專利名稱：：用于鑒定活性代謝物的同位素標(biāo)記的捕獲劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測(cè)活性代謝物(reactivemetabolite)的同位素標(biāo)記的捕獲劑、方法和鑒定候選藥物的方法。更具體地說(shuō)，所述檢測(cè)活性代謝物的同位素標(biāo)記的捕獲劑和方法可以用于檢測(cè)"硬"和"軟"活性代謝物，由此排除假陽(yáng)性。
背景技術(shù)：
：患者發(fā)病和死亡的一個(gè)原因，特異藥物毒性在臨床藥物開(kāi)發(fā)中和投放市場(chǎng)后仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。這些特異藥物反應(yīng)能夠?qū)е聭?yīng)用的限制并且甚至從市場(chǎng)召回，其結(jié)果導(dǎo)致醫(yī)藥工業(yè)更高的開(kāi)發(fā)成本。例如，曲格列酮、苯囉洛芬和左鎂酸由于不能接受的毒性反應(yīng)而在其投放不久后就;波從市場(chǎng)上召回。特異藥物反應(yīng)是通常顯示高度的個(gè)體感受性的稀有事件。另外，這些反應(yīng)通常不是劑量依賴的。目前，沒(méi)有可以用來(lái)評(píng)價(jià)這樣的僅在人中發(fā)生的反應(yīng)的動(dòng)物模型。因此，特異藥物毒性不能夠被有效的評(píng)價(jià)，并且在臨床試驗(yàn)中通常是被忽視的。目前，特異藥物反應(yīng)的機(jī)理尚不明確。有大量證據(jù)表明化學(xué)活性代謝物與特異毒性有關(guān)，特別對(duì)肝臟毒性。與特異毒性有關(guān)的所有藥物通過(guò)主要由細(xì)胞色素P450酶(CYP)以及其它氧化酶例如過(guò)氧化物酶、環(huán)加氧酶和髓過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的不同代謝途徑來(lái)形成反應(yīng)活性代謝物。假設(shè)與所述毒性有關(guān)的藥物首先進(jìn)行代謝活化以產(chǎn)生與細(xì)胞蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的有毒活性代謝物。這些共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)是免疫原性的，于是引發(fā)免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致特異藥物反應(yīng)。另一假設(shè)是說(shuō)由活性代謝物產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白的共價(jià)修飾損害信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)(signaltransductioncascades)和細(xì)胞的生命機(jī)能，從而導(dǎo)致在臨床中觀察到的嚴(yán)重后果。因此需要鑒定活性代謝物的方法。可以將化學(xué)活性代謝物基于其化學(xué)特性歸為兩類-"軟"和"硬"活性代謝物。"軟"活性代謝物包括大部分親電代謝物，其包括醌類、醌亞胺類、亞氨基醌曱基化物、環(huán)氧衍生物、芳烴氧化物和氮烯徵(nitrenium)離子，并且易于與"軟，，親電體例如半胱氨酸中的巰基反應(yīng)。相反，"硬"活性代謝物，其通常被看作是醛類，優(yōu)先與"硬"親電體例如賴氨酸、精氨酸和核酸的胺反應(yīng)。由于其不穩(wěn)定，活性代謝物的直接檢測(cè)和鑒定已經(jīng)證明是極其困難的。一種通常利用的方法是捕獲分子來(lái)捕獲活性代謝物，從而形成隨后能夠通過(guò)已知檢測(cè)方法(例如通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法)進(jìn)行表征的穩(wěn)定的加合物。最近，Avery,Michael,J.在歐洲專利公開(kāi)EP1,150,120公開(kāi)了一種用于鑒定產(chǎn)生活性代謝物的試驗(yàn)化合物的高通量篩選方法(high-throughputscreeningmethod)。該方法包括在谷胱甘肽存在下將試驗(yàn)化合物用代謝酶系統(tǒng)的微粒體藥物培養(yǎng)，并使用串聯(lián)質(zhì)鐠法檢測(cè)由此形成的谷胱甘肽加合物。然而，這種方法將鑒定活性代謝物以及在質(zhì)譜檢測(cè)中作為普通反應(yīng)的結(jié)果而形成的非活性成分(包括反應(yīng)混合物的非活性代謝物和成分)非活性組分，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性。Yan等人在美國(guó)專利公開(kāi)20050287623Al中公開(kāi)了使用穩(wěn)定同位素捕獲和質(zhì)譜法檢測(cè)活性代謝物的方法。然而，Yan等人公開(kāi)的方法僅檢測(cè)"軟"代謝物，不能同時(shí)檢測(cè)"硬"和"軟"活性代謝物。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于鑒定活性代謝物的同位素標(biāo)記的捕獲劑，式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(I)也稱作6-氨基-2-[2-(4-氨基-4-羧基-丁?；被?-3-巰基-丙?；被鵠-己酸，其中標(biāo)星號(hào)的基切上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的。本發(fā)明還涉及鑒定活性代謝物的方法，該方法包括(a)將式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(1)，和/或同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；與試驗(yàn)化合物和藥物代謝酶培養(yǎng)；產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；和(b)按照已知方法和/或按照本文描述的方法，例如通過(guò)中性損失質(zhì)譜法，檢測(cè)所述一種或多種加合物。本發(fā)明還涉及檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>同位素標(biāo)記的式(I)化合物和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)檢測(cè)在步驟(a)中產(chǎn)生的一種或多種加合物的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中雙峰的質(zhì)量差異是式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異。本發(fā)明還涉及使用式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物的混合物來(lái)鑒定活性代謝物(包括"軟"和/或"硬"活性代謝物)的方法，其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的。本發(fā)明還涉及檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，該方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物CH2INH2(|)，同位素標(biāo)記的式(I)化合物其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、疏和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的，和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)，以產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中產(chǎn)生的一種或多種加合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)譜中的一種或多種同位素雙峰，其中同位素雙峰的質(zhì)量差異是非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異。本發(fā)明還涉及包含(a)活性代謝物和非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>共價(jià)鍵合的絡(luò)合物和(b)活性代謝物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物的混合物。本發(fā)明還涉及鑒定候選藥物的方法，該方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物同位素標(biāo)記的式(I)化合物其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的，和藥物代謝酶培養(yǎng)，產(chǎn)生產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中產(chǎn)生的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)譜中的同位素雙峰的缺失(其中同位素雙峰的質(zhì)量差異是非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異)。