專利名稱：：林蛙抗癌肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于抗癌藥物及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗癌活性的林蛙抗癌肽藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：林蛙(W""ac/ze"w'"e"w、)是我國(guó)東北地區(qū)長(zhǎng)白山麓藥、食兩用的珍貴蛙種。林蛙是兩棲類動(dòng)物，生存環(huán)境復(fù)雜多樣，它們的皮膚在維持它們生存和適應(yīng)廣闊棲息地中起著重要作用，為了適應(yīng)存環(huán)境，蛙類的皮膚中分布了種類繁多、具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，是一個(gè)巨大的生物活性分子資源庫(kù)和藥物資源庫(kù)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)林蛙干皮抗菌肽進(jìn)行了研究，申報(bào)的專利也在增多，其中CN1216768A"生物抗菌肽及其制備方法"是涉及一種具有廣譜抗菌活性的林蛙蛙皮生物抗菌肽及其制備方法；CN1583166A"林蛙抗菌肽噴霧劑及其制備方法"、CN1583165A"林蛙抗菌肽凝膠劑及其制備方法"是涉及保護(hù)林蛙皮膚抗菌肽以噴霧劑和凝膠劑兩種形式用于臨床皮膚感染、燒傷燙傷感染領(lǐng)域；CN1679632A"林蛙鎮(zhèn)痛水提物及其制備方法及"是關(guān)于保護(hù)從林蛙干皮中提取的一種具有鎮(zhèn)痛作用的林蛙鎮(zhèn)痛水提物及其制備技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有抗癌藥物的不足，提供一種林蛙抗癌肽及其制備方法，該抗癌肽具有用量少，對(duì)多種癌細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷力，不損傷正常細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的林蛙抗癌肽具有如下特征以林蛙皮膚為原料于pH3-5酸化乙醇中浸提，將提取液離心后得上清液，上清液凍干濃縮，溶于蒸餾水中配制成溶液，經(jīng)凝膠柱層析，l-3M醋酸為洗脫液，280nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，分離得到分子量為l-10kD具有抗癌活性的肽，凍干濃縮為白色粉未，其在pH3-10范圍內(nèi)具有活性，pH值為5時(shí)活性最強(qiáng)，于0l(TC保存24個(gè)月仍有活性。本發(fā)明涉及的林蛙抗癌肽以林蛙皮為原料，其制備方法如下1、將林蛙皮加入2-10倍體積的酸化乙醇，于4-2(TC浸提24-72小時(shí)。其中酸化乙醇為0.5-5M鹽酸與乙醇調(diào)室pH值4-5或0.5-5M醋酸與乙醇調(diào)至pH值3-4為宜；2、上述提取液在3000-8000rpm下離心10-60min，收集上清液；3、沉淀重復(fù)2-3次步驟l和2;4、合并上清液凍干濃縮；5、凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液；6、上述溶液經(jīng)SephadexG-50凝膠柱層析，4-10。C條件下層析分離。凝膠柱以1-3M醋酸平衡，上樣，l-3M醋酸洗脫，流速為0.卜0.6ml/min，收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，收集分子量為l-10kD的活性組分，見圖l;凝膠柱還可以為SephadexG-25或SephadexG-75。7、活性組分透析脫鹽，冷凍干燥；于-2(TC保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。本發(fā)明林蛙抗癌肽，體內(nèi)和體外的抗癌作用研究表明林蛙抗癌肽對(duì)s咖胃肉瘤、白血病K562細(xì)胞、乳腺癌MCF"7細(xì)胞、卵巢癌SKOV3細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞和肝癌7721細(xì)胞均有明顯的抑制生長(zhǎng)作用；并能誘導(dǎo)K562腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞膜破損、細(xì)胞變形或出現(xiàn)胞芽和縊痕，細(xì)胞皺縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質(zhì)濃集、邊聚化，胞質(zhì)空泡化等。本發(fā)明所述的林蛙抗癌肽，其主要用于制備抗癌藥物或保健食品。