專利名稱：肝癌治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以利福平或其衍生物為有效成分的肝癌治療劑。

背景技術(shù)：
關(guān)于利福平，已報(bào)告了以下認(rèn)識(shí)。
(1)抗菌作用 利福平是作為抗結(jié)核藥的抗生素而被開發(fā)出來(lái)的。利福平通過(guò)與原核生物的由rpoB基因編碼的DNA依賴性RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，并阻礙RNA合成而顯示抗菌性。
(2)化學(xué)結(jié)構(gòu)
3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亞氨基]甲基]利福霉素 5，6，9，17，19，21-六羥基-23-甲氧基-2，4，12，16，18，20，22-七甲基-8-[N-(4-甲基-1-哌嗪基)亞氨甲基]2，7-(十五碳環(huán)氧[1，11，13]三烯亞胺)-萘并[2，1-β]呋喃-1，11(2H)-二酮21-乙酸酯 C43H58N4O12822.95 利福平在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的特征之一是存在苯并氫醌(naphtohydroquinone)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是使利福平具有自由基清除劑(free radical scavenger)作用的結(jié)構(gòu)。
(3)自由基清除作用 (a)ONOO＝抑制 一氧化氮(NO)在生物體內(nèi)發(fā)揮著血管擴(kuò)張作用等重要的作用，但當(dāng)大量存在時(shí)，其與氧結(jié)合轉(zhuǎn)化為過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitriteONOO＝)。ONOO＝氧化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA等生物物質(zhì)，并且引起酪氨酸的亞硝酸化，從而成為損傷的原因(參照非專利文獻(xiàn)1)。酪氨酸與α1-抗蛋白酶均與炎癥反應(yīng)相關(guān)，其亞硝酸化引起炎癥反應(yīng)。利福平抑制這些物質(zhì)的亞硝酸化(參照非專利文獻(xiàn)2)。
(b)抗氧化作用 DPPH(α，α-二苯基-β-苦基偕腙肼)為穩(wěn)定的自由基，使用DPPH對(duì)化合物的抗氧化作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。從其結(jié)果可知利福平具有抗氧化作用(參照非專利文獻(xiàn)3)。
(c)淀粉樣蛋白凝集抑制作用 可溶性β淀粉樣蛋白(Aβ)凝集成不溶性物質(zhì)是阿爾茨海默病的原因。用采用了Aβ1-40肽的系統(tǒng)嘗試著進(jìn)行研究，結(jié)果利福平抑制凝集反應(yīng)。已知在Aβ1-40肽的凝集反應(yīng)中出現(xiàn)的自由基發(fā)揮了很大的作用，因此推想利福平的自由基清除作用與凝集反應(yīng)的抑制相關(guān)(參照非專利文獻(xiàn)4)。
(4)組織分布 各種組織中利福平的分布是在給藥150mg和450mg后通過(guò)活檢采集組織來(lái)進(jìn)行的。從用血液/組織計(jì)算的濃度比來(lái)看，在給藥后12小時(shí)時(shí)，低于1(即在組織中的濃度高)的是膽汁、肝、膽囊壁、輸尿管、卵巢囊腫壁，基本接近1的是脾、腸系膜囊腫和囊液、闌尾、皮膚、肌肉、骨和乳腺癌組織，顯示大于1的值的是肺、胃壁和胃癌組織、脂肪、乳汁。其特別以從膽汁再吸收到肝而在肝中聚集為特征(參照非專利文獻(xiàn)5)。
(5)新生血管抑制作用 已報(bào)告利福平及其衍生物具有新生血管抑制作用(參照專利文獻(xiàn)1)。
(6)抗癌作用 已報(bào)告利福平或其衍生物對(duì)培養(yǎng)的癌細(xì)胞具有盡管弱卻存在的抗癌活性。此外也報(bào)告，在臨床上，當(dāng)對(duì)膽管細(xì)胞癌的患者給藥時(shí)，患者的預(yù)后得到改善。在大鼠的腺癌中，已證實(shí)利福平的衍生物經(jīng)由腹腔給藥時(shí)具有抗癌效果，但在經(jīng)口或經(jīng)皮給藥中卻沒有效果。也已指出利福平具有抑制急性髓性白血病復(fù)發(fā)的可能性(參照非專利文獻(xiàn)6～12)。
