專利名稱：一種從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景纖細席藻是一種廣泛分布于荒漠生境的絲狀藍藻，它屬于藍藻門、藍藻綱、 段殖體目、顫藻科、席藻屬。目前，對纖細席藻的利用一般只停留在進行人工藻 結(jié)皮上，對纖細席藻的其他應(yīng)用開發(fā)幾乎還是一片空白。纖細席藻之所以用于形 成人工藻結(jié)皮進行荒漠治理，主要的是由于其富含藻藍蛋白。藻膽蛋白是存在于 某些藻類(主要是紅藻和藍藻)藻膽體中的一類色素復(fù)合蛋白。藻膽蛋白具有強烈 的熒光性，發(fā)橙紅色熒光，而其本身則呈紅色、紫色或藍色等，故為有色多肽。 按光譜特性可把藻膽蛋白分成四類藻紅蛋白，藻藍蛋白，藻紅藍蛋白和別藻藍 蛋白。藻藍蛋白是其中的一類藍色色素蛋白。藻藍蛋白除可用于植物光合作用研 究外，還具有很高的應(yīng)用開發(fā)價值可作為純天然的色素，用于食品、化妝品和 染料等工業(yè)；試劑級藻藍蛋白可制成熒光試劑，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床診斷和免疫學(xué)及 生物工程等研究領(lǐng)域中；還可制成藥品用于醫(yī)療保健。目前在食品等行業(yè)中使用 的藍色素主要還是化學(xué)合成色素，而天然藍色素使用的很少，國內(nèi)的藻藍蛋白大 多是從螺旋藻和大型海藻中提取得到，它們的藻藍蛋白含量大都比纖細席藻的要 低，另外，培養(yǎng)大型海藻的成本遠比培養(yǎng)纖細席藻的成本要高。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的就是提供一種從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法包括以 下步驟A、培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉0.8 2.5g、磷酸氫二鉀0.02 0.05g、硫酸鎂0. 06 0. 09g、氯化鈣0. 02 0. 05g、檸檬酸0. 004 0. 008g、檸 檬酸鐵銨0. 004 0. 008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. 001 0. 003g、碳酸鈉0. 01 0.04g，微量元素溶液0.5 2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼 酸270 300mg、四水氯化錳170 200mg、七水硫酸鋅18 25mg、 二水鉬酸鈉 15 30mg、五水硫酸銅6 10mg，完全溶解后攪勻制得培養(yǎng)液；B、 纖細席藻的培養(yǎng)首先是一級培養(yǎng)，由纖細席藻種接入培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)時，調(diào)節(jié)氣流在1.5 3.5L.min—'，光強控制在65 85 w E. nf2. s—、溫度控制 在22 35'C，當(dāng)培養(yǎng)5 10天后，轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)；其次是二級培養(yǎng)，將一級 培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5 5L.min—'， 無菌處理，光強控制在75 95u E.nf2.^，溫度控制在22 35°C，培養(yǎng)5 10 天后轉(zhuǎn)入到三級培養(yǎng)；第三是三級培養(yǎng)，將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培 養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3 6L.mirf1，無菌處理，光強控制在70 100y E.m-2.s—'，溫度控制在22 35'C，培養(yǎng)5 10天后作為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種 源；第四是繼續(xù)培養(yǎng)，首先是小循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將三級培養(yǎng)后所得的藻種接入 小循環(huán)培養(yǎng)池，控制溫度在22 35°C，利用自然光進行光照，控制光照強度在 120 180u E.m—2.s—'，攪動培養(yǎng)基；其次是大循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將小循環(huán)培養(yǎng)池 中培養(yǎng)4 7天后的纖細席藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，小循環(huán)培養(yǎng)池與大循環(huán)培 養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為l:20 25;控制溫度在22 35'C，利用自然光進行光 照，控制光照強度在120 180y E.m-2. s-'培養(yǎng)10 20天后的纖細席藻過濾收得 纖細席藻藻漿；上述纖細席藻接種時，按每升培養(yǎng)液0. 1 0. 5g濕重的比例接入。C、 纖細席藻粉的制備將藻漿經(jīng)過離心獲得纖細席藻藻泥，然后將纖細席 藻藻泥經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到纖細席藻粉；D、 纖細席藻藻藍蛋白的抽提向纖細席藻粉中加入7 10倍重量的0.05 0.1 mol. L"， pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖溶液，充分攪勻后置于-10 -20。C下 冰凍，待凍結(jié)后取出，置于20 30'C下融溶，待其完全融溶后，再將其冰凍， 如此反復(fù)凍融3 5次，然后再3000 6000rpm下離心10 15min，收集上清液， 即為藻藍蛋白粗提液；E、 純化在冰浴條件下，在藻藍蛋白的粗提液中加入飽和度為50 70%的 硫酸銨避光鹽析20 40min，然后在3 5。C下3000 6000rpm離心15 25rain， 棄除上清液，用一倍體積的0. 