圖1林蛙抗癌肽SephadexG-50柱層析圖圖2對(duì)照組K562細(xì)胞；圖3絲裂霉素作用的K562細(xì)胞圖4林蛙抗癌肽作用的K562細(xì)胞圖5林蛙抗癌肽作用K562細(xì)胞24h、48h、72h后DNA電泳具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的制備方法，并不是用來限制發(fā)明的范圍。實(shí)施例l1、將100g林蛙皮加入1000mL酸化乙醇(乙醇與0.5M鹽酸配至pH值為4)于4'C浸提24小時(shí)；2、提取液在3000rpm離心80min，收集上清液，沉淀；3、沉淀再加入1000mL酸化乙醇，于4。C浸提24小時(shí)；4、提取液在3000rpm離心10min，收集上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?、合并兩次獲得的上清液，凍干濃縮；6、凍干粉lg溶于蒸餾水10ml中配成濃度為100mg/mL的溶液；7、上述溶液經(jīng)SephadexG-50凝膠柱層析，4"C條件下層析分離。以1M醋酸平衡后，將已制備好的100mg/mL的中國(guó)林蛙皮膚生物活性肽的粗提液上樣，1M醋酸洗脫，流速為0.5ml/min，以試管收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，測(cè)活，收集分子量l-10kD的活性組分；8、活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；于-20。C保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌實(shí)施例2(最佳方案)1、將500g林蛙皮加入1000ml酸化乙醇(乙醇和0.7M鹽酸配至PH值4.5)，于2(TC下浸提48小時(shí)；2、上述提取液在5000rpm下離心30min，分別收集上清液和沉淀；3、沉淀加入酸化乙醇1000mL，于常溫下浸提48小時(shí)；并重復(fù)1-3步驟1次；4、合并3次獲得的上清液凍干濃縮；5、凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為10mg/ml溶液；6、上述溶液經(jīng)SephadexG-50凝膠柱層析，4。C條件下層析分離以2M醋酸平衡后，將已制備好的10mg/mL的中國(guó)林蛙皮膚生物活性肽的粗提液上樣，2M醋酸洗脫，流速為0.25ml/min，以試管收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，測(cè)活，收集分子量l-10kD的活性組分；7、活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；于-20。C保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。實(shí)施例31、取20g林蛙皮加入100ml酸化乙醇(乙醇與5M鹽酸調(diào)至pH值5)中，于4"C浸提72小時(shí)；2、提取液在8000rpm下離心10min，分別收集上清液和沉淀；3、沉淀重復(fù)1和2步驟1次；4、將兩次獲得的上清液合并，凍干濃縮；5、凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為20mg/ml的溶液；6、上述溶液經(jīng)SephadexG-50凝膠柱層析，l(TC條件下層析分離。以3M7醋酸平衡后，將已制備好的20mg/mL的屮國(guó)林蛙皮膚生物活性肽的粗提液上樣，3M醋酸洗脫，流速為3ml/8min，以試管收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，測(cè)活，收集活性組分收集分子量l-10kD活性組分；7、活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；于-2(TC保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。實(shí)施例41、將500g林蛙皮加入1000ml酸化乙醇(乙醇和0.5M醋酸配至PH值3)，于20。C下浸提48小時(shí)；2、上述提取液在5000rpm下離心30min，分別收集上清液和沉淀；3、沉淀加入酸化乙醇1000mL,于常溫下浸提48小時(shí)；并重復(fù)1-3步驟1次；4、合并3次獲得的上清液凍干濃縮；5、凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為10mg/ml溶液；6、上述溶液經(jīng)SephadexG-50凝膠柱層析，以2M醋酸平衡后，將己制備好的10mg/mL的中國(guó)林蛙皮膚生物活性肽的粗提液上樣，2M醋酸洗脫，流速為0.25ml/min，以試管收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，測(cè)活，收集分子量l-10kD的活性組分；7、活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；于-20。