專利名稱：結(jié)核分枝桿菌融合蛋白的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白的構(gòu)建領(lǐng)域。
技術(shù)背景全球約1/3人口被結(jié)核感染，90%以上處于潛伏狀態(tài)。減毒牛型結(jié)核分枝桿菌-卡介苗 (Bacille Calmette-Guerin, BCG)對(duì)預(yù)防兒童嚴(yán)重的結(jié)核感染有效，然而對(duì)成人肺結(jié)核幾 乎沒有保護(hù)作用，因此亞單位疫苗增強(qiáng)免疫策略對(duì)于提高成人肺結(jié)核免疫保護(hù)水平具有重要 的意義[11]。以往結(jié)核亞單位疫苗研究主要選擇生長早期和對(duì)數(shù)生長期表達(dá)的抗原，忽略了休 眠期細(xì)菌特有的抗原。然而，休眠狀態(tài)結(jié)核桿菌在人體內(nèi)是普遍存在的。感染機(jī)體的結(jié)核桿 菌可能有處于休眠狀態(tài)的結(jié)核桿菌。結(jié)核桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，受到天然免疫物質(zhì)NO等的 攻擊，可能轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài)。處在結(jié)核結(jié)節(jié)低氧環(huán)境中的細(xì)菌，也大多轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài)。休眠狀 態(tài)的結(jié)核桿菌潛伏感染是成人肺結(jié)核復(fù)發(fā)的主要來源。BCG免疫機(jī)體后，由于休眠期抗原表 達(dá)量低，不能針對(duì)休眠期細(xì)菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)休眠狀態(tài)結(jié)核桿菌沒有免疫保護(hù)。然而 在與結(jié)核病患者密切接觸的健康人群中，發(fā)現(xiàn)對(duì)休眠期抗原存在很強(qiáng)的免疫應(yīng)答?；谏鲜?研究，建立對(duì)休眠期細(xì)菌的免疫應(yīng)答對(duì)控制成人結(jié)核病發(fā)生具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌融合蛋白的構(gòu)建及其應(yīng)用方法，尤其是在結(jié)核 亞單位疫苗中的應(yīng)用。隨著人們對(duì)潛伏感染的認(rèn)識(shí)，休眠期結(jié)核桿菌表達(dá)的抗原物質(zhì)開始受到重視。休眠期結(jié) 核桿菌為了適應(yīng)缺氧等惡劣生存環(huán)境部分基因表達(dá)上調(diào)。在低氧和NO作用的環(huán)境中，休眠相 關(guān)DosR調(diào)節(jié)子(包括48個(gè)基因)禾卩HspX ( a —crystallin)基因表達(dá)上調(diào)。部分上調(diào)表達(dá)的 因子有抗原性。其中，H印X抗原可以被致敏的T細(xì)胞識(shí)別，刺激T細(xì)胞分泌IFN—y ，具有細(xì)胞 免疫和體液免疫原性。在健康的與肺結(jié)核密切接觸的家人(80%)和醫(yī)務(wù)工作者(90%)中， H印X具有明顯的T細(xì)胞刺激活性，比例明顯高于普通人群(50%),提示HspX抗原具有免疫保護(hù) 作用。Ag85B屬于結(jié)核桿菌抗原85復(fù)合體家族成員。該家族是結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)物的濾過蛋白質(zhì)(short-term culture filtrates, ST-CF)中的主要分泌性蛋白質(zhì)，己證實(shí)是重要的結(jié)核桿菌 免疫保護(hù)性抗原。Mpt64是結(jié)核桿菌的分泌性蛋白質(zhì)，也是結(jié)核桿菌ST-CF中的主要成分,可以 占到結(jié)核桿菌培養(yǎng)基上清濾過液中蛋白質(zhì)總量的8%，其第190 19S為多肽片段H-2D(b)限制 性的CD8 + T細(xì)胞表位。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了結(jié)核分枝桿菌融合蛋白包含保護(hù)性抗原HspX; —段為 CD8+T細(xì)胞表位Mpt64的190_ 198位的氨基酸多肽；以及結(jié)核桿菌抗原85復(fù)合體Ag85B。