專利名稱：新型胰島素衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及糖尿病用胰島素，另外還提供其制 備方法。二背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的多發(fā)性代謝疾病，國內(nèi)外的發(fā)病率均呈上升趨勢。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國現(xiàn)有糖尿病患者3000萬人以上，糖尿病的發(fā)病率高達(dá)3.2%。 雖然許多疾病都能導(dǎo)致人死亡，但糖尿病是引起人死亡的第三位的主要原因。胰島素是治療糖尿病的特效多肽激素化合物，迄今為止尚無更有效的替代 藥物。但是，由于胰島素是一種蛋白質(zhì)，容易被胃腸道中的蛋白酶水解而失去 活性，因此只能注射使用，不能夠以其他方式給藥。對于胰島素依賴型的病人 來說，要維持生命的正常代謝，必須頻繁注射用藥，這就給該類病人帶來極大 痛苦和不便。為了解決給要困難，延緩胰島素在體內(nèi)的降解和排泄，近年來國內(nèi)外對胰 島素的新劑型開展了廣泛研究，化學(xué)修飾的方法是制備胰島素新劑型的重要研 究課題之一。對于糖尿病的病人來說，有效的治療方法涉及兩種外源胰島素的應(yīng)用，飲 食使用的速效胰島素和長效的基礎(chǔ)胰島素。目前胰島素衍生物的長效機(jī)理基本上分為三種第一種是改造胰島素的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，使之形成不溶的多聚體晶 態(tài)，利用這種不溶態(tài)在體內(nèi)的緩慢釋放，來達(dá)到長效作用；第二種是用化學(xué)修飾的方法在胰島素的某一個氨基酸殘基的側(cè)鏈上共價 結(jié)合一條脂肪鏈，通過連接的脂肪鏈在體內(nèi)與白蛋白的作用增加循環(huán)半壽期來 達(dá)到長效；第三種就是通過化學(xué)方法在胰島素的某些氨基酸殘基的官能團(tuán)上連接一 條或數(shù)條高分子物質(zhì)，以增加胰島素的循環(huán)半壽期而達(dá)到長效的目的。采取上述第一種長效機(jī)理的胰島素制劑的代表是Ultralente， Lente，和 半-Lente。但現(xiàn)已表明這些長效制劑的不溶性會引起劑量反應(yīng)的不一致，以及 在所述時間作用方面不可預(yù)測的問題，導(dǎo)致了血糖控制的不穩(wěn)定，從而容易產(chǎn) 生危及生命的低血糖癥狀，因此仍需要可溶的長效基礎(chǔ)胰島素以得到成功的強(qiáng) 胰島素替代療法。用脂肪鏈修飾胰島素的方法，人們進(jìn)行了許多研究。通常的辦法是使用活 化的脂肪酸修飾胰島素的N-末端氨基或e -氨基，稱之為?；葝u素。由于胰 島素(豬，人)具有三個可被修飾的氨基A1-Na， B1-Na， B29-N e 。因此 脂肪酸修飾的只能是這三個氨基。Muranishi和Kiso (日本專利申請1-254699)公開了豬，牛，人胰島素的 ?；?，具體公開了下列化合物B29- Ne—棕櫚酰胰島素和B1，B29- Na， N e -二棕櫚酰胰島素。Hashimoto 等人在藥理學(xué)研究 (Pharmaceutical Research ) 6: 171 176(1989)中報(bào)道了Bl-Na-棕櫚酰胰島素(N末端的a氨基被酰化)和Bl， B29的二?；葝u 素。Hashimoto的研究表明Bl-N a -—棕櫚酰胰島素只在高劑量時有降血糖作 用，而B1，B29- Ncc， Ne-二棕櫚酰胰島素基本無降血糖作用。丹麥的諾和諾德公司的B29-e-N單?；葝u素具有較好的降血糖作用， 并已上市，商品名在國內(nèi)叫做"地特胰島素"。這說明，只有B29- Ne的單修 飾胰島素才有可利用的降糖活性，但根據(jù)該藥物的專利，使用特別方法修飾胰' 島素，得到的B29- Ne單酰化胰島素的產(chǎn)率也只有73%，而且分離起來比較困 難。迄今為止，胰島素的脂肪鏈修飾僅限于修飾側(cè)鏈或N末端氨基，還沒有人 進(jìn)行過羧基修飾，并得到超過80%的產(chǎn)率的單一修飾物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種新型胰島素衍生物，是經(jīng)化 學(xué)修飾胰島素，另外還其供新型胰島素衍生物的制備方法，酶促合成，胰島素' 與所要修飾的化學(xué)基團(tuán)的連接是位點(diǎn)專一的和高效的。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是其化合物通式為C H2n+1NH-X-D，式中n-14-22， CnH2n+1NH為直鏈飽和脂肪氨基；X為遺傳編碼的 脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D為脫去B30 氨基酸殘基的天然豬胰島素或脫去B30氨基酸殘基的人胰島素。 所述X為蘇氨酸。所述CnH2n+1NH與X的羧基之間為酰胺鍵連接；X的氨基與D的C末端B29 賴氨酸的羧基之間是酰胺鍵連接。 ' 本發(fā)明新型胰島素衍生物的制備方法，具體合成步驟為第一步脂肪胺的制備將一定量的通式為CnH2 +10H的直連飽和脂肪醇
(n=14-22)加入到甲苯中，加熱共沸除去水分，余下的溶液加入與脂肪醇等 摩爾量的吡啶，回流反應(yīng)并滴加2倍脂肪醇摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加 完畢后再于80°C反應(yīng)2-6小時，冷卻過濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸餾除去甲 苯，得到的產(chǎn)物為CnH2n+1Cl，將該物質(zhì)放入反應(yīng)釜中，以少量無水甲醇溶解， 然后加入過量的液態(tài)氨，密閉下60°C反應(yīng)12-24小時，開釜后減壓除去過量 的氨和甲醇，得到通式為CUH2的脂肪胺(n=14-22)，備用；
