專利名稱：姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫調(diào)節(jié)肽在其生理濃度、有鹽和血清存在的條件下具有廣泛的生物學(xué)活 性，包括在先天性免疫細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞)中與炎癥反應(yīng)、先天性免 疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的活性，在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中作為先天性免疫和適應(yīng)性免疫的溝通橋梁?？咕目梢灾泻虶—菌脂多糖、G+菌脂磷壁酸和細(xì) 菌未甲基化CpG DNA等細(xì)菌信號分子。這些信號分子可以與宿主細(xì)胞表面Toll 樣受體結(jié)合，啟動信號級聯(lián)放大和細(xì)胞因子(如TNF-a、 IL-6等)正調(diào)節(jié)。低 濃度細(xì)菌信號分子可引發(fā)機(jī)體有益的炎癥反應(yīng)和發(fā)熱，但是如果反應(yīng)劇烈或持續(xù) 時間延長，可以導(dǎo)致全身循環(huán)障礙、器官衰竭，甚至死亡?？咕目梢种浦嗵?與血清脂多糖結(jié)合蛋白因子結(jié)合，防止內(nèi)毒素血癥和死亡。免疫調(diào)節(jié)肽還參與宿 主天然免疫的其他反應(yīng)，比如.，通過有絲分裂原激活的蛋白激酶信號通路或是其 它信號通路提高單核趨化蛋白的水平來刺激單核細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的趨化作 用、促進(jìn)肥大細(xì)胞組織胺的釋放、抑制組織蛋白酶以及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。細(xì)胞因子是一類主要由免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的高活性、多功能小分子蛋 白質(zhì)。細(xì)胞因子的產(chǎn)生細(xì)胞非常廣泛，除淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生多種 細(xì)胞因子外，粘膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞也能產(chǎn)生。 通常休止期細(xì)胞不產(chǎn)生或僅自發(fā)產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，當(dāng)受抗原、絲裂原或其他 激活劑激活后可大量產(chǎn)生一定種類的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子通過與耙細(xì)胞表面的相 應(yīng)受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)功能。由于細(xì)胞因子與其受體間具有很高的親和力，因 此極微量細(xì)胞因子就能產(chǎn)生明顯的生物學(xué)效應(yīng)。一般根據(jù)細(xì)胞因子的名稱和生物 學(xué)活性可分為主要起免疫調(diào)節(jié)作用的白細(xì)胞介素、有抗病毒作用的干擾素、能刺 激骨髓造血前體細(xì)胞生長和分化的集落刺激因子、有一定抗腫瘤活性并有明顯炎 癥介質(zhì)作用的腫瘤壞死因子、能刺激細(xì)胞生長的生長因子以及對免疫細(xì)胞有趨化 作用的趨化性細(xì)胞因子等六類。細(xì)胞因子的異常表達(dá)，常與臨床上許多疾病的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)。 一方面， 細(xì)胞因子表達(dá)過高、過低或缺陷，均會導(dǎo)致與機(jī)體免疫有關(guān)疾病的發(fā)生；另一方 面，伴隨著臨床上許多疾病進(jìn)程，某些細(xì)胞因子的表達(dá)量也會出現(xiàn)明顯的變化。虻科昆蟲俗稱牛虻，屬于吸血節(jié)肢動物，其寄生成功的關(guān)鍵是通過產(chǎn)生特異 唾液拮抗劑來影響宿主免疫反應(yīng)。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，這些物質(zhì)存在顯著的生 化和藥理學(xué)多樣性，其天然多樣性用在藥物治療和生化研究中將有很好前景，同 時也對于擴(kuò)展我們對宿主保護(hù)機(jī)制性機(jī)制的理解以及對唾液產(chǎn)品和先天性免疫 間作用的研究。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)和理論基礎(chǔ)，提供一種具有免疫調(diào)節(jié)活性，如 抑制腫瘤壞死因子(TNF-a )、單核趨化蛋白一1(MCP-1)、白細(xì)胞介素一2(IL-2)、 白細(xì)胞介素一8 (IL-8)和白細(xì)胞介素一IO (IL-10)的姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)多肽 及其基因和應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)多肽姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽是中國虻科昆蟲唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因編碼的一種線狀多肽，其全序列為甘氨酸一甘氨酸一纈氨酸一絲氨酸一甘氨酸一纈氨酸一絲氨酸一天冬氨酸一苯丙氨酸一谷氨酸一脯氨酸一異亮氨酸一谷氨酸一纈氨酸 一絲氨酸一甘氨酸一谷氨酸一天冬氨酸一酪氨酸-天冬酰胺一絲氨酸一天冬氨 酸_谷氨酸一丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸一天冬氨酸-甘氨酸_賴氨酸_丙氨 酸姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因的克隆包括姚虻唾液腺總RNA提取，mRNA純 化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選免疫調(diào)節(jié)肽基 因。