專利名稱：一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的制備方法，特別是一種采用基因工程法制備果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的方法。

背景技術(shù)：
20世紀(jì)30年代，隨著Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素之后，各種天然、合成、半合成的抗生素開始被應(yīng)用于抵抗各種微生物的感染，廣泛使用在藥物、動物飼料等領(lǐng)域。此后的幾十年，抗生素對保護(hù)人類健康做出了巨大貢獻(xiàn)。但是，隨著它的長期大量應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)了多種產(chǎn)生耐藥性的菌株，導(dǎo)致一些過去可以被抗生素有效控制的傳染性疾病死灰復(fù)燃?？垢腥局委熢俣认萑胛C(jī)，使得尋找抗生素替代品成了亟需解決的問題。
抗菌肽(Antibacterial Peptide)作為一種具有抗感染活性的多肽類物質(zhì)，具有以下特性性能穩(wěn)定，抗菌譜廣泛，不易產(chǎn)生耐藥性和生理抵制作用。因此，抗菌肽越來越多地受到人們的關(guān)注，有望成為替代抗生素的藥物。
果蠅缺乏哺乳動物所具有的獲得性免疫系統(tǒng)，即體內(nèi)沒有T細(xì)胞和B細(xì)胞，也沒有抗體和補(bǔ)體系統(tǒng)。但是成蟲果蠅卻能成為酵母、細(xì)菌和真菌的傳播載體，使有機(jī)體腐爛或變壞，這主要是因?yàn)楣壘哂刑烊坏拿庖呦到y(tǒng)，可以抵制各種病原微生物的侵染。果蠅免疫反應(yīng)的一個重要特點(diǎn)就是在受到病原微生物侵染或損傷時，脂肪體細(xì)胞能快速合成一些抗菌肽，這些分子分泌到血淋巴后能殺死入侵的病原微生物。伏蠅素Diptericin就是其中的一個重要成員，它對革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)殺菌作用，推測其殺菌機(jī)制可能是增加了革蘭氏陰性菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-半乳糖苷酶的釋放，從而增加內(nèi)膜和外膜的通透性，阻礙了細(xì)菌的生長。
目前抗菌肽的生產(chǎn)主要有以下渠道直接提取純化、化學(xué)合成以及通過基因工程合成的方法合成，但是，從生物體內(nèi)直接提取的難度大，對技術(shù)和成本的要求高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，化學(xué)合成法費(fèi)用昂貴，限制了應(yīng)用。因此，基因重組技術(shù)成為大量表達(dá)有活性抗菌肽的一條有效途徑。
大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)是迄今在基因工程領(lǐng)域中應(yīng)用最多、也最完善的系統(tǒng)，但是，運(yùn)用該系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽則遇到了很多困難，主要表現(xiàn)在1)抗菌肽對宿主細(xì)胞的毒性。陽性抗菌肽的抑菌作用會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生抑制，從而影響抗菌肽的進(jìn)一步表達(dá)。2)容易被降解。由于抗菌肽分子量小，本身帶有大量正電荷，因而對蛋白酶非常敏感，在表達(dá)細(xì)胞中容易被降解，難以實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)。因此，本發(fā)明選用融合表達(dá)載體pGEX-4T-1，該載體本身含有編碼GST蛋白的序列，使表達(dá)出的抗菌肽N端融合一段GST序列，起到以下三個作用1)增加外源蛋白的穩(wěn)定性；2)提高外源基因在宿主中的表達(dá)水平；3)有利于目的蛋白的分離純化。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為 a.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因提取果蠅總RNA，然后以果蠅總RNA為模板，根據(jù)果蠅diptericin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物 上游引物D15′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’； 下游引物D25′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’； 然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到280bp的diptericin片段； b.重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin的構(gòu)建將用EcoR I和Xho I雙酶切后的diptericin片斷插入質(zhì)粒pGEX-4T-1的EcoR I/Xho I之間，構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克??；抽提質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I雙酶切，得到280bp左右的片段，即為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin； c.融合蛋白的表達(dá)純化和伏蠅素Diptericin的獲得將上述的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6，加入100mM IPTG儲液至終濃度為1.0mM；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后離心，收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進(jìn)行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應(yīng)16小時，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行親和層析，收集流出組分，冷凍干燥，得到果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯而易見的特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn) 1.采用基因工程方法生產(chǎn)果蠅伏蠅素Diptericin，比化學(xué)合成法成本低。
2.以大腸桿菌為表達(dá)宿主，表達(dá)量較高，達(dá)到了315.4mg/L。
3.以pGEX-4T-1為表達(dá)載體，易于融合蛋白的純化，只需經(jīng)一次親和層析便可得到純度較高的融合蛋白。
4.只需經(jīng)一次酶切便可得到純的伏蠅素Diptericin，純化簡便。



圖1重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin的構(gòu)建流程圖。
圖2Diptericin-GST蛋白的純化，1-純化得到的Diptericin-GST蛋白，2-marker。
圖3Diptericin-GST蛋白的酶切，1-marker；2，3-酶切后的Diptericin-GST；4-酶切前的Diptericin-GST。
圖4Diptericin對大腸桿菌的抑菌活性，0-加入PBS對照；1-加入20μl1mg/ml Diptericin溶液；2-加入20μl 0.5mg/ml Diptericin溶液；3-加入20μl 0.25mg/ml Diptericin溶液。

