專利名稱：：一種從鼠腦組織中獲得小分子rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中提取RNA的方法，主要是一種從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法。
背景技術(shù)：
：小分子RNA近年來己成為RNA研究的熱點(diǎn)，已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道小分子RNA參與了生物體中重要生命活動(dòng)的調(diào)控。小分子RNA的有效富集是研究小分子RNA的前提條件，由于小分子RNA在總RNA中所占比例較低(約5%-10%左右)加上傳統(tǒng)的RNA提取方法的局限性，故小分子RNA的得率很低。microRNA是具有代表性的小分子RNA，它是一類長約22nt具有調(diào)節(jié)功能的非編碼小分子RNA，它參與了發(fā)育時(shí)序、細(xì)胞增殖與死亡以及腫瘤發(fā)生的調(diào)控，在生物體的分化、增殖、發(fā)育以及凋亡過程中具有重要作用。目前，常用的RNA提取方法有TriZol試劑快速提取法、十二烷基磺酸鈉-醋酸鉀法、苯酚法、異硫氰酸肌法、十六烷基三甲基溴化銨法、氯化鋰法等。所有這些方法都是針對(duì)一般的總RNA提取建立的，沒有考慮到小分子RNA富集的特殊需要，所以以這些提取方法獲得的總RNA中的小分子RNA的含量極低，不足以滿足小分子RNA研究的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)的缺陷，而提供一種從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。這種從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，包括以下步驟1)研磨取50mg小鼠腦組織，加入lmlEzol，用勻漿器研磨至勻槳，于室溫放置10min;2)去不溶物4°C，12000xg,離心10min;將上清轉(zhuǎn)入無核糖核酸酶的1.5ml離心管；3)氯仿抽提每管加入200-250pi氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5min;4)4°C，12000xg，離心15min;取上清至新的無RNase的1.5ml離心管中；5)異丙醇沉淀加入1ml-2ml異丙醇，混勻，-15°〇至-20°"沉淀12h;6)4°C,12000xg，離心10min;棄上清；7)加入lml預(yù)冷的75。/。乙醇，洗滌沉淀；4°C，7500xg，離心5min;8)棄上清，真空干燥，沉淀溶于30nl焦碳酸二乙酯處理水DEPC-H20中；9)NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的含量及純度，甲醛變性膠檢測(cè)總RNA的完整性；10)YM-lOO柱子中加入O.lMEDTA150nl潤洗，4°C，5000xg，離心6min;按5pg上樣量取出相應(yīng)樣品的體積，與150nl0.1MEDTA混合均勻后轉(zhuǎn)移到Y(jié)]VMt)O睡子中"4li，5000xg，離心6min。過柱所得即小分子RNA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，其特征在于在步驟3)中，加入的氯仿用暈為250nl氯仿/1mlEzol。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，其特征在于在步聚5)中異丙醇沉淀?xiàng)l件是異丙醇的量為ltnl，沉淀的溫度為-2(TC，沉淀的時(shí)間為12h。本發(fā)明的有益效果結(jié)果可用RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)小分子RNA來改方法有效獲得了小分子RNA。過于短小的RNA分子可用特異性的莖環(huán)引物來作為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的引物，該技術(shù)在miRNA擴(kuò)增效率方面比傳統(tǒng)方法高100多倍。該方法可用分離得到的小分子RNA也可直接用總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板。圖1為用本發(fā)明的方法提取的小鼠腦組織總RNA的電泳圖譜圖2為從用本發(fā)明的方法提取的總RNA中分離獲得的小分子RNA的檢測(cè)結(jié)果其中，圖l中l(wèi)。/。瓊脂糖MOPS電泳，60V,40min;圖2中2%瓊脂糖，lxTAE緩沖液，70v，45min。