第二步CnH2n+1NH-X的制備:取一定量的氨基用Fmoc保護(hù)了的氨基酸衍生物， 其化學(xué)通式為Fmoc-HN-X-(COOH)， X為氨基酸殘基，溶于二氯甲烷(CH2C12) 與二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中，加入Fmoc-HN-X-(COOH)等摩爾量的備 用的aUH2，再加入2倍Fmoc-HN-X-(C00H)摩爾量的碳二亞胺(DCC)， 0-10 °(:攪拌反應(yīng)12-24小時，然后過濾除去副產(chǎn)物DCU，得到的溶液中加入過量的 哌啶，攪拌反應(yīng)脫掉Fmoc保護(hù)基，得到CnH2n+1NH-X，備用，此時X的羧基與脂 肪胺形成酰胺連接，氨基為游離狀態(tài)； '
第三步去掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體D的制備在PH8. 3的碳酸氫 銨溶液中加入天然的豬胰島素或人胰島素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽 酶A，在37。C水浴中作用2小時，然后加酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液用S印hadexG50 分離，凍干，得到脫掉B30氨基酸的胰島素中間體，其B鏈N末端為B29-Lys， 備用；
第四步新型胰島素衍生物的制備首先將一定量備用的脫掉B30氨基酸殘 基的胰島素中間體用0.5-2N的醋酸溶液溶解，得溶液1;然后將備用的 C凡^NH-X溶于無水乙醇與二甲基甲酰胺(Et0H /畫F )的1: 1-1: 6體比積混合溶液中，得溶液2，原料胰島素中間體與CnH2n+1NH-X的摩爾比為1:20-1:100;
最后溶液1和2合并并調(diào)節(jié)pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35°C的
水浴中反應(yīng)12-24小時，即可得到本發(fā)明的終產(chǎn)物一B30的氨基酸殘基的羧
基被脂肪胺修飾的新型胰島素衍生物。
所述第一步脂肪胺的制備中滴加吡啶完畢后反應(yīng)時間為4小時。 所述第一步脂肪胺的制備中加入液態(tài)氨反應(yīng)時間為18小時。 所述第二步CnH2n+lNH-X的制備反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)時間為18小時。 所述第四步新型胰島素衍生物的制備中溶解脫掉B30氨基酸殘基的胰島素
中間體的醋酸溶液濃度為1N。
所述第四步新型胰島素衍生物的制備中原料胰島素中間體與CJk"NH-X的
摩爾比為1:60。
所述第四步新型胰島素衍生物的制備中溶液1和2合并并調(diào)節(jié)pH值為6. 8。 本發(fā)明胰島素衍生物是在天然胰島素或其類似物母體B鏈的C末端殘基的 a -羧基上連接一條脂肪鏈所形成的新型衍生物。其做法是以天然的豬胰島素 或人胰島素為起始原料，使用羧肽酶A在適當(dāng)?shù)娜芤褐袑⑸鲜鲆葝u素B鏈C末' 端第一個氨基酸殘基切掉，然后在適當(dāng)?shù)娜芤褐幸砸让笧榇呋瘎?，將一個連有 脂肪鏈的氨基酸衍生物通過酶促反應(yīng)連接到上述的去掉C末端第一個氨基酸的 胰島素上(此時C末端為賴氨酸)使之成為B鏈C末端上連接了脂肪鏈的新型 胰島素衍生物。該衍生物具有潛在的口服功能及長效功能。
本發(fā)明胰島素制備方法獨(dú)特，通過有機(jī)相的酶促反應(yīng)將事先合成好的脂肪 胺氨基酸衍生物連接到除掉B30氨基酸殘基的人胰島素或豬胰島素的中間體 上，胰島素與所要修飾的化學(xué)基團(tuán)的連接是位點(diǎn)專一的和高效的，該有機(jī)相酶'促反應(yīng)的產(chǎn)率在本專利中達(dá)到90%以上，最高達(dá)到99%。并且最后的結(jié)果是脂 肪鏈被連接到胰島素的B30氨基酸殘基的a羧基上，該連接為酰氨鍵，高產(chǎn)， 禾急定。
得到的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式為CnH2n+1NH-X-D，當(dāng)X為蘇氨酸時，此結(jié)構(gòu)式代表一 條脂肪鏈以酰胺鍵連接到人胰島素的B30氨基酸的羧基上；當(dāng)X為丙氨酸時， 此結(jié)構(gòu)式表示一條脂肪鏈以酰胺鍵連接到豬胰島素的B30氨基酸的羧基上。不 論起始原料是豬胰島素還是人胰島素，當(dāng)X為蘇氨酸時，通過本發(fā)明提供的方 法，最后都得到B鏈C末端羧基修飾了一條脂肪鏈的人胰島素。由于胰酶在有 機(jī)相中催化的合成反應(yīng)只要求B29為賴氨酸，因此，不論X為何種氨基酸，都 不影響最后修飾物的產(chǎn)率。
四

圖1是本發(fā)明脂肪鏈修飾胰島素與未修飾人胰島素的電泳行為對照圖。
采用聚丙烯酰胺自然連續(xù)電泳，凝膠濃度為10%，凝膠內(nèi)pH8.9 電極緩沖液pH為8.3，考瑪斯亮藍(lán)R250染色。 圖2為本發(fā)明產(chǎn)品C18H37NH-Thr-D的質(zhì)譜圖。
五具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)下的詳細(xì)說明，但不限子具體實(shí)施例。
實(shí)施例1:制備新型胰島素衍生物d晶7NH-Thr-D: 步驟1.脂肪胺C18H37NH2的制備
