專利名稱：自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法及其專用免疫親和吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法及其專用免疫親和 吸附劑。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)生物體內(nèi)的物質(zhì)及其變化產(chǎn)生了越來越濃厚的興 趣，而生物樣本的分析就成為探索和發(fā)現(xiàn)生命奧秘的必要手段。由于生物樣本成分 復(fù)雜，待測(cè)物濃度較低，而且大多數(shù)取樣量很少，這就對(duì)分析方法的選擇性和靈敏 度提出了更高的要求。免疫親和色譜(IAC， i誦unoaffinity chromatography)是 一種將免疫反應(yīng)與色譜分析方法相結(jié)合的分析方法。它的高度選擇性和高親和性無 疑使分析過程簡(jiǎn)化。在獸藥殘留分析中，IAC最簡(jiǎn)單而且最有效的應(yīng)用方式是作為 理化測(cè)定技術(shù)(如HPLC， GC)的樣品凈化手段，這種聯(lián)用方法可使免疫學(xué)技術(shù)和理 化技術(shù)在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，并避免了免疫分析法(如 ELISA， RIA)直接測(cè)定樣品的諸多不足。
鹽霉素(Salinomycin )和甲基鹽霉素(Narasin)屬于聚醚類獸用抗生素， 對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分霉菌起抗菌作用，單獨(dú)使用對(duì)雞綠蟲病有良好的預(yù)防 作用。鹽霉素和甲基鹽霉素的使用不可過量，否則其將會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)大量蓄積，通 過食物鏈而危及人類健康，重者會(huì)使所食用動(dòng)物中毒死亡。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè) 部公告第235號(hào)文規(guī)定鹽霉素和甲基鹽霉素在雞肌肉中最高殘留量為600 u g/ kg， 在皮膚、脂肪中的最高殘留量為1200 wg/ kg，在肝中的最高殘留量為1800ug/ kg。 歐盟自2006年，不再允許鹽霉素-鈉在飼料中添加。因此，檢測(cè)鹽霉素和甲基鹽霉 素在動(dòng)物性食品中的殘留量非常重要。
檢測(cè)鹽霉素和甲基鹽霉素殘留量的方法主要有高效液相色譜分析法(HPLC)、 液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(LC-MS)、液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等；這些方法的前處理利用液一液 分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果 差、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多、所需時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的免疫親和吸附劑。
本發(fā)明所提供的用于自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的免疫親和吸附劑，是 由固相載體和與其偶聯(lián)的鹽霉素單克隆抗體組成；所述鹽霉素單克隆抗體是以鹽霉 素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的抗體；所述鹽霉素類化合物為鹽霉素 或甲基鹽霉素。
其中，所述鹽霉素半抗原是通過將鹽霉素和氯化亞砜縮合反應(yīng)得到鹽霉素酰 氯，再將所述鹽霉素酰氯與氨基乙酸反應(yīng)得到的；所述鹽霉素單克隆抗體為鹽霉素 鼠單克隆抗體。所述鹽霉素單克隆抗體可以為鹽霉素鼠單克隆抗體。
所述鹽霉素單克隆抗體具體是由鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌產(chǎn)生。
所述鹽霉素單克隆抗體是用鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得 到的；所述鹽霉素半抗原將鹽霉素和氯化亞砜通過縮合反應(yīng)得到鹽霉素酰氯，再將 鹽霉素酰氯與氨基乙酸反應(yīng)得到鹽霉素半抗原。
鹽霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免 疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將鹽霉素反應(yīng)合成 鹽霉素半抗原，有助于制出針對(duì)鹽霉素抗原特異性較強(qiáng)的多克隆抗體。再將鹽霉素 半抗原采用碳化二亞胺法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比 例過低或過高都對(duì)免疫不利，半抗原與0VA、 RSA和KLH的結(jié)合摩爾比分別為11:1、
17: 1、 17: 1。
所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、
卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；
所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖 凝膠、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等，優(yōu)選為S印harose 4B。
所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中制成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述試劑盒中還可包括洗脫液、洗滌液和保存液；
