專利名稱：：色譜方法色譜方法本發(fā)明屬于用于純化多肽尤其是聚乙二醇化(PEGylated)多肽的色譜分離方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)在當(dāng)今醫(yī)藥事務(wù)中起重要作用。對于人類施用來說，每一種治療性蛋白質(zhì)必須符合特定的標(biāo)準(zhǔn)。為了確保生物藥用物質(zhì)對人類的安全性，尤其是必須將生產(chǎn)過程中積累的副產(chǎn)物除去。為了達(dá)到質(zhì)量管理規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，一個或多個純化步驟必須跟隨于生產(chǎn)過程之后。除其它因素外，純度、生產(chǎn)能力和收率在確定合適的純化方法中起重要作用。已很好地建立了不同方法并將其廣泛用于蛋白質(zhì)純化，例如使用微生物蛋白質(zhì)的親和色譜法(如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和色譜法)、離子交換色譜法(如陽離子交換(磺丙基或羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合型離子交換)、嗜硫吸附(如應(yīng)用P-巰基乙醇和其它的SH配體)、疏水作用或芳香族吸附色譜(如應(yīng)用苯基_瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或者間_氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和色譜(如應(yīng)用Ni(II)-和Cu(II)-親和物質(zhì))、分子排阻色譜和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93—102)。已報道了下列物質(zhì)的接合例如，聚乙二醇(PEG)和白介素_6(EP0442724)、PEG和促紅細(xì)胞生成素(WO01/02017)、包含內(nèi)皮生長抑素和免疫球蛋白類的嵌合分子(US2005/008649)、基于分泌抗體的融合蛋白(US2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991;人血清白蛋白US5，876，969)、聚乙二醇化多肽(US2005/0114037)和干擾素融合物。Necina，R.等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)報道通過具有高電荷密度的離子交換介質(zhì)直接從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲人單克隆抗體。在W089/05157中，報道了通過直接將細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行陽離子交換處理來純化產(chǎn)物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)，79-88描述了從小鼠腹水一步純化單克隆IgG抗體。W02004/024866中報道了通過離子交換色譜純化多肽的方法，其中用梯度洗脫從一種或多種污染物中分離出感興趣的多肽。在EP0530447中，報道了通過三個色譜步驟的聯(lián)合來純化IgG單克隆抗體的方法。在ProcessBiotechnol.42(2007)971-977中Yu，G.等人報道了單-聚乙二醇化的白介素-l受體拮抗劑的巧妙純化。Wang等人(Wang，H.，等人，P印tides26(2005)1213-1218)報道通過兩步陽離子交換色譜純化大腸桿菌中表達(dá)的hTFF3。Yun等人(Yun，Q.，等人，J.Biotechnol.118(2005)67-74)報道通過兩個連續(xù)離子_交換色譜步驟純化聚乙二醇化的rhG-CSF。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面是在感興趣的化合物洗脫后再生陽離子交換色譜柱的方法，該方法包括下述順序的以下步驟-用包含至少500mM濃度的氯化鈉的水性緩沖溶液從柱子上洗脫吸附的多肽，-用純凈水沖洗柱子，_施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，-用純凈水沖洗柱子，-施用包含0.5M磷酸二氫鈉和1M磷酸的溶液至柱子，-用純凈水沖洗柱子，-施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，持續(xù)至少4小時，禾口-通過用純凈水沖洗柱子來使陽離子交換柱再生。發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明包括在感興趣的化合物洗脫后再生陽離子交換色譜柱的方法，該方法包括下列步驟-用包含氯化鈉的水性緩沖溶液從陽離子交換柱上除去殘留的結(jié)合多肽，-用純凈水沖洗柱子，-施用氫氧化鈉溶液至柱子，-用純凈水沖洗柱子，-施用包含磷酸二氫鈉和磷酸的溶液至柱子，-用純凈水沖洗柱子，-施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，持續(xù)至少4小時，禾口-通過用純凈水沖洗柱子來使陽離子交換柱再生。在本申請中所用的術(shù)語"純凈水"指根據(jù)US藥典的用于注射的水。在本申請中所用的術(shù)語"離子交換材料"指在離子交換色譜中用作固定相的、載有共價結(jié)合的帶電荷取代基的、固定不動的高分子量基質(zhì)。為了達(dá)到完全的電荷中性，非共價結(jié)合的抗衡離子結(jié)合至所述基質(zhì)。"離子交換材料"具有與周圍溶液的相似帶電離子交換其非共價結(jié)合的抗衡離子的能力。根據(jù)其可交換的抗衡離子的電荷，將"離子交換樹脂"分為陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。依據(jù)帶電基團(tuán)(取代基)的性質(zhì)，將"離子交換樹脂"，例如在陽離子交換樹脂情況中，分為磺酸樹脂(S)或磺丙基樹脂(SP)或羧甲基樹脂(CM)。根據(jù)帶電基團(tuán)/取代基的化學(xué)性質(zhì)，依據(jù)共價結(jié)合的帶電取代基強(qiáng)度，又可以將"離子交換樹脂"分為強(qiáng)或弱陽離子交換樹脂。例如，強(qiáng)陽離子交換樹脂具有作為帶電取代基的磺酸基團(tuán)，優(yōu)選磺丙基基團(tuán)；弱陽離子交換樹脂具有作為帶電取代基的羧酸基團(tuán)，優(yōu)選羧甲基基團(tuán)，并且弱陰離子交換樹脂具有作為帶電取代基的二乙基氨基乙基基團(tuán)。在一實施方案中，陽離子交換色譜柱含有磺丙基陽離子交換樹脂，即所述柱子是磺丙基陽離子交換色譜柱。不同類型的離子交換材料即固定相是可以以不同的名稱并從眾多公司購得的，例如陽離子交換材料Bio-Rex(例如型號70)、Chelex(例如型號100)、Macro-Prep(例如型號cm、Highs、25S)、AG(例如型號50w、mp)都可以從BioRadLaboratories購得；WCX2可以從Ciphergen購得；DowexMAC-3可以從Dow化學(xué)公司購得；MustangC和MustangS可以從Pall公司購得；CelluloseCM(例如型號23、52)、hyper-D、partisphere可以從Whatmanpic.