C保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。實(shí)施例51、將500g林蛙皮加入1000ml酸化乙醇(乙醇和2M醋酸配至pH值3.5)，于2(TC下浸提48小時(shí)；2、上述提取液在5000rpm下離心30min，分別收集上清液和沉淀；3、沉淀加入酸化乙醇1000mL，于常溫下浸提48小時(shí)；并重復(fù)1-3步驟1次；4、合并3次獲得的上清液凍干濃縮；5、凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為10mg/ml溶液；6、上述溶液經(jīng)S印hadexG-25凝膠柱層析，以2M醋酸平衡后，將已制備好的10mg/mL的中國(guó)林蛙皮膚生物活性肽的粗提液上樣，2M醋酸洗脫，流速為0.25ml/min，以試管收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，測(cè)活，收集分子量l-10kD的活性組分；7、活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；于-2(TC保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。實(shí)施例61、將500g林蛙皮加入1000ml酸化乙醇(乙醇和5M醋酸配至pH值4)，丁-2(TC下浸提48小時(shí)；2、上述提取液在5000rpm下離心30min，分別收集上清液和沉淀；3、沉淀加入酸化乙醇1000mL，于常溫下浸提48小時(shí)；并重復(fù)1-3步驟1次；4、合并3次獲得的上清液凍千濃縮；5、凍干粉溶于蒸餾水中配成濃度為10mg/ml溶液；6、上述溶液經(jīng)SephadexG-75凝膠柱層析，以2M醋酸平衡后，將已制備好的10mg/mL的中國(guó)林蛙皮膚生物活性肽的粗提液上樣，2M醋酸洗脫，流速為0.25ml/min,以試管收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，測(cè)活，收集分子量l-10kD的活性組分；7、活性組分透析脫鹽，凍干濃縮；于-2(TC保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。林蛙抗癌肽的抗癌實(shí)驗(yàn)1、林蛙抗癌肽體內(nèi)抗癌活性的研究材料和方法林蛙抗癌肽由上述試驗(yàn)方法制備。將林蛙抗癌肽用蒸餾水配制成2.5、5、10mg/mL的溶液，用無菌的0.45pm的濾菌膜過濾，制備成無菌樣品注射液；試驗(yàn)選用BALB-c小鼠體重20士lg，雌雄各半，清潔級(jí)；胃肉瘤細(xì)胞株Siso。S咖腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代S^細(xì)胞接種前于RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)液中37。C、5。/。C02條件下復(fù)蘇至狀態(tài)良好，制成5xl(^個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。小鼠腋下常規(guī)消毒，皮下注射癌細(xì)胞懸液0.2mL，使每只小鼠癌細(xì)胞接種量達(dá)到106個(gè)。動(dòng)物分組和接種BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。I組為荷瘤對(duì)照組，每日注射生理鹽水，II組一IV組每日分別注射濃度為2.5、5、10mg/mL林蛙抗癌肽溶液，生理鹽水和樣品溶液的注射劑量均為0.01mL/d/g體重，連續(xù)注射15天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷椎處死小鼠，剝離瘤體，稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率的計(jì)算抑瘤率％=100(A-B)/AA為荷瘤對(duì)照組的平均瘤重；B為給藥組的平均瘤重表1林蛙抗癌肽對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用(n=10，_x—±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a:PO.Ol相對(duì)于荷瘤對(duì)照組結(jié)果與分析表1可以看出，中國(guó)林蛙皮膚生物活性肽對(duì)S，胃肉瘤細(xì)胞的抑制作用表現(xiàn)了一定的劑量依賴性，但是其對(duì)S18。胃肉瘤細(xì)胞的抑制在5mg/mL時(shí)就己經(jīng)達(dá)到了最好的作用效果。2、林蛙抗癌肽體外抗癌活性的研究材料和方法林蛙抗癌肽由上述試驗(yàn)方法制備。試驗(yàn)瘤株為K562細(xì)胞株、7721細(xì)胞株、Hela細(xì)胞株和SKOV3細(xì)胞株，HepG2細(xì)胞株和MCF7細(xì)胞株。