>開了大量具體細(xì)節(jié)以提供對(duì)本發(fā)明的充分理解。本發(fā)明可以不經(jīng)一些或全部這些具體細(xì)節(jié)而實(shí)施。在另一些情況下，對(duì)熟知的方法^^作沒(méi)有詳細(xì)描述，以免不必要地模糊本發(fā)明。引言本發(fā)明提供重組產(chǎn)生的干擾素-P蛋白類似物，其以相對(duì)于IFN-plb而言提高的水平顯示人干擾素-P(如IFN-pib)的生物活性。所述蛋白類似物可以用或不用HA進(jìn)行配制，但無(wú)需HA進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定。特別地，該干擾素-P蛋白類似物含有人干擾素-P類似物，其中25位的天冬酰胺(根據(jù)天然干擾素-P編號(hào))被天冬氨酸殘基重組替換。這種干擾素-p蛋白類似物不含有天然Asn25IFN-P。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組產(chǎn)生的干擾素-P蛋白類似物還可含有Asp25IFN-j3的分解產(chǎn)物，例如圖2所示產(chǎn)物。參考圖示描述Asp25IFN-p的主要分解途徑的圖2，Asp25殘基201可通過(guò)琥珀酰亞胺中間體205(二酰亞胺25(Imide25))轉(zhuǎn)化成異天冬氨酸殘基203(Isoasp25)。這樣的轉(zhuǎn)化可在例如接觸高溫或高pH條件時(shí)發(fā)生。在25位被異天冬氨酸或琥珀酰亞胺替換的干擾素-P類似物不顯著降低重組Asp25IFN-P類似物的生物活性，并可存在于IFN-p類似物產(chǎn)品及其治療性制劑中。該Asn25Asp突變使用rDNA技術(shù)引入，通過(guò)提供編碼Asp25IFN-P的基因以及將此基因引入細(xì)胞(如微生物細(xì)胞或真核細(xì)胞(如CHO細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)以在這些細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)Asp25IFN-J5蛋白類似物的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的rDNA還包括啟動(dòng)子序列。該IFN-P蛋白類似物可使用在至少6.5的pH(優(yōu)選約7的pH)進(jìn)行的還原型Lys-C內(nèi)切蛋白酶測(cè)定法來(lái)表征。在此pH進(jìn)行的Lys-C消化在特定位點(diǎn)切割蛋白質(zhì)，而不改變樣品中分解產(chǎn)物的相對(duì)量。該消化所得到的肽片段可通過(guò)RPHPLC進(jìn)一步分離、收集并通過(guò)Edman測(cè)序來(lái)鑒定。9本發(fā)明還提供該活性蛋白類似物化合物在治療性組合物中的制劑及其生產(chǎn)和使用方法。"蛋白類似物"在本文中指合成的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)M酸已經(jīng)被遺傳修飾和/或化學(xué)修飾，并且該蛋白質(zhì)保留親本蛋白的生物活性，例如細(xì)胞致病作用或抗增殖活性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，重組人干擾素-(5蛋白類似物含有人干擾素-Plb蛋白類似物，其中17位(才艮據(jù)天然干擾素-p編號(hào))的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸(特別是絲氨酸)替換，并且25位的天冬酰胺被天冬氨酸重組替換(例如，IFN-P^7，郵5)。在另一些實(shí)施方案中，Asp25進(jìn)一步化學(xué)修飾成異天冬氨酸或琥珀酰亞胺殘基(例如分別為IFN-p^7力。一5或IFN-p"/77，游^教亞^Z5)。Asp25IFN-(51b蛋白類似物以相對(duì)于IFN-Plb而言提高的水平顯示人干擾素-P的生物活性。此外，所述增強(qiáng)的生物活性在該蛋白質(zhì)類似物的無(wú)HA制劑中觀察到，從而使得無(wú)HA的IFN-plb具有治療性。用Asp25替換Asn25在本發(fā)明的合成蛋白類似物中，半胱氨酸17殘基可以缺失或被絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替換。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述替換為絲氨酸17。使用rDNA技術(shù)用天冬氨酸殘基替換天冬酰胺25殘基。參考圖3，展示了本發(fā)明Asp25IFN-卩l(xiāng)b蛋白類似物的一級(jí)(M酸序列(SEQIDNO:l))和二級(jí)(折疊、交聯(lián))結(jié)構(gòu)。在25位，天然Asn殘基被重組引入的Asp殘基替換。Asp25殘基可部分或基本上轉(zhuǎn)化成琥珀酰亞胺和/或異天冬氨酸，例如，通過(guò)使Asp25IFN-p類似物接觸誘導(dǎo)異構(gòu)化作用的條件，例如高溫或高pH。這些條件也可誘導(dǎo)天冬氨酸從L型旋光異構(gòu)成D型。本發(fā)明涵蓋L和D型的Asp25、Isoasp25和Imide25IFN-卩蛋白類似物。該蛋白類似物通過(guò)重組合成技術(shù)產(chǎn)生，任選地可以輔以表達(dá)后化學(xué)修飾。Asp25IFN-Plb合成蛋白類似物可以通過(guò)重組DNA定向誘變技術(shù)來(lái)制備。在本申請(qǐng)上文的