擴(kuò)增引物長度為25個核苷酸，其序列為5 ' CTCATTGTGGGACTGTTTACATCAT 3， ， PCR另一擴(kuò)增引物為CL0NTECH公司SMART TM cDNA Library Construction Kit中的3 ， PCR Primer引物，其序列為5' ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。 所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定。基因測序結(jié)果表明編碼姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)多肽的基因由362個核苷酸組 成，自5'端至3'端序列為atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg aaaaggaggc 120 ■gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240 atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 attgagtaat gatatggaaa aatatatgca aattaaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 3a 362編碼姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽為第115 — 204位核苷酸，其氨基酸序列為 Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro He Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr 15 10 15Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala 20 25 30本發(fā)明的有益效果在于由姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié) 構(gòu)，合成的姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽具有顯著的抑制腫瘤壞死因子(TNF-a)、單核趨化蛋白1 (MCP-1)、白細(xì)胞介素8 (IL-8)、白細(xì)胞介素10 (IL-10)、白細(xì) 胞介素2 (IL-2)的作用。該多肽能夠抑制多種細(xì)胞因子，能從姚虻唾液腺產(chǎn)品 和先天性免疫之間的關(guān)系角度揭示吸血節(jié)肢動物寄生的機(jī)制。具有結(jié)構(gòu)簡單、人 工合成方便、抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)。


第一效蒸發(fā)器的管程，殼程用蒸汽加熱，第一效蒸發(fā)于常壓下蒸發(fā)，蒸發(fā)出的肼和水的混和 蒸汽進(jìn)入第二效蒸發(fā)器的殼程作為熱源，冷凝后的水合肼溶液進(jìn)入水合肼貯槽，第二效蒸發(fā) 器是在真空下蒸餾的，真空度最好為0.04-0.09Mpa，蒸汽冷凝后進(jìn)入水合肼貯槽。列管式蒸 發(fā)器全部采用降膜式操作，可以有效防止結(jié)晶的鹽堵塞管道。經(jīng)過蒸發(fā)后的溶液控制含鹽量 40-60%,進(jìn)入犁刀式蒸發(fā)器中。多效列管式蒸發(fā)器蒸發(fā)后的溶液含鹽量不能太高，否則容易 堵塞蒸發(fā)器，控制較低的含鹽量雖可防止結(jié)晶出大量氯化鈉，但蒸發(fā)效率降低。進(jìn)入犁刀式蒸發(fā)器含鹽量40-60%的水合肼溶液，在犁刀攪拌下，控制蒸發(fā)溫度110-140 °C，直至水合肼蒸發(fā)完畢，蒸出的蒸汽進(jìn)入列管式多效蒸發(fā)器第二效的殼程做為熱源。由于 犁刀式蒸發(fā)器的攪拌較強(qiáng)，攪拌無死角，鹽堿蒸發(fā)后得到粉末狀的產(chǎn)品，不會堵塞出料口， 主要成分為含少量結(jié)晶水的碳酸鈉、氯化鈉和氫氧化鈉。所述銨鹽母液成分主要為氯化銨或硫酸銨，其中含極少量的聯(lián)二脲縮合過程中未反應(yīng)完 全的水合肼，可以添加少量次氯酸鈉或雙氧水，將其中的水合肼進(jìn)行氧化處理，得到無鹽、 無水合肼的純氯化銨或硫酸銨溶液，然后通過多效蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮或進(jìn)入曬鹽池自然蒸發(fā)， 結(jié)晶得到氯化銨或硫酸銨，分離后做為氮肥或化工原料。傳統(tǒng)的堿式碳酸鋅的制備方法是采用硫酸鋅溶液加入加入碳酸氫銨，在70。C以上碳化， 脫二氧化碳后生成，或硫酸鋅直接與碳酸鈉加熱反應(yīng)制成。傳統(tǒng)堿式碳酸鎂的制備則采用氯 化鎂溶液和碳酸鈉在一定溫度下反應(yīng)直接生成。本發(fā)明以生產(chǎn)水合肼蒸餾后副產(chǎn)鹽堿做為原料生產(chǎn)堿式碳酸鋅或堿式碳酸鎂。將犁刀式 蒸發(fā)器中放出的鹽和堿重新溶解，配制成20%-40%水溶液，然后邊攪拌邊加入氯化鎂溶液、 鋅的硫酸鹽或氯化物溶液，在0-5(TC下，攪拌反應(yīng)生成堿式碳酸鎂或堿式碳酸鋅沉淀，反應(yīng) 過程不需要傳統(tǒng)制備過程的高溫下碳化水解，過濾洗滌后得到堿式碳酸鎂或堿式碳酸鋅。可 以根據(jù)副產(chǎn)鹽堿中氫氧化鈉含量來補(bǔ)加適量的氫氧化鈉，使合成工藝和產(chǎn)品質(zhì)量更為穩(wěn)定。 由于副產(chǎn)鹽堿中本身含有氫氧化鈉，因此無需加熱至較高溫度進(jìn)行碳化水解，常溫或較低溫 度下即可生成堿式碳酸鹽，節(jié)省了能耗。另外由于不需要加熱碳化水解過程，因此可以大大 縮短反應(yīng)時間，提高反應(yīng)效率。