購得；AmberiiteIRC(例如型號76、747、748)、Amberiitegt73、Toyopearl(例如型號sp、cm、650M)都可以從TosohBioscienceGmbH購得；CM1500禾PCM3000可以從BioChromLabs購得；SP-S印haroseTM、CM-S印haroseTM可以從GEHealthcare購得；Poros樹脂可以從PerS印tiveBiosystems購得；AsahipakES(例如型號502C)、CXpakP、IECCM(例如型號825、2825、5025、LG)、IECSP(例如型號420N、825)、IECQA(例如型號LG、825)可以從ShokoAmericaInc.購得；50W陽離子交換樹脂可以從EichromTechnologiesInc購得。在一實施方案中，陽離子交換材料是強(qiáng)陽離子交換材料例如Macro-Prep⑧Highs或25S或者M(jìn)acroC即SP或者Toyopear1⑧SP650M或者SourceS或者SPS印harose或者POLYCATA。示例性陰離子交換材料是可以從Dow化學(xué)公司購得的Dowex⑧l(xiāng);都可以從BioRadLaboratories購得的AG⑧(例如型號1、2、4)、Bio-ReX5、DEAEBio-Gel1、Macro-PrepDEAE;可以從EichromTechnologiesInc.購得的陰離子交換樹脂1型；都可以從GEHealthcare購得的SourceQ、ANXS印harose4、DEAES印harose(例如型號CL-6B、FF)、QS印harose、C即toQ、C即toS;可以從PerkinElmer購得的AX-300;都可以從ShokoAmericaInc.購得的AsahipakES_502C、AXpakWA(例如型號624、G)、IECDEAE;都可以從TosohBioscienceGmbH購得的Amberlite⑧IRA_96、ToyopearlDEAE、TSKgelDEAE;可以從Pall公司購得的MustangQ。在本申請內(nèi)所用的術(shù)語"沖洗"指用二個或多個柱體積的特定溶液清洗柱子。術(shù)語"相同類型的陽離子交換材料"指利用相同的陽離子交換材料來完成兩個連續(xù)的離子交換色譜步驟。這是指連續(xù)的陽離子交換色譜步驟如下進(jìn)行將第一部分的陽離子交換材料用于第一個陽離子交換色譜步驟并將第二部分的相同的陽離子交換材料用于第二個陽離子交換色譜；或者將相同的陽離子交換材料用于兩個陽離子交換色譜步驟。在本申請范圍內(nèi)可替換使用的術(shù)語"階式洗脫(st印elution)"和"階式洗脫方法"指如下方法，其中例如將引起洗脫(即從材料上溶出結(jié)合的化合物)的物質(zhì)濃度立刻提高或降低，即直接從一個值/水平到下一個值/水平。在所述"階式洗脫"中，一個或多個條件例如pH、離子強(qiáng)度、鹽濃度和/或色譜法的流量馬上全部從第一個(例如起始的)值變化成第二個(例如最終的)值，即與線性變化不同，條件是增量式(即階式)變化的。在所述"階式洗脫方法"中，離子強(qiáng)度每次增加后，便收集新的流份。該流份包含伴隨離子強(qiáng)度的相應(yīng)增加從離子交換材料中回收的化合物。每一次增加后，將條件持續(xù)至洗脫方法中的下一個步驟。在本申請范圍內(nèi)可替換使用的術(shù)語"連續(xù)洗脫"和"連續(xù)洗脫方法"指如下方法，其中例如將引起洗脫(即從材料上溶出結(jié)合的化合物)的物質(zhì)濃度連續(xù)提高或降低，即將濃度通過一系列小梯階進(jìn)行變化，每一梯階中引起洗脫的物質(zhì)的濃度變化不大于2%，優(yōu)選不大于1%。在"連續(xù)洗脫"中，一個或多個條件例如pH、離子強(qiáng)度、鹽濃度和/或色譜法的流量可以線性地或以指數(shù)方式或漸近地進(jìn)行變化。該變化優(yōu)選是線性的。如本申請內(nèi)所用的術(shù)語"施用......至"和其語法上的同義詞涉及純化方法的部分步驟，其中使例如含有待純化的感興趣的物質(zhì)的溶液與固定相接觸。這是指a)將溶液加至固定相位于其中的色譜設(shè)備，或者b)將固定相加至溶液中。在a)情況中，例如含有待純化的感興趣的物質(zhì)的溶液穿過固定相，使固定相和溶液中的物質(zhì)相互作用。取決于條件例如pH、導(dǎo)電性、鹽濃度、溫度和/或流速，溶液中的一些物質(zhì)結(jié)合至固定相，并因此將其從溶液中移除。其它物質(zhì)保留在溶液中或被從固定相解吸附。溶液中的物質(zhì)可見于流出液(flow-through)中。"流出液"指流過色譜裝置后得到的溶液，其可以是所用的含有感興趣的物質(zhì)的溶液或者用于沖洗柱子或用于致使結(jié)合至固定相的一種或多種物質(zhì)洗脫的緩沖液。在一實施方案中，色譜裝置是柱子或盒(cassette)。純化步驟后，可以通過本領(lǐng)域技6術(shù)人員熟悉的方法例如沉淀、鹽析、超濾、滲濾、凍干、親和色譜或溶劑體積減少，將感興趣的物質(zhì)從溶液中回收，以得到基本均一形式的感興趣的物質(zhì)。在b)情況中，將固定相例如作為固體加到例如含有待純化的感興趣的物質(zhì)的溶液中，使固定相和溶液中的物質(zhì)相互作用。相互作用后，例如通過過濾將固定相除去，在此，例如感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相并隨其從溶液中除去，或者感興趣的物質(zhì)不結(jié)合至固定相并保留在溶液中。如本申請內(nèi)所用的術(shù)語"在適合結(jié)合的條件下"和其語法上的同義詞指當(dāng)使感興趣的物質(zhì)與固定相例如離子交換材料接觸時，感興趣的物質(zhì)例如聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素結(jié)合至固定相。這不是指必須100%的感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相，而是指基本上100%的感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相，即至少50%的感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相，優(yōu)選至少75%的感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相，優(yōu)選至少85%的感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相，更優(yōu)選大于95%的感興趣的物質(zhì)結(jié)合至固定相。如本申請內(nèi)所用的術(shù)語"緩沖的"指其中通過緩沖物質(zhì)將由于酸性或堿性物質(zhì)的加入或釋放引起的pH變化穩(wěn)定在一定水平的溶液?？梢允褂萌魏文墚a(chǎn)生上述效果的緩沖物質(zhì)。