偶發(fā)分枝桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)表博醇中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)突變株，該菌株能夠一步發(fā)酵生產(chǎn)表博醇，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725。表博醇是合成黃體酮、角鯊胺等藥品的重要中間體，采用本發(fā)明保藏號為CGMCC 9725的偶發(fā)分枝桿菌可將植物甾醇降解生產(chǎn)表博醇，并可將表博醇排出胞外大量積累，底物投料量濃度為2.5％，重量收率可達37～43％，純度高達96.7％，且雜質(zhì)量較少，生產(chǎn)成本較低，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。CGMCC No972520140925
【專利說明】
偶發(fā)分枝桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)表博醇中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002] 本發(fā)明涉及一株生產(chǎn)留體激素的偶發(fā)分枝桿菌菌株，相關(guān)液體菌劑及其在生產(chǎn)表 博醇中的應(yīng)用，具體地說，本發(fā)明涉及一株發(fā)酵生產(chǎn)表博醇的偶發(fā)分枝桿菌菌株，含有菌株 的菌劑及在生產(chǎn)表博醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0004] 表博醇作為一種留醇降解物，是合成黃體酮、角鯊胺等留體藥品的重要中間體，角 鯊胺是存在于鯊魚組織中的氨基留醇，可從多刺的角鯊魚，海綠角鯊的胃中分泌物中分離 得到，具有廣譜抗菌作用和抗血管生成效應(yīng)，近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)還具有良好的 抗癌功效，由于從角鯊以及相關(guān)魚類提取成本高，得率低，并難以產(chǎn)業(yè)化，近年來，研究人員 一直在探索一條大規(guī)模高效生產(chǎn)角鯊胺的技術(shù)路線，而本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物表博醇是合成角 鯊胺的重要中間體，此外，黃體酮也是一種重要的天然孕激素，其規(guī)模化生產(chǎn)也需要大量的 表博醇，因此，研究人員迫切需要尋找大規(guī)模低成本生產(chǎn)表博醇的工藝途徑和相關(guān)菌株。
[0005] 早在1972年，Marsheck et al利用留醇經(jīng)微生物降解能夠生成表博醇，但表博醇 的收率僅20~40mg/L，沒有進行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的價值。對于表博醇的發(fā)酵工藝研究主要 集中在20世紀80年代初期，1978年日本研究人員提出了由植物甾醇降解制備1，4表博醇 及表博醇的方法，兩種物質(zhì)總收率50~60%，其中以1，4表博醇為主，約占總重的95%以 上，且底物投料濃度僅0. 5%~0. 8%，同樣難以滿足表博醇大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0006] 此后陸續(xù)有研究報道在留醇降解制備雄烯二酮（4AD)的過程均發(fā)現(xiàn)有表博醇的 產(chǎn)生，但均未以表博醇為目的產(chǎn)物展開詳細的大規(guī)模生產(chǎn)相關(guān)研究。綜上所述，無論從發(fā)酵 工藝，還是產(chǎn)物收率和純度，目前已經(jīng)公開的方法都不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 發(fā)明技術(shù)內(nèi)容：
[0008] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株偶發(fā)分枝桿菌突變株，使用該突變株，可將植物 甾醇轉(zhuǎn)化為表博醇，且該突變株能有效抑制表博醇留核1，2位脫氫，以及17位碳側(cè)鏈羥甲 基的降解，使表博醇得以累積并分泌到胞外。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有偶發(fā)分枝桿菌突變株的液體菌劑。在必要的 時候，該液體菌劑還可以包含菌劑制備常用的載體和輔料。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供偶發(fā)分枝桿菌突變株及其菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)表博醇中 的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第四個目的是提供發(fā)酵生產(chǎn)表博醇的方法。