專利文獻(xiàn)1日本專利公開公報(bào)第2004-75665號(hào) 非專利文獻(xiàn)1藤田直 著、「活性酸素、過(guò)酸化脂質(zhì)、フリ一ラジカルの生成と消去機(jī)構(gòu)並びにそれらの生物學(xué)的作用」、薬學(xué)雑誌、2002年、Vol.122、p.203-218 非專利文獻(xiàn)2Whiteman，M.和Halliwell，B.著，“Prevention ofperoxynitrite-dependent tyrosine nitration and inactivation ofalphal-antiproteinase by antibiotics.”，F(xiàn)ree Radic Res，1997年，Vol.26，p.49-56 非專利文獻(xiàn)3Kalpana，T.及另4人著，“Assessment of antioxidantactivity of some antileprotic drugs.”，Arzneimittelforschung，2001年，Vol.51，p.633-637 非專利文獻(xiàn)4Tomiyama，T.及另6人著，“Inhibition of amyloid betaprotein aggregation and neurotoxicity by rifampicin.Its possible function as ahydroxyl radical scavenger.”，J Biol Chem，1996年，Vol.271，p.6839-6844. 非專利文獻(xiàn)5Acocella，G.著，“Clinical pharmacokinetics of rifampicin.”，Clin Pharmacokinet，1978年，Vol.3，p.108-127 非專利文獻(xiàn)6Winters，W.D.及另2人著，“Differential effects ofrifampicin on cultured human tumor cells.”，Cancer Res，1974年，Vol.34，p.3173-3179 非專利文獻(xiàn)7Joss，U.R.及另2人著，“Effect of dimethylbenzyldesmethyl rifampicin(DMB)on chemically induced mammary tumours in rats.”，Nat New Biol，1973年，Vol.242，p.88-90 非專利文獻(xiàn)8Sali，A.及另3人著，“Rifampicin as cytotoxic agent forcholangiocarcinomapreliminary report of seven cases”，J Cancer Res ClinOncol，1991年，Vol.117，p.503-504 非專利文獻(xiàn)9Burghouts，J.和Haanen，C.著，“A possible role ofrifampicin in prolonging remission duration in acute myelogenous leukaemia，Scand J Haematol”，1986年，Vol.36，p.376-378 非專利文獻(xiàn)10Adamson，R.H.著，“Evaluation of the antitumor activityof rifamycin SV.，Arch Int Pharmacodyn Ther”，1971年，Vol.192，p.61-65 非專利文獻(xiàn)11Hughes，A.M.和Calvin，M.著，“Effect of some rifamycinderivatives on chemically-induced mammary tumors in rats”，Cancer Lett，1976年，Vol.2，p.5-10 非專利文獻(xiàn)12Hughes，A.M.及另5人著，“Inhibition ofadenocarcinoma TA3 ascites tumor growth by rifamycin derivatives.”，Oncology，1978年，Vol.35，p.76-82

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供一種肝癌治療劑。本發(fā)明的課題還在于提供一種針對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌的治療劑以及向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移的抑制劑。
本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利福平或其衍生物對(duì)肝癌具有治療效果。
另外，胃癌、大腸癌、肺癌均屬于在日本人中多發(fā)性的癌，而且手術(shù)后通過(guò)門靜脈轉(zhuǎn)移到肝的情況很多。本發(fā)明的發(fā)明人為了開發(fā)針對(duì)從其他臟器轉(zhuǎn)移來(lái)的肝癌的治療劑進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利福平或其衍生物對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌具有治療效果。
利福平或其衍生物具有抑制轉(zhuǎn)移到肝的各種癌的增殖和向肝組織內(nèi)的浸潤(rùn)的作用，并對(duì)肝癌、特別是轉(zhuǎn)移性肝癌具有治療效果。
如上所述，已報(bào)告利福平對(duì)膽管癌具有抗癌活性，但是卻沒有利福平或其衍生物對(duì)肝癌、特別是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌有效的報(bào)告。