在一實施方案中，使用藥學(xué)上可接受的緩沖物質(zhì)例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽、或者三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或其鹽。在優(yōu)選的實施方案中，使用磷酸或其鹽、或者乙酸或其鹽、或者檸檬酸或其鹽、或者組氨酸或其鹽。緩沖溶液可以任選地含有其它的鹽例如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀?！闵V方法及其使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見例如色譜法(Chromatography)，第5片反，A部分基本原理禾口技術(shù)(FundamentalsandTechniques)，Heftma皿(編者)ElsevierSciencePublishingCompany1992Chromatogr即hy5thed51A1992;生物科學(xué)中的先進(jìn)色譜法和電遷移方法(AdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciences)，Deyl，Z.(編者)，ElsevierScienceBV，Amsterdam,TheNetherlands,(1998);當(dāng)今色譜法(ChromatographyToday)，Poole，C.F.禾口Poole，S.K.，ElsevierSciencePublishingCompany,NewYork,(1991);Scopes，蛋白質(zhì)純化原理和實踐(ProteinPurification-PrinciplesandPractice)(1982);Sambrook，J.等人(編者)，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第二片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989;或者分子生物學(xué)的當(dāng)前技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology),Ausubel，F(xiàn).M.等人(編者)，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork。促紅細(xì)胞生成素的聚乙二醇化通常生成不同化合物的混合物，例如多聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素、單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素、非聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素、活化的PEG酯的水解產(chǎn)物以及促紅細(xì)胞生成素本身的水解產(chǎn)物。為了獲得基本均一形式的單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素，必須將上述物質(zhì)分開，且必須將感興趣的化合物純化。因此，本發(fā)明的第二個方面是提供獲得基本均一形式的單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的方法，該方法包括下列步驟a)使用分子量20kDa至40kDa的活化的聚乙二醇化試劑將促紅細(xì)胞生成素聚乙二醇化，b)用兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟純化在步驟a)中得到的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，其中第一和第二個陽離子交換色譜步驟使用相同類型的陽離子交換材料，c)以基本均一的形式從第二個陽離子交換色譜柱回收單聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素，d)通過根據(jù)本發(fā)明的方法再生陽離子交換色譜柱。所述方法尤其用于純化聚乙二醇化的重組多肽，所述多肽是糖基化的，即其由哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選CHO細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Per.C6⑧細(xì)胞或HeLa細(xì)胞產(chǎn)生，并且然后被用化學(xué)方法聚乙二醇化。在一實施方案中，陽離子交換色譜柱的再生包括下列步驟-用包含氯化鈉的水性緩沖溶液將結(jié)合的多肽從陽離子交換柱移除，-用純凈水沖洗柱子，優(yōu)選使用至少兩個柱體積，-施用氫氧化鈉溶液至柱子，優(yōu)選至少兩個柱體積，-用純凈水沖洗柱子，優(yōu)選使用至少兩個柱體積，-施用包含磷酸二氫鈉和磷酸的溶液至柱子，優(yōu)選至少三個柱體積，-用純凈水沖洗柱子，優(yōu)選使用至少兩個柱體積，-施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，持續(xù)至少4小時，優(yōu)選4小時，禾口-通過用純凈水沖洗柱子來再生陽離子交換柱，優(yōu)選使用至少兩個柱體積。在本方法的第一個步驟中，促紅細(xì)胞生成素是聚乙二醇化的。用于聚乙二醇化反應(yīng)中的聚(乙二醇)(PEG)聚合物分子具有約20kDa至40kDa的分子量(就此處所用的"分子量"而言，其應(yīng)被理解為PEG的平均分子量，因為不能以確定的分子量得到作為聚合化合物的PEG，而實際上其具有一分子量分布范圍；術(shù)語"約"意指在所述的PEG制品中，一些分子會比所示的分子量大或有些分子會比所示的分子量小，即術(shù)語"約"指分子量分布，其中95%的PEG分子具有所示分子量+/_10%范圍內(nèi)的分子量。例如30kDa的分子量指27kDa至33kDa的范圍)。術(shù)語"促紅細(xì)胞生成素"指具有序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)或者與其基本同源的蛋白質(zhì)或多肽，其生物學(xué)性能與剌激紅細(xì)胞產(chǎn)生和剌激骨髓中的定向紅系祖細(xì)胞的分裂和分化有關(guān)?？梢酝ㄟ^重組DNA技術(shù)或通過內(nèi)源基因活化經(jīng)在真核細(xì)胞中例如在CHO細(xì)胞或者BHK細(xì)胞或者HeLa細(xì)胞中表達(dá)來制備重組促紅細(xì)胞生成素，即將促紅細(xì)胞生成素糖蛋白通過內(nèi)源基因活化來表達(dá)，參見例如US5，733，761、US5，641，670、US5，733，746、WO93/09222、WO94/12650、WO95/31560、WO90/11354、WO91/06667和WO91/09955。在一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素是基于人EPO序列的。