05 0. lmol. L—1， pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖液 溶解沉淀物，避光透析20 30h后離心，取上清液用0. 05 0. lmol. L-1， pH值為 6. 0 8. 0的磷酸緩沖液平衡好的DEAE—52離子交換柱，并用0. 05 0. lmol. L—', pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖液和0. 1 0. 3mol. L—'的NaCl溶液洗脫，用收集藍色組分，冷凍干燥得純化的藻藍蛋白。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和卓著的效果方法易行、操作方便、經(jīng)濟快捷、安全可靠、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量好，且所用設(shè)備簡單適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施方式
提取纖細席藻藻藍蛋白的具體實施步驟如下A、 培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉1.5g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸鎂0.075g、氯化鈣 0.036g、檸檬酸0.006g、檸檬酸鐵銨0.006g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. OOlg、碳 酸鈉0.02g，微量元素溶液lml。其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼 酸286mg、四水氯化錳181mg、七水硫酸鋅22. 2mg、 二水鉬酸鈉25. 2mg、五水 硫酸銅7.9mg，完全溶解后攪勻。B、 纖細席藻的培養(yǎng)(1) 一級培養(yǎng)將纖細席藻種接入裝有培養(yǎng)液的三角瓶(150 200ml)中， 靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，通氣培養(yǎng)時，調(diào)節(jié)氣流大小在2.5L.mirf'，氣流經(jīng)過棉花 球進行無菌處理，光強控制在70u E.m—2.s—'，溫度控制在30'C。培養(yǎng)7 10天 后轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)。(2) 二級培養(yǎng)將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶(500 1000ml)中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在3L.mirT'，無菌處理，光強控制在 80u E.nf2.3—1，溫度控制在30。C。當(dāng)培養(yǎng)7-10天后，轉(zhuǎn)入到三級培養(yǎng)。(3) 三級培養(yǎng):將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶(5000 20000ml)中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在5L.min—'，無菌處理，光強控制在 90u E.m—2.3—1，溫度控制在30'C。當(dāng)培養(yǎng)7 10天后，便可作為繼續(xù)培養(yǎng)的接 種種源。(4) 繼續(xù)培養(yǎng)① 小循環(huán)培養(yǎng)池(1 2m3)培養(yǎng)采用三級培養(yǎng)后所得的藻種，接入小循環(huán) 培養(yǎng)池。采用玻璃溫棚控制溫度在3(TC，利用自然光進行光照，采用遮蔭網(wǎng)控 制光照強度在120 180u E. m-2. s-'，葉輪或潛水泵攪動培養(yǎng)基。② 大循環(huán)培養(yǎng)池(40 60m3)培養(yǎng)將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4 7天的纖細 席藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，小循環(huán)培養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為1:20 25，其他培養(yǎng)條件與小循環(huán)培養(yǎng)池的培養(yǎng)條件相同。C、 纖細席藻粉的制備將大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)15 20天后的纖細席藻用泵抽到過濾裝置一一振動 斜面篩上，經(jīng)過振動斜面篩后，收得纖細席藻藻漿，然后將藻漿經(jīng)過離心機離心， 獲得纖細席藻藻泥。將纖細席藻藻泥濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到纖細席藻 粉。D、 纖細席藻藻藍蛋白的抽提向纖細席藻粉中加入7 10倍重量的0.05 0. lmol.L—'， pH值為6.0-8.0 的磷酸緩沖溶液，充分攪勻。然后置于一10 一2(TC下冰凍，待凍結(jié)后取出置于 20 3(TC下融溶，待其完全融溶后，再將其冰凍。如此反復(fù)凍融3 5次，絕大 部分藻藍蛋白從偽枝藻細胞中被提取出來，然后3000 6000rpm離心10 15min。 收集上清液，即為藻藍蛋白粗提液。E、 純化在冰浴條件下，在藻藍蛋白的粗提液中加入飽和度為50 70%的硫酸銨避光 鹽析20 40min，然后在3 5。C下3000 6000rpm離心15 25min，棄除上清液， 用一倍體積的0.05 0. lmol丄—1， pH值為6.0 8.0的磷酸緩沖液溶解沉淀物，避 光透析20 30h后離心，取上清液用0.05 0. lmol.L-1， pH值為6. 0 8. O的磷酸緩 沖液平衡好的DEAE—52離子交換柱，并用0.05 0. lmol.L—'， pH值為6. 0 8. 0的 磷酸緩沖液和O. 1 0.3mol.L"的NaCl溶液洗脫，用自動部分收集器收集藍色組 分，冷凍干燥得純化的藻藍蛋白。
權(quán)利要求