附圖的簡(jiǎn)要描述圖1A說(shuō)明雙氯酚酸的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖1B說(shuō)明得自雙氯酚酸的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖IC說(shuō)明得自雙氯酚酸的加合物II的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖2A說(shuō)明氯氮平的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖2B說(shuō)明得自氯氮平的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)語(yǔ)。圖3A說(shuō)明對(duì)曱盼的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖3B說(shuō)明得自對(duì)甲酚的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖3C說(shuō)明得自對(duì)曱酚的加合物II的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖4A說(shuō)明奧美拉唑的129Da中性損失掃描的總離子色鐠圖。圖4B說(shuō)明得自?shī)W美拉唑的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖5A說(shuō)明呋喃的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖5B說(shuō)明得自呋喃的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖6A說(shuō)明2-甲基呋喃的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖6B:得自2-甲基呋喃的異構(gòu)體加合物的NL串聯(lián)質(zhì)譜。圖7A說(shuō)明薄荷呋喃的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖7B說(shuō)明得自薄荷呋喃的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖8A說(shuō)明2-[2-口塞吩基]-呋喃的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖。圖8B說(shuō)明得自2-[2-噻吩基]-呋喃的加合物I的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖8C說(shuō)明得自2-[2-噻吩基]-呋喃的加合物II的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。圖8D說(shuō)明得自2-[2-噻吩基]-呋喃的加合物III的中性損失串聯(lián)質(zhì)譜。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記的捕獲劑，其中所述捕獲劑能夠與活性代謝物結(jié)合，式(I)化合物*CH2I*NH2(|)也稱作6-氨基-2-[2-(4-氨基-4-羧基-丁?；被?-3-巰基-丙酰基氨基]-己酸，其中星號(hào)標(biāo)記的基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或不可交換氫原子是同位素標(biāo)記的，優(yōu)選用一個(gè)或多個(gè)13。15N、180、2H和/或34S同位素標(biāo)記。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"不可交換氫"是指在水溶液中不發(fā)生交換的任何氫原子。對(duì)于式(I)化合物，可以被同位素標(biāo)記的不可交換氫原子是用如下所示的結(jié)構(gòu)式中的箭頭標(biāo)示的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>謝物反應(yīng)并將其捕獲，而式(I)化合物上的-(CH2)4-NH2基團(tuán)與所謂的"硬"活性代謝物反應(yīng)并將其捕獲。因此，式(I)化合物同位素標(biāo)記的式(I)化合物能夠同時(shí)捕獲"硬"和"軟"活性代謝物。也可以將其用圖示法表示如下。式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"活性代謝物"包括"軟"和"硬"活性代謝物。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"軟代謝物"是指任何親電子代謝物，其包含至少一個(gè)易于與"軟"親電體例如半胱氨酸中的巰基和式(I)化合物上的-SH反應(yīng)的取代基。所述取代基的適宜實(shí)例包括但不限于醌類、醌亞胺、亞氨基醌、methids、環(huán)氧化合物、芳香烴氧化物、氮烯镥(nitrenium)離子等。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"硬代謝物"是指親電子代謝物，其包含指示一個(gè)易于與"硬"親電體例如賴氨酸、精氨酸的胺或式(I)化合物的-(CH2)4-NH2反應(yīng)的取代基。所述取代基的適宜實(shí)例包括但不限于醛類等。因?yàn)榛钚源x物是與實(shí)驗(yàn)化合物有關(guān)的很多不良事件、特別是嚴(yán)重的和/或有毒的不良事件的肇因，所以迫切希望能夠檢測(cè)出由試驗(yàn)化合物產(chǎn)生的所有活性代謝物。還迫切希望在試驗(yàn)化合物給藥于人之前能夠確定試驗(yàn)化合物是否產(chǎn)生活性代謝物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解不是所有的試驗(yàn)化合物都產(chǎn)生活性代謝物，并且不是所有的試驗(yàn)化合物都產(chǎn)生"軟"和"硬"活性代謝物。有些試驗(yàn)化合物將不產(chǎn)生活性代謝物，有些試驗(yàn)化合物將僅產(chǎn)生硬活性代謝物，有些試驗(yàn)化合物僅產(chǎn)生軟活性代謝物，有些試驗(yàn)化合物產(chǎn)生硬和軟活性代謝物。因此本發(fā)明的捕獲劑和方法檢測(cè)由試驗(yàn)化合物產(chǎn)生的任何類型的活性代謝物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還能理解本發(fā)明方法，盡管涉及鑒定活性代謝物，也包括確定試驗(yàn)化合物是否產(chǎn)生活性代謝物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鑒定候選藥物(例如不產(chǎn)生活性代謝物的試驗(yàn)化合物)的方法。因此，本發(fā)明方法包括其中培養(yǎng)(如本文更詳細(xì)地描述)產(chǎn)生非活性代謝物，以及因此沒(méi)有加合物，并且質(zhì)鐠顯示沒(méi)有雙峰，由對(duì)于"軟"代謝物，谷胱甘肽、以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式的化合物是在微粒體培養(yǎng)中使用的檢測(cè)"軟"活性代謝物的最普通的捕獲劑。然而，對(duì)于"硬"活性代謝物，谷胱甘肽由于其低捕獲效能而不是適宜的捕獲劑。相反，對(duì)于檢測(cè)"硬"活性代謝物，使用另外的捕獲劑例如氨基脲、甲氧基胺和ot-acetyllisine。這需要用不同的捕獲劑進(jìn)行兩個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)以檢測(cè)"硬"和"軟"活性代謝物。與此相反，可以將式(I)化合物、同位素標(biāo)記的式(I)化合物和/或非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的混合物可以在單個(gè)試驗(yàn)中用來(lái)檢測(cè)"軟"和"硬"活性代謝物。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"同位素標(biāo)記的式(I)化合物"是指用至少一種同位素例如13C、15N、180、2H、3H、34S等標(biāo)記的式(I)化合物。優(yōu)選地，同位素是"C、15N、180或4。同位素標(biāo)記的式(I)化合物的適宜實(shí)例包括但不限于在其半胱氨酸上用130和/或"N標(biāo)記的式(1)化合物；在其半胱氨酸和賴氨酸基團(tuán)上用同位素標(biāo)記的式(I)化合物；式(I)化合物，在l-28位、優(yōu)選1-10位、更優(yōu)選3-8位、最優(yōu)選8位的一個(gè)或多個(gè)位置上同位素標(biāo)記的式(I)化合物；等。優(yōu)選地，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用至少一種選自13C、15N、"0和2H的同位素標(biāo)記的。更優(yōu)選地，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用兩個(gè)"N和六個(gè)13C同位素木亍i己的。