本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白為Ag85B-Mpt64190-198-HspX,簡(jiǎn)稱為AMH。為了更方便的使用AMH，將AMH與佐劑混合構(gòu)建亞單位疫苗。其中佐劑為二甲基三十六烷基銨(DDA)為基礎(chǔ)的復(fù)合佐劑(含卡介苗多糖核酸， BCG-PSBN)。該結(jié)核分枝桿菌融合蛋白以包涵體的形式存在。該結(jié)核分枝桿菌融合蛋白能在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)，并能用Ni-NTA介質(zhì)純化。AMM融合蛋白疫苗是我們已經(jīng)構(gòu)建的融合蛋白疫苗，所選抗原為結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性 抗原物質(zhì)Ag85B、 MPT6419(M98、 Mtb8.4，并將三者串連表達(dá)。我們的研究表明AMM融合蛋白 在佐齊UDDA—BCG PSN輔助下能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且誘導(dǎo)以Thl型 細(xì)胞免疫為主的免疫反應(yīng)，是有潛力的抗結(jié)核候選疫苗。為了進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)休眠期細(xì)菌的免 疫保護(hù)水平，我們用HspX替換Mtb8.4構(gòu)建了新的融合蛋白AMH，并通過特異性細(xì)胞免疫和體 液免疫的檢測(cè)，比較評(píng)價(jià)AMH融合蛋白的免疫活性。本發(fā)明的有益效果1、 本申請(qǐng)篩選休眠期保護(hù)性抗原，將休眠期抗原、對(duì)數(shù)生長期抗原聯(lián)合使用，試圖建立 針對(duì)結(jié)核桿菌不同生長狀態(tài)菌群的免疫反應(yīng)，從而有效清除或監(jiān)視包括潛伏感染在內(nèi)的各類 結(jié)核桿菌，預(yù)防成人結(jié)核病的發(fā)生。2、 本發(fā)明選用抗原Ag85B、 Mpt6419。—198、 HspX，構(gòu)建融合蛋白，以克服單一抗原免疫原不 足的缺點(diǎn)，同時(shí)建立對(duì)生長期和休眠期細(xì)菌全面的免疫力。3、 結(jié)核桿菌感染機(jī)體后激活CD4+、 CD8+T細(xì)胞和CD1限制的T細(xì)胞，激活的T細(xì)胞生成釋放 IFN-Y等細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞，從而清除結(jié)核桿菌。此外，CD8+T細(xì)胞被激活后，還會(huì)釋放穿孔素等淋巴毒性顆粒物質(zhì)直接殺傷感染了結(jié)核桿菌的靶細(xì)胞和結(jié)核桿菌。因此，結(jié)核疫 苗的目標(biāo)就是要建立Thl型為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外，CD8+T細(xì)胞對(duì)抑制潛伏感染的復(fù)發(fā)具有重要作用。4、 誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN- y的能力常被用來做為評(píng)價(jià)候選疫苗是否誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞免疫 的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究中ELISP0T檢測(cè)結(jié)果表明，針對(duì)AMH的組分HspX、 MPT6419M98以及PPD 刺激，A腿+DDA+BCG-PSN免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN- y的水平最高，Ag85B +DDA + BCG-PSN 及AMM+ DDA+ BCG-PSN免疫小鼠均次之；應(yīng)用AMH的另一組分Ag85B刺激時(shí)，IFN- y分泌水 平雖低于后兩組，但仍較高。說明AMH的T細(xì)胞表位可被很好地識(shí)別，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的 細(xì)胞免疫反應(yīng)。尤為重要的是，融合抗原免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞受CD8+T細(xì)胞表位MPT6419Q—198 刺激后，可以分泌IFN- y ，說明該融合蛋白疫苗較Ag85B和AMM疫苗誘導(dǎo)了較強(qiáng)的CD8+T淋 巴細(xì)胞，提示AMH疫苗具有抑制潛伏感染的作用。