[0012] 本發(fā)明公開了 一株偶發(fā)分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum)突變株 SZ-BBC-101，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725,保藏日期是2014年9月25日。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心簡 稱CGMCC，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0013] 本發(fā)明中公開的偶發(fā)分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum)突變株SZ-BBC-101, CGMCC 9725通過如下方式選育獲得：
[0014] 菌種分離：菌種的分離基物是存放植物留醇庫房附近的土壤，使用固體培養(yǎng)基劃 線，31°C培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑選單菌落表面粗糙，邊緣不規(guī)則，顏色為灰白色或淡黃色， 顯微鏡微觀為短桿狀進行再培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基在31°C，150rpm培養(yǎng)。
[0015] 菌種誘導(dǎo)：當(dāng)菌體密度生長至10s個/ml，離心收集菌體，用檸檬酸鈉溶液洗菌，并 用檸檬酸鈉溶液將菌體稀釋到原體積，并加入亞硝基胍，制成菌懸液，菌懸液37°C水浴30 分鐘，再次離心，菌體用磷酸緩沖液沖洗，并重新在磷酸緩沖液中懸浮分散。
[0017] 菌株生長篩選：將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布至初篩固體培養(yǎng)基上，于31°C培 養(yǎng)7天，挑取單菌落接種到復(fù)篩固體培養(yǎng)基中，凡在復(fù)篩培養(yǎng)基中不能生長的菌體，用初篩 培養(yǎng)基進行進一步的純化培養(yǎng)，得到誘變后的菌株。
[0017] 菌株轉(zhuǎn)化篩選：將誘變后的菌株接種到液體培養(yǎng)基上，31°C，150rpm培養(yǎng)48小時， 再接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，接種量10%，在31°C，200rpm，轉(zhuǎn)化72小時，取樣送液相檢測，根據(jù) 液相結(jié)果確定誘變后菌株轉(zhuǎn)化生成表博醇能力的優(yōu)略。
[0018] 經(jīng)過以上誘變篩選工作，得到一株優(yōu)良的變異菌株，并命名為偶發(fā)分枝桿菌 (Mycobacterium fortuitum)突變株SZ-BBC-101，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725,保藏日期是2014年9月25日。中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心簡稱CGMCC，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科 學(xué)院微生物研究所。
[0019] 偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-101，CGMCC 9725有如下形態(tài)學(xué)特征：在不同生長環(huán) 境下，菌體形態(tài)呈現(xiàn)差別，但基本上均為短桿狀，菌落表面粗糙，邊緣不規(guī)則，顏色為灰白色 或淡黃色，菌體尺寸較一般細菌小，長約〇. 6~1. 0微米，寬0. 3~0. 4微米。可將植物甾 醇降解轉(zhuǎn)化為表博醇，并在胞外大量積累，重量收率可達37~43%，達到工業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準。
[0020] 本發(fā)明的發(fā)酵反應(yīng)如附圖1所示。
[0021] 本發(fā)明還公開了含有偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-101，CGMCC 9725的液體菌劑， 按重量計，該菌劑含菌體生物量是1 %~1. 5%，余量為培養(yǎng)過CGMCC 9725的液體培養(yǎng)基。
[0022] 本發(fā)明還公開了制備偶發(fā)分枝桿菌突變株及其液體菌劑的方法。生產(chǎn)液體菌劑的 方法包括下列步驟：
[0023] A斜面種子培養(yǎng)：將CGMCC 9725接種于固體培養(yǎng)基上，30-32°C培養(yǎng)；
[0024] B液體種子培養(yǎng)：從A項培養(yǎng)的固體斜面上刮取菌體，接種到液體培養(yǎng)基中， 150rpm，30-32 °C 培養(yǎng)；
[0025] C計數(shù)：按重量計，含菌體生物量是1 %~1. 5%，余量為培養(yǎng)過CGMCC 9725的液 體培養(yǎng)基，得液體菌劑；
[0026] 其中，固體培養(yǎng)基組分是：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏 〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，瓊脂1.5% -2. 0%，余量為水。
[0027] 液體培養(yǎng)基組分是：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷 酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，余量為水。