在一優(yōu)選實施方案中，人促紅細(xì)胞生成素具有在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列，更優(yōu)選地，人促紅細(xì)胞生成素具有在SEQIDN0:1中所示的氨基酸序列。術(shù)語"促紅細(xì)胞生成素"還指SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)的變體，其中一個或多個氨基酸殘基被改變、刪除或插入，并且其具有與未修飾的蛋白質(zhì)相同的生物活性，例如在EP1064951或US6，583，272中報道的。變體可以具有含有1_6個額外的用于糖基化的位點的人促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的各種實驗來測定聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的比活性。本發(fā)明的純化的聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的生物活性如下與未注射組或?qū)φ战M個體相比，通過注射將所述蛋白給藥至人類患者致使骨髓細(xì)胞增加網(wǎng)狀細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^根據(jù)PharmeuropaSpec.IssueBiologicalsBRPErythropoietinBio97-2(1997)31-48的方法來測試根據(jù)本發(fā)明得到和純化的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的生物活性。根據(jù)本發(fā)明的"PEG"或"PEG基團(tuán)"意指含有作為基本部分的聚(乙二醇)的殘基。所述PEG可以含有另外的化學(xué)基團(tuán)，其對于結(jié)合反應(yīng)是必需的，其產(chǎn)生自分子的化學(xué)合成或者其是分子的組成部分的最佳距離的間隔物。上述另外的化學(xué)基團(tuán)不用于PEG聚合物分子的分子量計算中。此外，所述PEG可以由互相連接在一起的一個或多個PEG側(cè)鏈構(gòu)成。將具有多于一個PEG鏈的PEG稱作多臂的或支鏈的PEG?？梢岳缤ㄟ^將聚環(huán)氧乙烷加成至各種多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)來制備支鏈的PEG。支鏈的PEG描述于例如EP0473084、US5，932，462中。對于具有20_35kDa分子量的PEG,在一實施方案中使用線性的PEG分子，并且對于具有大于35kDa尤其具有40kDa分子量的PEG聚合物，在另一個實施方案中使用支鏈的PEG。對于PEG40kDa，兩臂的PEG是特別優(yōu)選的。術(shù)語"聚乙二醇化"指聚(乙二醇)殘基在多肽N-末端和/或內(nèi)部賴氨酸殘基處的共價連接。蛋白質(zhì)的聚乙二醇化在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的并被例如Veronese,F.M.，Biomaterials22(2001)405-417綜述。可以使用不同的官能基團(tuán)和具有不同分子量的聚(乙二醇)、線性的和支鏈的PEG以及不同的連接基團(tuán)將PEG進(jìn)行連接(還參見Francis,G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1-18;Delgado，C.等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSystems9(1992)249-304)?？梢栽谒芤褐邪凑绽鏦O00/44785中所述用聚乙二醇化試劑完成促紅細(xì)胞生成素的聚乙二醇化，在一實施方案中使用分子量5kDa-40kDa的NHS-活化的線性或支鏈PEG分子。還可以根據(jù)Lu，Y.等人，ReactivePolymers22(1994)221-229在固相完成聚乙二醇化。非隨機(jī)地，還可以根據(jù)W094/01451來生產(chǎn)N-末端聚乙二醇化的多肽。上述方法致使得到在一個或多個賴氨酸殘基的e-氨基基團(tuán)和/或在N-末端氨基基團(tuán)處聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素。可以根據(jù)Felix，A.M.等人，ACSSymp.Ser.680(Poly(ethyleneglycol))(1997)218-238實現(xiàn)N_末端氨基酸的選擇性聚乙二醇化?？梢栽诠滔嗪铣芍型ㄟ^偶聯(lián)礦-聚乙二醇化的氨基酸衍生物至肽鏈的N-l末端氨基酸來實現(xiàn)選擇性的N-末端聚乙二醇化?？梢栽诠滔嗪铣芍型ㄟ^偶聯(lián)NE-聚乙二醇化的賴氨酸衍生物至增長鏈來實現(xiàn)側(cè)鏈的聚乙二醇化。在固相合成期間如上所述那樣或經(jīng)液相合成通過施用活化的PEG試劑至氨基脫保護(hù)的肽，組合的N-末端和側(cè)鏈聚乙二醇化是可以實現(xiàn)的。合適的PEG衍生物是活化的PEG分子，其在一實施方案中具有約5至約40kDa的平均分子量，在優(yōu)選的實施方案中具有約20至約40kDa的平均分子量，并且在更優(yōu)選的實施方案中具有約30kDa至約35kDa的平均分子量。PEG衍生物可以是線性的或支鏈的PEG?？梢詮腟hearwaterPolymers(H皿tsville，AL，U.S.A.;www.nektar.com)獲得適合于在制備PEG-蛋白和PEG-肽共軛物中使用的各種PEG衍生物?；罨腜EG衍生物在本領(lǐng)域中是已知的，并將其描述在例如Morpurgo，M.，等人，J.Bioconjug.Chem.7(1996)363-368，關(guān)于PEG-乙烯基砜。直鏈和支鏈PEG種類(species)適合于制備聚乙二醇化的片段?；钚訮EG試劑的示例是碘代_乙酰基_甲氧基-PEG或甲氧基-PEG-乙烯基砜(在一實施方案中，m是約450至約900的整數(shù)并且R是直鏈或支鏈的具有l(wèi)-6個碳原子的低級烷基，例如甲基、乙基、異丙基等，其中甲基是優(yōu)選的)9所述碘代-活化物質(zhì)的應(yīng)用在本領(lǐng)域是公知的，并描述在例如Hermanson，G.T.的BioconjugateTechniques,AcademicPress,SanDiego(1996)147-148頁中。在一實施方案中，PEG種類是活化的PEG酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺基丙酸酯或N-羥基琥珀酰亞胺基丁酸酯或者N-羥基琥珀酰亞胺類例如PEG-NHS(Monfardini，C.等人，BioconjugateChem.6(1995)62-69)。在一實施方案中，PEG是被N_羥基琥珀酰亞胺酯活化的，采用烷氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺，例如甲氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺(麗30000;ShearwaterPolymers,Inc.)