與氯化鎂或氯化鋅反應(yīng)生成堿式碳酸鎂或堿式碳酸鋅，過濾分離掉其中的堿式碳酸鹽，(3)制備化合物3 [W-托利洛爾] 將化合物2 (2.3g， O.Olmol)和異丙胺(17mL， 0.20mol)溶于34mL DMF 中，60 70"C反應(yīng)6小時，反應(yīng)完畢,先常壓回收異丙胺，再減壓回收DMF,加入 60mL 1M的NaOH溶液溶解，乙酸乙酯(50mLx3)萃取，合并有機(jī)層，無水 Na2S04干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，石油醚重結(jié)晶得白色固體^^-托利洛爾 1.83g，收率82.1%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下mp 53-55 °C; [a]D20=+9.9(c 1.0, EtOH); iHNMR(400MHz， CDC13) S(ppm): 1.09(d, J=6.4, 6H,(CH3)2), 2.31(s, 3H,CH3), 2.72-2.75 (m， 1H，CH)， 2.78-2.90 (m,2H,CH2NH), 3.96-4.03(m,3H,ArOCH ，CH), 6.70-7.18(m,4H, ArH) 。 IR (KBr)cm":3430， 3306， 2924， 2874， 1680， 1581， 1470， 1383， 1291， 1255， 895， 766， 687。 CI-MS: 224(M+1)。實(shí)施例2:(1) 制備化合物1 [rW-3-間甲苯氧基-l，2-丙二醇]將間甲酚(10.8g， O.lmol)溶于120mL無水甲醇中，室溫下分批加入氫氧 化鈉(8.0g， 0.2mol)，再加入相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基溴化銨(0.16g， 0.5mmol)， 滴加(7 」-3-氯-l,2-丙二醇(25.4g， 0.23mol)，滴畢，55 60。C反應(yīng)10小時，反應(yīng) 完畢，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，無水乙醇和四氯化碳(V:V=5:95)重結(jié)晶得 白色固體(7 」-3-間甲苯氧基-l,2-丙二醇14.9g，收率81.6%， mp 60-62°C ， [a]D2()=-9.3(;c l.O，EtOH)。(2) 制備化合物2 [ "J-4-間甲苯氧甲基-1,3,2-二氧硫戊環(huán)-2-氧化物] 將化合物l (9.1g， 0.05mol)溶于70mL二氯甲烷中，控溫-15 -10。C滴加氯化亞砜(8.8g， 0.074mol)和lOmL二氯甲烷的混合溶液，滴畢，控溫5 1(TC 反應(yīng)約1.5小時，反應(yīng)完畢后，緩慢加入60mL水,分層，二氯甲烷(50mLx3)萃 取，合并有機(jī)層，水(60mLx2)洗有機(jī)層，無水Na2S04干燥，過濾，減壓濃 縮得淺黃色液體(5J-4-間甲苯氧甲基-1，3,2-二氧硫戊環(huán)-2-氧化物10.9g，收率 95.3%，氣相色譜含量含量97.3%， [a]D2Q=-47.2(cl.0,EtOH)。 G)制備化合物3 [(7 >托利洛爾] 將化合物2 (2.3g， O.Olmol)和異丙胺(85mL， l.Omol)溶于34mL乙腈中， 50 60。C反應(yīng)10小時，反應(yīng)完畢,先常壓回收異丙胺，再減壓回收乙腈，加入 60mL 2M的NaOH溶液溶解，乙酸乙酯(50mLx3)萃取，合并有機(jī)層，無水 Na2S04干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，甲苯重結(jié)晶得白色固體(7 >托利洛爾 1.86g，收率83.4%， mp53畫55。C; [a]D20=+9.9(c 1.0, EtOH)。7. 16,000 g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。D. 大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 挑取單個DH5a菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 。C 培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例l:100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中， 37。C振蕩2小時。當(dāng)OD,值達(dá)到O. 35時，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。2. 將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、 一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙 烯管中，在冰上方置10min，使培養(yǎng)物冷卻至(TC。3. 于4。C以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。4. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置l min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。5. 每50ml初始培養(yǎng)液且30ml預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液 (80mmol/L MgCl2, 20誦ol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。6. 于4。C以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。7. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置l min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。8. 每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份 細(xì)胞沉淀，分裝后備用。E. 酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1. 在微量離心管中力ti入1 u 1 Takara pMD18-T載體、4u 1無指盤臭蛙 cDNA雙鏈溶液，全量為5 yl。2. 加入5 Pl (等量)的連接酶緩沖混合物。3. 16'C反應(yīng)2小時。4. 全量(10 u 1)加入至100ulDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分 鐘。5. 42'C加熱90秒鐘后，再在冰中放置l分鐘。6. 