在一個(gè)實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是如下面化學(xué)結(jié)構(gòu)式(I-IS)中所示同位素標(biāo)記的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>(I-IS).如本文所用，除非另外說(shuō)明，"藥物代謝酶"是指優(yōu)選來(lái)源于人組織、更優(yōu)選來(lái)源于人肝臟組織的能夠使試驗(yàn)化合物代謝的任何酶或其混合物(參見(jiàn)例^口DrugMetabolizingEnzyme,EditedbyJaeS.Lee,R.ScottObachandMichaelB.Fisher,MarcelDekker,Inc.(2003》。適宜的實(shí)例包括但不限于肝樣i粒體、細(xì)胞色素P450酶或細(xì)胞色素P450酶的不同亞型的混合物。優(yōu)選地，藥物代謝物酶是人肝微粒體，更優(yōu)選細(xì)胞色素P450酶。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，在將試驗(yàn)化合物用細(xì)胞色素P450酶或細(xì)胞色素P450酶的不同亞型的混合物培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞色素P450酶或細(xì)胞色素P450酶的不同亞型的混合物是與NADPH輔因子或NADPH再生系統(tǒng)混合在一起培養(yǎng)的。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"試驗(yàn)化合物"是指用來(lái)進(jìn)行形成活性代謝物試驗(yàn)的任何化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選地，試驗(yàn)化合物是藥劑或者其鹽、酯或前藥。如本文所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"候選藥物"是指不產(chǎn)生活性代謝物的任何化學(xué)物質(zhì)或試驗(yàn)化合物。優(yōu)選地，候選藥物是藥劑或者其鹽、酯或前藥。如本文所用，除非另外指出，術(shù)語(yǔ)"加合物"是指活性代謝物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物或與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的任何共價(jià)結(jié)合的絡(luò)合物。說(shuō)明書(shū)尤其是反應(yīng)方案和實(shí)施例中使用的縮寫(xiě)詞如下APCI-MS/MS=大氣壓力化學(xué)離子化串聯(lián)質(zhì)語(yǔ)法=細(xì)胞色素P450酶=道爾頓=電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜法=高壓液相色i普法=質(zhì)譜法=(3-煙酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸(還原的)固相萃取CYPsDaESI曙MS/MSHPLCMSNADPHSPE在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記的式(I)化合物，其中星號(hào)標(biāo)記的基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或不可交換的氬原子是同位素標(biāo)記的，優(yōu)選用一個(gè)或多個(gè)"C、15N、180、2H、3H和/或"S同位素標(biāo)記。可以通過(guò)已知的方法，例如通過(guò)同位素交換后者通過(guò)使用同位素標(biāo)記的試劑/起始材料進(jìn)行肽偶聯(lián)合成，來(lái)制備同位素標(biāo)記的式(I)化合物。(參見(jiàn)例如Ott，DonaldG.,SyntheseswithStableIsotopesofCarbon,Nitrogen,andOxygen,(1981),Wiley,NewYork,N.Y;Keliher,EdmundJ.;Burrdl,RichardC.;Chobanian,HarryR.;Conkrite，KarinaL.;Shukla,Rajesh;Baldwin,JohnE.,Efficientsynthesesoffourstable-isotopelabeled(1R)-menthyl(lS,2S)-(+)誦2國(guó)phenylcyclopropanecarboxylates,Organic&BiomolecularChemistry,(2006),4(14)，pp2777-2784;Schippers，Nicole;Schwack,Wolfgang,Synthesisofthe15N-labelledinsecticideimidacloprid,JournalofLabelledCompoundsandRadiopharmaceuticals,(2006),49(3),pp305-310;和Bretz,Michael;Beyer,Marita;Cramer,Benedikt;Humpf，Hans國(guó)Ulrich,Synthesisofstableisotopelabeled3-acetyldeoxynivalenol，MolecularNutrition&FoodResearch,(2005),49(12),ppl151-1153.)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物。式(I-IS)化合物可以如下面反應(yīng)方案1中所述來(lái)制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>反應(yīng)方案1因此，按照已知的化學(xué)反應(yīng)(例如經(jīng)由酸-胺縮合失去水，參見(jiàn)例如,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>L.G.,OrganicChemistry,FourthEditions,PrenticeHall,1999，pp.136-137),將2-氨基-4-(l-羧基-2-巰基-乙基氨基曱?；?-丁酸與同位素標(biāo)記的賴氨酸反應(yīng)，獲得式(I-IS)化合物。本發(fā)明涉及式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>或同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；或者式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的混合物；在檢測(cè)活性代謝物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及使用同位素捕獲和質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)活'眭代謝物的方法，其中該方法排除假陽(yáng)性。本發(fā)明還提供在低水平檢測(cè)活性代謝物的高靈敏度方法。此外，本發(fā)明可應(yīng)用于以手動(dòng)或全自動(dòng)方式使用MS模式識(shí)別來(lái)檢測(cè)活性代謝物。本發(fā)明還涉及檢測(cè)活性代謝物的方法，該方法包括(a)將式(I)化合物或同位素標(biāo)記的式(I)化合物，其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的，與試驗(yàn)化合物和藥物代謝酶培養(yǎng)以產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；和(b)檢測(cè)所述加合物(按照已知方法)。例如，不使用穩(wěn)定同位素捕獲(例如不使用同位素標(biāo)記的捕獲劑例如同位素標(biāo)記的式(I)化合物)檢測(cè)活性代謝物的方法使用三級(jí)四極質(zhì)譜儀，其通過(guò)使用作為測(cè)量掃描的中性損失能夠觸發(fā)MS/MS全掃描。使用這種系統(tǒng)，可以在一次試驗(yàn)中獲得加合物的串聯(lián)MS質(zhì)譜，并且可以通過(guò)檢查特征產(chǎn)物離子來(lái)實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)鑒定。然而，由于相對(duì)于中性損失MS掃描，用MS全掃描通常獲得較小信噪比，所以使用MS全掃描系統(tǒng)可能難于檢測(cè)次要活性代謝物。而且，MS全掃描相對(duì)費(fèi)時(shí)且費(fèi)力。本發(fā)明涉及檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，該方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物、同位素標(biāo)記的式(I)化合物的混合物，其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的，和藥物代謝酶培養(yǎng)，獲得包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)檢測(cè)步驟(a)的加合物的中性損失質(zhì)i普中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中雙峰的質(zhì)量差異是非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，該方法包4舌(a)將試驗(yàn)化合物與包含式(I)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>同位素標(biāo)記的試(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>的混合物和藥物代謝酶培養(yǎng)；以獲得包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中的一種或多種加合物的中性損失質(zhì)諳；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)語(yǔ)中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中同位素雙峰的質(zhì)量差異為8Da。