具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述這種從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，包括以下步驟1)取兩份50mg左右小鼠腦組織，各加入1mlEzol，用勻漿器研磨至勻漿，分別標(biāo)記為MB1、MB2;于室溫放置10min;2)4°C，12000xg，離心10min;將上清轉(zhuǎn)入無核糖核酸酶(RNase)的1.5ml離心管；3)每管加入250^氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5min;4)4°C，12000xg，離心15min;取上清至新的無RNase的1.5ml離心管中；5)加入lml異丙醇，混勻，.2(TC沉淀12h;6)4'C，12000xg,離心10min;棄上清；7)加入1ml預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀；4'C，7500xg,離心5niin;8)棄上清，真空干燥，沉淀溶于30nlDEPC-H2O中；9)NanoDrop分光光度計(jì)(ND-1000)檢測(cè)總RNA的含量及純度，甲醛變性膠檢測(cè)總RNA的完整性。結(jié)果如表l、圖l所示。10)YM-100柱子中加入0.1MEDTA150pl潤洗，4'C，5000xg，離心6min;按5嗎上樣量取出相應(yīng)樣品的體積，與150^0.1MEDTA混合均勻后轉(zhuǎn)移到Y(jié)M-100柱子中，4'C，5000xg，離心6min。過柱所得即小分子RNA。RT-CR檢測(cè)MicroRNA(以miR-let-7a為例)1)用YM-100分離得到的小分子RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>ddH206.82'nl總體積為10pl，混勻后稍離心在PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3)反應(yīng)結(jié)束后取3nl反應(yīng)液，進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖2所示。從表1可以看出用本發(fā)明的方法提取的總RNA含量高、純度好，電泳結(jié)果(圖1)顯示提取的總RNA完整性好。圖2中mbl、mb2所示分別為從樣品MB1、MB2的總RNA分離得到的小分子RNA中以miR-let7a為檢測(cè)對(duì)象的RT-PCR結(jié)果電泳圖。miR-let7a是在小鼠腦組織中普遍表達(dá)的一種microRNA，圖2說明本發(fā)明的方法有效地分離得到了小分子RNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，其特征在于包括以下步驟1)研磨取50mg小鼠腦組織，加入1mlEzol，用勻漿器研磨至勻漿，于室溫放置10min；2)去不溶物4℃，12000×g，離心10min；將上清轉(zhuǎn)入無核糖核酸酶的1.5ml離心管；3)氯仿抽提每管加入200-250μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5min；4)4℃，12000×g，離心15min；取上清至新的無RNase的1.5ml離心管中；5)異丙醇沉淀加入1ml-2ml異丙醇，混勻，-15℃至-20℃，沉淀12h；6)4℃，12000×g，離心10min；棄上清；7)加入1ml預(yù)冷的75％乙醇，洗滌沉淀；4℃，7500×g，離心5min；8)棄上清，真空干燥，沉淀溶于30μl焦碳酸二乙酯處理水DEPC-H2O中；9)NanoDrop分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的含量及純度，甲醛變性膠檢測(cè)總RNA的完整性；10)YM-100柱子中加入0.1MEDTA150μl潤洗，4℃，5000×g，離心6min；按5μg上樣量取出相應(yīng)樣品的體積，與150μl0.1MEDTA混合均勻后轉(zhuǎn)移到Y(jié)M-100柱子中，4℃，5000×g，離心6min，過柱所得即小分子RNA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，其特征在于在步驟3)中，加入的氯仿用量為250pi氯仿/1mlEzol。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，其特征在于在步聚5)中異丙醇沉淀?xiàng)l件是異丙醇的量為lml，沉淀的溫度為-20'C，沉淀的時(shí)間為12h。全文摘要本發(fā)明涉及一種從小鼠腦組織中獲得小分子RNA的方法，該方法包括以下步聚包括以下步驟1)研磨加入Ezol充分研磨裂解細(xì)胞；2)去不溶物4℃、12000×g離心10min，取上清；3)氯仿抽提200-250μl氯仿/1mlEzol，劇烈振蕩后室溫靜置；4)4℃，12000×g，離心15min，取上清；5)異丙醇沉淀加入異丙醇1-2ml，反復(fù)倒置，混勻，-20℃沉淀12h；6)4℃，12000×g，離心10min，棄上清；7)洗滌沉淀加入75％乙醇1ml，使沉淀懸??；8)4℃，7500×g，離心5min，棄上清；9)干燥沉淀，溶于焦碳酸二乙酯處理水中；10)YM-100過柱分離小分子RNA。本發(fā)明有益的效果證明該發(fā)明可以有效地獲得小分子RNA，解決了傳統(tǒng)RNA提取方法小分子RNA獲取效率低難題。文檔編號(hào)C07H21/00GK101353364SQ20081012086公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者丁先鋒,徐根明,李順杰,郭江峰申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué);郭江峰