取18醇(C18H37OH) 27克(0. l摩爾)，加入裝有300毫升甲苯的500毫升 圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入與 脂肪醇等摩爾量的吡啶，回流反應(yīng)并滴加2倍脂肪醇摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90。C繼續(xù)反應(yīng)4小時，冷卻，過濾除去結(jié)晶 物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用水和乙醇重結(jié)晶，抽濾真空干燥得到25克 產(chǎn)物，此為Cuft7Cl。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓-力的反應(yīng)釜中，加入過量液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時，打開反應(yīng)釜，反應(yīng) 液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到飽和直鏈脂肪胺C18H37NH2。 步驟2. C18H37NH-Thr (NH2)的制備
取實(shí)施例1中制備的d晶7NH2 2.6克(8毫摩爾)，溶于CH2Cl2/DMF (1:3) 的混合溶液中，加入2.73克(8毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Fmoc-Thr(Fmoc-蘇氨酸)，然后加入DCC3.3克(16毫摩爾)，4。C下攪拌反應(yīng)24小時，過濾除 去DCU沉淀，然后加入過量的哌啶脫掉Fmoc保護(hù)基，溶液加入水沉淀產(chǎn)物， 過濾，洗滌，真空干燥，得到d^7NH-Thr(NH》。 步驟3.除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備
取100毫克人胰島素(通化東寶公司提供)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳 酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37。C保溫2小時，然后加入 冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50 (110cm， 1. 6cmlD)分離除 去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中 間體D，收率為97%。
步驟4. C18H37NH-Thr-D (此即為權(quán)利要求中通式CnH2n+1NH_X-D的一種)的制備
(1) 步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體30毫克，加入 0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液l，
(2) 取0.6毫升DMF/EtOH (1:1)混合液溶解步驟2中制備的 C18H37NH-Thr (NH2)，此為溶液2,(3) 合并溶液l、 2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)至pH6.5，再加入與胰島素中間 體1:200重量比的胰蛋白酶，3(TC反應(yīng)24小時。
(4) 反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3.0，得到的溶液用S印hadexG50 分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。
(5) 將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析、質(zhì)譜分 析，結(jié)果證實(shí)，得到了C,晶7NH-Thr-D，產(chǎn)率在95%以上。
所得產(chǎn)品電泳圖如圖l所示，由圖l可以看出，脂肪鏈修飾胰島素與未 修飾人胰島素的電泳行有明顯差異，這是因?yàn)樵谀z中，帶電粒子靠電荷的 差異由負(fù)極向正極移動，移動方向如圖；脂肪鏈修飾了胰島素的B鏈C末端 的羧基后，修飾的胰島素比未修飾的胰島素少了一個正電荷，因此其泳動速 度比未修飾胰島素慢，在電泳膠片上顯示了不同的兩個區(qū)帶，如圖中泳道l 和泳道3所示。
圖2C18H37NH-Thr-D的質(zhì)譜圖，在其MOLDI-TOF圖上，顯示出其分子量為 6031. 8，符合其分子式所代表的胰島素衍生物的質(zhì)量。 實(shí)施例2: C14H29NH-Ala-D的制備 步驟l.脂肪胺d4H29NH2的制備
取14醇(C14H290H) 18. 5克(0. l摩爾)，加入裝有300毫升甲苯的500毫 升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入' 與脂肪醇等摩爾量的吡啶，回流反應(yīng)并滴加2倍脂肪醇摩爾量的氯化亞砜 (S0C12)，滴加完畢后將溫度降到9(TC繼續(xù)反應(yīng)4小時，冷卻，過濾除去結(jié)晶 物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用水和乙醇重結(jié)晶，抽濾真空干燥得到17克 產(chǎn)物，此為CwH29Cl。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應(yīng)釜中，加入過量液態(tài)氨密閉，6(TC反應(yīng)24小時，打開反應(yīng)釜，反應(yīng) 液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到飽和直鏈脂肪胺C14H29NH2。 步驟2. C14HJH-Ala(NH2)的制備
取實(shí)施例1中制備的"H具l. 84克(10毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF (1:5) 的混合溶液中，加入1.64克(IO毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Fmoc-Ala(Fmoc-丙氨酸)，然后加入DCC4. 1克(20毫摩爾)，10°C下攪拌反應(yīng)24小時，過濾 除去DCU沉淀，然后加入過量的哌啶脫掉Fmoc保護(hù)基，溶液加入水沉淀產(chǎn)物， 過濾，洗滌，真空干燥，得到(:14仏9麗-Ala(NH》。 步驟3.除去B30氮基酸殘基的胰島素中間體的制備