背景技術(shù)：
章節(jié)中提到的專利中已經(jīng)描述了Cysl7Ser改變。定向i秀變寺支術(shù)是熟知的，并綜述于Lather,R.R和Lecoq，J.P.，GeneticEngineeringAcademicPress(1983)31-50頁(yè)。寡核香酸定向i秀變具體綜述于Smith,M.和Gillam，S.，GeneticEngineering:PrinciplesandMethods,PlenumPress(1981)3:1-32。Asn25Asp突變?cè)谙挛膶⒕唧w描述。應(yīng)該理解，以下誘變描述僅作為例子提供，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明還涵蓋對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的對(duì)以下方案的修改。通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))在作為模板的產(chǎn)生IFN-p的質(zhì)粒(pSY2501)上引入突變。可以使用Quik-Change誘變?cè)噭┖?Stratagenekit#200516，Stratagene,LaJolla,CA)。在PCR中使用合成寡核苦酸作為引物。在Asn25Asp誘變中使用的引物如下Asp25正向引物BSN25DF(SEQIDNO:3):Asp25反向引物BSN25DR(SEQIDNO:4):'正向引物(SEQIDNO:3)含有編碼天冬氨酸的核苷酸GAT。反向引物(SEQIDNO:4)與正向引物互補(bǔ)。兩個(gè)引物以相反的方向但在相同位置結(jié)合在質(zhì)粒DNA的不同鏈上。通過(guò)PCR復(fù)制整個(gè)質(zhì)粒，接著通過(guò)DpnI酶消化。DpnI僅消化甲基化的細(xì)菌模板DNA鏈，而使未甲基化的PCR所復(fù)制的質(zhì)粒保留完整。接著將Dpnl處理的反應(yīng)混合物加入XLGold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)中，用帶有突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在羧千青霉素和色氨酸存在下在Luria瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞集落。接著挑取若干集落，并在羧節(jié)青霉素和色氨酸存在下在Luria培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從每個(gè)培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒DNA，并通過(guò)對(duì)質(zhì)粒的IFN-p插入片段進(jìn)行測(cè)序來(lái)進(jìn)行分析。IFN-p插入片段的測(cè)序證實(shí)了Asn25向Asp25的突變。還對(duì)其余質(zhì)粒部分進(jìn)行充分的限制性消化。該IFN-(5插入片段含有啟動(dòng)子，其后直接跟隨編碼Asp25IFN-Plb蛋白的基因。Asp25IFN-卩l(xiāng)b編碼基因(SEQIDNO:5)和IFN-p插入片段(基因和啟動(dòng)子，SEQIDNO:6)的核苷絲列在下文提供。編碼天冬氨酸的密碼子GAT和終止密碼子TGA加有下劃線。Asp25IFN-Plb編碼基因的序列(SEQIDNO:5)IS4AGATCC用于表達(dá)Asp25IFN-plb的啟動(dòng)子和基因序列(SEQIDNO:6)GAATTCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAACTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAAOmAAGATCC使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)了Asp25IFN-P。用帶有Asp25IFN-plb基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)色氨酸阻抑物的大腸桿菌細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)Asp25IFN-plb，并分離和純化所表達(dá)的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，也可以使用其他表達(dá)系統(tǒng)，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK293或CHO-K)、桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞或酵母系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)(如12真核細(xì)胞)的一些中進(jìn)行的表達(dá)可導(dǎo)致Asp25IFN蛋白沒(méi)有末端Met缺失，或者表達(dá)為糖基化的蛋白，這些均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。通過(guò)肽片段的Edman測(cè)序，證實(shí)了Asp25突變蛋白的身份，其中所述肽片段通過(guò)將該蛋白在pH7進(jìn)行還原型Lys-C內(nèi)切蛋白,圖消化來(lái)獲得。