，其中R和m是如上所定義。在一實施方案中，PEG種類是甲氧基聚(乙二醇)-丁酸的N-羥基琥珀酰亞胺基酯。術(shù)語"烷氧基"指烷基醚基團(tuán)，其中術(shù)語"烷基"意指含有至多四個碳原子的直鏈或支鏈的烷基基團(tuán)，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等，優(yōu)選甲氧基。本申請內(nèi)所用的術(shù)語"基本均一形式"指得到的、含有的或所用的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素是具有確定數(shù)目的連接的PEG基團(tuán)的那些。在一實施方案中，聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素是單-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素。該制品可以含有未反應(yīng)的(即PEG基團(tuán)缺失的)促紅細(xì)胞生成素，多聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素以及聚乙二醇化反應(yīng)中產(chǎn)生的多肽片段。術(shù)語"基本均一形式"指單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素制品含有至少50%(w/w)的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，至少75%的單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，至少90%的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，或者多于95%的單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素。所述百分值是基于色譜圖的面積-%，所述色譜圖由獲得單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的陽離子交換色譜得到。本發(fā)明報道用于純化單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素以便得到基本均一形式的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的方法。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)都使用相同類型的陽離子交換材料的兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟的組合提供基本均一形式的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素。因此，本發(fā)明提供用于純化單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的方法，其包括下列步驟提供包含單_、多_和非聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的溶液；進(jìn)行兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟；在第二個陽離子交換色譜步驟中回收純化的單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，其中在兩個陽離子交換色譜步驟中使用相同類型的離子交換材料；以及通過根據(jù)本10發(fā)明第一方面的方法再生陽離子交換色譜柱。在第二個陽離子交換色譜步驟中回收純化的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素是通過從第二個陽離子交換色譜材料上洗脫單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素來實現(xiàn)的。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案中，兩個陽離子交換色譜步驟的差異在于所用的洗脫方法不同。在一個實施方案中，第一個陽離子交換色譜步驟以階式洗脫方法完成，即所用緩沖液的離子強(qiáng)度是階梯式增加的，即立刻從一個離子強(qiáng)度值到下一個離子強(qiáng)度值。在一個實施方案中，階式洗脫方法是以三階洗脫方法完成的。在第一梯階中，將大部分多-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素從陽離子交換色譜柱上洗脫。離子強(qiáng)度的第二次增加主要洗脫單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，基于相應(yīng)的分子排阻色譜圖的面積其具有大于60%的純度(面積_%)。離子強(qiáng)度的第三次增加主要從柱子上洗脫剩余的非_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素。在一個實施方案中，第二個陽離子交換色譜步驟用連續(xù)洗脫方法完成，即緩沖液的離子強(qiáng)度是連續(xù)增加的。將含有單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的洗脫的流份合并，以得到基本均一形式的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，在一實施方案中，基于相應(yīng)色譜圖的峰面積其含有少于O.5%的低分子量形式。在一實施方案中，緩沖液以10mM-250mM，優(yōu)選50mM-150mM，更優(yōu)選約100mM的濃度存在。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟是如下的步驟a)在適合于使所述單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素結(jié)合至所述第一個柱子中含有的陽離子交換材料的條件下，將含有單_、多_和非_聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的混合物的水性緩沖溶液施用至第一個陽離子交換色譜柱，b)通過流出緩沖液離子強(qiáng)度階梯式增加的階式洗脫方法，從第一個陽離子交換色譜柱回收單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，其中與步驟a)中所施用的混合物相比，單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的相對含量增加，c)在適合于使所述促紅細(xì)胞生成素結(jié)合至所述第二個柱子中含有的陽離子交換材料的條件下，將從步驟b)回收的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素施用至第二個陽離子交換色譜柱，此處所述第二個柱子中含有的陽離子交換材料與第一個柱子中的陽離子交換材料是相同類型的，d)通過流出緩沖液的離子強(qiáng)度連續(xù)增加的連續(xù)洗脫方法，以基本均一形式從所述第二個陽離子交換色譜柱回收純化的單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素。