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，該方法包括「(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物、同位素標(biāo)記的式(I)化合物的混合物(其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氬原子是同位素標(biāo)記的)和藥物代謝酶培養(yǎng)，獲得包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)分離步驟(a)的一種或多種加合物；(按照已知方法，優(yōu)選通過(guò)離心)；(c)測(cè)定所述分離的加合物的中性損失質(zhì)譜；(d)檢測(cè)所述分離的加合物的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中雙峰的質(zhì)量差異是非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，該方法包括「步驟A:培養(yǎng)混合物，該混合物包含(a)試驗(yàn)混合物；(b)式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>(c)同位素標(biāo)記的(I-IS)化合物其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物的摩爾比例為約1:1;和(c)選自以下的藥物代謝酶人肝微粒體、與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶和與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)胞色素P450酶；以產(chǎn)生包含一種或多種選自以下的培養(yǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)物混合物(a)非活性代謝物；(b)在式(I)化合物和活性代謝物之間形成的加合物；和(c)在同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物和活性代謝物之間形成的加合物；步驟B:測(cè)定步驟(A)中產(chǎn)生的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和步驟C:檢測(cè)步驟(B)的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中同位素雙峰的質(zhì)量差異為8Da。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用至少一個(gè)選自13C、15N、180和2H的同位素標(biāo)記的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用l-28個(gè)同位素、優(yōu)選1-10個(gè)同位素標(biāo)記的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用6個(gè)13。和2個(gè)"N原子標(biāo)記的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用中性損失質(zhì)譜檢測(cè)129Da損失(相應(yīng)于非同位素標(biāo)記的或同位素標(biāo)記的式(I)化合物的-C(0)-CH2-CH2-CH(NH2)-C02H部分的損失)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用APCI-MS/MS、ESI-MS/MS等，優(yōu)選ESI-MS/MS來(lái)測(cè)定同位素雙峰。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，中性損失質(zhì)譜中的同位素雙峰的質(zhì)量差異為約1-28個(gè)質(zhì)量單位、優(yōu)選2-10個(gè)質(zhì)量單位，更優(yōu)選8個(gè)質(zhì)量單位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物代謝酶選自人肝微粒體、細(xì)胞色素P450酶、過(guò)氧化物酶、環(huán)加氧酶和髓過(guò)氧化物酶。優(yōu)選地，藥物代謝酶是細(xì)胞色素P450酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)通過(guò)將試驗(yàn)化合物與含有藥物代謝酶例如S9、重組酶或微粒體酶的任何細(xì)胞級(jí)份培養(yǎng)而形成的活性代謝物。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用本發(fā)明方法預(yù)測(cè)試驗(yàn)化合物是否在人個(gè)體中形成活性代謝物(即在將試驗(yàn)化合物給予人之后)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，縮寫(xiě)"S9"是指S9級(jí)份(線粒體后上清液級(jí)份)，其是微粒體和胞漿的混合物。因此，其含有多種包括多種I期和II期酶，包括P450酶、黃素單氧酶、羧基酯酶、環(huán)氧化物酶、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、曱基轉(zhuǎn)移酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和其他藥物代謝酶。本發(fā)明還涉及包含(a)活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物和(b)活性代謝物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物，其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的摩爾比例在約1:1至1:2的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約1:1至約1:1.5的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為約l:l。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，活性代謝物和非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物與活性代謝物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物的摩爾比例在約1:1至約l:2的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約1:1至約1:1.5的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為約l:l。本發(fā)明還涉及檢測(cè)活性代謝物的方法。更具體地說(shuō)，在本發(fā)明方法中，將試驗(yàn)化合物與包含以下成分的混合物按照已知方法培養(yǎng)(a)非同位素標(biāo)記的式(I)化合物；(b)同位素標(biāo)記的式(I)化合物，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物含有6個(gè)13(:和2個(gè)"N原子；其中非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的摩爾比例為約1:1(以在質(zhì)語(yǔ)中產(chǎn)生具有大約相同強(qiáng)度雙峰)；和(c)藥物代謝酶例如人肝微粒體、與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶(CYP)(純化的、重組的、在微粒體中的、在肝細(xì)胞中的等)、與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)胞色素P450酶(CYP)(純化的、重組的、在微粒體中的、在肝細(xì)胞中的等)、過(guò)氧化物酶、環(huán)加氧酶、髓過(guò)氧化物酶等；優(yōu)選人肝微粒體；以產(chǎn)生包含一種或多種培養(yǎng)產(chǎn)物的混合物，所述培養(yǎng)物產(chǎn)物選自(a)非活性代謝物；(b)在非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與活性代謝物之間形成的加合物；和(c)在同位素標(biāo)記的式(I)化合物與活性代謝物之間形成的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，作為上述培養(yǎng)的結(jié)果產(chǎn)生的非活性(穩(wěn)定的)代謝物，將不與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物或同位素標(biāo)記的式(I)化合物反應(yīng)，而是在產(chǎn)物混合物中保持不變。