已報(bào)告抗癌劑ADRIACIN在對(duì)肝癌的臨床試驗(yàn)中的效果為16.7％，相對(duì)于此，其對(duì)膽囊癌和膽管癌的效果為60％(橫山正和、檜森 巽、氏家重紀(jì)、斉藤達(dá)雄(1974)；Adriamycinによろ悪性腫瘍の治療成績(jī) 癌の臨床20卷7號(hào)536-544)。如在該文中所顯示的，膽管癌與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌在細(xì)胞學(xué)上是種類不同的癌，通常，如果癌細(xì)胞的種類不同，則抗癌劑的種類也不同。也就是說(shuō)，即使在已知利福平對(duì)膽管癌有效的情況下，也無(wú)法同樣地預(yù)測(cè)其對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌也有效。
另外，其具有對(duì)向肝轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移癌有效的治療效果是由本發(fā)明的發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的。
利福平或其衍生物作為肝癌治療劑、特別是轉(zhuǎn)移性肝癌治療劑、或向向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移的抑制劑的有效成分是有用的。
即，本發(fā)明涉及肝癌治療劑、特別是轉(zhuǎn)移性肝癌治療劑、以及向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移的抑制劑，更具體地，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案 (1)一種肝癌治療劑，其以利福平或其衍生物為有效成分。
(2)根據(jù)(1)所述的治療劑，其中，上述肝癌為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌。
(3)根據(jù)(1)所述的治療劑，其中，上述肝癌為轉(zhuǎn)移性肝癌。
(4)根據(jù)(3)所述的治療劑，其中，上述轉(zhuǎn)移性肝癌為從肺癌、胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、胰腺癌或乳腺癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移癌。
(5)一種癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其以利福平或其衍生物為有效成分。
(6)根據(jù)(5)所述的癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，上述癌轉(zhuǎn)移為向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移。
(7)根據(jù)(6)所述的癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，上述癌轉(zhuǎn)移為從肺癌、胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、胰腺癌或乳腺癌向肝的轉(zhuǎn)移。
另外，本發(fā)明還提供以下技術(shù)方案 (8)一種肝癌的治療方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)個(gè)體(需要治療的患者等)給藥的工序。
(9)根據(jù)(8)所述的方法，上述肝癌為轉(zhuǎn)移性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌。優(yōu)選上述轉(zhuǎn)移性肝癌為從肺癌、胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、胰腺癌或乳腺癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移癌。
(10)一種抑制癌轉(zhuǎn)移的方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)個(gè)體(需要治療的患者等)給藥的工序。
(11)根據(jù)(10)所述的方法，其中，上述癌轉(zhuǎn)移為向肝的癌轉(zhuǎn)移。優(yōu)選上述癌轉(zhuǎn)移為從肺癌、胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、胰腺癌或乳腺癌向肝的轉(zhuǎn)移。
另外，本發(fā)明還涉及以下發(fā)明 (12)利福平(或其衍生物)在肝癌治療劑的制備中的用途。
(13)利福平(或其衍生物)在癌轉(zhuǎn)移抑制劑的制備中的用途。
(14)用于肝癌的治療的利福平(或其衍生物)、用于在肝癌的治療方法中應(yīng)用的利福平(或其衍生物)、或用于在肝癌的治療中應(yīng)用的利福平(或其衍生物)。
(15)用于癌轉(zhuǎn)移的抑制的利福平(或其衍生物)、用于在癌轉(zhuǎn)移的抑制方法中應(yīng)用的利福平(或其衍生物)、或用于在癌轉(zhuǎn)移的抑制中應(yīng)用的利福平(或其衍生物)。
需要說(shuō)明的是，本研究是得到日本文部科學(xué)省科學(xué)研究費(fèi)補(bǔ)助金特定領(lǐng)域研究、基礎(chǔ)研究以及科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)(JST)的支助而進(jìn)行的。



