專利名稱：：可變切向流過濾的制作方法可變切向流過濾本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)濃縮領(lǐng)域，更具體而言，其涉及切向流過濾(TFF)用于免疫球蛋白濃縮的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)、尤其是免疫球蛋白在當(dāng)前的醫(yī)藥事務(wù)中起著非常重要的作用。用于生產(chǎn)重組多肽的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的并且描述于，例如Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V.等，MethodsEnzymol.185(1990)3-7;Wurm，F(xiàn).和Bernard,A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159。在制藥應(yīng)用中使用的多肽主要在諸如CH0細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6⑧細(xì)胞等的哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)。對于人類應(yīng)用，每種藥用物質(zhì)都必須符合特定的標(biāo)準(zhǔn)。為確保生物藥用物質(zhì)對人類的安全性，例如，必須移除可能造成嚴(yán)重傷害的核酸、病毒和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。為符合質(zhì)量管理規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)步驟之后必須有一個或多個純化步驟。除其它因素外，純度、生產(chǎn)能力和收率在確定合適的純化方法中起著重要的作用。由于它們的化學(xué)和物理性質(zhì)，諸如分子量和結(jié)構(gòu)域構(gòu)造(包括二級修飾)，免疫球蛋白的下游加工非常復(fù)雜。例如，不僅對于配制的藥物，而且對于下游加工(DSP)的中間產(chǎn)品，都需要濃縮溶液以實(shí)現(xiàn)用于經(jīng)濟(jì)處理和應(yīng)用貯存的低體積。此外，短的濃縮時間對于確保順利加工和短的操作時間都是有利的。就此方面，不完善的TFF方法(尤其是最終純化步驟后的)可以引起持久的損害，甚至影響藥物產(chǎn)品。Ahrer，K.，等(J.Membr.Sci.274(2006)108-115)研究了單克隆抗體(mAb)中間溶液的切向流濃縮過程中切變應(yīng)力和聚集之間的關(guān)系。監(jiān)測了濃縮時間及所選擇的流和壓力對方法性能和聚集狀態(tài)的影口向(例如，參力口Dosmar，M.等，BioprocessInt.3(2005)40—50;Luo，R.等，BioprocessInt.4(2006)44-46)。Mahler，H.-C.等(Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.59(2005)407—417)報道了在通過不同的攪拌應(yīng)力方法形成的液體IgGl-抗體制劑中聚集的誘導(dǎo)和分析。在US6，252，055中，報道了濃縮的單克隆抗體制備物。用于生產(chǎn)濃縮抗體制備物的方法報道于US2006/0182740。US2006/0051347報道了包括超濾、滲濾和二次超濾序列的聯(lián)合方法。在EP0907378中報道了應(yīng)用具有250ml/分鐘的固定再循環(huán)速率的橫向流(cross-flow)超濾濃縮抗體制備物的方法。US2004/0167320報道了切向流過濾的方法以及用于其的設(shè)備。W097/45140報道了濃縮的抗體溶液。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于濃縮含有重組生產(chǎn)的免疫球蛋白的溶液的方法。更具體地，本發(fā)明的一個方面是通過切向流過濾濃縮免疫球蛋白溶液的方法，其中所施加的跨膜壓力和橫向流是可變的a)在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，1.4巴(bar)至1.6巴的跨膜壓力和75ml/分鐘至90ml/分鐘的橫向流，b)在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml的濃度范圍中，O.8巴至O.9巴的跨膜壓力和140ml/分鐘至160ml/分鐘的橫向流，以及c)在超過45mg/ml的濃度范圍中，0.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。在一個實(shí)施方案中，步驟c)中的濃度范圍是50mg/ml至高達(dá)275mg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟c)中的濃度范圍是50mg/ml至高達(dá)180mg/ml。