該重組產(chǎn)生的Asp25IFN-Plb經(jīng)確定含有主要的Asp25種類和兩種次要的分解產(chǎn)物，即，Isoasp25和Imide25IFN-pib類似物。這些產(chǎn)物由重組Asp25IFN-p通過(guò)圖2所示的分解途徑形成。Isoasp25和Imide25種類的量可以通過(guò)化學(xué)手段或通過(guò)熱處理作用而改變。例如，當(dāng)對(duì)Asp25IFN-p進(jìn)行高溫處理時(shí)，Isoasp25種類的比例可以提高。IFN-P蛋白類似物中Asp25、Isoasp25和Imide25種類的相對(duì)比例還可以通過(guò)改變?cè)摶旌衔锏膒H來(lái)改變。例如，在較高的pH(如9.25),Imide25級(jí)分的相對(duì)量降低。術(shù)語(yǔ)"人IFN-P蛋白類似物"涵蓋重組Asp25IFN-P及其分解產(chǎn)物，例如Isoasp25和Imide25。應(yīng)該理解，重組Asp25IFN-卩蛋白類似物完全不含Asn25IFN-p。盡管有可能如US專利申請(qǐng)11/271,516所述通過(guò)天冬酰胺殘基的化學(xué)脫酰胺作用獲得25位脫酰胺的干擾素類似物，但化學(xué)脫酰胺的干擾素產(chǎn)品通常含有未反應(yīng)的天然Asn25蛋白。Asn25干擾素顯示低于Asp25IFN-P蛋白類似物的生物活性，因此獲得不含Asn25的干擾素類似物是有利的。通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞致病作用(CPE)測(cè)定和Hs294T抗增殖測(cè)定，研究了重組Asp25IFN-p蛋白類似物產(chǎn)物的生物活性。Asp25IFN-卩l(xiāng)b的CPE活性為5.82xl07ITJ/mg,比無(wú)HA的Asn25IFN-卩l(xiāng)b的CPE活性高1.6倍，比以HA配制的IFN-Plb(Betaseron)的CPE活性高1.7倍。Asp25IFN-卩l(xiāng)b的Hs294T抗增殖生物活性為5.72xl07IU/mg，比無(wú)HA的Asn25IFN-J5lb的Hs294T抗增殖活性高1.3倍，比以HA配制的IFN-p^〃的相應(yīng)活性高1.7倍。Asp25IFN-P蛋白類似物在多種條件(包括高pH和高溫條件)下在無(wú)HA時(shí)保持其生物活性。因此，不需要用HA進(jìn)行配制來(lái)維持含有Asp25IFN-p的治療性產(chǎn)品的生物活性。對(duì)高pH或高溫處理的無(wú)HA的Asp25IFN-plb樣品通過(guò)RPHPLC和CEXHPLC進(jìn)行表征，這可以對(duì)完整蛋白或Lyc-C消化所得的肽混合物進(jìn)行。在經(jīng)受高pH(例如pH9.25)的樣品和經(jīng)受高溫(例如37。C)處理的樣品中均未觀察到可能指示意外蛋白質(zhì)降解的意外峰。在所有樣品中均證實(shí)了Asp25、Isoasp25和Imide25種類的存在。使樣品接觸37°C18天導(dǎo)致該IFN-p蛋白類似物中Isoasp25級(jí)分的量提高。使樣品接觸pH9.254小時(shí)使得Imide25種類級(jí)分降低，而Asp或Isoasp級(jí)分提高。還觀察到，當(dāng)重組Asp25IFN-p蛋白類似物IFN-p接觸高溫時(shí)，該Asp25IFN-p的生物活性提高。在37。C孵育18天的Asp25IFN-卩l(xiāng)b的CPE活性顯示出相對(duì)于以HA配制的IFN-plb為2.9倍提高以及相對(duì)于無(wú)HA的IFN-Plb為2.7倍提高，達(dá)到9.6xl07IU/mg。該提高的生物活性可能歸因于IFN-(5蛋白類似物中Isoasp25或Imide25種類的較高比例。一般而言，有多種可能的技術(shù)可使得重組產(chǎn)生的Asp25IFN-p蛋白類似物中Isoasp25或Imide25類似物的量提高。這些技術(shù)可能在大規(guī)模藥物生產(chǎn)中是有效并適于采用的，任何可以改變Asp25、Isoasp25和Imide25的相對(duì)量而保持天然生物活性(優(yōu)選提高生物活性)的技術(shù)均可使用。寬泛而言，可通過(guò)在中溫至高溫(例如25至60。C)和多種pH(從低(如約0至4)、中(如約4至10)到高(如約10至14))下孵育來(lái)改變Asp25、Isoasp25和Imide25IFN-卩類似物的相對(duì)量，其中反應(yīng)時(shí)間取決于條件從約1分鐘到約卯天或更長(zhǎng)。例如，可通過(guò)在高達(dá)60。C或約25至40°C(例如約37°C)孵育Asp25IFN-P(例如，Asp25IFN-(5la或Asp25IFN-卩l(xiāng)b)至少24小時(shí)(例如18天或長(zhǎng)達(dá)40天)來(lái)獲J彈具有提高的生物活性的IFN-p蛋白類似物。用于制備重組人Asp25IFN-P蛋白類似物的該4支術(shù)產(chǎn)生不含有Asn25種類的產(chǎn)物。Asp25、Isoasp25和Imide25的相對(duì)量可才艮據(jù)重組蛋白生產(chǎn)及后續(xù)化學(xué)處理(例如接觸高溫或高pH)的條件而變化。例如，可以獲得含有至少25%、至少50%、至少75%或約100%Asp25IFN-卩的IFN-p蛋白類似物。在一些情況下，可能期望純化和分離IFN-p蛋白類似物混合頁(yè)物中的單個(gè)種類。