5、 IgG2a/IgGl常用于反映不同疫苗免疫后，所誘導(dǎo)的Thl/Th2反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，針 對(duì)Ag85B抗原，AMH+DDA十BCG — PSN免疫小鼠血清IgG2a/IgGl比值僅低于BCG免疫組，而高 于AMM和Ag85B免疫組，且IgGl及IgG2a滴度最高；HspX抗體，IgG2a/IgGl比值及抗體滴 度均高于其它各組；針對(duì)PPD的抗體水平，AMH+DDA+BCG — PSN免疫組IgG2a/IgGl比值不高， 但抗體滴度較高，僅低于AMM+DDA+BCG—PSN組，可能與PPD的復(fù)合成份引起多種免疫反應(yīng) 有關(guān)。由此可見融合蛋白AMH在復(fù)合佐劑DDA和BCG—PSN的輔助下，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)體液免 疫的能力，且其細(xì)胞免疫反應(yīng)傾向于Thl型免疫應(yīng)答，免疫效應(yīng)強(qiáng)于單一抗原Ag85B構(gòu)成的 疫苗。


圖1為融合蛋白AMH氨基酸序列示意Z為在大腸桿菌BL21中表達(dá)純化蛋白質(zhì)AMH，其中M:蛋白分子量Marker; 1:大腸桿菌 BL21超聲裂解液上清；2: AMH包涵體溶解液；3: AMH經(jīng)Ni-NTA柱純化，洗脫緩沖液pH4.5圖3a、3b、3c、3d分別為免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞受到Ag85B、 HspX、 Mpt64W0-198和PPD 蛋白刺激后分泌IFN- y的水平。以DDA-BCG多糖核酸(BCG-PSN)為佐劑，融合蛋白AMH(20u g/ 只/次)、AMM (20yg/只/次)和單個(gè)重組抗原Ag85B (20ug/只/次)皮下免疫C57BL/6小鼠 三次，同時(shí)設(shè)立BCG免疫組和空白組作為對(duì)照。最后一次免疫5周后，每組取4只以上小鼠， 無菌分離脾細(xì)胞，給予特異性抗原刺激(抗原刺激濃度分別為Ag85B 10Pg/ml、 PPD 10Pg/ml、MPT6419。—198 2Pg/ml、 HspX 2Pg/ml)， 共同孵育48h后采用ELISP0T方法檢測(cè)IFN-Y的分泌 水平。以每1X1()6個(gè)淋巴細(xì)胞中分泌IFN-Y的細(xì)胞個(gè)數(shù)表示。下圖為對(duì)應(yīng)組小鼠脾細(xì)胞在相 應(yīng)抗原PPD刺激下分泌IFN-Y的斑點(diǎn)成像。*與AMH+DDA+BCG-PSN組比較有顯著性差異(p <0. 05)。
具體實(shí)施例方式
為了更了解本發(fā)明的內(nèi)容，特舉較佳實(shí)施例說明如下。
實(shí)施例l 融合蛋白AMH (Ag85B-Mpt64,剛-HspX)的構(gòu)建 1、材料和方法 1. 1主要試劑材料
1.1.1主要材料結(jié)核桿菌毒力標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由上海市肺科醫(yī)院提供；DDA購自 Sigma-Aldrich公司；重組質(zhì)粒pET28a-A麗、pET28a-Ag85B由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所構(gòu)建。 MPT64駅9s多肽片段由吉爾生化(上海)有限公司合成，純度90. 45%; Ni- NTAHis Bind Resins 購自Novagen (MD Chemicals Inc)公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。
質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購買力自化舜公司，內(nèi)切酶、連接酶等購買自 Biolab公司;IFNi ELISP0T kits為U-Cytech公司產(chǎn)品(Netherlands)。