藥物濃度的篩選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期癌細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中(lxl0、weir1)，每孔20(HiL，培養(yǎng)24h后，分別加入5、10、20mg/mL不同濃度己除菌的林蛙抗癌肽，陽性對(duì)照藥物選取絲裂霉素，其濃度為0.13mg/mL，經(jīng)0.45pm濾膜除菌后，每孔加藥量為4pL，陽性對(duì)照組和各個(gè)濃度的林蛙抗癌肽設(shè)平行孔5個(gè)，將正常K562細(xì)胞組作為陰性對(duì)照組。于37t:、5%<:02條件下繼續(xù)培養(yǎng)至20h、44h和68h,每孔加5mg/mLMTT20nL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，分別收集每孔細(xì)胞，于1000rpm離心10min，棄上清，再加入150pLDMSO溶解，按照原孔位置將溶液解移回培養(yǎng)板中，于酶標(biāo)儀490nm處測(cè)OD值。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察K562細(xì)胞以5xl()S個(gè)細(xì)胞/mL的濃度接入培養(yǎng)瓶中，每瓶3mL，分別加入已除菌的20mg/mL的林蛙抗癌肽60pL，陽性對(duì)照組加入濃度為0.13mg/mL的絲裂霉素60nL，將正常K562細(xì)胞組作為陰性對(duì)照組，培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞，先經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，用乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋后切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，置于JEM-200EX型(JEOL日本電子株式會(huì)社)透射電鏡下觀察形態(tài)改變。細(xì)胞DNA提取及電泳觀察收集經(jīng)過林蛙抗癌肽作用72h后的K562細(xì)胞lxl()6個(gè)，1000rpm離心5min，PBS漂洗1次，加入TE、l%SDS、RNase(5mg/mL)37。C孵育2h。用苯酚/氯仿/異戊醇抽提后，加入冷無水乙醇和1/10體積3MNaAC沉淀DNA，70%乙醇漂洗DNA，干燥后將DNA溶于TE中，置于100V，0.8%瓊脂糖凝膠電泳40min，用EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果與分析(1)林蛙抗癌肽對(duì)多種癌細(xì)胞的抑制作用林蛙抗癌肽不同濃度水平下，加藥后不同培養(yǎng)時(shí)間均能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。不同濃度下均在72h時(shí)抑癌作用最強(qiáng)，藥物濃度為10mg/ml就有較好的抑制效果。林蛙抗癌肽作用丁多種癌細(xì)胞IC5。值為K562細(xì)胞0.1569mg/mL，Hela細(xì)胞0.2352mg/mL，SKOV3細(xì)胞0.1764mg/mL，MCF7細(xì)胞0.1373mg/mL，HepG2細(xì)胞0.2549mg/mL，7721細(xì)胞0.2157mg/mL。(2)林蛙抗癌肽對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的影響見圖2,3，4。終濃度為0.3922mg/mL和0.1961mg/niL的林蛙抗癌肽處理的細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡改變，包括細(xì)胞皺縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質(zhì)濃集、邊聚，形成不同形狀、不同大小的塊狀，胞質(zhì)空泡化等。(3)林蛙抗癌肽對(duì)K562細(xì)胞DNA的影響見圖5，林蛙抗癌肽以終濃度0.1961mg/mL作用于K562細(xì)胞時(shí)，可誘導(dǎo)其發(fā)生DNA片段化。觀察電泳結(jié)果，可見隨時(shí)間的增加，梯帶強(qiáng)度增加，細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)時(shí)效關(guān)系。3抗癌肽穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(l)保存時(shí)間穩(wěn)定性材料和方法凍干的林蛙抗癌肽粉末200克4份，分別保存在-20。C、-4°C、12(TC、4。C和室溫條件下。