專利名稱：一種重組人血白蛋白—干擾素α2b的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物的方法，尤其涉及重組人血白蛋白一干擾素a 2b在畢赤酵母中的高效表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的純化。
背景技術(shù)：
普通干擾素(IFN)在體內(nèi)的半衰期較短，干擾素很快得到分解，治療期間不能始終保持有效的血藥濃度而持久地抑制病毒，從而使IFN治療丙型肝炎病毒(h印atitis Cvirus,HCV)感染的潛能受到限制。為克服以上不足，人們開發(fā)了多種類型的長效IFN，如聚乙二醇IFN、白蛋白IFN及IFN脂質(zhì)體等。其中人血白蛋白一干擾素是新的研究的熱點(diǎn)之一，其在延長半衰期和用于糖基化修飾方面具有更大的優(yōu)勢。將IFN與人血漿白蛋白融合是長效IFN的新發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)。人血清白蛋白(HSA)是人體血漿的主要成分，無免疫原性.人體相容性好，且本身在體內(nèi)即作為多種藥物的載體，水溶性良好，血漿半衰期長達(dá)2周以上。更為重要的是HSA是一種"惰性"蛋白，除作為載體外，本身沒有重要的生物活性。將蛋白與HSA融合，增加蛋白的分子量和水化半徑，利用HSA的載體作用來延長蛋白的體內(nèi)半衰期，是長效蛋白研發(fā)的一條重要途徑。 目前，報(bào)道的重組人血白蛋白一干擾素a 2b的發(fā)酵表達(dá)水平在300 400mg/L，純化出的原液收率在20 30%之間，相當(dāng)于每升發(fā)酵液可獲得重組人血白蛋白一干擾素a 2b純品為lOOmg左右，比活在1. OX 106IU/mg左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過構(gòu)建的工程菌將人血白蛋白cDNA的C端與IFNcDNA的N端融合，與酵母表達(dá)表達(dá)載體pPICZ a連接后引入畢赤酵母X33表達(dá)，獲得了高效表達(dá)的工程菌。工程菌的發(fā)酵表達(dá)水平在1000 1100mg/L。純化工藝采用陽離子交換層析，疏水層析和分子篩層析進(jìn)行組合生產(chǎn)，純化出的原液收率在40 50%之間，相當(dāng)于每升發(fā)酵液可獲得重組人血白蛋白一干擾素a 2b純品為500mg左右，比活在1. 0X106IU/mg以上。本發(fā)明適合工業(yè)化生產(chǎn)的高純度、高活性、低成本、高收率的純化工藝。其他各項(xiàng)指標(biāo)均要符合中國藥典關(guān)于生物制品的規(guī)定。 本發(fā)明通過構(gòu)建人血清白蛋白-干擾素a2b融合蛋白基因的畢赤酵母工程菌株，發(fā)酵表達(dá)后再進(jìn)行純化，其特征在于，工程菌株的構(gòu)建是將人血白蛋白cDNA的C端與IFNcDNA的N端融合，與酵母表達(dá)表達(dá)載體pPICZa連接后引入畢赤酵母X33表達(dá)，成為重組人血白蛋白一干擾素a 2b的工程菌株；發(fā)酵表達(dá)后的純化是通過將離心收集發(fā)酵上清液，后依次通過陽離子交換層析，疏水層析和分子篩層析得到重組人血清白蛋白一干擾素a 2b，具體描述如下 (1)重組人血白蛋白一干擾素a 2b工程菌的構(gòu)建。 根據(jù)人血白蛋白和人干擾素a2b的基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出目的基因，在設(shè)計(jì)人血白蛋白引物時(shí)，在引物的5'端添加限制性內(nèi)切酶XhoI切點(diǎn)，且在XhoI點(diǎn)與HSA結(jié)構(gòu)基因的5'端之間插入Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)的氨基酸殘基Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子(AAAAGA) ， HSA基因的3'端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)應(yīng)的DNA序列(GGATCC)，便于同后面的IFN- a 2b基因連接。