1.1.2主要儀器設(shè)備SCR20BA型超低溫離心機(jī)(日本HITACHI公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧 波新芝科器研究所)；640型紫外吸收光譜儀(美國Beckman公司)；Vivaflow50超濾濃縮系 統(tǒng)(德國Sartorius公司)；DZF-6090真空丁燥箱(重慶恒達(dá)儀器廠)；Bio-Rad550型酶聯(lián)免 疫檢測(cè)儀(USA); Biosys Bioreader肖動(dòng)酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像分析系統(tǒng)(Bio-sys GrabH)。 1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL6小鼠(SPF級(jí))購自蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。自由飲水進(jìn)食，晝夜 節(jié)律12小時(shí)。
1. 2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1重組蛋白Ag85B-MPT64訓(xùn)—湧-HspX (AMH)的構(gòu)建將&艦?zāi)鉻^的190-198位的基 因序列以及歷^r基因連接克隆入大腸桿菌表達(dá)載體，構(gòu)建融合抗原J《55/Hf/^W，，-^ aT， 并在大腸桿菌中表達(dá)。
1.2. l.l設(shè)計(jì)引物如下:_^_
Primers SequenceAg85BFAATGGATCCTTCTCCCGGCCGGGGCTI ) Ag85BRATTGAGCTCGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG(&jc I ) HspXFl ATAGAGCTCATGGCCACCACCCTTC(Sac I )
HspXF2 ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATT
ATGGCCACCACCCTTC(&c I ) H'spXR ACGAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG (ffi/ din)
1. 2. 1. 2 PCR擴(kuò)增Ag85B基因由于Ag85B基因后面要融合表達(dá)Mpt64190-198- HspX,所以設(shè)計(jì) 引物時(shí)把力^^皮冬止信號(hào)去掉，另外J^^術(shù)端的信號(hào)肽序列也被去掉，只擴(kuò)增成熟肽部分。應(yīng) 用5'-端特異性引物Ag85BF和3'-端引物六§858時(shí)廣增vfe9,55成熟肽片斷。PCR反應(yīng)條件如下 96。C預(yù)變性l分鐘；98。C變性10秒，62。C復(fù)性20秒，72。C延伸l分鐘，30個(gè)循環(huán);72。C延伸10 分鐘；4'Chold。 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用&c I和5s州I雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒pET28a(+)中。
1.2.1.3 PCR擴(kuò)增餘t似7^)-J^ -AfepJ (MH)片段以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株(〃J祝r)DNA為模板， 先用HspXFl和HspXR擴(kuò)增HspX基因片斷。PCR反應(yīng)條件如下98。C預(yù)變性5分鐘；98。C變性45 秒，62。C復(fù)性45秒，72。C延伸2分30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，以 此為模板，用HspXF2和HspXR擴(kuò)增l/^似/^ -76 -//邵爐合基因片斷。PCR反應(yīng)條件同上。 1. 2. 1.4構(gòu)建AMH表達(dá)質(zhì)粒PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，Ag85B片斷被5a出I和&cI酶切后，構(gòu)建入 pET28相應(yīng)的多克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pET28 Ag85B。 Mpt64190-198-HspX融合基因片斷用 'feci和歷"dIII雙酶切，克隆構(gòu)建入質(zhì)粒pET28 Ag85B中，構(gòu)建質(zhì)粒pET28 Ag85B-Mpt64190-198-HspX，經(jīng)測(cè)序鑒定。
結(jié)果pET28aAMH質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明插入的AMH基肉序列與H37Rv基因組序列完全一致，無 突變。AMH蛋白序列如圖1示。