根據(jù)林蛙抗癌肽體外抗癌活性結(jié)果，取上述條件下保存的林蛙抗癌肽加入雙蒸水，配成濃度10mg/mL的溶液，選用ICso值較小的K562細(xì)胞培養(yǎng)72h進(jìn)行抗癌活性實(shí)驗(yàn)，開始時(shí)每2月進(jìn)行1次，一年后，每個(gè)月進(jìn)行測(cè)定1次，測(cè)定保存24個(gè)月的活性。(2)pH值穩(wěn)定性材料和方法根據(jù)林蛙抗癌肽體外抗癌活性結(jié)果，選用ICso值較小的K562細(xì)胞培養(yǎng)72h進(jìn)行抗癌活性實(shí)驗(yàn)，取等量的抗癌肽粉末，分別用醋酸與蒸餾水調(diào)至pH3.0，pH4.0，pH5.0，pH6.0，pH7.0，pH8.0，pH9.0，pH10.0的溶液溶解，配制成最終濃度為10mg/mL的的溶液。相對(duì)應(yīng)以相同pH值的醋酸-水為陰性對(duì)照。結(jié)果與分析保存時(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果表明，-200°。保存24個(gè)月活性影響不大，但是4'C保存一年后活性明顯降低，室溫下保存半年后活性迅速下降。可見林蛙抗癌肽有較好的時(shí)間穩(wěn)定性，最好在0°C以下保存。pH值穩(wěn)定性結(jié)果表明，pH值的變化對(duì)抗癌肽的活性有一定的影響，當(dāng)pH值為5.0時(shí)活性最強(qiáng)。但是考慮到酸本身對(duì)癌細(xì)胞有一定抑制作用，因此，抗癌活性的測(cè)定選用pH值為7.0。權(quán)利要求1、一種林蛙抗癌肽，其特征在于以林蛙皮膚為原料于酸化乙醇中浸提，將提取液離心后得上清液，上清液濃縮，溶于蒸餾水中配制成溶液，經(jīng)凝膠柱層析，醋酸為洗脫劑，分離得到分子量為1-10kD具有抗癌活性的肽，其在pH3-10范圍內(nèi)具有活性，pH值為5時(shí)活性最強(qiáng)，于-20～0℃保存24個(gè)月仍有活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的林蛙抗癌肽，其特征在于酸化乙醇的pH值為3畫5。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的林蛙抗癌肽，其特征在于洗脫液醋酸的濃度為l-3M，尤其濃度為2M的洗脫效果最好。4、一種制備林蛙抗癌肽方法，其步驟如下-(1)將林蛙皮加入2-10倍體積的酸化乙醇中，于4-20。C浸提24-72小時(shí)(2)提取液在3000-8000rmp下離心10-60分鐘，收集上清液；(3)對(duì)沉淀物重復(fù)2-3次步驟1，2;(4)合并上清液，凍干濃縮；(5)凍干粉溶于蒸餾水中配成溶液；(6)上述溶液經(jīng)凝膠柱層析，4-10。C條件下層析分離。凝膠柱以l-3M醋酸平衡，上樣，l-3M醋酸洗脫，流速為0.125-0.625ml/min，收集洗脫液，每8min收集一管。根據(jù)檢測(cè)器測(cè)得的280nm下的紫外吸收峰合并各組分，收集分子量為l-10kD的活性組分；(7)活性組分透析脫鹽，凍干濃縮，于-20。C保存，得到本發(fā)明的林蛙抗癌肽。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的林蛙抗癌肽的制備方法，其特征在于步驟1中酸化乙醇的pH值為3-5。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的林蛙抗癌肽的制備方法，其特征在于步驟1中酸化乙醇由0.5-5M鹽酸與乙醇調(diào)至pH值為4-5或0.5-5M醋酸與乙醇調(diào)至pH值3-4時(shí)提取的效果較佳。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的林蛙抗癌肽的制備方法，其特征在于步驟6中凝膠柱可為SephadexG-25、SephadexG-50或SephadexG-75，其中SephadexG-50分離效果最好。8、權(quán)利要求1所述的林蛙抗癌肽，作為制備抗癌藥物或保健食品的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種林蛙抗癌肽及其制備方法。本發(fā)明的抗癌肽以林蛙皮為原料，經(jīng)酸化乙醇提取，離心，上清液冷凍干燥后，再用Sephadex柱層析進(jìn)行純化，脫鹽，凍干凝縮，得到具有抗癌活性的林蛙抗癌肽。體內(nèi)外抗癌試驗(yàn)表明，林蛙抗癌肽可以明顯抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明的林蛙抗癌肽可用于制備抗癌藥物或保健食品。文檔編號(hào)C07K14/435GK101445554SQ200810230190公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2008年12月26日優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日發(fā)明者尚德靜申請(qǐng)人:遼寧師范大學(xué)