多肽的聚乙二醇化通常不提供均一形式的聚乙二醇化產(chǎn)物。而且，其作為單-聚乙二醇化、多-聚乙二醇化和非-聚乙二醇化的產(chǎn)物的混合物獲得。因此，在所述方法的步驟a)中施用的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的溶液是單_、多_和非_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素以及低分子量形式或片段在水緩沖液中的混合物。通過分子排阻色譜(SE-HPLC)來測定不同物質(zhì)的相對含量。在分子排阻色譜圖中的相關(guān)峰的面積(即峰下的面積)的總和是分子排阻色譜圖的總面積。將單個峰的分?jǐn)?shù)以面積-%給出，即以色譜圖總面積的相對面積分?jǐn)?shù)給出?！闵V方法，其用途和相關(guān)術(shù)語是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。參見例如色譜法(Chromatography)，第5片反，A部分原理禾口技術(shù)(FundamentalsandTechniques)，Heftma皿(編者)，ElsevierSciencePublishingCompany,Chromatography第5片反，51A(1992)和其它相關(guān)的教科書。在色譜過程中，緩沖液流出陽離子交換色譜柱。所述"流出的緩沖液"根據(jù)色譜方法的步驟的需要進(jìn)行調(diào)整。其運(yùn)輸感興趣的物質(zhì)至(施用至)色譜材料和從色譜物質(zhì)運(yùn)輸出(洗脫)感興趣的物質(zhì)。在第一個陽離子交換色譜步驟中，將單-聚乙二醇化、多-聚乙二醇化和非-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素混合物以約lmg/ml的蛋白質(zhì)濃度施用至在水性溶液(其用約lOOmM磷酸鉀緩沖，約pH3.0)中的第一個陽離子交換色譜柱。在本申請范圍內(nèi)所用的術(shù)語"約"指在給定值上下10%的范圍，8卩±10%。施用之前和之后，用相同的緩沖溶液洗第一個柱子。對于階式洗脫方法中的第一個步驟，將緩沖液改變?yōu)樵诩sPH3.0的含有約100mM磷酸鉀、約90mM氯化鈉的緩沖液。用該緩沖液，將水解的PEG試劑即相應(yīng)的聚乙二醇化的碳酸、未反應(yīng)的偶聯(lián)試劑和多_聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素從陽離子交換色譜柱洗脫。對于所述三階洗脫方法中的第二個梯階，將緩沖液改變?yōu)樵诩spH3.0的含有約100mM磷酸鉀、約250mM氯化鈉的緩沖液。在該梯階中，將單-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素從第一個陽離子交換色譜柱回收。將收集的該洗脫梯階的流出緩沖液用純凈水約1:5至1:8稀釋。第一個陽離子交換色譜步驟后，回收的單-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素不含游離PEG。收集的第一個陽離子交換色譜的第二個梯階的流出緩沖液含有提高的相對含量的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，即當(dāng)與第一個陽離子交換色譜步驟之前相比時，單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的重量或面積_%(在收集的第二個梯階的流出緩沖液的分子排阻色譜的色譜圖中)分?jǐn)?shù)提高了。在一實施方案中，單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的相對含量是至少60面積_%。在優(yōu)選的實施方案中，單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的相對含量是至少80面積-%。為了進(jìn)一步純化單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，進(jìn)行第二個陽離子交換色譜步驟。對于第二個陽離子交換色譜來說，將收集的并稀釋的第二個洗脫梯階的流出緩沖液(調(diào)至約100mM的磷酸鉀濃度和約pH3.0的pH)施用至第二個陽離子交換色譜柱(其含有與第一個陽離子交換色譜柱相同類型的陽離子交換材料)。在一實施方案中，第二個陽離子交換柱和其中含有的陽離子交換材料與第一個陽離子交換色譜步驟中的相同。通過施用線性梯度來從第二個陽離子交換色譜柱回收單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，該線性梯度起始于約pH3.0的、具有約50mM氯化鈉的約100mM濃度的磷酸鉀緩沖液并終止于約pH3.0的、具有約500mM氯化鈉的約100mM濃度的磷酸鉀緩沖液。歷經(jīng)10個柱體積，氯化鈉濃度的變化是線性的。將流出的緩沖液分成份，并將每份用lM磷酸氫二鉀稀釋，以增加pH值至約pH6-8。第二個陽離子交換色譜步驟后，以基本均一形式(優(yōu)選具有至少95%(面積)的純度)得到單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知離子交換色譜技術(shù)。在結(jié)合至陽離子交換材料的多肽的回收步驟中，通過離子交換柱的緩沖液/溶液的離子強(qiáng)度即導(dǎo)電性是增加的。這可以通過增加緩沖液鹽濃度或通過添加其它鹽(所謂的洗脫鹽)至緩沖溶液來實現(xiàn)。根據(jù)洗脫方法，通過分批加入濃縮緩沖液或洗脫鹽溶液使緩沖液/鹽濃度立刻(階式洗脫方法)或連續(xù)(連續(xù)洗脫方法)增加。在一實施方案中，洗脫鹽是檸檬酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀或者檸檬酸或磷酸的其它鹽或者所述組分的任何混合物。在優(yōu)選的實施方案中，洗脫鹽是檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀或其混合物。在本方法的一個實施方案中，陽離子交換材料是強(qiáng)陽離子交換材料；在優(yōu)選的實施方案中，陽離子交換材料是Toyopearl⑧sp650M;在另一個優(yōu)選實施方案中，陽離子交換材料是磺丙基陽離子交換材料。在一實施方案中，引起洗脫的鹽濃度是5mM-500mM，在優(yōu)選的實施方案中其是5mM-400mM，并且在特別優(yōu)選的實施方案中其是5mM-250mM。在本發(fā)明的另一個實施方案中，引起洗脫的鹽同時用作緩沖物質(zhì)，例如檸檬酸或其鹽或者磷酸或其鹽?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法將單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素在含有藥學(xué)上可接受的載體或溶媒的適于注射的藥物組合物中使用。