圖1是將測(cè)定的吸光度換算為癌抗原在血漿中的濃度的曲線圖。STD.0.0～4.7分別為0.0～4.7U/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。1～7表示對(duì)照給藥組。8～14表示50mg給藥組。15～21表示100mg給藥組。22～27表示200mg給藥組。51～57表示5-FU給藥組。
圖2為表示利福平給藥與血漿中CA15-3濃度之間的關(guān)系的曲線圖。利福平100mg/kg組的血漿中CA15-3濃度與對(duì)照組的相比有顯著性差異(p＜0.05)地低。
圖3為表示皮下移植癌的生長(zhǎng)曲線的曲線圖。白圈表示非癌細(xì)胞對(duì)照、黑點(diǎn)表示對(duì)照、黑方塊表示3-甲酰利福霉素SV、黑三角表示利福霉素SV、黑菱形表示利福平。
圖4為表示在背部皮下移植有人肝癌細(xì)胞株Hep G2的裸鼠中，利福平對(duì)腫瘤體積的影響效果的曲線圖。點(diǎn)表示10只小鼠的平均值，垂直線表示S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。*P＜0.05、**P＜0.01vs對(duì)照組(Dunnett型多重比較檢驗(yàn))。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利福平或其衍生物對(duì)肝癌、特別是轉(zhuǎn)移性肝癌具有抗癌作用。本發(fā)明涉及以利福平或其衍生物為有效成分的肝癌治療劑。
本發(fā)明治療劑優(yōu)選的實(shí)施方式為針對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌的治療劑。另外，本發(fā)明還提供含有以利福平或其衍生物為有效成分的轉(zhuǎn)移性肝癌治療劑。
此外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)利福平或其衍生物能夠抑制從以肝以外的臟器為原發(fā)病灶的癌向肝的轉(zhuǎn)移。即，本發(fā)明涉及以利福平或其衍生物為有效成分的向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移的抑制劑。(在本說(shuō)明書中，本發(fā)明的上述治療劑或癌轉(zhuǎn)移抑制劑有時(shí)僅記為“本發(fā)明藥劑”。
本發(fā)明藥劑的有效成分通常為下述通式(I)表示的化合物。

另外，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式為以上述通式(I)表示的化合物的衍生物為有效成分的藥劑。
作為可用作本發(fā)明藥劑的利福平的衍生物，可列舉出例如3-甲酰RFM、利福霉素SV、或主代謝物25-去乙酰RFP等。
在本發(fā)明中，“轉(zhuǎn)移性肝癌”是指以肝以外的臟器或組織為原發(fā)病灶的肝癌，通常是指在肝以外的臟器或組織中的癌轉(zhuǎn)移到肝而成的癌?？闪信e出例如在肺、胃、直腸、大腸、結(jié)腸、胰臟或乳腺等發(fā)生的癌(例如肺癌、胃癌、直腸癌、大腸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌等)向肝轉(zhuǎn)移而引起的肝癌。
另外，在本發(fā)明中，利福平的鹽也包括在本發(fā)明的衍生物中。在本發(fā)明中，“鹽”是指與本發(fā)明的利福平形成的鹽，并且只要是藥理學(xué)上可接受的鹽，則沒有特殊限制，可列舉出例如無(wú)機(jī)酸鹽、有機(jī)酸鹽、無(wú)機(jī)堿鹽、有機(jī)堿鹽、酸性或堿性氨基酸鹽等。通常，本發(fā)明的“鹽”是指通常藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的治療劑可以記作例如“治療藥”、“抗癌劑”、“抗腫瘤劑”、“癌治療用組合物”、“醫(yī)藥品”、“醫(yī)藥組合物”等。
本發(fā)明的治療劑通常是指具有治療癌或抑制癌轉(zhuǎn)移的效果的藥劑(醫(yī)藥、醫(yī)藥組合物)，但具有例如預(yù)防癌或預(yù)防癌轉(zhuǎn)移的效果的藥劑也包含在本發(fā)明藥劑中。
本發(fā)明藥劑如在后文的實(shí)施例中所顯示的那樣，對(duì)肝癌的發(fā)生(例如、由肝硬化轉(zhuǎn)變成的肝癌的發(fā)生)具有預(yù)防效果。因此，本發(fā)明優(yōu)選為含有以利福平或其衍生物為有效成分的肝癌的預(yù)防劑或復(fù)發(fā)預(yù)防劑。作為本發(fā)明的預(yù)防劑優(yōu)選的實(shí)施方式，可列舉出例如由肝硬化轉(zhuǎn)變成的肝癌的發(fā)生的預(yù)防劑。
在本發(fā)明中，“癌”通常也被稱為惡性腫瘤。
本發(fā)明的以利福平或其衍生物為有效成分的藥劑可以采用常用方法制成片劑、丸劑、散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、粉劑、包衣片劑、膠囊劑、吸入劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、液體制劑、乳劑、懸浮劑、注射劑等制劑。