取100毫克人胰島素(通化東寶公司提供)溶于5毫升p朋.3的0. 1M碳 酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37。C保溫2小時，然后加入 冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50 (110cm， 1. 6cmlD)分離除 去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中 間體D，收率為97%。
步驟4. C14H29NH-Thr-D (此即為權(quán)利要求中通式CnH2n+1NH-X-D的一種)的制備
(1) 步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體30毫克，加入0. 15 毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液l
(2) 取0.6毫升DMF/EtOH (2:1)混合液溶解步驟2中制備的 CI4H29NH-Ala(NH》，此為溶液2。
(3) 合并溶液1、 2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)至pH6.8，再加入與胰島素中間體 1:200重量比的胰蛋白酶，3(fC反應(yīng)24小時。
(4) 反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。
(5)將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析、質(zhì)譜分析，
結(jié)果證實(shí)，得到了d4^NH-Ala-D，產(chǎn)率在95%以上。具體見

。 實(shí)施例3: C1SH33NH-Gly-D的制備 步驟1.脂肪胺C16H33NH2的制備
取22醇(C16H33OH) 24. 2克(0.1摩爾)，加入裝有300毫升甲苯的500毫 升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入 與脂肪醇等摩爾量的吡啶，回流反應(yīng)并滴加2倍脂肪醇摩爾量的氯化亞砜 (S0C12)，滴加完畢后將溫度降到9(TC繼續(xù)反應(yīng)4小時，冷卻，過濾除去結(jié)晶 物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用水和乙醇重結(jié)晶，抽濾真空干燥得到22克 產(chǎn)物，此為CwH33Cl。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓 力的反應(yīng)釜中，加入過量液態(tài)氨密閉，6CfC反應(yīng)24小時，打開反應(yīng)釜，反應(yīng) 液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到飽和直鏈脂肪胺C16H33NH2。 步驟2. C16H33NH-Gly (NH2)的制備
步驟1中制備的C16H33NH2 2. 4克(10毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF (1:5)的 混合溶液中，加入1.23克(IO毫摩爾)市售的氨基保護(hù)的Fmoc-Gly(Fmoc-甘 氨酸)，然后加入DCC3.3克(20毫摩爾)，0。C下攪拌反應(yīng)24小時，過濾除去 DCU沉淀，然后加入過量的哌啶脫掉Fmoc保護(hù)基，溶液加入水沉淀產(chǎn)物，過濾， 洗滌，真空干燥，得到d晶3NH-Gly(NH2)。
步驟3.除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司提供)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳 酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37。C保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應(yīng)，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50 (110cm， l^cmlD)分離除 去酶蛋白，收集11(T160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中 間體D，收率為97%。
步驟4.d晶3NH-Gly-D (此即為權(quán)利要求中通式CnH2n+NH-X-D的一種)的制備
(6) 步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體30亳克，加入 0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1
(7) 取0.6毫升DMF/EtOH (1:1)混合液溶解步驟2中制備的. C16H33NH-Gly(NH2)，此為溶液2。
(8) 合并溶液l、 2，用TEA(三乙胺)調(diào)節(jié)至pH7.0，再加入與胰島素中間 體1:100重量比的胰蛋白酶，3(TC反應(yīng)24小時。
(9) 反應(yīng)完成后，將體系用HAc調(diào)節(jié)pH3.0，得到的溶液用S印hadexG50 分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。