具體實(shí)施例方式 參見圖1、2、3、4，本發(fā)明具體方案敘述如下 1.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因 先提取果蠅總RNA，然后以果蠅總RNA為模板，根據(jù)果蠅diptericin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物 上游引物D15′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’； 下游引物D25′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’； 30℃10min，47℃30min，5℃5min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后85℃1min，55℃1min，72℃1min，循環(huán)25次進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到280bp左右大小的diptericin片段(包括編碼82個氨基酸殘基的Diptericin成熟肽基因序列246bp、終止密碼子3bp、引物設(shè)計(jì)增加24bp)，DNA序列測定表明擴(kuò)增片段序列與果蠅diptericin序列相符。
2.重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin的構(gòu)建 將用EcoR I和Xho I雙酶切后的diptericin片斷插入質(zhì)粒pGEX-4T-1的EcoR I/XhoI之間，構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克隆。抽提質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I雙酶切，得到280bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果相符。
3.融合蛋白的表達(dá)純化和伏蠅素Diptericin的獲得 將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6，加入100mM IPTG儲液至終濃度為1.0mM。繼續(xù)培養(yǎng)4小時后離心，收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進(jìn)行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度，表達(dá)量達(dá)到315.4mg/L。用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應(yīng)16小時，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行親和層析，收集流出組分，冷凍干燥，得到果蠅伏蠅素Diptericin。
4.伏蠅素Diptericin的初步抑菌活性 將得到的Diptericin凍干粉用500μl無菌水溶解，配成母液?？捡R斯亮藍(lán)法測得蛋白濃度為8mg/ml。取100μl母液稀釋成1mg/ml、0.5mg/ml以及0.25mg/ml的Diptericin溶液。
采用瓊脂擴(kuò)散法，以大腸桿菌為受試菌，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16～18h活化增菌，取0.1ml菌液置于LB瓊脂平板上，用滅菌的L形曲玻棒均勻涂布，略干后用滅菌打孔器，在涂有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面打孔，孔徑直徑為5mm，孔間中心距離≥24mm?？變?nèi)分別加入20μl 1mg/ml、0.5mg/ml以及0.25mg/ml的Diptericin溶液，及對照PBS，37℃培養(yǎng)過夜，用卡尺測量抑菌環(huán)直徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參見圖4，Diptericin對大腸桿菌有良好的抑殺作用，1mg/ml濃度時，抑菌圈直徑達(dá)20.00mm。
序列表
<110>上海大學(xué)
<120>一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的制備方法
<160>1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
5′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；
5′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；
權(quán)利要求
1.一種果蠅抗菌肽伏蠅素的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟為
a.獲得果蠅伏蠅素Diptericin基因提取果蠅總RNA，然后以果蠅總RNA為模板，根據(jù)果蠅diptericin基因序列設(shè)計(jì)特異性引物
上游引物D15′-CCGGAATTCGACGACATGACCATGAAGCC-3’；
下游引物D25′-CCGCTCGAGCTATTAGAAATTCGGAAATC-3’；
然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到280bp的diptericin片段；
b.重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin的構(gòu)建將用EcoR I和Xho I雙酶切后的diptericin片斷插入質(zhì)粒pGEX-4T-1的EcoR I/Xho I之間，構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑選出抗Ampicillin的陽性克??；抽提質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I雙酶切，得到280bp左右的片段，即為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin；
c.融合蛋白的表達(dá)純化和伏蠅素Diptericin的獲得將上述的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin在含100μg/mlAmpicillin的2×YT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6，加入100mM IPTG儲液至終濃度為1.0mM；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后離心，收集菌體，用緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，離心收集上清，進(jìn)行親和層析，收集果蠅伏蠅素Diptericin的融合蛋白組分，用凝血酶酶切融合蛋白，4℃下反應(yīng)16小時，終止反應(yīng)，再次進(jìn)行親和層析，收集流出組分，冷凍干燥，得到果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種果蠅抗菌肽伏蠅素Diptericin的制備方法。該方法的具體步驟為果蠅伏蠅素Diptericin基因的獲得，重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-diptericin的構(gòu)建以及融合蛋白的表達(dá)純化和伏蠅素Diptericin的獲得。本發(fā)明方法采用基因工程方法生產(chǎn)果蠅伏蠅素Diptericin，比化學(xué)合成法成本低。以大腸桿菌為表達(dá)宿主，表達(dá)量較高，達(dá)到了315.4mg/L。以pGEX-4T-1為表達(dá)載體，易于融合蛋白的純化，只需經(jīng)一次親和層析便可得到純度較高的融合蛋白。只需經(jīng)一次酶切便可得到純的伏蠅素Diptericin，純化簡便。
文檔編號C07K14/435GK101280307SQ20081003773
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者陳宇光, 佳 徐, 沈彥萍 申請人:上海大學(xué)