制劑制備中可以使用通常使用的賦形劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、矯味矯臭劑，或根據(jù)需要使用的穩(wěn)定劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、抗氧化劑等，配合一般作為醫(yī)藥品制劑的原料使用的成分并通過(guò)通常的方法制成制劑。
例如在制備經(jīng)口制劑中，在加入本發(fā)明的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽以及賦形劑、以及根據(jù)需要使用的粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、著色劑、矯味矯臭劑等后，通過(guò)通常的方法制成散劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、片劑、包衣片劑、膠囊劑等。
另外，在制備注射用制劑等液體制劑時(shí)，在本發(fā)明的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽中加入pH調(diào)節(jié)劑、溶解劑、等滲劑等，以及根據(jù)需要使用的助溶劑、穩(wěn)定劑等，通過(guò)通常的方法制成制劑。在制備注射劑時(shí)，根據(jù)需要，添加pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、保存劑等，并通過(guò)通常的方法制成皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)注射劑。注射劑也可以制成下述制劑在將溶液收納到容器后，通過(guò)冷凍干燥等制成固體制劑，然后在使用時(shí)配制。
作為制劑制備中使用的基質(zhì)原料，可以使用在醫(yī)藥品、醫(yī)藥部外品、化妝品等中通常使用的各種原料。作為所使用的基質(zhì)原料，具體地可列舉出例如，動(dòng)植物油、礦物油、酯油、蠟類、高級(jí)醇類、脂肪酸類、硅油、表面活性劑、磷脂類、醇類、多元醇類、水溶性高分子類、粘土礦物類、精制水等原料，還可以根據(jù)需要添加pH調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、螯合劑、防腐防霉劑、著色料、香料等。另外，也可以根據(jù)需要配合殺菌劑、消炎劑、細(xì)胞活化劑、維生素類、氨基酸、保濕劑、角質(zhì)溶解劑等成分。
按照含有作為主成分的本發(fā)明藥劑的方式制成上述劑型的制劑技術(shù)是公知的。
在給藥本發(fā)明的化合物或衍生物(包括鹽)時(shí)，對(duì)其形態(tài)沒有特殊限制，可以采用通常使用的方法經(jīng)口給藥或非經(jīng)口給藥。本發(fā)明藥劑的給藥量可以考慮劑型的種類、給藥方法、患者的年齡和體重、患者的癥狀等，并最終根據(jù)醫(yī)生或獸醫(yī)的判斷來(lái)適當(dāng)?shù)卮_定。
在本發(fā)明藥劑中，利福平或其衍生物的含有濃度沒有特殊限制，但給出如下例子相對(duì)于1kg待給藥個(gè)體的對(duì)象臟器(肝或肝細(xì)胞)，例如達(dá)到10～500mg、優(yōu)選為50～200mg、更優(yōu)選為50～100mg的濃度。
成為本發(fā)明藥劑的給藥對(duì)象的生物，通常為哺乳動(dòng)物，可列舉出例如，人、狗或貓等生物。
另外，本發(fā)明還涉及肝癌的治療(或預(yù)防)方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)個(gè)體給藥的工序。所述個(gè)體通常是指需要治療的患者，優(yōu)選為癌患者。另外，個(gè)體優(yōu)選為人，但非人動(dòng)物也可作為對(duì)象。作為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，可列舉出例如肝癌的預(yù)防方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)肝硬化的患者給藥的工序。
此外，本發(fā)明還涉及抑制癌轉(zhuǎn)移的方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)個(gè)體給藥的工序。
另外，本發(fā)明還涉及利福平或其衍生物的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可列舉出利福平(或其衍生物)在肝癌治療劑的制備中的用途，或利福平(或其衍生物)在癌轉(zhuǎn)移抑制劑的制備中的用途。
此外，本說(shuō)明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)被引入本說(shuō)明書作為參考。
實(shí)施例 以下通過(guò)實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
(實(shí)施例1)對(duì)裸鼠中的轉(zhuǎn)移到肝的肺癌(A549)的抑制作用 研究利福平對(duì)裸鼠經(jīng)脾移植到肝的肺癌細(xì)胞(A549)的增殖的作用。