這種純化和分離可通過(guò)陽(yáng)離子交換(CEX)HPLC來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如4吏用以下條件層析固定相PharmaciaMonoSHR5/5或等同物；洗脫緩沖液20mMTris-HCl，pH7.0，含有0.5%EmpigenBB(正十二烷基-N，N-二甲基甘油(烷基甜菜堿十二烷基二甲基甜菜堿，一種兼性表面活性劑))梯度洗脫緩沖液中NaCl線性梯度，至200mM或更高。為了生產(chǎn)，該技術(shù)可以大規(guī)模進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)合成蛋白類似物通過(guò)微生物產(chǎn)生時(shí)，它是未糖基化的。此外，該蛋白類似物還具有N末端甲石克氨酸缺失。在另一些實(shí)施方案中，所述蛋白類似物可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生，因此是糖基化的。如下文中進(jìn)一步的描述，多種活性測(cè)定試驗(yàn)證明，重組Asp"IFN-plb蛋白類似物具有相對(duì)于其親本Asn25IFN-Plb蛋白而言提高的生物活性。已經(jīng)使用無(wú)HA的樣品獲得了穩(wěn)定性結(jié)果，表明本發(fā)明的重組IFN-P蛋白類似物適于不用HA配制為治療劑。為了形成治療性組合物，可將如上述部分或基本純化的蛋白類似物與可藥用載體介質(zhì)(例如對(duì)這類治療產(chǎn)品而言熟知的那些)混合。盡管顯示無(wú)HA穩(wěn)定性是本發(fā)明組合物的有利特性，但Asp25IFN-P蛋白類似物也可以在含有HA的制劑中使用，它們并不排除在本發(fā)明范圍之外。此外，盡管本文中主要參考IFN-pib蛋白類似物描述了本發(fā)明，但本發(fā)明也可應(yīng)用于其他IFN-p類似物，包括IFN-pla類似物，和IFN-p蛋白的其他功能性變體。本發(fā)明的IFN-P蛋白類似物和組合物顯示出生物活性，該活性提示其在多種應(yīng)用中的治療用途，包括調(diào)節(jié)患者的細(xì)胞生長(zhǎng)和治療患者的病毒性疾病?？勺C明本發(fā)明的治療劑可用于治療患者的多發(fā)性硬化，特別是復(fù)發(fā)緩解型的MS。15實(shí)施例以下實(shí)施例展示本發(fā)明的一些方面，但不旨在以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1.制備重組Asp25IFN-plb。用于制備重組脫酰胺IFN-plb的PCR混合物的代表性組成和代表性PCR方案分別示于表1和表2。表1.PCR混合物的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2.代表性PCR方案<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>完成PCR后，在每個(gè)含有反應(yīng)混合物的管中加入Dpn1(2nL)，并將管在37。C孵育1小時(shí)。接著將含有Dpnl的混合物(2pL)加入XLGold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中(45jiL細(xì)胞和2nLp-巰基乙醇)。將得到的混合物在0。C保持30分鐘，接著在42。C保持45秒，并在加入SOC培養(yǎng)基(500^L)后以250rpm搖動(dòng)在37。C孵育1小時(shí)。將細(xì)胞在Luria-B/L-羧芐青霉素(100ng/mL)和色氨酸(50照/mL)平板上涂板。使菌落在J7。C生長(zhǎng)24小時(shí)。挑取6個(gè)菌落并各自轉(zhuǎn)移到在分開的管中，管中有含羧千青霉素(100Hg/mL)和色氨酸(50照/mL)的Luria液體培養(yǎng)基(2mL)。使細(xì)菌在37。C生長(zhǎng)24小時(shí)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Qiagen方案從細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得DNA。通過(guò)定制的測(cè)序，確定DNA的身份。接著用含有Asp25IFN-卩l(xiāng)b插入片段的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌MM294-1細(xì)胞。將細(xì)胞接種到補(bǔ)充有色氨酸的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞以37。C培養(yǎng)約21小時(shí)，在色氨酸耗盡后收獲細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)分離和純化表達(dá)的Asp25IFN-plb蛋白。實(shí)施例2:重組Asp25IFN-|5lb的效力提高CPE和Hs294T抗增殖生物活性測(cè)定的結(jié)果分別總結(jié)于表3和表4。表3展示了Asp25IFN-plb、熱處理和高pH處理的Asp25IFN-卩l(xiāng)b的CPE活性，并與以HA配制的(Betaseron)和無(wú)HA的Asn25IFN-卩l(xiāng)b的CPE活性比較。表3:IFN-plb蛋白類似物的CPE生物活性。