專利名稱：一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景具鞘微鞘藻屬于藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、段殖體目、顫藻科、微鞘藻屬。它是干旱、 半干旱地區(qū)生物結(jié)皮中的優(yōu)勢(shì)種群。目前，對(duì)具鞘微鞘藻的利用一般只停留在進(jìn) 行人工藻結(jié)皮上，具鞘微鞘藻之所以用于形成人工藻結(jié)皮進(jìn)行荒漠治理，主要的 是由于其富含藻藍(lán)蛋白。藻膽蛋白是存在于某些藻類(主要是紅藻和藍(lán)藻)藻膽體 中的一類色素復(fù)合蛋白。藻膽蛋白具有強(qiáng)烈的熒光性，發(fā)橙紅色熒光，而其本身 則呈紅色、紫色或藍(lán)色等，故為有色多肽。按光譜特性可把藻膽蛋白分成四類 藻紅蛋白，藻藍(lán)蛋白，藻紅藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。藻藍(lán)蛋白是其中的一類藍(lán)色色 素蛋白。藻藍(lán)蛋白除可用于植物光合作用研究外，還具有很高的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值 可作為純天然的色素，用于食品、化妝品和染料等工業(yè)；試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白可制成 熒光試劑，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床診斷和免疫學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中；還可制成藥 品用于醫(yī)療保健。目前在食品等行業(yè)中使用的藍(lán)色素主要還是化學(xué)合成色素，而 天然藍(lán)色素使用的很少，藻藍(lán)蛋白大多是從螺旋藻和大型海藻中提取得到，它們 的藻藍(lán)蛋白含量大都比具鞘微鞘藻的要低，另外，培養(yǎng)大型海藻的成本遠(yuǎn)比培養(yǎng) 具鞘微鞘藻的成本要高。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法包括 如下步驟A、培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉0.8 2.5g、磷酸氫二鉀0.02 0.05g、硫酸鎂0. 06 0. 09g、氯化鈣0. 02 0. 05g、檸檬酸0. 004 0. 008g、檸 檬酸鐵銨0. 004 0. 008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.001 0.003g、碳酸鈉0.01~ 0. 04g，微量元素溶液0. 5 2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼 酸270 300mg、四水氯化錳170 200mg、七水硫酸鋅18 25mg、 二水鉬酸鈉 15 30mg、五水硫酸銅6 10mg,完全溶解后攪勻制得培養(yǎng)液；B、 具鞘微鞘藻的培養(yǎng)首先是一級(jí)培養(yǎng)，將具鞘微鞘藻藻種接入培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在1.5 3.5L.min—1，光強(qiáng)控制在65 85 u E. m-2. s-1，溫度 控制在22 35'C，培養(yǎng)5 10天后轉(zhuǎn)入到二級(jí)培養(yǎng)；其次是二級(jí)培養(yǎng)，將一級(jí) 培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5 5L.mirT'， 無菌處理，光強(qiáng)控制在75 95u E.m—2. s—'，溫度控制在22 35°C，培養(yǎng)5 10 天后轉(zhuǎn)入到三級(jí)培養(yǎng)；第三是三級(jí)培養(yǎng)，將二級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培 養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3 6L.min—'，無菌處理，光強(qiáng)控制在70 100P E.m—2.s—'，溫度控制在22 35'C，培養(yǎng)5 10天后作為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種 源；第四是繼續(xù)培養(yǎng)，首先是小循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將三級(jí)培養(yǎng)后所得的藻種，接 入小循環(huán)培養(yǎng)池，控制溫度在22 35°C，利用自然光進(jìn)行光照，控制光照強(qiáng)度 在120 180n E.m—2.s—'，攪動(dòng)培養(yǎng)基；其次是大循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將小循環(huán)培 養(yǎng)池中培養(yǎng)4 7天后的具鞘微鞘藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，小循環(huán)培養(yǎng)池與大 循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為1:20 25，將大循環(huán)培養(yǎng)池中控制溫度在22 35'C，利用自然光進(jìn)行光照，控制光照強(qiáng)度在120 180u E.m-2.s-'培養(yǎng)10 20 天后的具鞘微鞘藻過濾收得具鞘微鞘藻藻漿；上述具鞘微鞘藻接種時(shí)，按每升培養(yǎng)液O. 1 0.5g濕重的比例接入。C、 具鞘微鞘藻粉的制備將藻漿經(jīng)過離心獲得具鞘微鞘藻藻泥，經(jīng)濃縮、 脫水、干燥、粉碎后得到具鞘微鞘藻粉；D、 具鞘微鞘藻藻藍(lán)蛋白的抽提向具鞘微鞘藻粉中加入7 10倍重量的 0. 05 0. lmol. L"，pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖溶液，充分?jǐn)噭?，然后置?10 -2(TC下冰凍，待凍結(jié)后取出，置于20 30'C下融溶，待其完全融溶后，再將其 冰凍，如此反復(fù)凍融3 5次，然后3000 6000rpm離心10 15min，收集上清 液，即為藻藍(lán)蛋白粗提液；E、 純化在冰浴條件下，在藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入飽和度為50 70%的 硫酸銨避光鹽析20 40min，然后在3 5。