使用1.5×106cells/50μL/body的肺癌細(xì)胞(A549)作為移植細(xì)胞。并且，作為移植前的麻醉，在移植處置的約5分鐘前，按照每1g體重10μL容量，腹腔內(nèi)給藥5mg/mL Nembutal。
移植部位和移植方法如下所述。首先，使用剪刀將小鼠(小鼠、雄性、BALB/cA Jcl-nu nu/nu)以各10mm左右沿背腹軸方向剪開左側(cè)腹部的皮膚、肌肉層。使用前端圓形的小鑷子從腹腔內(nèi)拉出脾，捏住脾的下端(腹側(cè))，在距端部3～5mm的位置基本水平地刺入針，針頭插入脾內(nèi)部5～7mm，緩慢注入細(xì)胞懸浮液。此外，細(xì)胞懸浮液50μL裝在裝有27號(hào)G針的1mL注射器內(nèi)。在細(xì)胞懸浮液注入后，保持針頭在脾內(nèi)約10秒鐘，等到內(nèi)壓下降后拔出針，用Kimwipes擦拭從傷口漏出的注入液。另外，為了防止臟器干燥，用浸于生理鹽水并擰干了的脫脂棉蓋住脾。由于麻醉的小鼠體溫容易下降，因此放在干燥的脫脂棉等上盡量進(jìn)行保溫，等待10分鐘直至移植細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肝。
脾的摘除和縫合如下進(jìn)行。預(yù)先使用小鑷子將縫合線從脾中央部到胰臟之間穿過(guò)縫合線(絲軟質(zhì)縫合線3號(hào))，分別在脾內(nèi)走行的2根血管(背側(cè)、腹側(cè))上打結(jié)，過(guò)10分鐘從腹側(cè)的血管結(jié)扎，然后將背側(cè)的血管和脾的一部分一起結(jié)扎。用小鑷子按住結(jié)扎了腹側(cè)血管的線，同時(shí)用環(huán)形鑷子牽拉并摘出脾，用剪刀從不會(huì)使線的結(jié)扣脫離的位置切掉脾背側(cè)部。剪斷多余的縫合線，將內(nèi)臟送回腹腔內(nèi)，用2號(hào)縫合線在1處縫合肌肉層。用訂書機(jī)將皮膚訂在一起，擦掉皮膚的血跡，并送回籠子。另外，根據(jù)需要用加熱板等保溫，使其適應(yīng)從麻醉和術(shù)后的恢復(fù)。
將利福平以50、100和200mg/kg的用量從癌細(xì)胞移植后第4日開始按1日1次、一周5日(周六、周日停藥)反復(fù)地經(jīng)口給藥約3周。
將5-FU以30mg/kg的用量從癌細(xì)胞移植后第4日開始按1日1次、一周5日(周六、周日停藥)反復(fù)地給藥約3周。將藥劑懸浮于0.5w/v％的羧甲基纖維素鈉溶液(0.5％CMC-Na)中，使用1mL注射筒和小鼠用金屬制胃管強(qiáng)制經(jīng)口給藥。對(duì)照組僅給藥0.5％CMC-Na。
(a)一般狀態(tài)觀察 一般狀態(tài)觀察的結(jié)果示于下表1。觀察第16日到第18日可見，對(duì)照組中的5例皮膚蒼白、體溫降低以及活動(dòng)性降低，在觀察第18日的即將采血前2例死亡。對(duì)照組的上述癥狀和死因認(rèn)為是由轉(zhuǎn)移性肝癌所致的全身狀態(tài)的急劇惡化所致。另一方面，利福平各給藥組中，直到觀察第15日未見異常，觀察第16日到第18日可見，50mg/kg組中的1例和200mg/kg組中的2例皮膚蒼白、皮膚變黃、體溫降低以及活動(dòng)性降低，觀察第17日200mg/kg的1例死亡。在利福平各給藥組中，雖然未見劑量依賴性地抑制由轉(zhuǎn)移性肝癌所致的上述癥狀發(fā)生和死亡的明顯效果，但與對(duì)照組相比，上述癥狀的發(fā)生例數(shù)少，這啟示利福平可能抑制由轉(zhuǎn)移性肝癌所致的全身狀態(tài)的惡化。在5-FU給藥組中，僅可見1例在觀察第15日到第18日皮膚發(fā)紅，未觀察到表明在整個(gè)觀察期間，由轉(zhuǎn)移性肝癌所致的全身狀態(tài)的急劇惡化的癥狀，從而得到證明抑制轉(zhuǎn)移性肝癌的進(jìn)行的結(jié)果。
第18日的臨床癥狀示于表1。
表1 第18日的臨床癥狀
#發(fā)疹 在對(duì)照組中，7例中的5例觀察到一些外觀上的異常，而在利福平100mg/kg組中，未觀察到外觀上的異常。
另外，腫瘤(癌)細(xì)胞轉(zhuǎn)移度和肝的空泡化的病理學(xué)觀察結(jié)果示于表2。
表2
表中、“-”表示無(wú)轉(zhuǎn)移、“+”、“++”、”+++”表示轉(zhuǎn)移度分別為弱、中、強(qiáng)。
對(duì)照組全部可見強(qiáng)的轉(zhuǎn)移、增殖。另外，利福平具有抑制轉(zhuǎn)移、增殖的傾向，在利福平100和200mg/kg組中，可見伴隨著代謝酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的空泡化。
(b)利用癌標(biāo)記物CA15-3的監(jiān)測(cè) 此外，用CA15-3 ELISA試劑盒(Panomics)作為分析試劑盒來(lái)實(shí)施利用癌標(biāo)記物CA15-3的監(jiān)測(cè)。
具體而言，在觀察第18日(癌細(xì)胞移植后第22日)用乙醚麻醉后，從后大靜脈腹部用肝素涂布注射筒盡可能地采集血液。采集的血液立即以1870×g離心分離10分鐘，將得到的血漿用于測(cè)定。測(cè)定如下實(shí)施。