所述洗滌液為含有終濃度為0. 2-0. 3g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 5-3. 5g/L 的12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 1-0. 3g /L的氯化鉀、終濃度為8. 0-9. 5g /L的氯化鈉、0.01-0.02M、 pH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液；所述終濃度均為各物 質(zhì)在所述洗滌液中的濃度；
所述洗脫液為甲醇與水以8-10: 1體積比混合的溶液；
所述保存液為含有終濃度為0. 2-0. 3g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 5-3. 5g/L 的12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 1-0. 3g /L的氯化鉀、終濃度為8. 0-9. 5g /L 的氯化鈉、終濃度為O. 1-0. 3g /L的NaN3、 0. 01-0. 02M、 pH值為7. 2-7. 6的磷酸 鹽緩沖液；所述終濃度均為各物質(zhì)在所述保存液中的濃度；
所述洗滌液優(yōu)選為含有終濃度為0. 27g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 9g/L的 12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 2g /L的氯化鉀、終濃度為8. 8g /L的氯化鈉、0. OIM、 pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液；
所述洗脫液優(yōu)選為甲醇與水以9: l體積比混合的溶液；
所述保存液優(yōu)選為含有終濃度為0. 27g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 9g/L的 12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0.2g/L的氯化鉀、終濃度為8.8g/L的氯化鈉、終 濃度為0.2g /L的NaN" 0. OIM、 pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法。 本發(fā)明所提供的自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法，包括以下步驟
1) 樣品的前處理
取動(dòng)物組織勻漿，加入硫酸鹽，再加入提取液進(jìn)行提取，然后進(jìn)行離心力是3000
g -4000g的離心，取上清液作為樣品溶液；所述提取液為乙腈或甲醇；所述離心
力優(yōu)選為3500g;
2) 將步驟l)得到的樣品溶液與PBS緩沖液混合，過上述免疫親和色譜柱，然 后依次用上述任一洗滌液、水、上述任一洗脫液進(jìn)行洗脫，收集得到鹽霉素類化合 物溶液；所述鹽霉素類化合物為鹽霉素或甲基鹽霉素。
其中，所述動(dòng)物組織樣品包括肌肉、肝。
本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)動(dòng)物樣品中鹽霉素類化合物含量的方法。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)動(dòng)物樣品中鹽霉素類化合物含量的方法，是用上述自動(dòng)物 樣品中提取鹽霉素類化合物的方法從動(dòng)物樣品中提取得到鹽霉素類化合物后，再對(duì) 所述鹽霉素類化合物的量進(jìn)行檢測(cè)。 由鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體或鹽霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No.2587也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明免疫親和吸附劑以及裝載有該吸附劑的色譜柱基于免疫反應(yīng)和色譜反 應(yīng)，適合從生物樣品(如肌肉、肝)中凈化鹽霉素和甲基鹽霉素，便于殘留分析。 在該免疫親和色譜柱中，鹽霉素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌 的單克隆抗體與溴化氰活化的S印harose 4B的偶聯(lián)率是94X。動(dòng)態(tài)柱容量為 1800ng/mL(鹽霉素)、2000ng/mL(甲基鹽霉素)，在使用了 20次后柱容量為總柱容 量的25%左右，保存期為l年。
本發(fā)明的免疫親和吸附劑及色譜柱使用了高特異性的鹽霉素單克隆抗體，具有 高選擇性，保證了檢測(cè)效果的可靠性，同時(shí)還樣品前處理過程大大簡(jiǎn)化，尤其適用 于肌肉和肝中微量鹽霉素和甲基鹽霉素的前處理，分析質(zhì)量得到改善。免疫親和吸 附劑的高選擇性使得鹽霉素分析方法的檢測(cè)限將主要取決于取樣量，這是單純理化 手段難以達(dá)到的；本發(fā)明的免疫親和吸附劑及色譜柱對(duì)待測(cè)組分有很強(qiáng)的保留和濃 縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實(shí)測(cè)樣品條件下免疫親和吸附劑對(duì)組分的保 留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發(fā)明的提取方法對(duì)組分凈化的同時(shí) 還可提供定性信息，方法操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，免疫親和色譜柱能重復(fù)使用，能 節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，降低分析成本和環(huán)境污染。本發(fā)明檢測(cè)法可高效檢測(cè)鹽霉素 和甲基鹽霉素的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測(cè)定技術(shù)直接測(cè)定樣本的信息量太少、定量 準(zhǔn)確性差，或理化方法選擇性低等不足。因此，本發(fā)明免疫親和吸附劑、色譜柱和 試劑盒，及提取和檢測(cè)動(dòng)物樣品中鹽霉素類化合物的方法適合于推廣應(yīng)用。