例如，合適的組合物已描述在WO97/09996、W097/40850、W098/58660和W099/07401中。用于配制本發(fā)明產(chǎn)品的優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的載體是人血清白蛋白、人血漿蛋白等。可以將本發(fā)明化合物配制在含有張度劑(例如132mM氯化鈉)的pH7的10mM磷酸鈉/鉀中。藥物組合物可以任選地含有防腐劑。藥物組合物可以含有不同量的單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，例如10-1000iig/ml、例如50iig或400iig。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的施用致使人體中紅細(xì)胞形成。因此，單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的施用補(bǔ)充在紅細(xì)胞生產(chǎn)中起重要作用的促紅細(xì)胞生成素蛋白?？梢詫⒑袉?聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的藥物組合物以對于通過各種方式施用至人類患者有效的強(qiáng)度進(jìn)行配制，所述患者患有以紅細(xì)胞產(chǎn)生低或缺失(單獨地或為疾患或疾病的部分)為特征的血液病癥?？梢詫⑺幬锝M合物通過注射例如通過皮下或靜脈注射施用。單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的平均量可以變化。共軛物的確切量受以下因素影響例如要被治療的疾患的確切類型、要被治療的患者的情況及組合物中的其它成分。例如可以以0.01-10iig/kg體重、優(yōu)選0.1-1iig/kg體重施用，例如每周施用一次。已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)可以用根據(jù)本發(fā)明的方法在分離效率沒有顯著降低的情況下將陽離子交換色譜柱再生。已表明用根據(jù)本發(fā)明的再生方法，陽離子交換色譜柱可以使用至少40個分離循環(huán)，在一實施方案中可以使用至少50個分離循環(huán)，在另一個實施方案中可以使用至少60個分離循環(huán)，而在分離效率(參見圖1)和收率(參見圖2)方面沒有顯著降低。本申請范圍內(nèi)所用的術(shù)語"分離循環(huán)"指下列序列i)平衡柱子，ii)將待分離的溶液施用至柱子上，iii)沖洗柱子，iv)從柱子上回收被吸附的化合物，v)沖洗柱子，vi)再生柱子。還已發(fā)現(xiàn)用根據(jù)本發(fā)明的再生方法，不但可以避免分離效率的下降，而且還能防止負(fù)荷容量的下降(參見圖2)。本申請范圍內(nèi)所用的術(shù)語"分離效率"指陽離子交換色譜柱分離溶液中化合物的能力。本申請范圍內(nèi)所用的術(shù)語"沒有顯著降低"指陽離子交換色譜柱在含有相同化合物溶液的連續(xù)色譜中提供相同的化合物分離，即在+/-5%變化范圍內(nèi)，在一實施方案中在+/-2.5%變化范圍內(nèi)。本申請范圍內(nèi)所用的術(shù)語"負(fù)荷容量"指從陽離子交換色譜柱回收的感興趣的化合物的量。提供下列實施例、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實范圍在附加的權(quán)利要求書中提出。應(yīng)當(dāng)理解可以在不背離本發(fā)明精神的情況下，對所述的方法進(jìn)行修改。13附圖詳述圖1再生方法的循環(huán)數(shù)驗證期間第一個色譜的流出緩沖液集合體(pool)中單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的純度。圖2再生方法的循環(huán)數(shù)驗證期間第一個色譜的流出緩沖液集合體中單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的收率。材料和方法SE-HPLCSE-HPLC根據(jù)蛋白質(zhì)的表觀分子量來分離蛋白質(zhì)。因此，本方法能檢測單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素、低分子量形式和片段、促紅細(xì)胞生成素的多聚乙二醇化形式和較高的聚集物。將HPLC裝配220-nm檢測器和Superose6HR柱子(尺寸10X300mm，PharmaciaBiotech,Cat-Nr:17-0537-01)或者Superose610/300GL柱子(PharmaciaBiotech,Cat-Nr:17-5172-01)。將柱子于室溫在等強(qiáng)度條件下使用，用約0.4ml/min的流速。流動相緩沖液是pH6.8的具有300mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液。根據(jù)所用的HPLC系統(tǒng)，該方法可以用100i!L或500iiL的樣品上樣體積來完成。將樣品用流動相緩沖液稀釋至約0.5mg/mL(100iiL負(fù)載)或0.Img/mL(500yL負(fù)載)的蛋白濃度。具有低于0.Img/mL的蛋白濃度的樣品可以不稀釋就使用。將洗脫的蛋白質(zhì)在220nm的檢測波長進(jìn)行檢測。RP-HPLC:通過RP-HPLC來分析純度，RP-HPLC可將單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素從寡聚形式和相關(guān)物質(zhì)中分出。在Poroshell柱子上使用乙腈/TFA水溶液梯度來完成實驗。在用紫外吸收在220nm監(jiān)測洗脫曲線。單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素和相關(guān)物質(zhì)或寡聚形式的百分?jǐn)?shù)是根據(jù)洗脫的蛋白質(zhì)的總峰面積來計算的。實施例1單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的純化可以例如根據(jù)WO01/87329來生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素并根據(jù)W096/135718的報道來純化?？梢岳绺鶕?jù)WO03/029291來生產(chǎn)聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素。a)在SPToyopearl650M上的第一個色譜在填充SPToyopeaii650M的磺丙基(SP)柱子上完成第一個色譜步驟。將柱子在RT使用。第一個柱子的最大負(fù)荷容量定為1.5g蛋白/升柱體積(CV)。將柱子用pH2.9-3.1的lOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-A緩沖液)平衡。在載樣步驟后，將柱子用一系列含有增加量NaCl的磷酸鉀緩沖液沖洗和洗脫。