[0028] 本發(fā)明還公開了偶發(fā)分枝桿菌突變株及其菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)表博醇中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還公開了生產(chǎn)表博醇的方法，該方法包括下列步驟：
[0030] ①發(fā)酵培養(yǎng)：將含有偶發(fā)分枝桿菌液體菌劑接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為 10%~15%，轉(zhuǎn)化溫度為30-321：，發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200-400印111，空氣流量為30-3517 min，罐壓為（λ 045±0· 055MPa ;
[0031] ②分離提取：加熱分層，取油層，乙醇萃取，濃縮離心，正己烷過濾除油，乙醇活性 炭脫色，濃縮，乙醇精制，析晶，干燥得表博醇；
[0032] 其中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組分為：玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氫二 鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，檸檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷脂 0· 25g/L，豆油160g/L，植物留醇25g/L，余量為水；
[0033] 在本發(fā)明中植物留醇是β -谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇，玉米留醇或木 甾醇中的一種或多種。
[0034] 在本發(fā)明中，表博醇是合成黃體酮、角鯊胺等藥品的重要中間體。 本發(fā)明的有益效果 1. 本發(fā)明利用一株突變的偶發(fā)分枝桿菌發(fā)酵生產(chǎn)表博醇，使用合適的發(fā)酵液，接種濃 度和發(fā)酵培養(yǎng)條件，顯著提高了偶發(fā)分枝桿菌生產(chǎn)表博醇的效率，并縮短的發(fā)酵工藝流程， 節(jié)約發(fā)酵時間，并顯著減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生； 2. 本發(fā)明采用的偶發(fā)分枝桿菌生產(chǎn)表博醇，可將表博醇排出胞外大量積累，由于該突 變株1，2脫氫的活性喪失，因此不再產(chǎn)生1，4表博醇，節(jié)約了純化流程，降低了純化成本。 3. 本發(fā)明的制備表博醇的方法還具有下面特點： 底物投料量大，重量收率可達37~43 %，獲得的表博醇成品純度高達96. 7 %，且雜質(zhì) 量較少，生產(chǎn)成本較低，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，為利用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)表博 醇提供了新的思路。本發(fā)明涉及的突變菌株以及相關(guān)發(fā)酵方法具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前 旦
【附圖說明】：
[0036] 圖1是生物發(fā)酵反應(yīng)示意圖。
[0037] Α表示植物甾醇，Β表示表博醇。
[0038] 圖2是表博醇精致成品的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】：
[0040] 下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。
[0041] 實施例1.偶發(fā)分支桿菌突變株SZ-BBC-101的選育獲得。
[0042] 1. 1菌種分離：在本工廠廠區(qū)存放植物留醇的廠房附近的土壤取樣，使用固體培 養(yǎng)基劃線，31°C培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，挑選單菌落表面粗糙，邊緣不規(guī)則，顏色為灰白色或淡 黃色，顯微鏡微觀為短桿狀進行再培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基在31°C，150rpm培養(yǎng)。
[0043] 固體培養(yǎng)基配方及配制方法：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉 膏〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，按實際需要秤取以上物質(zhì)，加入純化水，攪拌溶解，lmol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)PH7. 5,加入瓊脂2. 0 %，加熱溶清，如制作斜面，溶清后分裝至試管或茄型 瓶中，121°C滅菌20分鐘，冷卻到70°C擺放斜面或倒平板，冷卻至室溫凝固后，31°C空培養(yǎng) 48小時，無菌落出現(xiàn)則可以使用。