(10) 將凍干物分別進(jìn)行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析、質(zhì)譜分 析，結(jié)果證實(shí)，得到了 CieH33NH-Gly-D，產(chǎn)率在95%以上。具體見附圖說 明。
實(shí)施例4
C12H25NH-Leu-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C12H25OH，氨基酸為亮氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例5
C12H25NH-Leu-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C12H25OH，氨基酸為亮氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。. 實(shí)施例6C13H27NH-Phe-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C13H270H，氨基酸為苯丙氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例7
C14H29NH-Trp-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C14H290H，氨基酸為色氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例8
C15H31NH-lie-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C15H310H，氨基酸為異亮氨酸，按照實(shí)施例l所述的工藝步驟及工藝條件制備。. 實(shí)施例9
C16H33NH-Ser-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C16H330H，氨基酸為絲氨基酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例10
C17H35NH-Met-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C17H350H，氨基酸為甲硫氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例11
C18H37NH-Cys-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C18H370H，氨基酸為半胱氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例12
C12H25NH-Glu-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C12H25OH，氨基酸為谷氨基酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例13
C13H27NH-Gin-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為.C13H270H，氨基酸為谷氨酰胺，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。
實(shí)施例14
C14H29NH-Asp-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 CMH290H，氨基酸為天冬氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例15
C12H25NH-Asn-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C12H250H，氨基酸為天冬酰胺，按照實(shí)施例l所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例16
C15H31NH-Arg-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為. C15H31OH，氨基酸為精氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例17
C16H33NH-Val-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C16H330H，氨基酸為纈氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝歩驟及工藝條件制備。 實(shí)施例18
C17H35NH-His-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C17H35OH，氨基酸為組氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。 實(shí)施例19
UH37NH-Tyr-D的制備具體原料為脫掉B30的胰島素中間體D，脂肪醇為 C18H37OH，氨基酸為酪氨酸，按照實(shí)施例1所述的工藝步驟及工藝條件制備。
1權(quán)利要求
1. 新型胰島素衍生物，其特征是其化合物通式為CnH2n+1NH-X-D，式中n＝14-22，CnH2n+1NH為直鏈飽和脂肪氨基；X為遺傳編碼的脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D為脫去B30氨基酸殘基的天然豬胰島素或脫去B30氨基酸殘基的人胰島素。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型胰島素衍生物，其特征是其中X為L-蘇氨酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型胰島素衍生物，其特征是其中的CnH2n+1NH 與X的羧基之間為酰胺鍵連接。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型胰島素衍生物，其特征是其中X的氨基 與D的C末端B29賴氨酸的羧基之間是酰胺鍵連接。