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟c)中的濃度范圍是50mg/ml至高達(dá)130mg/ml。在另一實(shí)施方案中，步驟a)中的跨膜壓力和橫向流是1.5巴和80ml/分鐘，步驟b)中是0.85巴和150m1/分鐘，和/或步驟c)中是O.85巴和130ml/分鐘。在另一實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液是緩沖的、水性(aqueous)免疫球蛋白溶液。本發(fā)明的另一方面是用于生產(chǎn)異源免疫球蛋白的方法，其包括下述順序的以下步驟a)提供重組哺乳動物細(xì)胞，其包含一種或多種編碼異源免疫球蛋白的核酸；b)在適于表達(dá)該異源免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)步驟a)的細(xì)胞；c)從重組哺乳動物細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收異源免疫球蛋白；d)應(yīng)用具有可變跨膜壓力和橫向流的切向流過濾濃縮所獲得包含所述異源免疫球蛋白的水性、緩沖溶液。在一個實(shí)施方案中，該方法的步驟d)包括應(yīng)用具有以下可變跨膜壓力和橫向流的切向流過濾濃縮所獲得的水性、緩沖溶液i)在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，1.4巴至1.6巴的跨膜壓力和75m1/分鐘至90m1/分鐘的橫向流，ii)在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml的濃度范圍中，O.8巴至O.9巴的跨膜壓力和140m1/分鐘至160m1/分鐘的橫向流，以及iii)在超過45mg/ml的濃度范圍中，O.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。在另一實(shí)施方案中，該方法在步驟d)之前或步驟d)之后包括以下步驟e)純化含有異源免疫球蛋白的水性、緩沖溶液。在另一實(shí)施方案中，所述異源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物。在一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞或？￡11.(:6@細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明報道了用于將免疫球蛋白溶液濃縮至濃度超過100mg/ml的方法。出人意料地發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以以低的聚集物形成和在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)這一目的。在本發(fā)明中，術(shù)語"切向流過濾"或"TFF"可互換使用，其表示這樣的過濾方法，其中待濃縮的含有多肽的溶液沿著濾膜表面(即，與濾膜表面正切)流動。該濾膜包含具有確定截?cái)嘀档目讖?。在一個實(shí)施方案中，該截?cái)嘀凳?0kDa至50kDa，優(yōu)選30kDa。該過濾方法是一種超濾方法。術(shù)語"橫向流"表示待濃縮溶液的與膜正切的液流(滲余物流)。術(shù)語"通量(flux)"或"滲透物流(permeateflow)"在本發(fā)明中可互換使用，其表示穿過膜(即，通過膜孔)的流體的流。即，其指通過膜的滲透物的體積流速。"流"通常以每單位時間每單位膜面積的體積的形式如升/m7h(LMH)給出。在一個實(shí)施方案中，橫向流的特征在于該橫向流以對于0.02m2的膜面積而言的ml/分鐘表示。在另一實(shí)施方案中，在單個步驟中橫向流是2401/m2/h、4501/m7h和3901/m2/h。滲透物包括待濃縮溶液的溶劑，以及具有所應(yīng)用的膜的截?cái)嘀狄韵路肿恿康姆肿?但非異源免疫球蛋白)。術(shù)語"跨膜壓力"或"TMP"在本發(fā)明內(nèi)可互換使用，其表示施加的用于驅(qū)動溶劑和比濾膜的截?cái)嘀蹈〉某煞滞ㄟ^濾膜的孔徑的壓力?？缒毫κ侨肟?、出口和滲透物的平均壓力，并且可如下計(jì)算術(shù)語"免疫球蛋白"是指由一個或多個基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。確認(rèn)的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因和繁多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以以不同的形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab^以及單鏈(scFv)或雙體(例如，Huston,J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988)5879-5883;Bird，R.E.