圖1為鹽霉素和甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品5Pg/kg的色譜圖。 圖2為未添加鹽霉素和甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肌肉組織的液相色譜圖。 圖3為添加5Pg/kg鹽霉素和甲基鹽霉素樣品雞肌肉組織的液相色譜圖。 圖4為鹽霉素和甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品25Pg/kg的色譜圖。 圖5為未添加鹽霉素和甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肝臟液相色譜圖。 圖6為添加25Pg/kg鹽霉素和甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肝臟液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料 試劑等如無特殊說明，均可從市面公司購(gòu)買得到。
實(shí)施例1、凈化鹽霉素和甲基鹽霉素的免疫色譜柱的制備鹽霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為53003-10-4。 一、鹽霉素單克隆抗體的制備
(一)鹽霉素半抗原的合成 將鹽霉素和氯化亞砜通過縮合反應(yīng)得到鹽霉素酰氯，再將鹽霉素酰氯與氨基乙 酸反應(yīng)得到鹽霉素半抗原。
半抗原合成的具體步驟為
(1) 鹽霉素與氯化亞砜以1: 1的摩爾比攪袢混合均勻，在室溫(25°C)條件 下反應(yīng)4小時(shí)，得到鹽霉素酰氯；
(2) 鹽霉素酰氯與氨基乙酸以1: 1的體積比例混合均勻，加入吡啶進(jìn)行催化，
在冰浴條件下攪拌反應(yīng)，得到鹽霉素半抗原。
- (二)免疫原的合成
采用碳化二亞胺法將鹽霉素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原合成的具體步驟
(1) 取鹽霉素半抗原5mg溶于0.5ml N， N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再向其中 加入25mg碳化二亞胺(DEC)，室溫(25°C)條件下活化反應(yīng)30 rain得到I液；
(2) 取卵清蛋白20mg，用2.7mlpH8.0 PBS液溶解，得到II液；
(3) 將I液加到II液后，室溫(25°C)攪拌反應(yīng)過夜，得到免疫原。 利用紫外吸收光譜對(duì)半抗原與載體蛋白進(jìn)行鑒定，并按下面的公式計(jì)算結(jié)合比
(每分子載體蛋白連接的半抗原數(shù)目)。
y偶合物-y載體^ 結(jié)合比=^ (Z為摩爾吸光系數(shù))
得到的免疫原中半抗原與OVA的摩爾結(jié)合比為11: 1。
合成的免疫原采用免疫電泳測(cè)定其純度為98. 6%。
(三) 動(dòng)物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以鹽霉素半抗原與卵清蛋 白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100嗎/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑 混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏 不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
(四) 細(xì)胞融合取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5: 1比例(數(shù)量配比)與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合。
雜交瘤細(xì)胞克隆化采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用 有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株命名為鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3，該細(xì)胞株已于2008年7 月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2587。
(五) 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 C-3-3 CGMCC No.2587用凍存液制成5Xl()6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在 液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液 后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
(六) 單克隆抗體的制備與純化
增量培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 2587置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37"C條件 下進(jìn)行培養(yǎng)，用下述辛酸-飽和硫酸銨法和DEME纖維素離子交換層析法將得到的培
養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，-2(rc保存。