[0044] 液體培養(yǎng)基配方及配制方法：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏 l〇g/L，磷酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH7. 0~7. 2,用純化水定 容至1L，121°C滅菌20分鐘。
[0045] 1. 2菌體誘變：當(dāng)菌體生長密度達到10s個/ml，將液體菌劑涂布于固體培養(yǎng)基 平板上，并于涂布接種后再在固體培養(yǎng)基平板中央及周邊數(shù)處均勻點放亞硝基胍小顆粒， 31°C培養(yǎng)7天后，用接種環(huán)緊靠各個亞硝基胍抑菌圈外側(cè)，將菌苔挑于無菌生理鹽水中制 成菌懸液，用以進行突變株篩選。
[0046] 1. 3突變株篩選：將誘變后的菌懸液進行稀釋涂布，培養(yǎng)基使用初篩培養(yǎng)基，于 31°C培養(yǎng)7天。挑取單菌落接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，凡是在復(fù)篩培養(yǎng)基中不能生長的菌體，用 初篩培養(yǎng)基進行進一步的純化培養(yǎng)，得到誘變后的菌株。
[0047] 初篩培養(yǎng)基配方及配制方法：葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉4g/L，磷酸二氫鉀4g/L， 七水硫酸鎂0. 3g/L，七水硫酸亞鐵0. 05g/L，瓊脂20g/L，pH7. 5,培養(yǎng)基121°C滅菌20分鐘。
[0048] 復(fù)篩培養(yǎng)基配方及配制方法：表博醇5g/L，磷酸氫二鈉4g/L，磷酸二氫鉀4g/L，七 水硫酸鎂〇. 3g/L，七水硫酸亞鐵0. 05g/L，瓊脂20g/L，pH7. 5,培養(yǎng)基121°C滅菌20分鐘。
[0049] 1. 4菌種搖瓶轉(zhuǎn)化能力測試：將誘變后的菌株接種到液體培養(yǎng)基上，31 °C， 150rpm，培養(yǎng)48小時，再接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，接種量10%，在31°C，200rpm，轉(zhuǎn)化72小時， 取樣送液相檢測，根據(jù)液相結(jié)果對比突變后的菌株轉(zhuǎn)化能力優(yōu)劣，最終確定目標(biāo)菌株。
[0050] 液體培養(yǎng)基配方及配制方法：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏 l〇g/L，磷酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，余量為水，lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH7. 0~7. 2， 121°C滅菌20分鐘。
[0051] 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方及配制方法：玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氫 二鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，檸檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷脂 0· 25g/L，豆油64g/L，植物留醇10g/L，余量為水。
[0052] 經(jīng)過以上誘變選育工作，得到一株優(yōu)良的突變株，分類命名為偶發(fā)分枝桿菌 (Mycobacterium fortuitum)突變株SZ-BBC-101，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號是CGMCC 9725,保藏日期是2014年9月25日。中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心簡稱CGMCC，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科 學(xué)院微生物研究所。
[0053] 偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-101，CGMCC 9725有如下特征：在不同生長環(huán)境下， 菌體形態(tài)呈現(xiàn)差別，但基本上均為短桿狀，菌落表面粗糙，邊緣不規(guī)則，顏色為灰白色或淡 黃色，菌體尺寸較一般細菌小，長約〇. 6~1. 0微米，寬0. 3~0. 4微米?？蓪⒅参镧薮冀?解轉(zhuǎn)化為表博醇，并在胞外大量積累，純化方便，產(chǎn)率高。
[0054] 實施例2.偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-101液體菌劑制備方法。
[0055] 2. 1斜面固體培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉 膏〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，按實際需要秤取以上物質(zhì)，余量為水，攪拌溶解，lmol/L氫 氧化鈉溶液調(diào)PH7. 5,加入瓊脂2. 0%，加熱溶清，分裝至茄型瓶中，加入量約為茄型瓶的 20%，然后塞好膠塞，于121°C滅菌20分鐘，冷卻到70°C擺放斜面，冷卻至室溫凝固后，31°C 空培48小時，無菌落出現(xiàn)則可以使用。