所以將PCR獲得的符合目的HSA基因長度的片段用XhoI-BamHI雙切，再進(jìn)行膠回收后就得到了可以用于連接的HSA基因片段。用BamHI-P5和NotI_P3引物獲得的IFN-a 2b基因時(shí)，引物BamHI-P5在基因的5'-端添加了 BamHI位點(diǎn)，而Notl-P3引物在IFN-a 2b的3'-端添加了終止密碼子(TGA)和限制性內(nèi)切酶NotI的序列GCGGCCGC。這樣PCR獲得的基因IFN- a 2b通過BamHI和Notl雙切后，就可以通過BamHI的粘端將HSA和IFN-a 2b首尾相連起來的融合基因。重組人血白蛋白一干擾素a2b的工程菌株，使用基因重組技術(shù)將人血白蛋白基因(HAS)與干擾素-a2b(IFN-a2b)基因連接起來，為了更好的保證兩種蛋白各自獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)，中間使用GlySer(GGATCC)兩個(gè)氨基酸的連接子進(jìn)行連接。將基因HSA (XhoI-BamHI) 、 IFN-a 2b (BamHI-NotI)和載體pPICZ a (Xhol-Notl)建立連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆，酶切和測序鑒定。將經(jīng)測序確認(rèn)的表達(dá)載體pPICZ a -HSA-IFN- a 2b電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，篩選高表達(dá)的克隆。最終將確定高表達(dá)的作為原始菌種，成為重組人血白蛋白一干擾素a 2b的工程菌株。
(2)重組人血白蛋白一干擾素a 2b的發(fā)酵表達(dá)。 參照Invitrogen公司酵母發(fā)酵手冊(cè)，對(duì)重組人血白蛋白一干擾素a 2b工程菌發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化篩選。篩選了培養(yǎng)基的pH值、誘導(dǎo)pH值、誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間。建立的發(fā)酵工藝時(shí)工程菌表達(dá)水平在1000 1100mg/L。
(3)重組人血白蛋白一干擾素a 2b發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物的純化。 所述陽離子交換層析，需要用冰醋酸調(diào)節(jié)，使pH為4. 6，再用蒸餾水將發(fā)酵液稀釋
使電導(dǎo)率為《20mS/cm，將發(fā)酵上清直接上樣c即to匪C柱，收集目的蛋白峰。 所述疏水層析步驟中，在陽離子目標(biāo)蛋白收集液中加入Na2S04，使Na2S04的終濃度
達(dá)至U 0. 7M，直接上樣PHenyl S印harose High Performance柱，收集目的蛋白峰。 所述分子篩層析步驟中，將疏水層析收集目的蛋白峰過Superdex 200pr印grand
分子篩層析柱，用20mM的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集目的蛋白峰，得到重組人血清白蛋白一
干擾素a2b。 根據(jù)重組人血白蛋白一干擾素a2b的性質(zhì)，將重組人血白蛋白一干擾素a2b的發(fā)酵上清采用陽離子交換層析(c即to匪C)，疏水層析(Phenyl S印haroseHighPerformance)和分子篩層析(Superdex 200pr印grand)進(jìn)行組合純化生產(chǎn)，得到符合中國藥典關(guān)于生物制品質(zhì)量要求的原液。重組人血白蛋白一干擾素a2b在發(fā)酵過程中采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，發(fā)酵上清的色素、離子強(qiáng)度和電導(dǎo)比較高，在采用普通離子交換層析時(shí)，需要利用超濾系統(tǒng)進(jìn)行脫鹽，發(fā)酵上清才能結(jié)合在柱子上。本發(fā)明在第一步層析過程中采用c即to匪C陽離子交換層析，發(fā)酵上清不需要任何處理直接上樣。因?yàn)閏即to匪C是一種復(fù)合配基的陽離子交換層析介質(zhì)，其吸附過程具有耐鹽特性，表明該配基在高電導(dǎo)下直接進(jìn)樣，并且蛋白結(jié)合在配基上，該介質(zhì)結(jié)合在高強(qiáng)度的瓊脂堿性配基上，放大時(shí)具有流率快、低反壓的特點(diǎn)。