C下3000 6000rpra離心15 25min， 棄除上清液，用一倍體積的0.05 0. lmol.i;1， pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖液 溶解沉淀物，避光透析20 30h后離心，取上清液用0.05 0. lmol.L-1， pH值 為6.0 8.0的磷酸緩沖液平衡好的DEAE — 52離子交換柱，并用0.05 0. lmol. L"， pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖液和0. 1 0. 3mo1. L'1的NaCl溶液洗脫，用收集藍(lán)色組分，冷凍干燥得純化的藻藍(lán)蛋白。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和卓著的效果方法易行、經(jīng)濟(jì)快捷、操作方便、產(chǎn)量 高、產(chǎn)品質(zhì)量好、安全可靠，且所用設(shè)備簡(jiǎn)單適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
從具鞘微鞘藻提取藻藍(lán)蛋白的具體實(shí)施步驟如下A、 培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉1.5g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸鎂0.075g、氯化鈣0.036g、 檸檬酸0.006g、檸檬酸鐵銨0.006g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.001g、碳酸鈉0.02g， 微量元素溶液lml，其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼酸286mg、 四水氯化錳181mg、七水硫酸鋅22.2mg、二水鉬酸鈉25.2mg、五水硫酸銅7.9mg， 完全溶解后攪勻制得培養(yǎng)液。B、 具鞘微鞘藻的培養(yǎng)(1) 一級(jí)培養(yǎng)將具鞘微鞘藻種接入裝有培養(yǎng)液的三角瓶(150 200ml)中， 靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，通氣培養(yǎng)時(shí)，調(diào)節(jié)氣流大小在2.5L.min'1，氣流經(jīng)過棉花 球進(jìn)行無菌處理，光強(qiáng)控制在70^iE.m—2.3—1，溫度控制在30'C。當(dāng)培養(yǎng)7 10天 后，轉(zhuǎn)入到二級(jí)培養(yǎng)。(2) 二級(jí)培養(yǎng)將一級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶(500 1000ml)中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在3L.mii!'1，無菌處理，光強(qiáng)控制在 8(HiE.m-2.s—1，溫度控制在3(TC。當(dāng)培養(yǎng)7 10天后，轉(zhuǎn)入到三級(jí)培養(yǎng)。(3) 三級(jí)培養(yǎng):將二級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶(5000 20000ml)，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在5L.min'1，無菌處理，光強(qiáng)控制在 90|aE.m-2.s"，溫度控制在30'C。培養(yǎng)7 10天后，便可作為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種 源。(4) 繼續(xù)培養(yǎng)① 小循環(huán)培養(yǎng)池(1 2m3)培養(yǎng)采用三級(jí)培養(yǎng)后所得的藻種，接入小循環(huán) 培養(yǎng)池。采用玻璃溫棚控制溫度在30'C，利用自然光進(jìn)行光照，采用遮蔭網(wǎng)控 制光照強(qiáng)度在120 18(HiE.m—^s'1，葉輪或潛水泵攪動(dòng)培養(yǎng)基。② 大循環(huán)培養(yǎng)池(40 60m3)培養(yǎng)將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4 7天的具鞘 微鞘藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，小循環(huán)培養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為1:20 25，其他培養(yǎng)條件與小循環(huán)培養(yǎng)池的培養(yǎng)條件相同。上述具鞘微鞘藻接種時(shí)，按每升培養(yǎng)液O. 1 0.5g濕重的比例接入。C、 具鞘微鞘藻粉的制備將大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)15 20天后的具鞘微鞘藻用泵抽到過濾裝置——振 動(dòng)斜面篩上，經(jīng)過振動(dòng)斜面篩后，收得具鞘微鞘藻藻漿，然后將藻漿經(jīng)過離心機(jī) 離心，獲得具鞘微鞘藻藻泥。將具鞘微鞘藻藻泥經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后 得到具鞘微鞘藻粉。D、 具鞘微鞘藻藻藍(lán)蛋白的抽提向具鞘微鞘藻粉中加入7 10倍重量的0.05 0.1mol.L—1， pH值為6.0-8.0的磷酸緩沖溶液，充分?jǐn)噭?。然后置于?0 一20'C下冰凍，待凍結(jié)后取出，置 于20 3(TC下融溶，待其完全融溶后，再將其冰凍。如此反復(fù)凍融3 5次。絕 大部分藻藍(lán)蛋白從偽枝藻細(xì)胞中被提取出來，然后3000 6000rpm離心10 15min，收集上清液，即為藻藍(lán)蛋白粗提液。E、 純化在冰浴條件下，在藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入飽和度為50 70%的硫酸銨避光 鹽析20 40min，然后在3 5。C下3000 6000卬m離心15 25min，棄除上清液， 用一倍體積的0.05 0.1mol.L'1， pH值為6.0 8.0的磷酸緩沖液溶解沉淀物，避光 透析20 30h后離心，取上清液用0.05 0.1mol.i;1， pH值為6.0 8.0的磷酸緩沖 液平衡好的DEAE—52離子交換柱，并用0.05 0.1mol.L—1， pH值為6.0 8.0的磷 酸緩沖液和0.1 0.3 mol. L"的NaCl溶液洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集藍(lán)色組分， 冷凍干燥得純化的藻藍(lán)蛋白。