優(yōu)選地，同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用一種或多種選擇的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的。適宜的同位素包括但不限于13C、15N、2H、3H、lsO、34S等。優(yōu)選地，同位素選自13C、15N、180和211,更優(yōu)選"C和"N。優(yōu)選地，同位素標(biāo)記的式(I)化合物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異為約1-28個(gè)質(zhì)量單位、優(yōu)選2-10個(gè)質(zhì)量單位、更優(yōu)先8個(gè)質(zhì)量單位。優(yōu)選將含有一種或多種培養(yǎng)產(chǎn)物(非活性代謝物、在活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間形成的加合物和/或在活性代謝物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間形成的加合物)的產(chǎn)物混合物清洗，并按照已知方法例如通過(guò)離心、SPE或液-液萃取來(lái)濃縮，以獲得產(chǎn)物濃縮物。然后把產(chǎn)物濃縮物溶解在適用于質(zhì)譜法(即適合于注射到質(zhì)語(yǔ)儀)的溶劑中，所述溶劑是例如5%乙腈在水中的溶液、5%曱醇在水中的溶液。優(yōu)選地，按照已知方法，例如通過(guò)液相色譜法、HPLC、毛細(xì)管電泳或其他分離技術(shù)，將產(chǎn)物混合物分離為單獨(dú)的加合物成分。然后測(cè)定每一加合物或加合物成分的中性損失質(zhì)譜。可以按照已知方法，使用任何電離源，例如使用APCI-MS/MS、ESI-MS/MS等，優(yōu)選通過(guò)使用ESI-MS/MS,來(lái)測(cè)定中性損失質(zhì)譜。或者，可以在一個(gè)步驟中使用環(huán)形系統(tǒng)例如LC/MS等來(lái)完成分離和質(zhì)譜測(cè)定。如果活性代謝物是由試驗(yàn)化合物產(chǎn)生并且是存在的(作為與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物)，則相應(yīng)的質(zhì)鐠將顯示一個(gè)或多個(gè)由于非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異而間隔的雙峰。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，雙峰可以通過(guò)4見(jiàn)覺(jué)識(shí)別或者通過(guò)使用評(píng)估MS才莫型的電腦軟件程序來(lái)鑒定。作為實(shí)例，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用6個(gè)"C和2個(gè)"N原子標(biāo)記的，如在式(I-IS)化合物中那樣，并且非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物是以約1:1的摩爾比例存在的，在碰撞誘導(dǎo)解離中，非同位素標(biāo)記的和同位素標(biāo)記的加合物將經(jīng)歷焦谷氨酸的中性損失(129Da)。作為結(jié)果，在活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間形成的加合物的質(zhì)譜將表現(xiàn)出質(zhì)量差異為8Da的兩個(gè)同位素分子離子，并且同位素雙峰將顯示近似相等的強(qiáng)度。8Da的一致質(zhì)量差異和所迷雙峰的近似相等強(qiáng)度由此提供鑒定活性代謝物加合物的獨(dú)特MS信號(hào)標(biāo)志。在本發(fā)明方法中，假陽(yáng)性是容易排除的，因?yàn)槠湓诒粶y(cè)定的中性損失質(zhì)譜中不顯示特征性雙峰。通過(guò)使用計(jì)算機(jī)輔助的MS模型識(shí)別，可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的自動(dòng)化。作為實(shí)例，制定一種邏輯圖來(lái)為計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)活性代謝物的程序。更具體地說(shuō)，模型識(shí)別過(guò)程由以下步驟構(gòu)成1.定義m/z^f直的i吳差寬容度(errortolerance);2.定義潛在同位素雙峰的峰強(qiáng)度比例的誤差范圍；3.用選擇的信噪比設(shè)置確定總離子色譜圖中的色譜峰；4.檢測(cè)各個(gè)色語(yǔ)峰的主要分子離子的m/z值；5.使用定義的誤差寬容度通過(guò)適宜的道爾頓數(shù)(基于所選同位素類型和數(shù)目)尋找質(zhì)量有差異的雙峰；6.確定鑒定雙峰的強(qiáng)度比例；7.鑒定加合物。在使用這種方法時(shí)，雙峰的強(qiáng)度比例和質(zhì)量差異是模式識(shí)別中的最主要的決定參數(shù)。強(qiáng)度比的誤差寬容度是通過(guò)非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I)化合物的純度確定的，而m/z值的誤差寬容度則取決于質(zhì)譜儀的性能。本發(fā)明方法用來(lái)在單一試驗(yàn)中確定試驗(yàn)化合物是否產(chǎn)生"硬"和/或"軟"活性代謝物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，雖然本發(fā)明方法同時(shí)檢測(cè)"硬"和"軟"活性代謝物，如果"硬"或"軟"活性代謝物不是由特定的試驗(yàn)化合物形成的，那么該方法將檢測(cè)形成了哪一種類型的活性代謝物。另外，如果沒(méi)有形成活性代謝物，該方法將產(chǎn)生沒(méi)有特征雙峰的質(zhì)譜，由此將試驗(yàn)化合物鑒定為候選藥物。本發(fā)明還涉及鑒定候選藥物(即不產(chǎn)生活性代謝物的試驗(yàn)化合物)的方法，該方法包括r(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物、同位素標(biāo)記的式(I)化合物的混合物(其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的)和藥物代謝酶培養(yǎng)，獲得產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)語(yǔ)中的同位素雙峰的缺失(其中同位素雙峰的質(zhì)量差異是非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及筌定候選藥物的方法，該方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氳原子是同位素標(biāo)記的；和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)；獲得產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中產(chǎn)生的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)諳中的同位素雙峰的缺失(其中同位素雙峰的質(zhì)量差異是8Da的質(zhì)量差異)。提供以下實(shí)施例以幫助理解本發(fā)明，而不是意圖且不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制隨后提供的權(quán)利要求。實(shí)施例1-標(biāo)準(zhǔn)程序A.培養(yǎng)和穩(wěn)定同位素捕獲本文描述的所有微粒體培養(yǎng)均是在水浴中于37X:進(jìn)行的。將試驗(yàn)化合物與人肝微粒體制備物(細(xì)胞色素P450酶制備物)在補(bǔ)充了以1:1的等摩爾比預(yù)先混合的非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-S)化合物的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中混合。將所得混合物在37。C預(yù)熱5分鐘。把輔因子-NADPH再生系統(tǒng)加到反應(yīng)混合物中-(以啟動(dòng)反應(yīng))，獲得1000的最終體積。所得反應(yīng)混合物含有10jaM試馬全化合物、1mg/ml樣i粒體蛋白質(zhì)、1mM非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物的混合物、1.3mMNADP+、3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、3.3mM氯化鎂。在培養(yǎng)60分鐘之后，通過(guò)加入150^1三氯乙酸(10%)將反應(yīng)中止。將所得混合物于4。C以10,000g離心15分鐘以使沉淀的蛋白形成小團(tuán)，并把上清液進(jìn)行固相萃取?；蛘?