不需要超濾系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行處理，可以避免超濾系統(tǒng)在發(fā)酵液脫鹽的過程中因剪切力比較高可能造成目的蛋白活性減低。這樣不但節(jié)約了生產(chǎn)設(shè)備成本，而且提高了產(chǎn)品的質(zhì)量。 第二步層析采用疏水層析(Phenyl S印harose High Performance)，因?yàn)槭杷畬游鼍哂懈啕}吸附，低鹽洗脫的特性。而c即to匪C陽離子交換層析需要高鹽的條件下洗脫蛋白，從c即to匪C陽離子交換層析中收集的目的蛋白液加入適當(dāng)鹽后可直接上疏水層析(Phenyl S印harose High Performance)，這樣操作簡單，減少了樣品的處理過程，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)率。 第三步采用分子篩層析(Superdex 200pr印grand)，不但可以去除前兩步無法去除的二聚體，而且可以直接更換樣品的緩沖系統(tǒng)，可以直接用于制劑的配制，不需要采用其他更換緩沖體系的處理。整個(gè)層析過程采用陽離子交換層析(capto匪C)，疏水層析(Phenyl Sepharose High Performance)禾口分子蹄層析(Superdex 200prep grand)三禾中不
同分離機(jī)制的層析組合，具有很好的純化效果?？梢猿龀^大部分的雜蛋白和色素、熱源和核酸片段等非蛋白類雜質(zhì)。整個(gè)純化組合合理，不需要其他處理過程，操作簡單，工藝穩(wěn)定，易于產(chǎn)業(yè)化放大。 本發(fā)明工程菌的發(fā)酵表達(dá)水平在1000 1100mg/L。純化出的原液收率在40 50%之間，相當(dāng)于每升發(fā)酵液可獲得重組人血白蛋白一干擾素a 2b純品為500mg左右，比活在1.0X106IU/mg以上。適合工業(yè)化生產(chǎn)的高純度、高活性、低成本、高收率的純化工藝。其他各項(xiàng)指標(biāo)均要符合中國藥典關(guān)于生物制品的規(guī)定。


圖1發(fā)酵產(chǎn)物和純化各步SDS-PAGE電泳圖 其中l(wèi)Mark 2發(fā)酵液3陽離子4疏水5分子篩 圖2陽離子層析(c即to匪C)色譜圖 其中峰1為穿越峰峰2為目的蛋白峰峰3為雜質(zhì)峰 圖3疏水層析(Phenyl S印harose High Performance)色譜圖 其中峰1為穿越峰峰2為目的蛋白峰峰3為雜質(zhì)峰 圖4分子篩層析(Superdex 200pr印grand)色譜圖
具體實(shí)施例方式
— .重組人血清白蛋白一干擾素a 2b畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建
1.目的基因獲得 根據(jù)GeneBank中公布的HSA基因的序列信息，設(shè)計(jì)PCR引物 XhoI-HSA-P5 :5， -cat etc gag(內(nèi)切酶XhoI位點(diǎn))aaa aga(Kex2蛋白酶酶切位
點(diǎn))gat gca cac朋g agt gag gtt-3' BamHI_HSA_P3 :5' -cat gga tec (內(nèi)切酶BamHI位點(diǎn))taa gec taa ggc agettgact tgc agc-3' 根據(jù)從現(xiàn)有干擾素a 2b工程菌的質(zhì)粒pHC16IFN- a 2b序列信息，設(shè)計(jì)PCR引物BamHI_2b_P5 :5' -cat gga tec (內(nèi)切酶BamHI位點(diǎn))tgt gat ctg cct caa accca-3'