5、 新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是具體合成步驟為 第一步脂肪胺的制備將一定量的通式為C H2n+10H的直連飽和脂肪醇(n=14-22)加入到甲苯中，加熱共沸除去水分，余下的溶液加入與脂肪醇等 摩爾量的吡啶，回流反應(yīng)并滴加2倍脂肪醇摩爾量的氯化亞砜(S0C1》滴加完 畢后再于8(TC反應(yīng)2-6小時，冷卻過濾除去結(jié)晶物，然后減壓蒸餾除去甲苯， 得到的產(chǎn)物為CnH2 +1Cl，將該物質(zhì)放入反應(yīng)釜中，以少量無水甲醇溶解，然后 加入過量的液態(tài)氨，密閉下60°C反應(yīng)12-24小時，開釜后減壓除去過量的氨 和甲醇，得到通式為C H2n+1NH2的脂肪胺(n=14-22)，備用；第二步Uk+,NH-X的制備:取一定量的氨基用Fmoc保護(hù)了的氨基酸衍生物，其化學(xué)通式為Fmoc-HN-X-(C00H) ， X為氨基酸殘基，溶于二氯甲垸(CH2C12) 與二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中，加入Fmoc-HN-X-(COOH)等摩爾量的備 用的CJUNH2，再加入2倍Fmoc-HN-X-(C00H)摩爾量的碳二亞胺(DCC)， 0-10 。C攪拌反應(yīng)12-24小時，然后過濾除去副產(chǎn)物DCU，得到的溶液中加入過量的 哌啶，攪拌反應(yīng)脫掉Fmoc保護(hù)基，得到Qk+1NH-X，備用，此時X的羧基與脂肪胺形成酰胺連接，氨基為游離狀態(tài)；第三步去掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體D的制備在pH8. 3的碳酸氫 銨溶液中加入天然的豬胰島素或人胰島素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽 酶A，在37°(]水浴中作用2小時，然后加酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液用S印hadexG50 分離，凍干，得到脫掉B30氨基酸的胰島素中間體，其B鏈N末端為B29-Lys， 備用；第四步新型胰島素衍生物的制備首先將一定量備用的脫掉B30氨基酸殘 基的胰島素中間體用0.5-2N的醋酸溶液溶解，得溶液1;然后將備用的 Ok+,NH-X溶于無水乙醇與二甲基甲酰胺(Et0H / DMF )的1: 6體比積 混合溶液中，得溶液2;原料胰島素中間體與CnH2 +1NH-X的摩爾比為1:20-1:100， 最后溶液l和2合并并調(diào)節(jié)pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35。C的 水浴中反應(yīng)12-24小時，即可得到本發(fā)明的終產(chǎn)物——B30的氨基酸殘基的羧 基被脂肪胺修飾的新型胰島素衍生物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是第 一步脂肪胺的制備中滴加吡啶完畢后反應(yīng)時間為4小時。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是第 一步脂肪胺的制備中加入液態(tài)氨反應(yīng)時間為18小時。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是第 二步CnH2n+1NH-X的制備反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)時間為18小時。
9、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是第 四步新型胰島素衍生物的制備中溶解脫掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體的醋 酸溶液濃度為1N。
10、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是第 四步新型胰島素衍生物的制備中原料胰島素中間體與CnH2n+1NH-X的摩爾比為 1:60。
11、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型胰島素衍生物的制備方法，其特征是第 四步新型胰島素衍生物的制備中溶液1和2合并并調(diào)節(jié)pH值為6. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。新型胰島素衍生物，其特征是其化合物通式為C_nH_2n+1NH-X-D，式中n＝14-22，C_nH_2n+1NH為直鏈飽和脂肪氨基；X為遺傳編碼的脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D為脫去B30氨基酸殘基的天然豬胰島素或脫去B30氨基酸殘基的人胰島素。本發(fā)明胰島素衍生物是在天然胰島素或其類似物母體B鏈的C末端殘基的α-羧基上連接一條脂肪鏈所形成的新型衍生物。其做法是以天然的豬胰島素或人胰島素為起始原料，使用羧肽酶A將上述胰島素B鏈C末端第一個氨基酸殘基切掉，然后胰蛋白酶為催化劑，將一個連有脂肪鏈的氨基酸衍生物通過酶促反應(yīng)成為B鏈C末端上連接了脂肪鏈的新型胰島素衍生物。該衍生物具有潛在的口服功能及長效功能。
文檔編號C07K14/62GK101298477SQ200810011479
公開日2008年11月5日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者何明磊 申請人:大連民族學(xué)院