所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血 清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (體積百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中 的終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7. 4。
1、 SAS鹽析1) 50%飽和度鹽析:取上述細(xì)胞培養(yǎng)液5ml，加等量0. 01 mol/L、 pH7.4的PBS (lL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0.2g，氯化鈉8.8g)混勻，然后逐漸滴加等體積的飽和硫酸銨(pH7.4)溶液(使 硫酸銨溶液的飽和度達(dá)到50%)，邊加邊攪拌，室溫放置30min， 3000g離心30min， 棄上清液留沉淀。2) 33%飽和度鹽析在步驟l)得到的沉淀中分別加入5ra10.01 mol/L PBS (lL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化鉀 0.2g，氯化鈉8.8g)溶解沉淀，再加飽和硫酸銨溶液達(dá)到33%飽和度，邊加邊攪 拌，室溫放置30min，棄上清液留沉淀。重復(fù)操作2次。3)脫鹽取0.01 mol/L、 pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0. 2g，氯化鈉8. 8g)溶解步驟2)得到的沉淀，裝于透析袋中，懸于盛有0. 01 mol/L、 pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0.2g，氯化鈉8.8g)的燒杯中脫鹽，放置于4。C，每天換液3 — 4次，l%BaCl2 檢測(cè)直至透析液中無硫酸根離子為止。4)透析完畢，3000g離心5min，取上清液 置-2(TC冰箱保存，進(jìn)行DEME-纖維素離子交換層析。
(2) DEME-纖維素離子交換層析1) DE-52纖維素的處理稱取2g DE-52纖維素粉末，置于盛有重蒸餾水的燒杯中，充分?jǐn)嚢瑁o置后去掉多余溶液，然后加
入800ral 0.5mol/LNa0H溶液，攪拌均勻，lh后布氏漏斗抽濾，接著用重蒸水充分 洗滌至中性。再用0.5mol/LHCl溶液以同樣的方法處理。最后換用0. 5mol/L NaOH 溶液處理一次，充分水洗至中性。2)平衡將經(jīng)步驟l)處理的DE-52纖維素浸泡 于0. 01 mol/L、 PH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g， 12水合磷酸氫二 鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)中，充分洗滌，靜置后去掉多余溶液，如此 反復(fù)2-3次，直至上清液pH達(dá)到7.4為止。3)裝柱將平衡后的DE-52纖維素用 滴管連續(xù)加入層析柱中，用洗脫液(lL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g， 12水合磷酸 氫二鈉2.服g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g， pH7.4)連續(xù)洗脫，充分流洗，直到流 出液pH值與洗脫液的pH值相同為止。4)加樣將經(jīng)步驟(1) SAS鹽析得到的抗體 用0.01mol/L、 pH7.4的磷酸鹽緩沖液(lL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g， 12水合 磷酸氫二鈉2. 86g，氯化鉀0. 2g，氯化鈉8. 8g))稀釋，然后沿層析柱壁緩慢加入， 打開層析柱出口，讓抗體稀釋液流入柱床內(nèi)，再用磷酸鹽緩沖液沖洗柱壁。5)洗 脫和收集:加入洗脫液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 86g, 氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g， pH7.4)，每管2ml收集，邊收集邊用20%磺基水楊酸 檢測(cè)抗體洗脫情況。6)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體溶液在280nm和260nm處的OD 值，得到純化的鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No.2587分泌的單克 隆抗體，純化后的單抗在-2(TC冰箱保存。
(七)單抗對(duì)甲基鹽霉素、馬杜霉素、莫能菌素的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587產(chǎn)生的鹽霉素單 克隆抗體對(duì)甲基鹽霉素、馬杜霉素、莫能菌素的交叉反應(yīng)?？贵w抑制物分別采用倍 比稀釋的甲基鹽霉素、馬杜霉素、莫能菌素；具體步驟為①用包被液將抗原(鹽 霉素)稀釋成適當(dāng)濃度，以每孔100 uL的量加入酶聯(lián)反應(yīng)板中；②放入37 r溫 箱中2 h，取出后倒掉余液并用200 ^ /孔的洗液洗板三次，間隔每次3 min，之 后拍干；③每孔加入150 liL的封閉液放入37 "C溫箱2 h，取出后直接拍干； 加入倍比稀釋的甲基鹽霉素、馬杜霉素、莫能菌素每孔50化；⑤同時(shí)向每孔加入上 述由鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體，每 孔50叱；37。C溫育30 min;用洗滌液洗板4次，甩干；⑥每孔加入100 u L的酶 標(biāo)二抗，放入37 。C溫箱30min，取出后洗滌同上，之后拍干；⑦每孔加入四甲基 聯(lián)苯胺(TMB)溶液IOO uL，放入37 。C溫箱15 min，取出后每孔加入50 uL終 止液；⑧用酶標(biāo)儀中測(cè)定光密度值。根據(jù)以下公式，分別根據(jù)IC5。 (ng/mL)計(jì)算交叉反應(yīng)率:
交叉反應(yīng)率(％) =T，5。, = 、 X100%
IC50 (競(jìng)爭(zhēng)物)
鹽霉素單克隆抗體對(duì)甲基鹽霉素、馬杜霉素、莫能菌素的交叉反應(yīng)分別為80%， 1%， 0.1%。表明，本發(fā)明單抗對(duì)鹽霉素和甲基鹽霉素的特異性強(qiáng)。 二、免疫色譜柱(IAC)的制備
基質(zhì)的準(zhǔn)備取2克溴化氰活化的S印harose 4B干凍粉，在盛有1. Ommol l一 加1的G3漏斗中膨脹。用200mL l.Ommol 1—加1充分洗滌，整個(gè)過程不超過15分 鐘。
抗體的準(zhǔn)備用5ml0. lmol/L的NaHC03溶液(含0. 5mol/L的NaCl， pH 8. 4) 將35mg純化的鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克 隆抗體稀釋。
偶聯(lián)反應(yīng)將膨脹的溶膠用0. lmol/L的NaHC03溶液(含0. 5mol/L的NaCl， pH 8.4)平衡后，轉(zhuǎn)入上述單克隆抗體稀釋液中溴化氰活化的S印harose 4B干凍粉與 純化抗體的質(zhì)量比為2g: 35mg，混合，4。C下150rpm攪拌20 —24hr。
反應(yīng)液轉(zhuǎn)入G3漏斗中，用100 mL 0.01 M， pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液(1 L水溶 液中含有磷酸二氫鉀0. 27 g， 12水合磷酸氫二鈉2. 86 g，氯化鉀0. 2 g，氯化鈉 8.8g)洗滌，收集洗滌液，紫外鑒定，將洗滌液稀釋后分別測(cè)其260nm、 280nm的
紫外吸光度。計(jì)算單抗量的公式為
單抗量=(1.45XOD28。nm-0. 74X0D26。nJ X稀釋倍數(shù)X溶液的體積 計(jì)算偶聯(lián)率計(jì)算公式為
偶聯(lián)前單抗總量一未偶聯(lián)單抗量
偶聯(lián)率(％) = - xi00%
偶聯(lián)前單抗總量
三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的偶聯(lián)率檢測(cè)結(jié)果表明，鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體與溴化氰活化的S印harose 4B的偶聯(lián)率是94%。
活化位點(diǎn)的封閉將上述偶聯(lián)后的凝膠轉(zhuǎn)入0. lmol/L的Tris—HCl緩沖液(含 0.5mol/L的NaCl， pH 8.0)中，混合，4。C下緩慢攪拌2hr，以封閉未偶聯(lián)的活化 位點(diǎn)。洗滌:凝膠用5倍體積的0. lmol/L醋酸鹽緩沖液(含0. 5mol/L的NaCl， pH 4. 0) 和0. lmol/L Tris—HCl緩沖液(含0. 5mol/L的NaCl， pH 8. 0)交替沖洗3次。用 0.01 mol/L、 pH7.4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g， 12水合磷酸氫二鈉 2.9g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡后，抽干的凝膠轉(zhuǎn)入0.01 mol/L、 pH7.4 的磷酸鹽緩沖液(lL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 9g，氯 化鉀0.2g，氯化鈉8.8g， NaN3 0. 2g)中，4'C下存放備用。
裝柱將偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No.2587分泌的 單克隆抗體的免疫吸附劑轉(zhuǎn)入到含G3濾板的玻璃柱里，制成偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗 體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱(IAC柱)。 (二) IAC柱容量的確定
本實(shí)驗(yàn)中所使用的PBS緩沖液如無特殊說明，均為如下組成1LPBS溶液中 含有磷酸二氫鉀0. 27g， 12水合磷酸氫二鈉2. 9g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8. 8g。
將上述制備的偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分 泌的單克隆抗體的免疫色譜柱，用10ml 0.01 mol/L、 pH7. 4的PBS平衡。
將含有5ug' ml—i鹽霉素(SAL)禾B5ug' ml—1甲基鹽霉素(NAR)的PBS 連續(xù)加到IAC柱，自然重力下流出。
當(dāng)柱達(dá)到飽和后(流出液中樣品濃度和加樣液濃度相同)，先后用10ml PBS、 10ml純水洗滌IAC柱，除去提取液中干擾雜質(zhì)。
最后用6ml甲醇/水(體積比90/10)將SAL、 NAR洗脫，自然重力下流出，收集， 吹干，用lmL甲醇復(fù)溶后取lOO uL進(jìn)HPLC分析。其中，HPLC色譜條件U反相色譜 柱(Supelcosil LC-18 ) (5 u m， 250X 4.6 mm i. d.);流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸 (940-30-30， v: v: v)，采用等度洗脫，流速為lmL/min，溫度室溫25。C;衍 生化試劑為甲醇300mL中緩慢加入10mL硫酸，混勻待溫度降至室溫后，加入20g香草 醛，混勻，流速為O. 5mL/min，衍生化溫度95。C;檢測(cè)波長(zhǎng)520nm。
計(jì)算出動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量。動(dòng)態(tài)柱容量(dynamic column capacity)是 指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對(duì)待測(cè)物的最大吸收值。其計(jì)算公式為