將游離的聚乙二醇化碳酸即水解的PEG試劑和多-聚乙二醇化形式分別在流出液中和隨后的應(yīng)用SP-A緩沖液和pH2.9-3.1的含有90mM氯化納的lOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-B緩沖液)的沖洗步驟中除去。通過使用pH2.9-3.1的含有250mM氯化納的lOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-C緩沖液)來洗脫單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，將其收集在容器中并直接用純凈水l:5稀釋。將該收集的洗脫物稱作"SP洗脫物集合體(pool)1"。接著，將柱子用pH2.9-3.1的含有750mM氯化納的lOOmM磷酸鉀緩沖液(SP-D緩沖液)沖洗，以便除去未反應(yīng)的促紅細(xì)胞生成素，并將柱子再生。b)在SPToyopearl650M上的第二個色譜將第二個柱子在RT使用。用SP-A緩沖液平衡后，將SP洗脫物集合體I施用至柱子，并隨后將柱子用SP-A緩沖液沖洗。通過使用經(jīng)pH2.9-3.1的lOOmM磷酸鉀緩沖液緩沖的歷經(jīng)10個柱體積從50mM至500mM斜率的氯化納線性梯度進(jìn)行洗脫。將產(chǎn)物峰分成至多8個單一流份，并將每份直接用1M磷酸氫二鉀稀釋，以提高pH至6-8。單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素洗脫完成后，可以將梯度的斜率增加，以便立即用pH2.9-3.1的含有500mM氯化納的lOOmM磷酸鉀緩沖液沖洗柱子。c)SPToyopearl650M柱子的再生將兩個柱子的樹脂以7個步驟的序列進(jìn)行再生。將柱子用純凈水沖洗后，用0.5M氫氧化鈉溶液沖洗。將堿性溶液用純凈水置換，接著用酸沖洗(0.5M磷酸二氫鈉，1M磷酸)。經(jīng)再一個純凈水步驟后，將柱子用0.5M氫氧化鈉除熱源，持續(xù)^4小時?？列?Caustic)再生后，將柱子再次用純凈水沖洗。通過超濾來生產(chǎn)純凈水(PWIII)。根據(jù)美國藥典，PWIII水的質(zhì)量相當(dāng)于注射用水的質(zhì)量。根據(jù)Ph.Eur.和USP.完成測試。根據(jù)上述第一個色譜步驟完成的對照操作期間，在各流出緩沖液中不能檢測到殘留的蛋白質(zhì)或PEG部分。60個循環(huán)后，樹脂的SDS-PAGE分析顯示在凝膠上沒有殘留的蛋白質(zhì)或PEG部分。基于這些數(shù)據(jù)，殘留蛋白質(zhì)和PEG部分的批次間遺留可以被排除，因此柱子的再生是非常有效的(還見圖1)。各色譜中得到的收率檢測顯示沒有下降(還見圖2)。表1:柱子再生參數(shù)概覽。柱子參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如在圖1和2中所示，對于所有循環(huán)的第一個色譜步驟來說，在流出緩沖液集合體中單-聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的純度和收率明顯在至少80%純度和至少35%收率的范圍內(nèi)。另外，在柱子的使用期限內(nèi)，不能觀察到單_聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的純度趨勢。權(quán)利要求用于在感興趣的化合物洗脫后再生陽離子交換色譜柱的方法，其包括以下順序的下列步驟-用包含至少500mM濃度的氯化鈉的水性緩沖溶液從柱子上洗脫吸附的多肽，-用純凈水沖洗柱子，-施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，-用純凈水沖洗柱子，-施用包含0.5M磷酸二氫鈉和1M磷酸的溶液至柱子，-用純凈水沖洗柱子，-施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，持續(xù)至少4小時，和-通過用純凈水沖洗柱子來使陽離子交換色譜柱再生。2.獲得基本均一形式的單-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素的方法，其包括下列步驟a)使用活化的分子量20kDa至40kDa的聚乙二醇化試劑將促紅細(xì)胞生成素聚乙二醇化，b)用兩個連續(xù)的陽離子交換色譜步驟純化在步驟a)中得到的聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素，其中第一和第二個陽離子交換色譜步驟使用相同類型的陽離子交換材料，c)以基本均一的形式從第二個陽離子交換色譜柱回收單-聚乙二醇化的促紅細(xì)胞生成素，d)通過以下順序的下列步驟再生陽離子交換色譜柱i)用包含氯化鈉的水性緩沖溶液將結(jié)合的多肽從陽離子交換柱移除，ii)用純凈水沖洗柱子，iii)施用氫氧化鈉溶液至柱子，iv)用純凈水沖洗柱子，v)施用包含磷酸二氫鈉和磷酸的溶液至柱子，vi)用純凈水沖洗柱子，vii)施用0.5M氫氧化鈉溶液至柱子，持續(xù)至少4小時，禾口viii)通過用純凈水沖洗柱子來再生陽離子交換色譜柱。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的陽離子交換色譜柱是強(qiáng)陽離子交換色譜柱。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的陽離子交換色譜柱是磺丙基陽離子交換色譜柱。5.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述的緩沖劑是磷酸或其鹽、或者乙酸或其鹽、或者檸檬酸或其鹽、或者組氨酸或其鹽。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的促紅細(xì)胞生成素是具有SEQIDNO:1或2氨基酸序列的人促紅細(xì)胞生成素。7.根據(jù)權(quán)利要求2或6中的任何一項所述的方法，其特征在于所述的PEG具有20-35kDa的分子量并且是線性的。8.根據(jù)權(quán)利要求2或6中的任何一項所述的方法，其特征在于所述的PEG具有40kDa的分子量并且是支鏈的。9.根據(jù)權(quán)利要求2和6-8中的任何一項所述的方法，其特征在于所述的第一個陽離子交換色譜步驟是以階式洗脫完成的，并且所述的第二個陽離子交換色譜步驟是以線性洗脫完成的。10.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項所述的方法，其特征在于所述的陽離子交換色譜柱能夠使用至少40個分離循環(huán)。全文摘要本發(fā)明包括用于再生陽離子交換色譜柱的方法。文檔編號C07K1/00GK101754789SQ200880025173公開日2010年6月23日申請日期2008年7月15日優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日發(fā)明者A·施羅特,A·維斯納,H·舒里格,J·伯格,K·雷徹特申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司