1.2.2 AMH蛋白表達(dá)純化活化表達(dá)A腿蛋白的E. coli BL21菌體，移入1升培養(yǎng)基中振蕩 培養(yǎng)Z-3h至0D600達(dá)到~0. 5;加入IPTG(0.8mM)37。C誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)4h; 4 。C離心(以下沒 有特殊說明，均為4 "C)12，000 gX10分鐘收集細(xì)菌;細(xì)菌重懸于不含尿素的BufferB (sodium phosphate buffer 0. 1 M, Tris-Cl 0. 0丄M, pH 8. 0) 5 ml/g濕菌，冰浴下超聲破碎細(xì)菌 30分鐘(200-300 W，超聲1 sec停1 sec); 12, OOOgXlO min離心收集AMM包涵體。AMH 蛋白溶于buffer B (urea 8 M， NaH2P04 0.1 M， Tris-CI 0.01 M， pH 8.0) 4 。C過夜；隨 后應(yīng)用Ni-NTA His. Bind柱(Novagen)純化系統(tǒng)純化目的蛋白。將4 ml AMH溶液和1 ml 50%
7Ni-NTA His Bind介質(zhì)混合，室溫下振蕩60min充分混合，仔細(xì)加入洗脫柱；首先加入2 X 4 ml buffer C (urea 8 M， NaH2P04 0.1 M， Tris-CI 0.01 M， pH 6. 3)洗滌；然后依次分別 加入Buffer D (urea 8 M， NaH2P04 0. 1 M， Tris-Cl 0.01 M, pH 5.9)禾tl Buffer E (urea 8 M, NaH2P04 0.1 M, Tris-CI 0.01 M, pH4. 5)洗脫。各個(gè)分離組分分別上樣于12% SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，收集目的組分。最后，分離到的目的組分依次用尿素梯度溶液(6， 4， 2, 1， 0.5, and 0 M urea with 5 raM TrisCl, pH 7. 9)透析，4 。C下每個(gè)梯度透析12 h。 Lowry法測(cè)定 蛋白濃度。圖2示AMH蛋白包涵體及其純化產(chǎn)物，可見經(jīng)Ni-NTA介質(zhì)純化可以得到較高純度 的AMII蛋白。
實(shí)施例2亞單位疫苗的配制
將BCG-PSN用生理鹽水溶解至0. 6rag/ml，融合蛋白AMH用PBS稀釋至0. 5呢/ml。 DDA 用注射用水配制成2. 5 mg/ml ， 80 。C水浴10min，冷卻至室溫。取BCG-PSN溶液50y 1與等 量AMH蛋白溶液充分混勻，室溫放置lmin。在混合溶液中逐滴加入DDA，然后充分乳 化，使疫苗呈均一的乳油狀。 實(shí)施例3動(dòng)物免疫試驗(yàn)
1、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組(共六組)
A. AMH(20ug/次/只)+00八(250嗎/次/只)+卡介茼多糖核酸(BCG—PSN， 30ug/次/只)
B. Ag85B(20ug/次/只)+DM (M0ug/次/只)+卡介菌多糖核酸(30ug/次/只)
C. DDA (250ug/次/只)+卡介菌多糖核酸(30ug/次/只)
D. AMM(Ag85B-Mpt6419?！?98-Mtb8.4， 20ug) +DDA (250118/次/只)+ BCG—PSN (30ug/次/只)
E. 生理鹽水(NS， 200iil/次/只)
F. BCG (5Xl(fCFU/只)
2、 免疫方法
分別在第1、 4、 7周用制備好的蛋白疫苗腹股溝皮下免疫動(dòng)物(200ul/只)，卡介苗5 X106CFU在第一周腹股溝皮下免疫動(dòng)物一次。蛋白疫苗最后一次免疫后5周采血檢測(cè)體液免 疫指標(biāo)，動(dòng)物處死無菌分離脾臟淋巴細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)。 3 、 ELISA法檢測(cè)抗體水平
用Ag85B蛋白(5Pg/ml)， PPD蛋白(2(^g/m] ) , HspX (5化/ml)包被96孔板(10(M/Vell) 4'C過夜。用PBST溶液300ri/well洗板5次X5min/次。從l : 200開始至l : 12800，加入對(duì)倍稀釋的血清樣品，37"放置1 h。洗板后，加入200W/well的l : 20000稀釋的兔抗鼠IgGl、 IgG2a， 37。C放置lh。洗板后，加入100W/we11 TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘顯色后，加 入5(mi/well終l卜液(2N的Il2S04)終止反應(yīng)；在450nm檢測(cè)0D值。