等，Science242(1988)423-426;一般地，Hood等，Immunology,BenjaminN.Y.，第二版(1984);禾口Hunk即iller，T.和Hood，L.，Nature323(1986)15-16)。術(shù)語"完全免疫球蛋白"表示包含兩條稱為輕免疫球蛋白鏈多肽(輕鏈)和兩條稱為重免疫球蛋白鏈多肽(重鏈)的免疫球蛋白。完全免疫球蛋白的每一條重和輕免疫球蛋白鏈多肽含有可變結(jié)構(gòu)域(可變區(qū))(一般為多肽鏈的氨基端部分)，其包含可與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)域。完全免疫球蛋白的每一條重和輕免疫球蛋白鏈多肽還包含恒定區(qū)(一般為羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體與i)擁有FcY受體(FcyR)的細(xì)胞諸如吞噬細(xì)胞結(jié)合，或與ii)擁有新生兒Fc受體(FcRn)(也稱為Brambell受體)的細(xì)胞結(jié)合。其還介導(dǎo)與一些因子包括經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子諸如成分(Clq)的結(jié)合。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈的可變區(qū)依次包含不同的片段，即四個框架區(qū)域(FR)和3個高變區(qū)(CDR)。術(shù)語"免疫球蛋白片段"表示包含重鏈的可變結(jié)構(gòu)域、Q1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、Q2結(jié)構(gòu)域、Q3結(jié)構(gòu)域、Q4結(jié)構(gòu)域，輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域中至少一個結(jié)構(gòu)域的多肽。還包含其衍生物和變體。例如，可存在其中一個或多個氨基酸或氨基酸區(qū)域缺失的可變結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"免疫球蛋白綴合物"表示包含通過肽鍵與其它多肽軛合的免疫球蛋白重或輕鏈的至少一個結(jié)構(gòu)域的多肽。所述其它多肽是非免疫球蛋白肽，諸如激素、生長受體、抗融合肽或補(bǔ)體因子等。通用的色譜方法和它們的用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如參見色譜法(Chromatography)，第5片反，A部分原理禾口技術(shù)(FundamentalsandTechniques)，Heftmann，E.(編輯)，ElsevierSciencePublishingCompany,紐約，(1992);生物科學(xué)中的先進(jìn)色譜法禾口電遷移方法(AdvancedChromatogr即hicandElectromigrationMethodsinBiosciences),Deyl，Z.(編車茸)，ElsevierScienceBV，Amsterdam,TheNetherlands,(1998);當(dāng)今的色譜法(ChromatographyToday),Poole，C.F.，禾口Poole，S.K.，ElsevierSciencePublishingCompany,紐約(1991);Scopes，蛋白質(zhì)純化原理和實(shí)踐(ProteinPurification-PrinciplesandPractice)(1982);S咖brook，J.，等(編車茸)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989;或分子生物學(xué)的當(dāng)前技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology),Ausubel，F(xiàn).M.等(編車茸)，JohnWiley&Sons,Inc.，紐約。對于重組產(chǎn)生的異源免疫球蛋白的純化，通常應(yīng)用不同柱色譜步驟的組合。通常在蛋白質(zhì)A親和色譜法后跟隨有一個或兩個其它的分離步驟。最終的純化步驟稱為"精制步驟(polishingst印)"，用于除去痕量雜質(zhì)和污染物，例如聚集的免疫球蛋白、殘余HCP(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))、DNA(宿主細(xì)胞核酸)、病毒或內(nèi)毒素。對于這一精制步驟，通常使用在流通模式中的陰離子交換材料。