，將反應(yīng)混合物進(jìn)行液-液萃取以從上清液中回收代謝物。B.質(zhì)譜法MS分斗斤是在Micromass(Manchester,UK)^wa〃raA^/cra三級(jí)四極質(zhì)譜儀上進(jìn)行的。ESI離子源是以正離子模式進(jìn)行的，并且試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下毛細(xì)管電壓3.2kV,源溫120。C,去溶劑化溫度300。C，樣本錐體電壓26V。以中性損失掃描模式收集的質(zhì)譜是通過(guò)在范圍m/z400-800以2.0s掃描獲得的。C.LC-MS/MS分析對(duì)于活性代謝物的完整分析，首先用具有自動(dòng)采樣器的Agilent1100HPLC系統(tǒng)(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)將樣本進(jìn)行色譜分離，并把洗脫劑輸入以中性損失掃描才莫式運(yùn)轉(zhuǎn)的A^cra三重四極質(zhì)語(yǔ)儀中。將AgilentZorbaxSBCI8柱(2.1x50mm)用于色譜分離。初始流動(dòng)相由95%水(0.5%乙酸)組成，并且使用95%水至95%乙腈的單一梯度用7分鐘以0.3ml/min的流速洗脫代謝物。在7分鐘，將柱用95%乙腈洗滌2分鐘，然后以初始條件進(jìn)行再平衡。對(duì)IO卞I等份試樣的清潔樣本進(jìn)行LC-MS/MS分析。將數(shù)據(jù)用得自Micromass的A^w(y";c版本4.0軟件進(jìn)行處理。在檢測(cè)到正峰值之后，隨后獲得MS/MS光譜以進(jìn)一步確定加合物的結(jié)構(gòu)。為了獲得CID(碰撞誘導(dǎo)解離)光譜，將質(zhì)鐠儀用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式操作。實(shí)施例2-9:檢測(cè)軟和/或硬活性代謝物按照上面實(shí)施例1中所述程序，將本發(fā)明方法應(yīng)用于檢測(cè)已知試驗(yàn)化合物的活性代謝物，更具體地說(shuō)應(yīng)用于已知產(chǎn)生"軟"和/或"硬"代謝物的試驗(yàn)化合物，其中是以129Da的損失掃描中性損失質(zhì)譜，并且使用同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物，其與相應(yīng)的非同位素標(biāo)記的式(I)化合物相差8Da單位。實(shí)施例2:雙氯盼酸選擇雙氯盼酸作為試'瞼化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)沖全測(cè)軟活性代謝物的適用性。雙氯酚酸的兩種活性代謝物以及相應(yīng)加合物的形成描述于下面的反應(yīng)方案E1。在下述反應(yīng)中，雙氯酚酸的活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物通過(guò)-SH部分形成加合物。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。反應(yīng)方衆(zhòng)El圖1A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色語(yǔ)圖(MS)。幾種成分對(duì)中性掃描表現(xiàn)出正反應(yīng)，并且有兩種成分表現(xiàn)出預(yù)期的同位素雙峰(質(zhì)量差異為8Da)。加合物I在5.9的保留時(shí)間被洗脫下來(lái)，并且如圖1B所示，表現(xiàn)出在m/z688和696的特征同位素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>雙峰，而加合物II的保留時(shí)間為5.8分鐘，并且如圖1C所示，表現(xiàn)出在m/z654和662Da的特征同位素雙峰。實(shí)施例3:氯氮平選擇氯氮平作為實(shí)驗(yàn)化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)軟活性代謝物的適用性。氯氮平的單一活性代謝物和相應(yīng)的加合物的形成描述于下面的反應(yīng)方案E2。在下述反應(yīng)中，氯氮平的活性代謝物通過(guò)-SH部分與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成加合物。為了清晰起見(jiàn)，下面只顯示了與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物形成的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。<image>imageseeoriginaldocumentpage45</image>圖2A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖(MS)。幾種成分對(duì)中性掃描表現(xiàn)出正反應(yīng)，但是如圖2B所示，只有保留時(shí)間為5.4分鐘的一種成分表現(xiàn)出在m/z703和711Da的特征同位素雙峰。實(shí)施例4:對(duì)曱酚選擇對(duì)曱酴作為實(shí)驗(yàn)化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)軟活性代謝物的適用性。兩種活性代謝物的對(duì)甲酚以及相應(yīng)加合物的形成描述于下面的反應(yīng)方案E3中。在下述反應(yīng)中，對(duì)甲酚的活性代謝物通過(guò)-SH部分與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)形成加合物。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。活性代謝物l活性代謝物II反應(yīng)方案E3圖3A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色-潛圖(MS)。兩種成分表現(xiàn)出特征同位素雙峰。如圖3B所示，保留時(shí)間<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>為0.64分鐘的加合物I表現(xiàn)出在m/z485和493Da的同位素雙峰。如圖3C所示，保留時(shí)間為0.71分鐘的加合物II表現(xiàn)出在m/z501和509Da的同位素雙峰。實(shí)施例5:奧美4立哇謝物的適用性。".、、、、、奧美拉唑的單一活性代謝物和相應(yīng)加合物的形成描述于下面的反應(yīng)方案E4中。在下述反應(yīng)中，奧美拉唑的活性代謝物通過(guò)-SH部分與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成加合物。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>反應(yīng)方案E4圖4A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的j29Da中性損失掃描的總離子色譜圖(MS)。如圖4B所示，只有保留時(shí)間為5.3分鐘的一種成分表現(xiàn)出在m/z723和731Da的特征同位素雙峰。選擇呋喃作為實(shí)驗(yàn)化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)硬活性代謝物的適用性。呋喃的單一活性代謝物以及相應(yīng)的加合物的形成描述于下面的反應(yīng)方案E5中。在下述反應(yīng)中，呋喃的活性代謝物通過(guò)-SH部分和末端-NH2部分與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成加合物。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。反應(yīng)方菜E5圖5A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖(MS)。如圖5B所示，在8.9分鐘的保留時(shí)間洗脫下來(lái)的成分表現(xiàn)呋喃活性代j射物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>出在m/z427和435Da的特征同位素雙峰。實(shí)施例7:2-甲基呋喃選擇2-曱基呋喃作為實(shí)驗(yàn)化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)硬活性代謝物的適用性。2-曱基呋喃的單一活性代謝物及其相應(yīng)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體加合物描述于下面的反應(yīng)方案E6中。在下述反應(yīng)中，2-曱基呋喃的活性代謝物通過(guò)-SH部分和末端-NH2部分與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成兩種加合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成的加合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還能明白，在本試驗(yàn)中形成的兩種加合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體將產(chǎn)生近似相同的質(zhì)謙。