結(jié)果重組AMH蛋白在佐劑DDA-卡介菌多糖核酸輔助下，可以刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的 IgGl、 IgG2a，如表1示。針對(duì)Ag85B抗原，AMH+DDA+BCG—PSN免疫小鼠血清IgG2a/IgGl比值僅 低于BCG免疫組，而高于A醒和Ag85B免疫組，且lgGl及IgG2a滴度最高；HspX抗體，IgG2a/IgGl 比值及抗體滴度均高于其它各組；針對(duì)PPD的抗體水平，AMH+DDA+13CG—PSN免疫組IgG2a/IgGl 比值不高，但抗體滴度較高，僅低于AMM+DDA+BCG—PSN組。
__表l.疫苗免疫小鼠抗體水平檢測(cè)_
分組 抗Ag85B 抗HspX 抗PPD
IgGl IgG2a igG2a/IgGl IgGl IgG2a IgG2a/IgGl IgGl IgG2a
IgG2a/IgGl
AMH+DDA+BCG-PSN 12800 40320.322540 64002.52 6400 3200
0.50
Ag85B+DDA+BCG-PSN 5080 10080.20 800 8001.00 400 1131
2. 83
AMM+ DDA+BCG-PSN 12800 32000.251600 16001.00 12800 6400
0. 50
DDA+BCG—PSN 3200 400 0. 13 1008 635 0.63 566 1131
2. 00
BCG 800 10081.26 504 6351.26 800
1131 1."
NS 8040 - 4040 - 40
40 _
以DDA-BCG多糖核酸(BCG-PSN)為佐劑，融合蛋白AMH (20ug/只/次)、AMM (20ug/ 只/次)和單個(gè)抗原Ag85B (20ii g/只/次)皮下免疫C57BL/6小鼠三次，同時(shí)設(shè)立BCG免疫 組和空白組作為對(duì)照。最后一次免疫5周后，每組取4只小鼠，摘除眼球取外周血，分離血 清，采用ELISA方法檢測(cè)血清抗Ag85B、 PPD和HspX IgG,、 IgG2a抗體水平?？乖粷舛确謩e為Ag85B 5^/ml、 PPD 20Pg/tnl、 HspX 5Pg/ml。
4、 ELISPOT法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌IFN- Y細(xì)胞數(shù)
IFN- y的水平與結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)相關(guān)。應(yīng)用ELISPOT方法檢測(cè)了免疫小鼠脾臟淋
巴細(xì)胞分別針對(duì)特異性抗原分泌IFN-y的水平。小鼠最后一次免疫五周后無菌分離脾臟，應(yīng)
用ELISP0T技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞受到Ag85B蛋白、HspX蛋白、Mpt64柳，多肽，PPD蛋白刺激后IFN-
y的表達(dá)ELISPOT板預(yù)先用IFN-y抗體包被過夜，無菌摘除脾臟，研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過
濾，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。加終濃度為5X107mL的淋巴細(xì)胞100W/well入96孔
ELISPOT板中，分別給予Ag85B蛋白(脅g/ml)' HspX蛋白(2l^g/ml), Mpt64蛋白(2Pg/ml)，
PPD蛋白(10化/ml)刺激。共同孵育48小時(shí)后，按ELISPOT操作說明依次加入檢測(cè)抗體等試
劑，洗板、顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。數(shù)據(jù)應(yīng)用One-Way ANOVA (spss10. 0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果重組AMH蛋白在佐劑卡介菌多糖核酸-DDA輔助下，免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞受到 Ag85B、 HspX、 Mpt6419。 —19S和PPD蛋白刺激后，能分泌較高水平的IFN-y ，如表2和圖3示。其 中，A腿亞單位疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞受到特定抗原(HspX、 Mpt6419。—?jiǎng)偤蚉PD)刺激后，產(chǎn)生分 泌IFN-y的淋巴細(xì)胞數(shù) (108±48、 159±55、 220±43)明顯高于單個(gè)抗原Ag85B免疫組(44 ±5、 28±8、 131±52， t值分別為3. 63、 5.77、 3.45， p<0. 05)和另一個(gè)融合蛋白A麗組(10 ±2、 33±2、 114±43， t值分別為3.89、 4.74、 3.86， p<0.05)。