比活性(xio7IU/mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4展示了Asp25IFN-plb的Hs294T抗增殖活性，并與以HA配制的(Betaseron)和無(wú)HA的Asn25IFN-|3lb的相應(yīng)活性比較。表4.IFN-plb蛋白類似物的Hs294T抗增殖活性比活性(xl07IU/mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.1,CPE生物測(cè)定IFN-p在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)，其中一些病毒類型的復(fù)制和致細(xì)胞病變作用(CPE)受到抑制。使用A549人肺癌細(xì)胞和鼠腦心肌炎(EMC)病毒來(lái)評(píng)估Asp25IFN-plb及其高溫(37。C約18天)和高pH(pH9.25，4小時(shí))處理樣品的生物活性。在96孔板中進(jìn)行IFN-p測(cè)試樣品的連續(xù)稀釋。在組織培養(yǎng)基中制備A549細(xì)胞并加入測(cè)定平板中。孵育過(guò)夜后，將EMC病毒加入測(cè)試平板中，其后再孵育過(guò)夜以允許病毒復(fù)制。用足量IFN-plb處理的細(xì)胞受到對(duì)抗病毒攻擊的保護(hù)，并保持存活。未受保護(hù)的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞致病改變并死亡。使用磷酸酶(pNPP)染色技術(shù)對(duì)干擾素劑量依賴性CPE進(jìn)行定量，并由細(xì)胞生存力(吸光度測(cè)量)與IFN-p濃度的曲線來(lái)制得劑量應(yīng)答曲線。由測(cè)試樣品與WHO校正的參考標(biāo)準(zhǔn)品的ED5。(用于獲得最大細(xì)胞保護(hù)作用的一半所需的濃度)的比值，計(jì)算IFN-p活性。如表3所示，無(wú)HA的Asp25IFN-plb的CPE活性顯著高于以HA配制的IFN-plb(1.7倍提高)和無(wú)HA的Asn25IFN-卩l(xiāng)b(1.6倍)的CPE活性。熱處理的無(wú)HA的Asp25IFN-plb的CPE活性甚至更高(相對(duì)于以HA配制的IFN-plb為2.9倍增加，相對(duì)于無(wú)HA的Asn25IFN-卩l(xiāng)b為2.6倍)。高pH處理的Asp25IFN-p保留其高活性，分別比IFN-J5lb及無(wú)HA的Asn25IFN-卩l(xiāng)b的CPE活性高1.8和1.6倍。2.2抗增殖活性IFN-p對(duì)從人腫瘤建立的多種細(xì)胞系顯示抗增殖活性。4吏用人黑素瘤lb樣品的生物活性。在96孔板中進(jìn)行IFN-P測(cè)試樣品的連續(xù)稀釋。在組織培養(yǎng)基中制備反應(yīng)細(xì)胞(respondercells)并加入測(cè)定平板中。孵育3天后，用pNPP(—種磷酸酶染料)染色細(xì)胞以測(cè)量生長(zhǎng)反應(yīng)。細(xì)胞生長(zhǎng)以劑量依賴性方式響應(yīng)于IFN-P而受到抑制。由細(xì)胞數(shù)(光密度測(cè)量)對(duì)IFN-p濃度的曲線來(lái)制得劑量反應(yīng)曲線。由測(cè)試樣品與WHO校正的參考標(biāo)準(zhǔn)品的ED5。(用于獲得最大細(xì)胞生長(zhǎng)反應(yīng)的一半所需的濃度)的比值，計(jì)算IFN-(3活性如表4所示，Asp25IFN-plb的抗增殖活性顯著高于以HA配制的IFN-j5lb(1.7倍提高)和無(wú)HA的Asn25IFN國(guó)卩l(xiāng)b(1.3倍)。實(shí)施例3.表征重組Asp25IFN-j3lb重組Asp25IFN-Plb在25位(根據(jù)天然干擾素編號(hào))具有天冬氨酸殘基對(duì)天冬酰胺殘基的重組替換。它還帶有Cysl7Ser突變。Asp25IFN-plb的一級(jí)序列示于圖3。25位的天冬氨酸可按照?qǐng)D2所示的降解途徑轉(zhuǎn)化成琥珀酰亞胺和異天冬氨酸種類。本發(fā)明的重組IFN-plb蛋白類似物涵蓋Asp25突變體蛋白以及來(lái)自Asp25突變體的Imide25和Isoasp25干擾素。在下述測(cè)定試驗(yàn)中研究本發(fā)明重組IFN-plb蛋白類似物的組成3.1還原型Lys-C肽作圖肽作圖使用酶消化及其后的RP-HPLC產(chǎn)生蛋白質(zhì)的指紋圖譜。通過(guò)RP-HPLC分離的每一肽片段均可分離并進(jìn)一步通過(guò)其他分析方法(例如質(zhì)譜或Edman肽測(cè)序)表征。肽作圖通常作為一種ID試驗(yàn)用于質(zhì)量控制。它也是檢測(cè)蛋白質(zhì)中由于諸如修剪(clipping)、突變和降解(因氧化或脫酰胺所致)等事件而產(chǎn)生的微小一級(jí)結(jié)構(gòu)改變的有力工具。US專利申請(qǐng)11/271,516中描述的化學(xué)脫酰胺研究顯示，化學(xué)脫酰胺的IFN-p含有天冬氨酸、琥珀酰亞胺和異天冬氨酸變體，其中脫酰胺僅在25位發(fā)生。因此，用于分析重組Asp25IFN-p蛋白類似物的肽作圖應(yīng)在不改變樣品中Asp25、Imide25和Isoasp25種類的分布的條件下進(jìn)行。已知在高pH下環(huán)狀二酰亞胺是不穩(wěn)定的，并可以人為地轉(zhuǎn)化成其他種類。