兩種加合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物反應(yīng)方案E6圖6A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>譜圖(MS)。如圖6B所示，保留時(shí)間為5.6分鐘和5.9分鐘的兩種加合物異構(gòu)體(結(jié)構(gòu)異構(gòu)體)分別表現(xiàn)出在m/z441和449Da的特征同位素雙峰；實(shí)施例8:2-薄荷呋喃選擇薄荷呋喃作為實(shí)驗(yàn)化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)硬活性代謝物的適用性。薄荷呋喃的單一活性代謝物以及相應(yīng)的加合物的形成描述于下面的反應(yīng)方案E7。在下屬反應(yīng)中，薄荷呋喃的活性代謝物通過(guò)末端-NH2部分與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物形成加合物。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>加合物反應(yīng)方案E7圖7A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色語(yǔ)圖(MS)。如圖5B所示，保留時(shí)間為5.9分鐘的一種成分表現(xiàn)出在m/z527和535Da的特征同位素雙峰。實(shí)施例9:2-(2-瘞吩基)-呋喃選擇2-(2-噻吩基)-呋喃作為實(shí)驗(yàn)化合物來(lái)證明本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)硬和軟活性代謝物的適用性。2-(2-噻吩基)-呋喃的活性代謝物以及隨后與式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物的混合物(后文稱作"捕獲劑GSK")的加合物的形<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>成描述于下面反應(yīng)方案E8和E9。更具體地說(shuō)，反應(yīng)方案8顯示產(chǎn)生硬活性代謝物(H1)的呋喃環(huán)的打開(kāi)、產(chǎn)生軟活性代謝物(S1)的p塞吩環(huán)的環(huán)氧化和相應(yīng)加合物的形成。另外，反應(yīng)方案9顯示活性代謝物(S1)的異構(gòu)化形成第二硬活性代謝物(H2),以及其相應(yīng)加合物的形成。(Hl)活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)通過(guò)-SH部分和末端-NH2部分形成加合物；(Sl)活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物通過(guò)兩個(gè)-SH部分形成加合物；(H3)活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物和同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物通過(guò)末端-NH2部分形成加合物。為清晰起見(jiàn)，下面只顯示與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的加合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能理解，與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物具有相同的結(jié)構(gòu)，只是在同位素標(biāo)記方面不同而已。2-[2-噻吩基]呋喃反應(yīng)方衆(zhòng)E8(H1)-硬活性代謝物(S1)-軟活性代謝物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>加合物III反應(yīng)方案E9圖8A顯示了從反應(yīng)混合物獲得的129Da中性損失掃描的總離子色譜圖(MS)。如圖8B所示，具有6.5分鐘的保留時(shí)間的加合物I在m/z509和517Da表現(xiàn)出特征同位素雙峰；如圖8C所示，加合物II表現(xiàn)出在m/z527和535Da的特征同位素雙峰；并且如圖8D所示，加合物III在m/z495和503Da表現(xiàn)出特征同位素雙峰。盡管前述說(shuō)明書(shū)講授了本發(fā)明的原理，并為了例證說(shuō)明的目的而提供了實(shí)施例，但是可以理解本發(fā)明的實(shí)施包括所有通常的變化、修正和改良，這些變化、修正和改良屬于下面權(quán)利要求及其同等物的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.同位素標(biāo)記的式(I)化合物其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的。2.權(quán)利要求1的化合物，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用至少一個(gè)選自13C、15N、180和^的同位素標(biāo)記的。3.權(quán)利要求2的化合物，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用1至10個(gè)選自13C和15N的同位素標(biāo)記的。4.權(quán)利要求3的化合物，其中6個(gè)碳原子是用"C同位素標(biāo)記的,并且2個(gè)氮原子是用"N同位素標(biāo)記的。5.同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>6.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>和藥物代謝酶培養(yǎng)；產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；和(b)檢測(cè)步驟(a)的加合物。7.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所迷方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物和藥物代謝酶培養(yǎng)其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；和(b)檢測(cè)步驟(a)的一種或多種加合物。8.;險(xiǎn)測(cè)試纟全化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(a)將試驗(yàn)化合物與包含式(I)化合物同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)，其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；和(b)才企測(cè)步驟(a)的一種或多種加合物。9.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>同位素標(biāo)記的式(l)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)，其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；產(chǎn)生包含一種或多種力口合物的產(chǎn)物混4、物；(b)檢測(cè)步驟(a)中產(chǎn)生的一種或多種加合物產(chǎn)物的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中雙峰的質(zhì)量差異是式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異。10.權(quán)利要求9的方法，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用至少一個(gè)選自13C、15N、180和211的同位素標(biāo)記的。11.權(quán)利要求10的方法，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用1至IO個(gè)選自13C和15N的同位素標(biāo)記的。12.權(quán)利要求9的方法，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用6個(gè)"C原子和2個(gè)"N標(biāo)記的。13.權(quán)利要求9的方法，其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的摩爾比為約1:1。14.權(quán)利要求13的方法，其中同位素雙峰質(zhì)量相差8個(gè)質(zhì)量單位。15.權(quán)利要求9的方法，其中藥物代謝酶是人肝微粒體。16.權(quán)利要求9的方法，其中藥物代謝酶是與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶或者與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)胞色素P450酶。17.權(quán)利要求9的方法，其中所述中性損失質(zhì)譜是用ESI-MS/MS或LS/MS測(cè)定的。18.權(quán)利要求9的方法，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>19.