表2.分泌工FN- y的淋巴細(xì)胞數(shù)/1 x 106個(gè)淋巴細(xì)胞
分組 Ag85b+ HspX+ MPT64削—198+ PPD十
X土SDtX士SDtX土SDtX士SDt
AMH+DDA+BCG-PSN169 ±35108±48159±55220 ±43
Ag85B+DM+BCG-PSN206 ±2144 ±5*3.6328 ±8*5.77131±52*3. 45
_1. 89
DDA十BCG-PSN54 土25±5*4. 995.3640 ±18*6.47
5. 30
扁+DM+BCG-PSN280 ±50*-4. 4910±2*3. 8933±2*4.74114 ±43*3. 86
NS19 ±4*8.2212±2*3.822±1*4.7210±5*9. 56
BCG30 ±6*7. 353±2*4. 9337±9*5.0520 ±12*9. 04
N》4
t與AMH+DDA+BCG-PSN組比較*與AMH+DDA+BCG-PSN組比較有顯著性差異(p<0. 05)。
權(quán)利要求
1、結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，含結(jié)核分枝桿菌融合蛋白包含保護(hù)性抗原HspX、一段為CD8+T細(xì)胞表位Mpt64的190-198位的氨基酸多肽、以及結(jié)核桿菌抗原85復(fù)合體Ag85B。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，其特征為所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋 白與佐劑混合構(gòu)建亞單位疫苗。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，其特征為佐劑為二甲基三十六烷基銨 為基礎(chǔ)構(gòu)成的復(fù)合佐劑，抗原為融合蛋白AMH。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，其特征為所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋 白以包涵體的形式存在。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，其特征為所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋 白能在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，其特征為利用Ni-NTA介質(zhì)純化。
全文摘要
本發(fā)明為結(jié)核分枝桿菌融合蛋白的構(gòu)建及其應(yīng)用，涉及融合蛋白的構(gòu)建?，F(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白忽略了休眠期細(xì)菌的特有的抗原，本申請(qǐng)?zhí)峁┙Y(jié)核分枝桿菌融合蛋白包含保護(hù)性抗原HspX、一段為CD8⁺T細(xì)胞表位Mpt64的190-198位的氨基酸多肽、以及結(jié)核桿菌抗原85復(fù)合體Ag85B。篩選休眠期保護(hù)性抗原，將休眠期抗原、對(duì)數(shù)生長期抗原聯(lián)合使用構(gòu)建疫苗，試圖建立針對(duì)結(jié)核桿菌不同生長狀態(tài)菌群的免疫反應(yīng)，從而有效清除或監(jiān)視包括潛伏感染在內(nèi)的各類結(jié)核桿菌，預(yù)防成人結(jié)核病的發(fā)生。
文檔編號(hào)C07K14/35GK101654477SQ20081014714
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月21日
發(fā)明者于紅娟, 傅林鋒, 姜雯雯, 宋楠楠, 青 李, 王洪海, 王秉翔, 祝秉東, 郄亞卿, 彧 雒 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)