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供獨(dú)特的內(nèi)切蛋白酶消化，其在基本上中性的pH(在至少約6.5、優(yōu)選約6.9至約7.1、更優(yōu)選約7的pH)進(jìn)行。這種消化不會(huì)人為地誘導(dǎo)琥珀酰亞胺分解，因此不影響所分析樣品中Asp25、Imide25和Isoasp25種類的分布。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在所述pH范圍內(nèi)缺乏溶解性的情況下，這種消化可在增溶劑如EmpigenBB(—種烷基甜茱堿兼性表面活性劑)存在下進(jìn)行。這些增溶劑還可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的與Lys-C內(nèi)切蛋白酶相容的非離子型(如Tween80，可得自Sigma-Aldrich，MilwaukeeWI)、P曰離子型、陰離子型或兼性表面活性劑。使用這種消化進(jìn)行的蛋白質(zhì)作圖特別適用于分析IFN-p,但也可用于分析其他蛋白質(zhì)，例如在高pH不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。已經(jīng)開發(fā)了一種新的還原型賴氨酰內(nèi)切蛋白酶(R)(Lys-C)肽作圖，其與在至少約6.5、優(yōu)選至少約6.9至7.1的pH下發(fā)揮功能的還原劑聯(lián)用，以表征重組IFN-P蛋白類似物中存在的種類。一種可用于這種測(cè)定中的合適的還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)。重組IFN-plb蛋白類似物的Lys-C消化使用包括以下步驟的樣品制備來(lái)進(jìn)行在約7.0的pH進(jìn)行消化，以及其后在約6.9至7.1的最佳pH范圍內(nèi)進(jìn)行還原。為了保存樣品中Asp25、Isoasp25和Imide25形式的天然水平以及為了有效還原和切割蛋白質(zhì)，都需要這一pH范圍。由于在此開發(fā)的肽作圖利用中性pH樣品制備，因此可以成功地實(shí)現(xiàn)對(duì)Asp25IFN-p及其降解產(chǎn)物的天然水平的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)。可以與該方法一起4吏用的其他合適的還原劑可包括三(2-羧乙基)膦(TCEP)、2-巰基乙醇、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、2-巰基乙胺和巰基乙酸。通過(guò)還原型Lys-C肽作圖測(cè)試重組Asp25IFN-plb的樣品，以證實(shí)25位Asn到Asp的突變。向2mM天冬氨酸制劑緩沖液中的0.25至0.5mg/ml濃度的每一0.4mlIFN樣品中加入pH7.0的250nlIMTRISHCI、5jd30%EmpigenBB(可得自Calbiochem，SanDiego,CA)和620W0.01NHCI。通過(guò)加入4jil1mg/mlLys-C來(lái)開始消化，并在37。C孵育4小時(shí)。接著再加入4jd1mg/mlLys-C，并將樣品在37。C孵育總計(jì)24小時(shí)。加入100nl8M胍，猝滅此消化。接著通過(guò)加入8fiUMDTT并之后在37。C孵育45分鐘來(lái)還原消化的樣品。使用0.1%三氟乙酸中的乙腈梯度作為洗脫緩沖液，以2ml/分鐘的流速和40。C的柱溫，通過(guò)RP-HPLC層析(Vydac218TP54C18，250x4.6mm)拆分肽片段。Lys-C內(nèi)切蛋白酶在特定位點(diǎn)切割干擾素蛋白，產(chǎn)生12個(gè)主要的肽片段Kl-K12。一級(jí)(primary)和二級(jí)(secondary)Lys-C切割位點(diǎn)和相應(yīng)的肽片段示于圖3。K2片段含有25位的突變殘基。取決于該殘基的性質(zhì)，K2片段在RP-HPLC上在不同的保留時(shí)間洗脫，佳L得可以區(qū)分Asp25、Isoaps25和Imide25種類。該方法還4吏得可以將脫酰胺種類與天然Asn25IFN區(qū)分開來(lái)。圖4A顯示Lyc-C消化的干擾素的RP-HPLC軌跡(trace)。軌跡405對(duì)應(yīng)于重組Asp25IFN-plb蛋白類似物，軌跡403對(duì)應(yīng)于對(duì)照Asn25IFN-plb，軌跡401代表空白Lys-C酶樣品。對(duì)應(yīng)于Kl和K2片段的峰出現(xiàn)在32至40分鐘的保留時(shí)間區(qū)間中。這一區(qū)間的放大圖示于圖4B?？梢钥闯?，重組Asp25IFN-Plb蛋白類似物的主要K2片段在遲于天然Asn25畫-(Jlb對(duì)照的K2片段的保留時(shí)間洗脫。分離了重組產(chǎn)生的Asp25IFN-(5的該主要片段，通itJH普和Edman測(cè)序技術(shù)鑒定為Asp25IFN-卩l(xiāng)b。重組Asp25IFN-j3lb蛋白類似物產(chǎn)物中存在的兩個(gè)次要片段，被鑒定為Imide25和Isoasp25種類。證實(shí)Kl和K2片段身份的Edman測(cè)序數(shù)據(jù)示于表5。表5,通過(guò)Edman測(cè)序鑒定Lys-C肽作圖片段樣品序列注釋重組Asp25IFN-plbKlSYNIXGFLQRSSNFQSQK(SEQIDNO:7)證實(shí)存在Serl7和N端Met缺失K2(主峰)LLWQLDGR(SEQIDNO:8)證實(shí)Asp25突變K2(次峰)IXWQLXXX(SEQIDNO:9)X對(duì)應(yīng)于在該循環(huán)中無(wú)信號(hào)。