NotI_2b_P3 :5'-cat gcggccgc (內(nèi)切酶NotI位點(diǎn))tea ttc ctt act tct taaactttc_3， 用引物XhoI-HSA-P5和BamHI_HSA-P3將人的HSA基因從cDNA第一鏈文庫中擴(kuò)增出，XhoI-HSA-P5引物就在HSA基因5，—端添加限制性內(nèi)切酶Xhol切點(diǎn)，且在Xhol點(diǎn)與HSA結(jié)構(gòu)基因的5'-端之間插入Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)的氨基酸殘基Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子(AAA AGA)，這就保證在畢赤酵母分泌表達(dá)融合蛋白時(shí)能夠順利切除信號(hào)肽序列，分泌產(chǎn)生的HSA同天然的HSA的N-端序列完全相同，而BamHI-HSA-P3引物在HSA基因的3'-端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)應(yīng)的DNA序列(GGATCC)，便于同后面的IFN- a 2b基因連接。所以將PCR獲得的符合目的HSA基因長度的片段用XhoI-BamHI雙切，再進(jìn)行膠回收后就得到了可以用于連接的HSA基因片段。用BamHI-P5和NotI_P3引物獲得的IFN-a 2b基因時(shí)，引物BamHI-P5在基因的5'-端添加了 BamHI位點(diǎn)，而Notl-P3引物在IFN-a 2b的3'-端添加了終止密碼子(TGA)和限制性內(nèi)切酶NotI的序列GCGGCCGC。這樣PCR獲得的基因IFN- a 2b通過BamHI和Notl雙切后，就可以通過BamHI的粘端將HSA和IFN- a 2b首尾相連起來的融合基因。 用購買的Strategene公司的正常成人肝臟cDNA第 一 鏈中的cDNA作模板，用XhoI-HSA-P5和BamHI-HSA-P3引物，建立如下的PCR反應(yīng) 模板cDNA---------1 ii 1 XhoI-HSA-P5--------2 ii 1 BamHI-HSA-P3--------2 ii 1 10X Polymerase BufferII-------3 ii 1 DNA聚合酶--------0. 2 ii 1 dH20--------------------------21.8 ill _ 總體積30iU PCR條件95 °C變性3分鐘，按94°C -40秒、54°C -50秒、73 °C _2分鐘循環(huán)30次，最后73t:延伸5分鐘。 以pHC16_IFN- a 2b載體為模板，用BamHI_P5和Notl-P3引物PCR出IFN- a 2b基因，PCR反應(yīng)如下 模板pHC16_IFN- a 2b-----1 ii 1 BamHI_2b_P5--------2 ii 1 NotI_2b_P3--------2 ii 1 10X Polymerase BufferII-------3 ii 1 DNA聚合酶--------0. 2 ii 1 dH20--------------------------21.8 ill _ 總體積30iUPCR條件94°C變性2分鐘，按94°C -30秒、54°C -30秒、72 °C -80秒循環(huán)30次，最
后72t:延伸3分鐘 2.表達(dá)載體的構(gòu)建 Invitrogen公司的表達(dá)載體pPICZ a經(jīng)Xhol和Notl雙酶切-膠回收純化處理，作插入用載體。將雙切膠回收后的基因HSA (XhoI-BamHI) 、 IFN-a 2b (BamHI-NotI)和載體pPICZa (XhoI-NotI)建立如下的連接反應(yīng)
pPICZ a -XhoI-NotI (插入用載體)---------2 ii 1
HSA基因片段(XhoI-BamHI雙切)-----
IFN- a 2b基因片段(BamHI-NotI雙切)
T4連接緩沖液(10X)-----------------
T4 DNA連接酶----------------------
3. 5 ii 1
總體積lOiU 連接反應(yīng)條件25°C， 1小時(shí)后，65t:， 10分鐘。 將上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的大腸桿菌NovaBlue (Novagen公司產(chǎn)品)感受態(tài)細(xì)胞，鋪板于LB+25ug/ml Zeocin+1. 