加入37。C溫浴過的LB培養(yǎng)基890ul， 37。C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。7. 取200 u 1涂布于含有X-Gal、 IPTG、 Amp的LB培養(yǎng)基上37。C培養(yǎng)16 小時，形成單菌落。8. 每個LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構(gòu)建 的cDNA大約含l X 106個單獨(dú)克隆。IV、姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因克隆篩選擴(kuò)增引物長度為25個核苷酸，其序列為5' CTCATTGTGGGACTGTTTACATCAT 3， ， PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART cDNA Library Construction Kit中的3 ， PCR Primer引物，其序列為5' ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3'。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行94 °C 30秒鐘，56°C 3 0秒鐘和72 °C 60 秒鐘，30個循環(huán)。首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含IOOU g/inl氨芐青霉素的LB培養(yǎng) 基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個細(xì)菌/毫升，和30個細(xì)菌/毫升分別用于 首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8X8矩陣鋪板(共64孔，每孔100 "I), 37 'C過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個樣品進(jìn)行PCR 鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。V、姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因序列測定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBEST Sequencing Primer RV-M禾卩BcaBEST Sequencing Primer M13-47, BcaBEST Sequencing Primer RV-M序列5、 GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3' ， BcaBEST Sequencing Primer M13-47: 5， CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，。基因測序結(jié)果自5'端 至3'端序列為atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60 tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg犯aaggaggc 120 gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcgaagacta taacagtgat 180 gaagcggacg aagacggaaa agcgtaattc taccaccttt aacccat肌c agcaaagcca 240 atgaagcaga gtgcaattta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 300 3ttg3gt犯t gat3tgg犯3 aatatatgca犯tta犯caa 3a^aaaa犯a aaaa^aaaaa 360 — . 362姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因核苷酸的序列表為序列長度為362個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類cDNA，來源姚虻 唾液腺。編碼姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽為第115 — 204位核苷酸，其氨基酸序列為 Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro lie Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr 15 10 15Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala 20 25 30姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因作為基因工程制備姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽的應(yīng)用。實(shí)施例二制備姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽I 、姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法根據(jù)編碼姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽的 基因推斷姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序 列。通過HPLC反相ds柱層析脫鹽、純化。II、分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS )，以甘油間硝基芐醇二甲亞砜(1:1:1， V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為lyA,發(fā)射電壓為25Kv。