權(quán)利要求18的方法，其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物的摩爾比為約1:1。20.權(quán)利要求19的方法，其中藥物代謝酶選自人肝微粒體、與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶以及與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)胞色素P450酶。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述中性損失質(zhì)鐠是使用ESI-MS/MS或LS/MS測(cè)定的。22.混合物，所述混合物包含式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>和同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的。23.權(quán)利要求22的混合物，其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的摩爾比為約1:1。24.權(quán)利要求23的方法，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用6個(gè)"C原子和2個(gè)"N原子標(biāo)記的。25.混合物，所述混合物包含(a)活性代謝物與式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物和(b)活性代謝物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物共價(jià)鍵合的絡(luò)合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的。26.權(quán)利要求25的混合物，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>27.權(quán)利要求25的混合物，其中活性代謝物與非同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物和活性代謝物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的共價(jià)鍵合的絡(luò)合物的摩爾比為約1:1。28.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含式(I)化合物、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)；產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中產(chǎn)生的一種或多種加合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中同位素雙峰的質(zhì)量差異為8Da。29.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括步驟A:培養(yǎng)混合物，所述混合物包含(a)試驗(yàn)化合物；(b)式(I)化合物(c)同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>i摩爾比為約1:1;和(c)選自人肝微粒體、與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶和與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)胞色素P450酶的藥物代謝酶；產(chǎn)生包含一種或多種選自以下的培養(yǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)物混合物(a)非活性代謝物；(b)在式(I)化合物與活性代謝物之間形成的加合物；和(c)在同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物與活性代謝物之間形成的加合物；步驟B:測(cè)定步驟(A)中產(chǎn)生的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和步驟C:檢測(cè)步驟(B)的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中同位素雙峰的質(zhì)量差異為8Da。30.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫和/或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)，產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)分離步驟(a)的一種或多種加合物；(c)測(cè)定所述分離的加合物的中性損失質(zhì)譜；(d)檢測(cè)所述分離的加合物的中性損失質(zhì)語(yǔ)中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中雙峰的質(zhì)量差異是非同位素標(biāo)記的式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物之間的質(zhì)量差異。31.檢測(cè)試驗(yàn)化合物的活性代謝物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物的摩爾比為約1:1;和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)，產(chǎn)生包含一種或多種加合物的產(chǎn)物混合物；(b)分離步驟(a)中的一種或多種加合物；(c)測(cè)定所述分離的加合物的中性損失質(zhì)譜；(d)檢測(cè)所述分離的加合物的中性損失質(zhì)譜中的一個(gè)或多個(gè)同位素雙峰，其中所述雙峰的質(zhì)量差異是8Da。。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>32.鑒定候選藥物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>同位素標(biāo)記的式(I)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中標(biāo)星號(hào)的基團(tuán)上的一個(gè)或多個(gè)碳、氮、氧、硫或非可交換氫原子是同位素標(biāo)記的；和藥物代謝酶的混合物；產(chǎn)生產(chǎn)物混合物；(b)測(cè)定步驟(a)中產(chǎn)生的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)語(yǔ)中的同位素雙峰的缺失。33.權(quán)利要求32的方法，其中同位素標(biāo)記的式(I)化合物是用6個(gè)"C原子和2個(gè)15N原子標(biāo)記的。34.權(quán)利要求33的方法，其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的摩爾比為約1:1。35.權(quán)利要求34方法，其中藥物代謝酶是與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶或者與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)胞色素P450酶。36.權(quán)利要求35的方法，其中中性損失質(zhì)語(yǔ)是用ESI-MS/MS或LS/MS測(cè)定的。37.鑒定候選藥物的方法，所述方法包括(a)將試驗(yàn)化合物與包含非同位素標(biāo)記的式(I)化合物同位素標(biāo)記的式(I-IS)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(卜IS);和藥物代謝酶的混合物培養(yǎng)，產(chǎn)生產(chǎn)物混合物；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(b)測(cè)定步驟(a)中產(chǎn)生的產(chǎn)物混合物的中性損失質(zhì)譜；和(c)檢測(cè)步驟(b)的中性損失質(zhì)譜中的同位素雙峰的缺失。38.權(quán)利要求37的方法，其中式(I)化合物與同位素標(biāo)記的式(I)化合物的摩爾比為約1:1。39.權(quán)利要求38的方法，其中藥物代謝酶是與NADPH輔因子組合的細(xì)胞色素P450酶和與NADPH再生系統(tǒng)組合的細(xì)月包色素P450酶。40.權(quán)利要求39的方法，其中中性損失質(zhì)語(yǔ)是用ESI-MS/MS或LS/MS測(cè)定的。全文摘要本發(fā)明涉及用于檢測(cè)活性代謝物的同位素標(biāo)記的捕獲劑、方法和鑒定候選藥物的方法。更具體地說(shuō)，所述檢測(cè)活性代謝物的同位素標(biāo)記的捕獲劑和方法可以用于檢測(cè)“硬”和“軟”活性代謝物，由此排除假陽(yáng)性。文檔編號(hào)C07K5/093GK101568548SQ200780043721公開(kāi)日2009年10月28日申請(qǐng)日期2007年9月24日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者N·D·胡伯特,Z·嚴(yán)申請(qǐng)人:詹森藥業(yè)有限公司