5% Agar平板上，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)20小時(shí)，挑取平板上的陽性克隆，接種到LB+25ug/mlZeocin培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后收集菌體，用Watson質(zhì)粒小量提取試劑盒，采用Xhol-Notl雙酶切法篩選含有HSA-IFN- a 2b融合基因長度的陽性克隆，并進(jìn)行DNA序列測定確認(rèn)，最終得到序列完全符合設(shè)計(jì)要求的表達(dá)載體pPICZa _HSA_IFN_a 2b。 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及高表達(dá)菌株的篩選 將上述經(jīng)測序確認(rèn)的表達(dá)載體pPICZ a -HSA-IFN- a 2b用DNA限制性內(nèi)切酶Pmel酶切線性化，取2ul酶切后樣品電泳檢視線性化完全后，將剩余的質(zhì)粒用苯酚抽提_無水乙醇沉淀_75%乙醇洗滌-干燥等處理后，將全部質(zhì)粒溶解于5. 0ul的重蒸水中，按照操作手冊(cè)中描述的方法電轉(zhuǎn)化巴斯德畢氏酵母X-33，在含有YPD+Zeocin的平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，按pPICZaA，B，and C操作手冊(cè)中的篩選方法，篩選高表達(dá)的克隆。最終將確定高表達(dá)的作為原始菌種，成為重組人血白蛋白一干擾素a 2b的工程菌株。
二、重組人血清白蛋白一干擾素a 2b的高密度發(fā)酵 參照invitrogen畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)，用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白基本過程是挑取在平板中活化的生產(chǎn)菌種的單菌落，接種YPD液體培養(yǎng)基(YPD液體培養(yǎng)基酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2% ) 。 30°C、250 300rpm條件下培養(yǎng)16 24小時(shí)，直到0D6。。=2 6作為種子液。以5 10%的接種量接種基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方磷酸(85% )26. 7ml，硫酸鈣0. 93g，硫酸鉀18. 2g，硫酸鎂_7H20 14. 9g，氫氧化鉀4. 13g，甘油40g， PTM工微量元素4.4ml，用去離子水加至lL中)。接種前用氨水將發(fā)酵培養(yǎng)基pH調(diào)到5.0，溫度設(shè)定為3(TC，溶氧始終大于20^飽和度。培養(yǎng)直到甘油被完全耗盡后，開始補(bǔ)加50%的甘油(每升甘油補(bǔ)料中需添加12ml微量元素)，設(shè)定補(bǔ)料速率為18. 15m1/小時(shí)/升初始發(fā)酵液體積。至菌體濕重180 220g/L時(shí)，停止補(bǔ)甘油，甘油耗盡維持饑餓狀態(tài)0. 5 lh左右，開始補(bǔ)100%甲醇(每升甲醇中含12ml微量元素)進(jìn)入誘導(dǎo)階段，誘導(dǎo)前用氨水將培養(yǎng)基pH調(diào)到6. O，溫度設(shè)定為25°C，開始設(shè)定甲醇補(bǔ)料速度為3. 6ml/小時(shí)/L初始發(fā)酵液體積。在適應(yīng)后補(bǔ)料速度再加倍到7. 3ml/小時(shí)/L初始發(fā)酵液體積。以7. 3ml/小時(shí)/L初始發(fā)酵液體積速度補(bǔ)料2小時(shí)后，提高補(bǔ)料速度至10. 9ml/小時(shí)/L初始發(fā)酵液體積。并且這個(gè)補(bǔ)料速度保持到發(fā)酵的其余整個(gè)過程。維持溶氧20%以上，誘導(dǎo)70小時(shí)左右下罐。離心收集發(fā)酵液上清。發(fā)酵液上清作SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)量(圖l)，表達(dá)水平在1000mg/l左右。 三、重組人血清白蛋白一干擾素a 2b的純化
1.重組人血清白蛋白一干擾素a 2b的陽離子純化
7