III、純化的姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度， 分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測 序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。實(shí)施例三姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽的藥理實(shí)驗(yàn)1、 姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽對腫瘤壞死因子(TNF-a )抑制的作用(圖1): 大鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備和培養(yǎng):'大鼠斷頸椎處死，無菌取出脾臟并剝離脂肪組織，在RPMI1640培養(yǎng)基中沖掉血跡，無菌剪碎脾臟后轉(zhuǎn)移至200目銅網(wǎng)，并用2ml 注射器芯將脾臟研磨分散成單個細(xì)胞。1000rpm/min離心10分鐘，棄上清，將 沉淀懸浮于含10%胎牛血清、2ug/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培養(yǎng)基， 調(diào)整細(xì)胞濃度至2Xl(^個/ml。于96孔板的每個孔中加入細(xì)胞懸液196ul，并加 入濃度為lmg/ml的牛虻免疫調(diào)節(jié)肽4ul，使之終濃度達(dá)20ug/ml,設(shè)2個重復(fù)孔； 同時設(shè)置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫調(diào)節(jié)肽的細(xì)胞作為對照，設(shè) 2個重復(fù)？L. 37°C， 5%0)2及飽和濕度下培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1. 5ml 離心管中，2000rpm/min離心10min，保留上清，并保存于一20°C，用于細(xì)胞因子 的檢測。將保存于一2(TC，用于TNF-a檢測的細(xì)胞上清加入ELISA試劑盒的空 白微孔中50ul/孔，設(shè)2個重復(fù)孔；根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，在樣品孔中 加入10ul的生物素標(biāo)記液；在樣品孔中加入50ul的酶標(biāo)記溶液；37'C孵育反應(yīng) 60分鐘；洗滌液5次，每次靜置10—20秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37 。C下避光孵育反應(yīng)15分鐘；每孔加入50ul終止液，終止反應(yīng)；于波長450nm 的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值;'以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪 制曲線圖；根據(jù)樣品的OD值查找對應(yīng)的濃度范圍，2個重復(fù)孔的濃度取平均值。2、 姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽對單核趨化蛋白一l (MCP-1)抑制的作用(圖2):大鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備和培養(yǎng)大鼠斷頸椎處死，無菌取出脾臟并剝離脂肪組織，在RPMI1640培養(yǎng)基中沖掉血跡，無菌剪碎脾臟后轉(zhuǎn)移至200目銅網(wǎng)，并用2ml 注射器芯將脾臟研磨分散成單個細(xì)胞。1000rpm/min離心10分鐘，棄上清，將 沉淀懸浮于含10%胎牛血清、2ug/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培養(yǎng)基， 調(diào)整細(xì)胞濃度至2X 1()S個/ml。于96孔板的每個孔中加入細(xì)胞懸液196ul，并加 入濃度為lmg/ml的牛虻免疫調(diào)節(jié)肽4ul，使之終濃度達(dá)20ug/ml,設(shè)2個重復(fù)孔； 同時設(shè)置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫調(diào)節(jié)肽的細(xì)胞作為對照，設(shè) 2個重復(fù)？L. 37°C， 5%(;02及飽和濕度下培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1. 5ml 離心管中，2000rpm/min離心10min，保留上清，并保存于一20。C，用于細(xì)胞因子 的檢測。將保存于—20。C，用于MCP-1檢測的細(xì)胞上清加入ELISA試劑盒的空 白微孔中50ul/孔，設(shè)2個重復(fù)孔；根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，在樣品孔中 加入10ul的生物素標(biāo)記液；在樣品孔中加入100ul的酶標(biāo)記溶液；37"C孵育反應(yīng) 60分鐘；洗滌液5次，每次靜置10 — 20秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37 'C下避光孵育反應(yīng)15分鐘；每孔加入50ul終止液，終止反應(yīng)；于波長450nm 的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪 制曲線圖；根據(jù)樣品的OD值查找對應(yīng)的濃度范圍，2個重復(fù)孔的濃度取平均值。3、 姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽對白細(xì)胞介素一8(IL-8)抑制的作用(圖3): 大鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備和培養(yǎng)大鼠斷頸椎處死，無菌取出脾臟并剝離脂肪組織,在RPMI1640培養(yǎng)基中沖掉血跡，無菌剪碎脾臟后轉(zhuǎn)移至200目銅網(wǎng)，并用2ml 注射器芯將脾臟研磨分散成單個細(xì)胞。