已建立了不同的方法并將其廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)回收和純化，諸如用微生物蛋白質(zhì)的親和色譜法(例如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和色譜)，離子交換色譜法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換)，嗜硫吸附(例如用P-巰基乙醇和其它SH配體)，疏水相互作用或芳香性吸附色譜(例如，用苯基_瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或間氨基苯硼酸)，金屬螯合親和色譜(例如用Ni(II)_和Cu(II)-親和材料)，尺寸排阻色譜，和電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93—102)。術(shù)語"異源免疫球蛋白"表示不是由哺乳動物細(xì)胞天然產(chǎn)生的免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的免疫球蛋白是通過重組方法產(chǎn)生的。此類方法在本領(lǐng)域是公知的，并且包括在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)、隨后回收和分離異源免疫球蛋白，并且通常純化至藥學(xué)上可接受的純度。為了生產(chǎn)(即表達(dá))免疫球蛋白，通過標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼輕鏈的核酸和編碼重鏈的核酸各自插入到表達(dá)盒中。應(yīng)用常規(guī)方法能很容易地分離和測序編碼免疫球蛋白輕和重鏈的核酸。雜交瘤細(xì)胞可作為此類核酸的來源。可將表達(dá)盒插入到表達(dá)質(zhì)粒中，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，否則所述宿主細(xì)胞不產(chǎn)生免疫球蛋白。在合適的原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并且從裂解后的細(xì)胞或從培養(yǎng)上清液回收免疫球蛋白。本申請中所使用的術(shù)語"免疫球蛋白溶液"表示含有完全免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物的水性緩沖溶液。該溶液例如可以是培養(yǎng)上清液、或柱色譜洗脫物、或精制的免疫球蛋白溶液。"異源DNA"或"異源多肽"是指不天然存在于給定宿主細(xì)胞中的DNA分子或多肽、或DNA分子群或多肽群。對特定宿主細(xì)胞異源的DNA分子可以含有衍生自宿主細(xì)胞物種的DNA(S卩，內(nèi)源DNA)，只要該宿主DNA與非宿主DNA(g卩，外源DNA)組合即可。例如，含有與包含啟動子的宿主DNA片段可操作連接的編碼多肽的非宿主DNA片段的DNA分子被認(rèn)為是異源DNA分子。反之，異源DNA分子可包含與外源啟動子可操作地連接的內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因。由非宿主DNA分子編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。術(shù)語"在適于表達(dá)異源免疫球蛋白的條件下"表示用于培養(yǎng)表達(dá)免疫球蛋白的哺乳動物細(xì)胞的條件，并且其是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，或可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知，這些條件將取決于所培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞的類型和所表達(dá)的免疫球蛋白的類型而可能不同。一般而言，哺乳動物細(xì)胞在2(TC至4(rC的溫度下培養(yǎng)，并且持續(xù)足以允許免疫球蛋白的有效蛋白質(zhì)生產(chǎn)的時間段，例如，4至28天。術(shù)語"重組哺乳動物細(xì)胞"指可以將或?qū)⒗缇幋a異源多肽的核酸導(dǎo)入/轉(zhuǎn)染至其中的細(xì)胞。術(shù)語"細(xì)胞"包括用于表達(dá)核酸的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CH0細(xì)胞(例如CH0K1、CH0DG44)、或BHK細(xì)胞、或NS0細(xì)胞、或SP2/0細(xì)胞、或HEK293細(xì)7胞、或HEK293EBNA細(xì)胞、或PER,C6⑧細(xì)胞、或C0S細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、或BHK細(xì)胞、或HEK細(xì)胞、或Sp2/0細(xì)胞、或PER.C6⑧細(xì)胞。本文所使用的表述"細(xì)胞"包括主題(subject)細(xì)胞及其后代。因此，術(shù)語"重組細(xì)胞"包括最初轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及包含從其衍生的后代細(xì)胞的培養(yǎng)物，而不考慮傳代的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于故意或非故意的突變，所有的后代在DNA內(nèi)容物中可能不是精確同一的。