在該循環(huán)及其后的循環(huán)中無(wú)信號(hào)提示存在25Isoasp對(duì)照Asn25IFN-PlbKlSYNLLGFLQRSSNFQSQK(SEQIDNO:10)證實(shí)存在Serl7和N端Met缺失K2LLWQLNGR(SEQIDNO:11)證實(shí)存在Asn2522實(shí)施例4.無(wú)HA的重組Asp25IFN-plb產(chǎn)品的穩(wěn)定性。由于期望在無(wú)HA的治療性制劑中使用重組Asp25IFN-P，因此研究了無(wú)HA的Asp25IFN-plb在生物活性方面的穩(wěn)、定性。進(jìn)行了兩種類型的穩(wěn)、定性研究。通過(guò)將無(wú)HA的Asp25IFN-plb置于37°C22天以及在另一單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中置于pH9.254小時(shí)來(lái)研究對(duì)高溫的穩(wěn)定性和對(duì)高pH的穩(wěn)定性。圖5A顯示了熱處理前后經(jīng)Lys-C消化的無(wú)HA的Asp25IFN-|3lb的RPHPLC數(shù)據(jù)。軌跡501是空白Lys-C酶的軌跡，軌跡503對(duì)應(yīng)于Asp25IFN-plb，軌跡505對(duì)應(yīng)于在37。C孵育22天的Asp25IFN-(Jlb。從該圖中可以看出，在高溫穩(wěn)定性才羊品中沒(méi)有^L察到指示除Isoasp25和Imide25IFN-p類似物以外的其他分解種類的意外峰。圖5B中更詳細(xì)地顯示了對(duì)應(yīng)于Kl和K2片段的目的峰。可以看出，Asp25、Isoasp25和Imide25種類的相對(duì)量在熱處理后發(fā)生了改變。值得注意的是，Isoasp25片段的比例提高了。該實(shí)發(fā)逸明，無(wú)HA的Asp25IFN-pib能長(zhǎng)期承受高溫接觸，而對(duì)其生物活性產(chǎn)生不良影響的分解種類無(wú)顯著增加，因此它適用于無(wú)HA的制劑。通過(guò)對(duì)完整蛋白進(jìn)行的Mono-SCEXHPLC來(lái)分析高pH下無(wú)HA的Asp25IFN-plb樣品的穩(wěn)定性。高pH處理前后Asp25IFN-Plb的層析圖示于圖6。在無(wú)HA的高pH穩(wěn)定性樣品中未觀察到指示意外降解的峰。軌跡601對(duì)應(yīng)于Asn25IFN-pib，軌跡603對(duì)應(yīng)于Asp25IFN-plb，軌跡605對(duì)應(yīng)于接觸pH9.254小時(shí)的Asp25IFN-卩l(xiāng)b。可以看出，Asp25、Isoasp25和Imide25種類的相對(duì)量在高pH處理后發(fā)生變化。具體地，Imide25片段顯著減少，而Isoasp25種類增加。該實(shí)發(fā)汪明，無(wú)HA的Asp25IFN-plb在高pH下不形成意外的降解產(chǎn)物。以HA進(jìn)行配制涉及通常在高pH下進(jìn)行的步驟，因此有利的是，Asp"IFN-plb在高pH條件下保持其生物活性，并可配制在含有HA的治療性產(chǎn)品中?？梢缘贸鼋Y(jié)論，Asp25IFN-plb在高溫和高pH條件下均保持其生物活性，并且不形成任何意外的降解產(chǎn)物?？梢缘贸鼋Y(jié)論，AspMIFN-pib可成功地配制在無(wú)HA或含有HA的治療劑中用于治療多發(fā)性硬化和其他疾病o結(jié)論基于上述研究中獲得的結(jié)果，重組Asp25IFN-p蛋白類似物(包括Asp25、Isoasp25和Imide25IFN-(J種類)以提高的水平顯示IFN-卩(例如IFN-plb)的生物活性。重組Asp25IFN-p(例如Asp25IFN-卩l(xiāng)b)可以以可藥用的方式制備，并可配制成具有提高的生物活性的治療性產(chǎn)品。本發(fā)明的重組IFN-p蛋白類似物可使用定點(diǎn)誘變技術(shù)通過(guò)在人IFN-p中引入Asp25突變來(lái)制備。本發(fā)明的重組IFN-p蛋白類似物可降低無(wú)HA及含HA的IFN-(5制劑的所需臨床劑量。通過(guò)降低臨床劑量，可以減少發(fā)生不良免疫反應(yīng)(如中和抗體)的患者比例。盡管出于清楚理解的目的而在一定程度上詳細(xì)描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解，可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和修改。應(yīng)該指出，有許多替代方式可以實(shí)施本發(fā)明的方法和組合物。因此，所述實(shí)施方案應(yīng)理解為舉例說(shuō)明性而非限制性的，本發(fā)明并不旨在僅限于所給出的具體內(nèi)容，而是可在所附權(quán)利要求的范圍和等同方案內(nèi)進(jìn)行修改。本文引用的所有文獻(xiàn)為了所有目的特此通過(guò)引用而整體地并入本文。權(quán)利要求1.人干擾素-β蛋白類似物，其包含不含Asn25的Asp25人干擾素-β。2.權(quán)利要求l的蛋白類似物，其中所述蛋白類似物顯示天然人干擾素-P的生物活性。3.權(quán)利要求1的蛋白類似物，其包含SEQIDNO:2所示的M絲列。4.權(quán)利要求l的蛋白類似物，其中，根據(jù)天然干擾素-p編號(hào)，17位的半胱氨酸缺失或被中性M酸替換。