^士 a , , T、 藥物濃度(ng/mL) x體積(mL) 動(dòng)態(tài)柱谷雖(ng/m。= 柱床體積(mL)
絕對(duì)柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗體對(duì)待測(cè)物的最大 結(jié)合容量。其計(jì)算公式為幼^A一旦，，，"、 動(dòng)態(tài)柱容量(ng/mL) 絕對(duì)柱容量(ng/mglgG)=--
單位體積凝膠IgG偶聯(lián)量(mg/mL)
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果表明偶聯(lián)有雜交瘤細(xì)胞株鹽霉素單克隆 抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的動(dòng)態(tài)柱 容量和絕對(duì)柱容量分別為1800ng/mL、 192ng/mL (SAL) , 2000ng/mL、 213ng/mL (NAR)。
實(shí)施例2、含有實(shí)施例1中免疫色譜柱的試劑盒的制備及其對(duì)鹽霉素和甲基鹽 霉素的凈化效果
1、 凈化鹽霉素和甲基鹽霉素的試劑盒的制備
該試劑盒由免疫色譜柱(IAC柱)，鹽霉素、甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，洗滌液， 洗脫液，保存液，海綿托架所組成，海綿托架上設(shè)有孔和凹槽。海綿托架的凹槽內(nèi) 有裝有鹽霉素、甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，洗滌液，洗脫液，保存液的試劑瓶，海綿托 架的孔內(nèi)裝有IAC柱。其中免疫色譜柱為實(shí)施例1制備的偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體 雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No.2587分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱。
所述洗滌液為含有終濃度為0. 27g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 9g/L的12水 合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 2g /L的氯化鉀、終濃度為8. 8g /L的氯化鈉、0. 01M、 pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液；所述終濃度均為各物質(zhì)在所述洗滌液中的濃度；
所述洗脫液為甲醇與水以9: l體積比混合的溶液；
所述保存液為含有終濃度為0. 27g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 9g/L的12水 合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 2g /L的氯化鉀、終濃度為8. 8g /L的氯化鈉、終濃度 為0. 2g/L的NaN3、 0. 01M、 pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述終濃度均為各物質(zhì)
在所述保存液中的濃度；
將含有偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單 克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒分別放在4"C，有效期為12個(gè)月。
2、 鹽霉素、甲基鹽霉素的提取效果實(shí)驗(yàn)
IAC提取原理是，將特異性抗體鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體和惰性基質(zhì)偶聯(lián)，制備免疫吸附劑，裝柱。當(dāng)含鹽霉素 和甲基鹽霉素的混合物流過IAC柱時(shí)，固定抗體選擇性地結(jié)合鹽霉素和甲基鹽霉素， 其它不被識(shí)別的樣品雜質(zhì)則不受阻礙地流出IAC柱，經(jīng)洗滌后，將抗原-抗體復(fù)合 物解離洗脫，鹽霉素和甲基鹽霉素得到凈化或分離。IAC柱經(jīng)再生處理后可重復(fù)使 用。檢測(cè)樣品的處理
1) 分別取不含鹽霉素和甲基鹽霉素的雞肌肉和雞肝臟組織置于勻漿機(jī)中，于
10000rpm下勻漿3分鐘。置于一20。C保存?zhèn)溆谩?br> 2) 未添加鹽霉素和甲基鹽霉素的樣品處理分別稱取5.0克已勻漿的雞肌肉 和雞肝臟組織樣品，分別置于100ml聚丙烯離心管中，再分別向管中加入10g無水 硫酸鈉，用玻璃棒搗勻，靜置5min后加入20ml乙腈(肌肉)或甲醇(肝臟)，渦 動(dòng)混勻，振蕩20分鐘，3500g離心10分鐘，取上清液，重復(fù)提取一次，合并上清， 將其裝入雞心瓶。50。C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至余2-3ml，將其轉(zhuǎn)至10ml離心管，用2ml甲醇洗 滌雞心瓶后并入，3500g離心10分鐘，將上清加至20ml PBS中，混勻，得到樣品 溶液。
添加鹽霉素和甲基鹽霉素的樣品處理分別稱取5.0克已勻漿的雞肌肉和雞肝 臟組織樣品，分別置于100ml聚丙烯離心管中，向管中添加鹽霉素和甲基鹽霉素標(biāo) 準(zhǔn)品，使鹽霉素和甲基鹽霉素在雞肌肉勻漿中的終濃度均為5Pg/kg，使鹽霉素和甲 基鹽霉素在雞肝臟組織中的終濃度均為25Pg/kg，再分別向管中加入10g無水硫酸 鈉，用玻璃棒搗勻，靜置5min后加入20ml乙腈(肌肉)或甲醇(肝臟)，渦動(dòng)混 勻，振蕩20分鐘，3500g離心10分鐘，取上清液，重復(fù)提取一次，合并上清，將 其裝入雞心瓶。5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至余2-3ml，將其轉(zhuǎn)至10ml離心管，用2ml甲醇洗滌 雞心瓶后并入，3500g離心10分鐘，將上清加至20ml PBS中，混勻，得到樣品溶 液。
將偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆 抗體的免疫色譜柱平衡到室溫，然后將上述的樣品溶液過柱，用10ml洗滌液、10ml 純水洗滌，目的是為了除去非特異性吸附的雜質(zhì)。用6ml洗脫液洗脫，在5(TC N2 氣流下吹干，然后用lmL甲醇復(fù)溶(肝臟樣品用lmL甲醇/水(90/10， v/v)復(fù)溶)， 過0.2um有機(jī)濾膜后取100 uL進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定鹽霉素和甲基鹽霉素的含量。
其中，肌肉樣品的色譜條件為流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸(940-30-30， v: v: v)， 采用等度洗脫，流速為lmL/min，溫度室溫；衍生化試劑為甲醇300mL中緩慢加入 10mL硫酸，混勻待溫度降至室溫后，加入20g香草醛，混勻，流速為O. 5mL/min，衍 生化溫度95。C;檢測(cè)波長(zhǎng)520nm。
肝臟樣品的色譜條件為流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸(935-50-15 ， V: V: V)， 采用等度洗脫，流速為O. 8mL/min，溫度室溫；衍生化試劑為甲醇500mL中緩慢加入10mL硫酸，混勻待溫度降至室溫后，加入20g香草醛，混勻，流速為O. 7mL/min， 衍生化溫度95°C。
標(biāo)準(zhǔn)品的色譜條件為Cw反相色譜柱(Supelcosil LC-18 ) (5 u m， 250X 4. 6 mmi.d.);流動(dòng)相為甲醇-水-乙酸(940-30-30， v: v: v)，采用等度洗脫，流速 為lmL/min，溫度室溫；衍生化試劑為甲醇300mL中緩慢加入10mL硫酸，混勻待溫 度降至室溫后，加入20g香草醛，混勻，流速為O. 5mL/min，衍生化溫度95'C;檢 測(cè)波長(zhǎng)520nm。 IAC柱用20ml的保存液平衡保存于4'C備用。鹽霉素5^g/kg和甲基 鹽霉素5Pg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜如滅l所示；鹽霉素25Pg/kg和甲基鹽霉素25lVkg標(biāo)準(zhǔn) 品的圖譜如圖4所示。
結(jié)果表明，用IAC進(jìn)行樣品凈化，不干擾藥物色譜峰，能夠完全分離，說明制 備的IAC非特異性吸附極小。其中偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗體的免疫親和色譜柱對(duì)于未添加鹽霉素和甲基鹽霉 素的雞肌肉的凈化效果如圖2所示，添加鹽霉素和甲基鹽霉素的雞肌肉的凈化效果 圖3所示；偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單
克隆抗體的免疫親和色譜柱對(duì)于未添加鹽霉素和甲基鹽霉素的雞肝臟的凈化效果 如圖5所示，對(duì)于添加鹽霉素和甲基鹽霉素的雞肝臟的凈化效果圖6所示。 實(shí)施例3、用實(shí)施例2中所述試劑盒檢測(cè)樣品中的鹽霉素和甲基鹽霉素
1、 樣品前處理
1) 分別取雞肌肉和雞肝臟組織置于勻漿機(jī)中，于10000rpra下勻漿3分鐘。置 于一2(TC保存?zhèn)溆谩?br> 2) 分別稱取5.0克已勻漿的雞肌肉和雞肝臟組織樣品，分別置于100ml聚丙 烯離心管中，再分別向管中加入10g無水硫酸鈉，用玻璃棒搗勻，靜置5min后加 入20ml乙腈(肌肉)或甲醇(肝臟)，渦動(dòng)混勻，振蕩20分鐘，3500g離心10 分鐘，取上清液，重復(fù)提取一次，合并上清，將其裝入雞心瓶。5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至余 2-3ml，將其轉(zhuǎn)至10ml離心管，用2ml甲醇洗滌雞心瓶后并入，3500g離心10分鐘， 將上清加至20ml PBS中，混勻，得到樣品溶液。
2、 鹽霉素和甲基鹽霉素的提取
將偶聯(lián)有鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆 抗體的免疫色譜柱平衡到室溫，然后將上述的樣品溶液過柱，用10ml洗滌液、lOml 純水洗滌，目的是為了除去非特異性吸附的雜質(zhì)。用6ml洗脫液洗脫，在5(TC N2氣流下吹干，然后用lmL甲醇復(fù)溶(肝臟樣品用lmL甲醇/水(90/10， v/v)復(fù)溶)， 過0.2um有機(jī)濾膜，得到鹽霉素和甲基鹽霉素提取液，取IOO PL進(jìn)行后續(xù)分析。 3、 HPLC分析，測(cè)定鹽霉素和甲基鹽霉素的含量。
權(quán)利要求
1、一種用于自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的免疫親和吸附劑，它是由固相載體和與其偶聯(lián)的鹽霉素單克隆抗體組成；所述鹽霉素單克隆抗體是以鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的抗體；所述鹽霉素類化合物為鹽霉素或甲基鹽霉素。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述鹽霉素半抗原是通過將 鹽霉素和氯化亞砜縮合反應(yīng)得到鹽霉素酰氯，再將所述鹽霉素酰氯與氨基乙酸反應(yīng) 得到的；所述鹽霉素單克隆抗體為鹽霉素鼠單克隆抗體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的吸附劑，其特征在于所述鹽霉素單克隆抗體是由 鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌產(chǎn)生。