1)將血漿樣品用等量的稀釋緩沖液(ELISA kit附帶)稀釋后，將各樣品分別注入2個(gè)微孔內(nèi)，每個(gè)100μL，在室溫(25℃)下靜置5小時(shí)。
2)用0.02％Tween20/PBS洗滌5次。
3)向各微孔內(nèi)加入200μL的HRP-標(biāo)記檢測(cè)抗體(ELISA kit附帶)，在37℃下靜置2小時(shí)。
4)用0.02％Tween20/PBS洗滌5次。
5)向各微孔中加入100μL的TMB，在室溫(25℃)下靜置直至顯色。
6)向各微孔中加入100μL的1N HCl，使顯色停止。
7)在450nm下測(cè)定吸光度。
將測(cè)定的吸光度換算成癌抗原在血漿中的濃度，其曲線示于圖1。另外，圖2表示各給藥組每個(gè)的合計(jì)值。由于軟件的關(guān)系未能示出，但在100mg給藥組中，可見統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。
從上述結(jié)果可見，在經(jīng)口給藥100mg利福平的組中，血中的癌標(biāo)記物CA15-3為有顯著性差異的降低，且顯示出臨床癥狀顯著地得到改善。
(實(shí)施例2)經(jīng)口給藥的利福平及其衍生物對(duì)LL/2 Lewis肺癌細(xì)胞在異種動(dòng)物中的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制效果 將LL/2細(xì)胞(106 cells/動(dòng)物)移植到雄性裸鼠的皮下，在癌的大小達(dá)到200mm3時(shí)，自由地給予含有0.8mg/mL利福平、3-甲酰利福霉素SV、利福霉素SV的飲用水。一組7只小鼠。用體積表示皮下移植的癌的大小(圖3、表3)。對(duì)向肝和肺轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移癌的評(píng)價(jià)是分別對(duì)切片的臟器拍照，計(jì)算并表示出癌區(qū)域的面積(表4和表5)。
表3
表4
表5
其結(jié)果是通過(guò)給藥利福平，向肝和肺轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移被抑制。
(實(shí)施例3)利福平的腫瘤增殖抑制效果 使用背部皮下移植有人肝癌細(xì)胞株Hep G2的裸鼠，對(duì)利福平的腫瘤增殖抑制作用進(jìn)行研究。
將在體外增殖了的Hep G2按照1×107cells/0.1mL/body的條件移植到7周齡的雌性裸鼠的右背部皮下。作為試驗(yàn)組，設(shè)定對(duì)照組、利福平的50、100和200 mg/kg/天組共計(jì)4組(n＝10)。在平均腫瘤體積達(dá)到95.41mm3時(shí)(第1天，移植后第16日)進(jìn)行分組，分別在第1天～第28天1日1次，計(jì)28次地經(jīng)口給藥試驗(yàn)物質(zhì)。對(duì)對(duì)照組同樣地給予0.5％CMC-Na水溶液。到第29天，測(cè)定體重和腫瘤直徑(長(zhǎng)徑和短徑)，分別計(jì)算出體重變化率和腫瘤體積。在第29天測(cè)定腫瘤重量，計(jì)算出腫瘤增殖抑制率(IRInhibition Rate)。
關(guān)于一般狀態(tài)，所有的試驗(yàn)組在整個(gè)觀察期間，全部小鼠未觀察到異常情況。
關(guān)于體重變化情況，對(duì)照組在整個(gè)觀察期間可見隨著天數(shù)逐漸減少(第29天的體重變化率-13.8±4.5％)。另一方面，在利福平給藥組的50mg/kg/天組中，可見與對(duì)照組基本同樣地逐漸減少(第29天的體重變化率-14.4±4.0％)，在100和200mg/kg/天組中，可見第19天和第26天體重增加，體重減少的程度也與對(duì)照組相比為輕度的(第29天的體重變化率分別為-9.1±10.2％和-5.1±4.9％)。
關(guān)于腫瘤增殖，在對(duì)照組可見在整個(gè)觀察期間腫瘤體積顯著增大。另一方面，在利福平的50、100和200mg/kg/天組中可見在第22天和第29天，與對(duì)照組相比，腫瘤體積均為有顯著性差異的低值。
測(cè)定結(jié)果示于圖4、表6。
表6
上述表6中的“第1天”表示給藥開始日。各值表示平均值±S.D.。*P＜0.05、**P＜0.01vs對(duì)照組(Dunnett型多重比較檢驗(yàn))。
對(duì)照組的腫瘤體積在第1天為94.21±33.06mm3，在第29天為1611.16±511.39mm3?？梢娫谡麄€(gè)觀察期間腫瘤體積隨著天數(shù)增大。
利福平50mg/kg/天組的腫瘤體積，在第1天為95.52±31.15mm3，在第29天為1134.95±399.98mm3。在第22天和第29天與對(duì)照組相比，可見腫瘤體積為有顯著性差異的低值(均為P＜0.05，Dunnett型多重比較檢驗(yàn))。
利福平100mg/kg/天組的腫瘤體積，在第1天為97.09±31.20mm3，在第29天為1020.57±397.37mm3。在第22天和第29天與對(duì)照組相比，可見腫瘤體積為有顯著性差異的低值(分別為P＜0.05和P＜0.01，Dunnett型多重比較檢驗(yàn))。