權(quán)利要求
1.一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟A、培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉0.8～2.5g、磷酸氫二鉀0.02～0.05g、硫酸鎂0.06～0.09g、氯化鈣0.02～0.05g、檸檬酸0.004～0.008g、檸檬酸鐵銨0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.001～0.003g、碳酸鈉0.01～0.04g，微量元素溶液0.5～2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼酸270～300mg、四水氯化錳170～200mg、七水硫酸鋅18～25mg、二水鉬酸鈉15～30mg、五水硫酸銅6～10mg，完全溶解后攪勻制得培養(yǎng)液；B、具鞘微鞘藻的培養(yǎng)首先是一級(jí)培養(yǎng)，將具鞘微鞘藻藻種接入培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在1.5～3.5L.min-1，光強(qiáng)控制在65～85μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后轉(zhuǎn)入到二級(jí)培養(yǎng)；其次是二級(jí)培養(yǎng)，將一級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5～5L.min-1，無菌處理，光強(qiáng)控制在75～95μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后轉(zhuǎn)入到三級(jí)培養(yǎng)；第三是三級(jí)培養(yǎng)，將二級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3～6L.min-1，無菌處理，光強(qiáng)控制在70～100μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后作為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源；第四是繼續(xù)培養(yǎng)，首先是小循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將三級(jí)培養(yǎng)后所得的藻種，接入小循環(huán)培養(yǎng)池，控制溫度在22～35℃，利用自然光進(jìn)行光照，控制光照強(qiáng)度在120～180μE.m-2.s-1，攪動(dòng)培養(yǎng)基；其次是大循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4～7天后的具鞘微鞘藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，將大循環(huán)培養(yǎng)池中控制溫度在22～35℃，利用自然光進(jìn)行光照，控制光照強(qiáng)度在120～180μE.m-2.s-1培養(yǎng)10～20天后的具鞘微鞘藻過濾收得具鞘微鞘藻藻漿；C、具鞘微鞘藻粉的制備將藻漿經(jīng)過離心獲得具鞘微鞘藻藻泥，經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到具鞘微鞘藻粉；D、具鞘微鞘藻藻藍(lán)蛋白的抽提向具鞘微鞘藻粉中加入7～10倍重量的0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖溶液，充分?jǐn)噭颍缓笾糜?10～-20℃下冰凍，待凍結(jié)后取出，置于20～30℃下融溶，待其完全融溶后，再將其冰凍，如此反復(fù)凍融3～5次，然后3000～6000rpm離心10～15min，收集上清液，即為藻藍(lán)蛋白粗提液；E、純化在冰浴條件下，在藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入飽和度為50～70％的硫酸銨避光鹽析20～40min，然后在3～5℃下3000～6000rpm離心15～25min，棄除上清液，用一倍體積的0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液溶解沉淀物，避光透析20～30h后離心，取上清液用0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液平衡好的DEAE-52離子交換柱，并用0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液和0.1～0.3mol.L-1的NaCl溶液洗脫，用收集藍(lán)色組分，冷凍干燥得純化的藻藍(lán)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在 于小循環(huán)培養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為1:20 25。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從具鞘微鞘藻中提取藻藍(lán)蛋白的方法，首先將硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉，微量元素溶液按比例配制成具鞘微鞘藻培養(yǎng)液；其次是將具鞘微鞘藻置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)并制得具鞘微鞘藻粉；最后從具鞘微鞘藻粉中提取具鞘微鞘藻藻藍(lán)蛋白并將其純化。本發(fā)明所用方法易行、操作方便、安全可靠、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量好，且所用設(shè)備簡(jiǎn)單適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101220080SQ20081004677
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者劉永定, 沈銀武, 王焰新, 胡春香, 謝作明 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)