5.權(quán)利要求4的蛋白類似物，其中所述半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基替換。6.權(quán)利要求5的蛋白類似物，其還包括其中25位的殘基選自異天冬氨酸和環(huán)狀二酰亞胺的人干擾素-P。7.權(quán)利要求5的蛋白類似物，其中所述蛋白類似物是未糖基化的。8.權(quán)利要求7的蛋白類似物，其中所述蛋白類似物具有N末端甲硫氨酸缺失。9.權(quán)利要求2的合成蛋白類似物，其中所述蛋白類似物具有高于IFN-plb的生物活性。10.權(quán)利要求9的蛋白類似物，其中所述蛋白類似物具有比無(wú)HA的IFN-Plb高至少約1.6倍的生物活性。11.權(quán)利要求9的蛋白類似物，其中所述蛋白類似物具有比以HA配制的IFN-Plb高至少約1.7倍的生物活性。12.具有IFN-p活性的治療性組合物，其包含與可藥用載體介質(zhì)混合的治療有效量的4又利要求1的蛋白類似物。13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物不含HA。14.權(quán)利要求12的紐合物，其中所述組合物以HA配制。15.制備IFN-p蛋白類似物的方法，其包括用Asp25干擾素-p的編碼序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞以表達(dá)Asp25IFN-P蛋白類似物。16.權(quán)利要求15的方法，還包括分離和純化所述Asp25IFN-p蛋白類似物。17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法制備的無(wú)Asn的Asp25人干擾素-p蛋白類似物。18.治療患者的方法，包括對(duì)所述患者施用有效量的權(quán)利要求12的組合物。19，權(quán)利要求18的方法，其中所述治療是治療患者的多發(fā)性硬化，所述有效量是該組合物的治療有效量。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述多發(fā)性硬化為復(fù)發(fā)緩解型的。21.肽作圖方法，包括將蛋白質(zhì)樣品在pH至少6.5的、含有Lys內(nèi)切蛋白酶-C的緩沖溶液中孵育；允許Lys內(nèi)切蛋白酶-C消化該蛋白質(zhì)樣品；用還原劑還原經(jīng)消化的蛋白質(zhì)樣品；和通過(guò)液相層析拆分經(jīng)消化的蛋白質(zhì)樣品中的肽片段。22.權(quán)利要求21的方法，其中還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)。23，權(quán)利要求22的方法，其中蛋白質(zhì)樣品為人IFN-J5蛋白類似物。24.權(quán)利要求21的方法，其中液相層析為RP-HPLC。25.權(quán)利要求23的方法，其中孵育在約7的pH進(jìn)行。26.權(quán)利要求21的方法，其中緩沖溶液還包含增溶劑。27.權(quán)利要求26的方法，其中增溶劑為烷基甜茱堿兼性表面活性劑。28.含有編碼Asp25人干擾素-p的DNA序列的孩t生物。29.編碼Asp25人干擾素-p并包含SEQIDNO:5所示序列的DNA序列。30.權(quán)利要求29的序列，還包含用于表達(dá)Asp25人干擾素-p的啟動(dòng)子序列，該編碼序列和啟動(dòng)子序列包含如SEQIDNO:6所示的序列。31.具有可藥用的純度的權(quán)利要求1的人干擾素-P類似物。32.權(quán)利要求15的方法，其中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選自微生物細(xì)胞、CHO細(xì)月包和昆蟲細(xì)胞。33.權(quán)利要求32的方法，其中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。34.權(quán)利要求15的方法，其中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞為真核細(xì)胞。全文摘要根據(jù)天然人干擾素-β編號(hào)，25位的天冬酰胺被天冬氨酸殘基重組替換的人干擾素-β蛋白類似物，以相對(duì)于IFN-β1b而言提高的水平顯示人干擾素-β(例如IFN-β1b)的生物活性。這些類似物通過(guò)將編碼Asp25IFN-β的基因引入細(xì)胞和表達(dá)該重組蛋白來(lái)獲得。得到的IFN-β蛋白類似物適用于在大規(guī)模生產(chǎn)中摻入用于治療疾病(包括多發(fā)性硬化)的含HA或無(wú)HA的治療劑中。使用酶消化和其后的RP-HPLC產(chǎn)生蛋白質(zhì)的指紋圖譜的還原型Lys內(nèi)切蛋白酶-C肽作圖技術(shù)，還可作為ID試驗(yàn)用于IFN-β蛋白類似物產(chǎn)品的質(zhì)量控制中。文檔編號(hào)C07K14/565GK101506232SQ200780029614公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2007年7月24日優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日發(fā)明者D·拉森,D·約翰遜-杰克遜,I·扎羅,K·古屋申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司