利福平200mg/kg/天組的腫瘤體積，在第1天為94.83±31.47mm3，在第29天為1029.61±232.44mm3。在第22天和第29天與對(duì)照組相比，可見腫瘤體積為有顯著性差異的低值(分別為P＜0.05和P＜0.01，Dunnett型多重比較檢驗(yàn))。
可以清楚如上所述，在本試驗(yàn)條件下，在利福平的100和200mg/kg/天組中，利福平對(duì)Hep G2帶癌裸鼠不產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，并顯示出腫瘤增殖抑制作用。
(實(shí)施例4)利福平對(duì)肝癌發(fā)生的預(yù)防效果 下面對(duì)利福平對(duì)肝癌發(fā)生的預(yù)防效果進(jìn)行研究。即，在以下的表7(肝硬化患者的利福平給藥期間以及未發(fā)生肝癌的期間)所示的5例肝硬化患者中，如表7所記載的，將利福平以150mg～300mg的范圍給藥，結(jié)果從診斷肝硬化日開始到臨床研究結(jié)束日的期間中，均未見有病例發(fā)生肝癌。
表7
本發(fā)明涉及將利福平或其衍生物用于肝癌、特別是向肝轉(zhuǎn)移的癌的治療的內(nèi)容。
利福平在肝的聚集度高，因此期待其對(duì)向肝轉(zhuǎn)移的癌具有有效性。利福平為自由基清除劑，對(duì)于自由基清除劑，已知其具有抑制肝內(nèi)的癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、游走的活性，另外，利福平及其衍生物具有新生血管抑制作用，其結(jié)果，其被期待能夠抑制癌的增殖。此外，利福平作為自由基清除劑的作用有可能對(duì)新生血管抑制作用做出了貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的發(fā)明人查明利福平或其衍生物具有抑制肝癌、特別是轉(zhuǎn)移到肝的各種癌的增殖和向肝組織內(nèi)的浸潤(rùn)的作用，因此其能夠作為它們的治療劑使用。
權(quán)利要求
1、一種肝癌治療劑，其以利福平或其衍生物為有效成分。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療劑，其中，所述肝癌為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療劑，其中，所述肝癌為轉(zhuǎn)移性肝癌。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療劑，其中，所述轉(zhuǎn)移性肝癌為從肺癌、胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、胰腺癌或乳腺癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移癌。
5、一種癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其以利福平或其衍生物為有效成分。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，所述癌轉(zhuǎn)移為向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的癌轉(zhuǎn)移抑制劑，其中，所述癌轉(zhuǎn)移為從肺癌、胃癌、直腸癌、結(jié)腸癌、大腸癌、胰腺癌或乳腺癌向肝的轉(zhuǎn)移。
8、一種肝癌的治療方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)個(gè)體給藥的工序。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述肝癌為轉(zhuǎn)移性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞癌。
10、一種抑制癌轉(zhuǎn)移的方法，其包括將利福平或其衍生物對(duì)個(gè)體給藥的工序。
11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述癌轉(zhuǎn)移為向肝轉(zhuǎn)移的癌轉(zhuǎn)移。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以利福平或其衍生物為有效成分的肝癌治療劑或癌轉(zhuǎn)移抑制劑。本發(fā)明的發(fā)明人為了開發(fā)針對(duì)肝癌的治療劑進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利福平或其衍生物對(duì)肝癌、特別是轉(zhuǎn)移性肝癌具有治療效果。利福平或其衍生物具有抑制轉(zhuǎn)移到肝的各種癌的增殖和向肝組織內(nèi)的浸潤(rùn)的作用，并對(duì)轉(zhuǎn)移性肝癌具有治療效果。
文檔編號(hào)C07D498/08GK101610771SQ20088000517
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者七里真義, 河野裕, 剛 原, 牧野弘, 平井美和, 增田尊信, 杉本正信 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京醫(yī)科齒科大學(xué), 佳康爾研究所股份有限公司