4、 以權(quán)利要求1-3中任一所述的免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱。
5、 含有權(quán)利要求1-3中任一所述的免疫親和吸附劑的試劑盒或含有權(quán)利要求4 所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗脫液、 洗滌液和保存液；所述洗滌液為含有終濃度為0. 2-0. 3g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 5-3. 5g/L 的12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 1-0. 3g /L的氯化鉀、終濃度為8. 0-9. 5g /L 的氯化鈉、0.01-0.02M、 pH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液；所述終濃度均為各物 質(zhì)在所述洗滌液中的濃度；所述洗脫液為甲醇與水以8-10: 1體積比混合的溶液；所述保存液為含有終濃度為0. 2-0. 3g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 5-3. 5g/L 的12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 1-0. 3g /L的氯化鉀、終濃度為8. 0-9. 5g /L 的氯化鈉、終濃度為0. 1-0. 3g /L的NaN3、 0. 01-0. 02M、 pH值為7. 2-7. 6的磷酸 鹽緩沖液；所述終濃度均為各物質(zhì)在所述保存液中的濃度；所述洗滌液優(yōu)選為含有終濃度為0. 27g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 9g/L的 12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0. 2g /L的氯化鉀、終濃度為8. 8g /L的氯化鈉、0. 01M、 pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液；所述洗脫液優(yōu)選為甲醇與水以9: l體積比混合的溶液；所述保存液優(yōu)選為含有終濃度為0. 27g/L的磷酸二氫鉀、終濃度為2. 9g/L的12水合磷酸氫二鈉、終濃度為0.2g/L的氯化鉀、終濃度為8.8g/L的氯化鈉、終 濃度為0. 2g /L的NaN3、 0. OIM、 pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液。
7、 一種自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法，包括以下步驟1) 樣品的前處理取動(dòng)物組織勻漿，加入硫酸鹽，再加入提取液進(jìn)行提取，然后進(jìn)行離心力是3000 g -4000g的離心，取上清液作為樣品溶液；所述提取液為乙腈或甲醇；所述離心 力優(yōu)選為3500g;2) 將步驟1)得到的樣品溶液與PBS緩沖液混合，過權(quán)利要求4所述的免疫親 和色譜柱，然后依次用權(quán)利要求6中所述的洗滌液、水、權(quán)利要求6中所述的洗脫 液進(jìn)行洗脫，收集得到鹽霉素類化合物溶液；所述鹽霉素類化合物為鹽霉素或甲基 鹽霉素。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物組織樣品包括肌肉、肝。
9、 一種檢測(cè)動(dòng)物樣品中鹽霉素類化合物含量的方法，是用權(quán)利要求7或8中 所述方法從動(dòng)物樣品中提取得到鹽霉素類化合物后，再對(duì)所述鹽霉素類化合物的量 進(jìn)行檢測(cè)。
10、 由鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587分泌的單克隆抗 體或鹽霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株C-3-3 CGMCC No. 2587。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的方法及其專用免疫親和吸附劑。該用于自動(dòng)物樣品中提取鹽霉素類化合物的免疫親和吸附劑，是由固相載體和與其偶聯(lián)的鹽霉素單克隆抗體組成；所述鹽霉素單克隆抗體是以鹽霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的抗體；所述鹽霉素類化合物為鹽霉素或甲基鹽霉素。本發(fā)明的免疫親和吸附劑及色譜柱使用了高特異性的鹽霉素單克隆抗體，具有高選擇性，保證了檢測(cè)效果的可靠性，同時(shí)還樣品前處理過程大大簡(jiǎn)化，尤其適用于肌肉和肝中微量鹽霉素和甲基鹽霉素的前處理，分析質(zhì)量得到改善。本發(fā)明檢測(cè)法可高效檢測(cè)鹽霉素和甲基鹽霉素的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測(cè)定技術(shù)直接測(cè)定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確性差，或理化方法選擇性低等不足。因此，本發(fā)明免疫親和吸附劑、色譜柱和試劑盒，及提取和檢測(cè)動(dòng)物樣品中鹽霉素類化合物的方法適合于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07D493/20GK101433825SQ20081022778
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者萬宇平, 馮才偉, 史為民, 張素霞, 曹興元, 李建成, 江海洋, 沈建忠, 王戰(zhàn)輝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)