1.一種從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟A、培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉0.8～2.5g、磷酸氫二鉀0.02～0.05g、硫酸鎂0.06～0.09g、氯化鈣0.02～0.05g、檸檬酸0.004～0.008g、檸檬酸鐵銨0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.001～0.003g、碳酸鈉0.01～0.04g，微量元素溶液0.5～2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼酸270～300mg、四水氯化錳170～200mg、七水硫酸鋅18～25mg、二水鉬酸鈉15～30mg、五水硫酸銅6～10mg，完全溶解后攪勻制得培養(yǎng)液；B、纖細席藻的培養(yǎng)首先是一級培養(yǎng)，由纖細席藻種接入培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)時，調(diào)節(jié)氣流在1.5～3.5L.min-1，光強控制在65～85μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，當(dāng)培養(yǎng)5～10天后，轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)；其次是二級培養(yǎng)，將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5～5L.min-1，無菌處理，光強控制在75～95μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后轉(zhuǎn)入到三級培養(yǎng)；第三是三級培養(yǎng)，將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3～6L.min-1，無菌處理，光強控制在70～100μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后作為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源；第四是繼續(xù)培養(yǎng)，首先是小循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將三級培養(yǎng)后所得的藻種接入小循環(huán)培養(yǎng)池，控制溫度在22～35℃，利用自然光進行光照，控制光照強度在120～180μE.m-2.s-1，攪動培養(yǎng)基；其次是大循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4～7天后的纖細席藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，將大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)10～20天后的纖細席藻過濾收得纖細席藻藻漿；C、纖細席藻粉的制備將藻漿經(jīng)過離心獲得纖細席藻藻泥，將纖細席藻藻泥經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到纖細席藻粉；D、纖細席藻藻藍蛋白的抽提向纖細席藻粉中加入7～10倍重量的0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖溶液，充分攪勻后置于-10～-20℃下冰凍，待凍結(jié)后取出，置于20～30℃下融溶，待其完全融溶后，再將其冰凍，如此反復(fù)凍融3～5次，然后再3000～6000rpm下離心10～15min，收集上清液，即為藻藍蛋白粗提液；E、純化在冰浴條件下，在藻藍蛋白的粗提液中加入飽和度為50～70％的硫酸銨避光鹽析20～40min，然后在3～5℃下3000～6000rpm離心15～25min，棄除上清液，用一倍體積的0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液溶解沉淀物，避光透析20～30h后離心，取上清液用0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液平衡好的DEAE-52離子交換柱，并用0.05～0.1mol.L-1，pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液和0.1～0.3mol.L-1的NaCl溶液洗脫，用收集藍色組分，冷凍干燥得純化的藻藍蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法，其特征在于小循環(huán) 培養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為1:20 25。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從纖細席藻中提取藻藍蛋白的方法，首先是將硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉，微量元素溶液按比例配制成纖細席藻培養(yǎng)液；然后將纖細席藻置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)并制取纖細席藻粉；最后從纖細席藻粉中提取纖細席藻藻藍蛋白并將其純化。本發(fā)明所用方法易行、操作方便、安全可靠、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量好，且所用設(shè)備簡單適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/14GK101235075SQ200810046768
公開日2008年8月6日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者劉永定, 沈銀武, 王焰新, 胡春香, 謝作明 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)