[0056] 2. 2液體種子培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏 l〇g/L，磷酸氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH7. 0~7. 2,余量為水， 12 rc滅菌20分鐘，冷卻到室溫。
[0057] 2. 3將偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-101接種到斜面固體培養(yǎng)基上，于31°C培養(yǎng)7 天。從斜面固體培養(yǎng)基上刮取菌體接種到液體種子培養(yǎng)基中，在31°C，150rpm，培養(yǎng)48小 時，得液體菌劑。
[0058] 2. 4取樣計數(shù)，按生物量測定方法測菌體含量，按重量計，該液體菌劑的含生物量 約為1 %~1. 5%，余量為培養(yǎng)過偶發(fā)分枝桿菌突變株的培養(yǎng)基。
[0059] 生物量測定方法：取100ml樣品，抽濾，濾渣刮下，放置在濾紙上將培養(yǎng)基吸干，稱 重結(jié)果如下。
[0060]
[0061] 實施例3.偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-101菌株及液體菌劑的應(yīng)用。
[0062] 3. 1檢測方法
[0063] (1)高效液相色譜檢測條件
[0064] 流動相：甲醇：水=70 : 30,流速：1.0ml/min，檢測波長：254nm，柱溫：25°C，進 樣量：1〇μ 1，溶液配制：準確稱取15mg供試品，用甲醇稀釋至50ml，操作：分別進10μ 1空 白溶液和測試液。
[0065] (2)重量收率=(表博醇重量+底物重量）X 100%。
[0066] 3.2乩搖瓶轉(zhuǎn)化
[0067] 發(fā)酵培養(yǎng)：將液體菌劑接種到滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，接種量為10%，于31°C， 200rpm，轉(zhuǎn)化72小時，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為玉米楽54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸 氫二鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，梓檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷 脂0.258/1，豆油16(^/1，總含量95%植物留醇258/1，余量為水 ；
[0068] 分離提?。喝?，薄層色譜（TLC)點板檢測，轉(zhuǎn)化完全，加熱至75-80°C，并充分攪 拌混勻，靜置分層，取油層，用3體積95%乙醇萃取三次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結(jié)晶 析出，離心得到表博醇萃取粗品，1. 5體積的正己烷攪拌保溫（55-57°C ) 2小時，過濾除油 得到表博醇除油半成品，7體積95%乙醇，5%重量的活性碳攪拌保溫（58-60°C ) 2小時，離 心分離活性炭，料液濃縮得到表博醇脫色半成品，2體積95%乙醇攪拌保溫（58-60°C ) 2小 時，充分溶解，冷卻水緩慢降溫至30°C，再用冰水冷卻到15°C析晶，離心分離得到表博醇精 制半成品，70°C，-0. 07MPa，干燥12小時，得到表博醇精制成品，送高效液相色譜檢測含量， 表博醇重量收率如下。
[0069]

[0070] 3· 3 50L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化
[0071] 發(fā)酵培養(yǎng)：將液體菌劑接種到滅菌后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基裝樣量為27L， 接種量為10 %，共計30L，轉(zhuǎn)化溫度31°C，攪拌速度400rpm，空氣流量為30-35L/min，罐壓為 0. 05MPa，轉(zhuǎn)化66小時。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷 酸氫二鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，梓檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵 磷脂0.258/1，豆油16(^/1，總含量95%植物留醇25 8/1，余量為水。
[0072] 取樣，薄層色譜（TLC)點板檢測，轉(zhuǎn)化完全，加熱至75-80°C，并充分攪拌混勻，靜 置分層，取油層，用3體積95 %乙醇萃取三次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結(jié)晶析出，離心 得到表博醇萃取粗品，1. 5體積的正己烷攪拌保溫（55-57°C ) 2小時，過濾除油得到表博醇 除油半成品，7體積95%乙醇，5%重量的活性碳攪拌保溫（58-60°C ) 2小時，離心分離活性 炭，料液濃縮得到表博醇脫色半成品，2體積95%乙醇攪拌保溫（58-60°C ) 2小時，充分溶 解，冷卻水緩慢降溫至30°C，再用冰水冷卻到15°C析晶，離心分離得到表博醇精制半成品， 70°C，-0. 07MPa，干燥12小時，得到表博醇精制成品送高效液相色譜檢測，高效液相色譜譜 圖見圖2,表博醇重量收率43. 0%。