與最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有相同功能或生物活性的變體后代也包括在內(nèi)。在本申請中使用的術(shù)語"緩沖的"表示這樣的溶液，其中通過緩沖物質(zhì)使由于添加或釋放酸性或堿性物質(zhì)而導(dǎo)致的PH值改變得以保持恒定。可以使用產(chǎn)生此類效果的任何緩沖物質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，使用藥學(xué)上可接受的緩沖物質(zhì)，例如，磷酸或其鹽、醋酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉或其鹽、2_(^嗎啉代)乙磺酸或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽、或者三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或其鹽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖物質(zhì)是磷酸或其鹽、醋酸或其鹽、或者檸檬酸或其鹽、或者組氨酸或其鹽。緩沖溶液可任選地包含另外的鹽，例如，氯化鈉、和/或硫酸鈉、和/或氯化鉀、和/或硫酸鉀、和/或擰檬酸鈉、和/或擰檬酸鉀。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，緩沖的水性溶液的pH值是pH3.0至pHIO.O，優(yōu)選pH3.0至pH7.0，更優(yōu)選pH4.0至pH6.0、以及最優(yōu)選pH4.5至pH5.5?，F(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，用根據(jù)本發(fā)明的切向流過濾(TFF)方法，可在短時間內(nèi)獲得具有低的聚集物形成的濃縮的免疫球蛋白溶液，其中在所述方法中，跨膜壓力和橫向流在過濾過程中是可變的，并且根據(jù)待濃縮溶液中免疫球蛋白的實(shí)際濃度而調(diào)整。也就是說，已出人意料地發(fā)現(xiàn)，如果應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的TFF方法(即其中在過濾處理過程中根據(jù)抗體溶液的實(shí)際濃度而改變和調(diào)整跨膜壓力的方法)，在切向流過濾過程中的聚集物形成是很低的。與本領(lǐng)域已知的恒定方法(即其中在過濾處理之前選擇跨膜壓力并在整個切向流過濾過程中保持恒定的方法)相比，根據(jù)本發(fā)明的方法是可變的方法。本發(fā)明包括通過切向流過濾濃縮免疫球蛋白溶液的方法，其中所施加的跨膜壓力和橫向流是可變的，并且在過濾處理過程中根據(jù)濃縮的免疫球蛋白溶液中的免疫球蛋白濃度而改變，其中a)在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，施加1.4巴至1.6巴的跨膜壓力和75m1/分鐘至90m1/分鐘的橫向流，b)在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml的濃度范圍中，施加0.8巴至0.9巴的跨膜壓力和140m1/分鐘至160m1/分鐘的橫向流，以及c)在超過45mg/ml的濃度范圍中，施加O.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。TFF中的切變應(yīng)力和聚集物形成之間存在聯(lián)系。為評估該影響，用以下公式計(jì)算在所使用的膜表面上的流誘導(dǎo)的切變應(yīng)力、、,=^^其中4是"〃=4^^所述公式基于Gerhart等(流體力學(xué)基礎(chǔ)(FundamentalsofFluidMechanics)，Addison-WesleyPublishingCompany(1993))禾PCheryan等(超濾和微濾手冊(UltrafiltrationandMicrofiltrationHandbook)，第二版CRCPressLLC(1998))。在這一公式中，dH是水壓(hydraulic)直徑，a是流通道寬度，b是流通道高度以及L是流通道長度。此夕卜，Ap二Pi-p。，其中Pi是所施加的入口壓力，P。是出口壓力。在一個實(shí)施例中，應(yīng)用了由再生纖維素構(gòu)成的HydrosartTM膜(SartoconSlice200Hydrosart,SartoriusAG，G6ttingen，德國)，其具有30kDa的標(biāo)稱分子量截?cái)嘀狄约?.02m2的膜面積。對于所使用的膜盒，計(jì)算得到1.08mm的水壓直徑。首先用標(biāo)準(zhǔn)的TFF方法操作該膜，所述標(biāo)準(zhǔn)方法即在濃縮過程中不改變跨膜壓力和橫向流。分析了具有預(yù)置、恒定的Ap和0.6巴的預(yù)置、恒定跨膜壓力(TMP)的3種恒定方法。