層析填料為c即to匪C(美國GE公司)，緩沖液A為25mM醋酸-醋酸鈉(pH = 4. 6)，緩沖液B為50mM磷酸鈉(pH7. 0)+lM NaCl。用緩沖液A預(yù)先平衡capto匪C柱，用冰 醋酸調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液使PH為4. 6后，再用蒸餾水將發(fā)酵液稀釋使電導(dǎo)率為《20mS/cm，將發(fā) 酵上清直接上樣c即to匪C柱，上完樣后以緩沖液A平衡柱子，將未結(jié)合到柱子的物質(zhì)沖洗 干凈，再用100X的緩沖液B洗脫目的蛋白。收集目的蛋白峰(圖2)，測蛋白濃度計(jì)算回收 率，作SDS-PAGE電泳用凝膠成像系統(tǒng)掃描計(jì)算蛋白純度(圖1)。經(jīng)此步純化，蛋白回收率 為80%左右，蛋白純度90%。 2.重組人血清白蛋白一干擾素a 2b的疏水層析純化 層析填料為Phenyl S印harose High Performance (美國GE公司)，緩沖液A為 20mM pH7. O的PB緩沖液加O. 7M Na2S04，緩沖液B為20mM pH7. 0的PB緩沖液加O. 3M Na2S04。 用緩沖液A預(yù)先平衡Phenyl S印harose High Performance柱，在陽離子目標(biāo)蛋白收集液中 加入Na2S04，使化2504的終濃度達(dá)到0. 7M，直接上樣用緩沖液A平衡好的Phenyl S印harose High Performance柱，上完樣后以緩沖液A平衡柱子，將未結(jié)合到柱子的物質(zhì)沖洗干凈，再 用100X的緩沖液B洗脫目的蛋白。收集目的蛋白峰(圖3)，測蛋白濃度計(jì)算回收率，作 SDS-PAGE電泳用凝膠成像系統(tǒng)掃描計(jì)算蛋白純度(圖1)。經(jīng)此步純化，蛋白回收率為70% 左右，蛋白純度可達(dá)97%。 3.重組人血清白蛋白一干擾素a 2b的分子篩純化 層析填料為Superdex 200pr印grand (美國GE公司)，用20mM的磷酸鹽緩沖液平 衡Superdex 200柱子，將疏水目的蛋白收集液直接上樣，用20mM的磷酸鹽緩沖液洗脫，收 集目的蛋白峰(圖4)。測蛋白濃度計(jì)算回收率，作SDS-PAGE電泳用凝膠成像系統(tǒng)掃描計(jì)算 蛋白純度(圖1)。經(jīng)此步純化，蛋白回收率為90%，蛋白純度可達(dá)100%。
四、重組人血清白蛋白一干擾素a 2b原液的檢測 根據(jù)中國藥典有關(guān)規(guī)定對(duì)重組人血清白蛋白一干擾素a2b原液進(jìn)行了相關(guān)檢 測，主要是原液的純度和生物學(xué)活性
1.純度分析 采用HPLC-C8反相柱(Waters, USA) ， 10% 80%含0. 1% TFA乙腈梯度，流速為 0. 8ml/min，檢測為280nm。所得原液的純度可達(dá)100%。
2.體外生物活性分析 體外生物學(xué)活性測定采用WISH細(xì)胞病變抑制法，參照《中國藥典2005年版》中《干 擾素效價(jià)測定(細(xì)胞病變抑制法)》。蛋白定量采用1owry法，重組人血清白蛋白一干擾素 a 2b原液的比活在1. 5X 106IU/mg。其他各項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均符合規(guī)定。
8
權(quán)利要求
一種重組人血清白蛋白-干擾素α2b的生產(chǎn)方法，通過構(gòu)建人血清白蛋白-干擾素α2b融合蛋白基因的畢赤酵母工程菌株，發(fā)酵表達(dá)后再進(jìn)行純化，其特征在于，工程菌株的構(gòu)建是將人血白蛋白cDNA的C端與IFN cDNA的N端融合，與酵母表達(dá)表達(dá)載體pPICZα連接后引入畢赤酵母X33表達(dá)，成為重組人血白蛋白-干擾素α2b的工程菌株；發(fā)酵表達(dá)后的純化是通過將離心收集發(fā)酵上清液，后依次通過陽離子交換層析，疏水層析和分子篩層析得到重組人血清白蛋白-干擾素α2b。