1000rpm/min離心10分鐘，棄上清，將 沉淀懸浮于含10%胎牛血清、2ug/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)的RPMI1640培養(yǎng)基， 調(diào)整細(xì)胞濃度至2Xl()S個/ml。于96孔板的每個孔中加入細(xì)胞懸液196ul，并加 入濃度為lmg/ml的牛虻免疫調(diào)節(jié)肽4ul，使之終濃度達(dá)20ug/ml,設(shè)2個重復(fù)孔； 同時設(shè)置用LPS或者不用LPS刺激，不加牛虻免疫調(diào)節(jié)肽的細(xì)胞作為對照，設(shè) 2個重復(fù)？L. 37°C， 5%0)2及飽和濕度下培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1. 5ml 離心管中，2000rpm/min離心10min，保留上清，并保存于一20。C，用于細(xì)胞因子 的檢測。將保存于一2(TC，用于IL-8檢測的細(xì)胞上清加入ELISA試劑盒的空白 微孔中100ul/孔，設(shè)2個重復(fù)孔；根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，在樣品孔中 加入50ul的酶標(biāo)記溶液；37'C孵育反應(yīng)60分鐘；洗滌液5次，每次靜置10 — 20 秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37'C下避光孵育反應(yīng)15分鐘；每孔加入50ul 終止液，終止反應(yīng)；于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的0D值；以O(shè)D值為縱坐 標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖；根據(jù)樣品的OD值査找對應(yīng)的濃度 范圍，2個重復(fù)孔的濃度取平均值。4、 姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽對白細(xì)胞介素一10(IL-10)抑制的作用(圖4): 大鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備和培養(yǎng)大鼠斷頸椎處死，無菌取出脾臟并剝離脂肪組織，在RPMI1640培養(yǎng)基中沖掉血跡，無菌剪碎脾臟后轉(zhuǎn)移至200目銅網(wǎng)，并用2ml 注射器芯將脾臟研磨分散成單個細(xì)胞。1000rpm/min離心10分鐘，棄上清，將 沉淀懸浮于含10%胎牛血清、5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培養(yǎng) 基，調(diào)整細(xì)胞濃度至2Xl(^個/ml。于96孔板的每個孔中加入細(xì)胞懸液196ul， 并加入濃度為lmg/ml的牛虻免疫調(diào)節(jié)肽4ul，使之終濃度達(dá)20ug/ml，設(shè)2個重復(fù) 孔；同時設(shè)置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫調(diào)節(jié)肽的細(xì)胞作為對 照，設(shè)2個重復(fù)孔.37'C， 5%0)2及飽和濕度下培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于 1.5ml離心管中，2000rpm/min離心10min,保留上清，并保存于一20。C，用于細(xì) 胞因子的檢測。將保存于一2(TC，用于IL-10檢測的細(xì)胞上清加入ELISA試劑 盒的空白微孔中50ul/孔，設(shè)2個重復(fù)孔；根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，在樣 品孔中加入10ul的生物素標(biāo)記液；在樣品孔中加入50ul的酶標(biāo)記溶液；37'C孵 育反應(yīng)60分鐘；洗滌液5次，每次靜置10 — 20秒；每孔加入底物A、B液各50ul; 37'C下避光孵育反應(yīng)15分鐘；每孔加入50ul終止液，終止反應(yīng)；于波長450nm 的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪 制曲線圖；根據(jù)樣品的OD值查找對應(yīng)的濃度范圍，2個重復(fù)孔的濃度取平均值。5、 姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽對白細(xì)胞介素一2(IL-2)抑制的作用(圖5):大鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備和培養(yǎng)大鼠斷頸椎處死，無菌取出脾臟并剝離脂肪組織，在RPMI1640培養(yǎng)基中沖掉血跡，無菌剪碎脾臟后轉(zhuǎn)移至200目銅網(wǎng)，并用2ml 注射器芯將脾臟研磨分散成單個細(xì)胞。1000rpm/min離心10分鐘，棄上清，將 沉淀懸浮于含10%胎牛血清、5ug/ml伴刀豆球蛋白(ConA)的RPMI1640培養(yǎng) 基，調(diào)整細(xì)胞濃度至2Xl(^個/ml。于96孔板的每個孔中加入細(xì)胞懸液196ul， 并加入濃度為lmg/ml的牛虻免疫調(diào)節(jié)肽4nl，使之終濃度達(dá)20ug/ml,設(shè)2個重復(fù) 孔；同時設(shè)置用ConA或者不用ConA刺激，不加牛虻免疫調(diào)節(jié)肽的細(xì)胞作為對照，設(shè)2個重復(fù)孔.37'C， 5%(:02及飽和濕度下培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于 1.5ml離心管中，2000rpm/min離心10min，保留上清，并保存于一20。C，用于細(xì) 胞因子的檢測。將保存于一20'C，用于IL-2檢測的細(xì)胞上清加入ELISA試劑盒 的空白微孔中100ul/ L,設(shè)2個重復(fù)孔；根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，在樣 品孔中加入50ul的酶標(biāo)記溶液；37'C孵育反應(yīng)60分鐘；洗滌液5次，每次靜置 10 — 20秒；每孔加入底物A、 B液各50ul; 37'C下避光孵育反應(yīng)15分鐘；每孔 加入50ul終止液，終止反應(yīng)；于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的0D值；以 OD值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖；根據(jù)樣品的OD值査找 對應(yīng)的濃度范圍，2個重復(fù)孔的濃度取平均值。姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽及其基因和應(yīng)用-ST25 SEQUENCE LISTING<110〉中國科學(xué)院昆明動物研究所<120〉姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽及其基因和應(yīng)用<130> 1<160〉 2<170〉 Patentln version 3.4<210〉 1<211〉 362<212〉 腿<213〉 Tabacus yao Macquart<400> 1atgttgttaaaaagt ucgttttctttmUgagcctgctcattgtgggactgt tUca60tcatgtgatgcggatgcccaatatgaggatctcgtcacaggcUUUcg謹(jǐn)aggaggc120gtUgtggagttagtgactttgaacccatcgaggtctctggcgaagactataacagtgat180gaagcggacgaagacggaaaagcgtaattctaccacctttaacccataacagcaaagcca240atgaagcagagtgcaattUgtttgaaugttttatgtatttcatatggc300at tgagUatgatatggaaaaatatatgcaaat Uaacaaaaemaaaaaaaaaaaaaaa360362<210> 2 <211〉 30 <212> PRT<213〉 Tabacus yao Macquart <400> 2Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro lie Glu Val Ser Gly 15 10 15Glu Asp Tyr Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala 20 25 30
權(quán)利要求
1.姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)肽是中國虻科昆蟲唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因編碼的一種線狀多肽，其全序列為甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-賴氨酸-丙氨酸。
2. 姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因核苷酸序列，其特征在于免疫調(diào)節(jié)肽基因由362個核苷酸組成，其自S'端至3'端序列為atgttgttaa aaagttacgt tttcttttta ttgagcctgc tcattgtggg actgtttaca 60tcatgtgatg cggatgccca atatgaggat ctcgtcacag gctatttacg a犯aggaggc 120gttagtggag ttagtgactt tgaacccatc gaggtctctg gcg犯gacta taacagtgat 180gaagcggacg犯gacggaaa agcgt犯ttc taccaccttt aacccataac agcaaagcca 240atgaagcaga gtgc犯ttta gtttgaatag ttttatgtat aatcccacca ttcatatggc 3003ttg3gtaat g3t3tgg犯3犯tatatgc3犯tta^acaa朋aa肌犯aa aaa犯aaaaa 360犯o
3. 權(quán)利要求2所述的姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因核苷酸序列，其特征在于， 編碼姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽為第115-204位核苷酸，其氨基酸序列為Gly Gly Val Ser Gly Val Ser Asp Phe Glu Pro lie Glu Val Ser Gly Glu Asp Tyr15 10 15Asn Ser Asp Glu Ala Asp Glu Asp Gly Lys Ala20 25 ' 30
4.權(quán)利要求1所述的姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)肽作為抑制腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細(xì)胞介素2 (IL-2)、白細(xì)胞介素8 (IL-8)、 單核趨化蛋白l (MCP-1)、白細(xì)胞介素IO (IL-10)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該免疫調(diào)節(jié)肽是中國虻科昆蟲唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽基因編碼的一種線狀多肽，其全序列為甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-賴氨酸-丙氨酸。免疫調(diào)節(jié)肽基因由362個核苷酸組成，其中編碼成熟編碼姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽為第115-204位核苷酸。該姚虻唾液腺免疫調(diào)節(jié)肽作為抑制多種細(xì)胞因子的應(yīng)用。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)。
文檔編號C07K14/435GK101220091SQ20081005807
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者徐學(xué)清, 李東升, 靜 武, 仞 賴, 馬冬瑩 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所