[0073] 根據(jù)圖2顯示的產(chǎn)物及雜質(zhì)如下：
本發(fā)明相關(guān)技術(shù)方案的保護范圍并不限于實施例中的內(nèi)容，實施例的內(nèi)容僅起到解釋 本發(fā)明技術(shù)方案的示例性作用，與實施例相關(guān)技術(shù)方案的變體或常規(guī)參數(shù)調(diào)整后的技術(shù)方 案仍在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一株偶發(fā)分枝桿菌（Mycobacteriumfortuitum)突變株SZ-BBC-lOl，其在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號是CGMCC 9725。2. -種含有權(quán)利要求1所述突變株的液體菌劑，按重量計，該菌劑含菌體生物量是 1%~1. 5%〇3. -種制備權(quán)利要求2所述液體菌劑的方法，該方法包括下列步驟： A斜面種子培養(yǎng)：將權(quán)利要求1所述的偶發(fā)分枝桿菌突變株SZ-BBC-IOl接種于固體培 養(yǎng)基上，30-32 °C培養(yǎng)； B液體種子培養(yǎng)：從A步驟中培養(yǎng)的固體斜面上刮取菌體，接種到液體培養(yǎng)基中， 150rpm，30-32 °C 培養(yǎng)； C獲得液體菌劑：按菌體濕重計，獲得含菌體生物量是1 %~1. 5%的液體菌劑，余量為 培養(yǎng)權(quán)利要求1所述偶發(fā)分枝桿菌突變株的液體培養(yǎng)基； 其中，所述固體培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨l〇g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖12g/L，牛肉膏 〇. 5g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，瓊脂1. 5 % -2. 0 %，余量為水； 所述液體培養(yǎng)基包括：胰蛋白胨5g/L，酵母膏0. 5g/L，葡萄糖6g/L，牛肉膏10g/L，磷酸 氫二鉀2g/L，玉米漿54g/L，余量為水。4. 權(quán)利要求1所述的突變株在發(fā)酵生產(chǎn)表博醇中的應(yīng)用，所述表博醇的結(jié)構(gòu)式為：5. 權(quán)利要求2所述的液體菌劑在發(fā)酵生產(chǎn)表博醇中的應(yīng)用，其中所述表博醇的結(jié)構(gòu)式 為：6. -種生產(chǎn)表博醇的方法，該方法包括下列步驟： ① 發(fā)酵培養(yǎng)：將權(quán)利要求2所述的液體菌劑接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為 10%~15%，轉(zhuǎn)化溫度為30-321：，轉(zhuǎn)速為200-400印111，空氣流量為30-35171^11，罐壓為 0. 045±0. 055MPa ; ② 分離提?。杭訜岱謱?，取油層，乙醇萃取，濃縮離心，正己烷過濾除油，乙醇活性炭脫 色，濃縮，乙醇精制，析晶，干燥得表博醇； 其中所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基包括：玉米漿54g/L，牛肉膏10g/L，胰蛋白胨5g/L，磷酸氫二 鉀2g/L，葡萄糖6g/L，酵母膏0. 5g/L，硫酸銨10g/L，檸檬酸lg/L，吐溫-801g/L，卵磷脂 0· 25g/L，豆油160g/L，植物留醇25g/L，余量為水； 所述植物留醇為β_谷留醇，豆留醇，菜油留醇，菜籽留醇，玉米留醇或木留醇中的一 種或多種。7.根據(jù)權(quán)利要求6中的方法，該方法包括下列步驟： ① 發(fā)酵培養(yǎng)：將液體菌劑接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為10%，于31°C，轉(zhuǎn)速 400rpm轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時間為66小時，空氣流量為35L/min，罐壓為0. 050MPa ; ② 分離提?。喝樱由V（TLC)點板檢測，轉(zhuǎn)化完全，加熱至75-80°C，并充分攪拌 混勻，靜置分層，取油層，用3體積95%乙醇萃取三次，乙醇萃取液濃縮至絕大部分結(jié)晶析 出，離心得到表博醇萃取粗品，1. 5體積的正己烷攪拌保溫2小時，保溫溫度為55-57°C，過 濾除油得到表博醇除油半成品，7體積95%乙醇，5%重量百分比的活性碳攪拌保溫2小時， 保溫溫度為58-60°C，離心分離活性炭，料液濃縮得到表博醇脫色半成品，2體積95%乙醇 攪拌保溫2小時，保溫溫度為58-60°C，使其充分溶解，冷卻水緩慢降溫至30°C，再用冰水冷 卻到15°C析晶，離心分離得到表博醇精制半成品，70°C，-0. 07MPa，干燥12小時，得到表博 醇精制成品。
【文檔編號】C12N1/20GK105886418SQ201410717368
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月1日
【發(fā)明人】陳美華
【申請人】陳美華