2. 如權(quán)利要求l重組人血清白蛋白-干擾素a2b的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述重 組人血白蛋白-干擾素a2b的工程菌株，在設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增人血白蛋白基因(HSA)引物時(shí)， 在引物的5'端添加限制性內(nèi)切酶XhoI切點(diǎn)，且在Xhol點(diǎn)與HSA結(jié)構(gòu)基因的5'端之間插 入Kex2蛋白酶酶切位點(diǎn)的氨基酸殘基Lys-Arg對(duì)應(yīng)的密碼子(AAA AGA) ， HSA基因的3' 端添加了限制性內(nèi)切酶BamHI對(duì)應(yīng)的DNA序列(GGATCC)便于同后面的IFN-a 2b基因連 接。工程菌株在設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增人干擾素-a 2b(IFN-a 2b)IFN-a 2b基因引物時(shí)，在引物的 5' _端添加了 BamHI位點(diǎn)，在引物的3'-端添加了終止密碼子(TGA)和限制性內(nèi)切酶Notl 的序列GCGGCCGC。這樣PCR獲得的基因IFN- a 2b通過BamHI和Notl雙切后，就可以通 過BamHI的粘端將HSA和IFN- a 2b首尾相連起來的融合基因。將基因HSA (Xhol-BamHI)、 IFN-a 2b(BamHI-Notl)和載體pPICZ a (Xhol-Notl)建立連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，篩 選高表達(dá)的克隆。
3. 如權(quán)利要求l或2重組人血清白蛋白-干擾素a2b的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述 重組人血白蛋白-干擾素a2b的工程菌株，使用基因重組技術(shù)將人血白蛋白基因(HAS)與 干擾素-a2b(IFN-a2b)基因連接起來，為了更好的保證兩種蛋白各自獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)， 中間使用GlySer兩個(gè)氨基酸的連接子進(jìn)行連接。
4. 如權(quán)利要求l重組人血清白蛋白-干擾素a2b的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述 陽離子交換層析，需要用冰醋酸調(diào)節(jié)，使PH為4. 6，再用蒸餾水將發(fā)酵液稀釋使電導(dǎo)率為 《20mS/cm，將發(fā)酵上清直接上樣capto匪C柱。
5. 如權(quán)利要求1重組人血清白蛋白-干擾素a 2b的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述疏水 層析步驟中，在陽離子目標(biāo)蛋白收集液中加入化2504，使化2504的終濃度達(dá)到O. 7M，直接上 樣Phenyl S印harose High Performance柱，收集目的蛋白峰。
6. 如權(quán)利要求l重組人血清白蛋白-干擾素a2b的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述分子 篩層析步驟中，將疏水層析收集目的蛋白峰過Superdex 200 pr印grand分子篩層析柱，用 20rnM的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集目的蛋白峰，得到重組人血清白蛋白_干擾素a 2b。
全文摘要
本發(fā)明涉及在畢赤酵母系統(tǒng)中分泌表達(dá)的重組人血白蛋白-干擾素α2b的生產(chǎn)方法。尤其涉及重組人血白蛋白-干擾素α2b在畢赤酵母中的高效表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的純化。該發(fā)明將含有重組人血白蛋白-干擾素α2b的畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵，隨后將發(fā)酵液通過高速離心機(jī)離心收集發(fā)酵上清，陽離子交換層析，疏水層析和分子篩層析進(jìn)行組合純化生產(chǎn)，生產(chǎn)出符合中國藥典規(guī)定的重組人血白蛋白-干擾素α2b融合蛋白。本發(fā)明發(fā)酵表達(dá)量高，純化工藝組合合理，操作程序簡化，收率高，生產(chǎn)成本低，符合產(chǎn)業(yè)化要求。
文檔編號(hào)C07K1/16GK101768601SQ20101010345
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月1日
發(fā)明者劉寧, 劉紅軍, 宋磊 申請(qǐng)人:山東泉港藥業(yè)有限公司