表1:所施加的壓力差和相應(yīng)切變應(yīng)力的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過觀察通量相對于上升的蛋白質(zhì)濃度，在不同的Ap下處理的曲線中沒有顯著的差異。但是對于3巴模式，觀察到了由于高入口壓力導(dǎo)致的較低終濃度。與在較低的恒定橫向流(CF;90ml/分鐘)和較低的平均Ap(約0.9巴)下進(jìn)行的濃縮模式相比，1.2_1.8巴的較高Ap有助于隨時間改善的通量性能和較高的終濃度(TMP—直是0.6巴)。對濃縮處理前和處理后濁度、光線遮蔽(L0)和動態(tài)光散射(DLS)數(shù)據(jù)的比較顯示隨著升高的切變應(yīng)力發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)的聚集物形成(圖2)?；赥MP/CF-探查實(shí)驗(yàn)(例如參見Luo，R.，等，BioprocessInt.4(2006)44-54)，已開發(fā)了與施加高入口壓力模式(Ap=3巴)相比具有相當(dāng)?shù)目偺幚頃r間的TFF方法。已開發(fā)了根據(jù)本發(fā)明的方法以改善隨時間的通量性能和減少免疫球蛋白聚集物形成，即，將低的聚集物形成和短的總濃縮時間結(jié)合。在開發(fā)根據(jù)本發(fā)明方法的過程中，根據(jù)待濃縮的免疫球蛋白溶液中的主要免疫球蛋白濃度進(jìn)行了TMP和CF探查。發(fā)現(xiàn)了具有在給定濃度下根據(jù)最佳通量圖式(profile)調(diào)整的TMP和CF的方法。沒有在濃縮最后階段的高入口壓力的缺點(diǎn)(例如參見，Dosmar，M.，等，BioprocessInt.3(2005)40-50)，根據(jù)本發(fā)明的方法在所產(chǎn)生的濃縮物的濁度、LO和DLS數(shù)據(jù)中顯示出低的聚集物負(fù)載(參見圖3和4)。此外，應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法，達(dá)到了更高的終濃度。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，跨膜壓力和橫向流根據(jù)濃縮的免疫球蛋白溶液的實(shí)際濃度而變化。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法是可變切向流過濾方法，其中待濃縮溶液中免疫球蛋白的實(shí)際濃度決定所施加的跨膜壓力和橫向流。因此，根據(jù)免疫球蛋白的實(shí)際濃度調(diào)整跨膜壓力和橫向流，以減少施加的應(yīng)力，并因此減少聚集的免疫球蛋白分子的形成并提供短的總濃縮時間。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，定義了3個濃度范圍。待濃縮溶液的第一個實(shí)際濃度范圍是0mg/ml至30mg/ml，第二個實(shí)際濃度范圍是15mg/ml至55mg/ml，以及第三個實(shí)際濃度范圍是45mg/ml至180mg/ml。正如所見，這些濃度范圍是重疊的范圍。已發(fā)現(xiàn)在15mg/ml至30mg/ml和45mg/ml至55mg/ml的重疊濃度范圍中，在本發(fā)明的方法中可使用不同的跨膜壓力和橫向流值。在這些重疊的濃度范圍中，可施用兩種TMP和CF設(shè)置中的任一種，而不會對聚集形成或處理時間產(chǎn)生顯著影響。因此，在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實(shí)施方案中，從a)至b)和從b)至c)的條件可以在重疊濃度范圍中的任意濃度值處進(jìn)行改變。在一個實(shí)施方案中，步驟c)中的濃度范圍是50mg/ml至高達(dá)275mg/ml。在另一實(shí)施方案中，跨膜壓力和橫向流在步驟a)中是1.5巴和80ml/分鐘，在步驟b)中是0.S5巴和150ml/分鐘，和/或在步驟c)中是0.85巴和130ml/分鐘。在另一實(shí)施方案中，免疫球蛋白溶液是緩沖的水性免疫球蛋白溶液。在一個實(shí)施方案中，濃度范圍在步驟a)中是5至25mg/ml，步驟b)中是25至50mg/ml，以及在步驟c)中是50至140mg/ml。本發(fā)明另一方面是用于生產(chǎn)異源免疫球蛋白的方法，其包括以以下順序的下列步驟a)提供重組哺乳動物細(xì)胞，其包含一種或多種編碼異源免疫球蛋白的核酸；b)在適于表達(dá)該異源免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)該哺乳動物細(xì)胞；c)從重組哺乳動物細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收水性、緩沖溶液形式的異源免疫球蛋白；d)應(yīng)用具有可變的、依賴于免疫球蛋白濃度的跨膜壓力和橫向流的切向流過濾，濃縮所獲得的包含異源免疫球蛋白的水性、緩沖溶液。在根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法的一個實(shí)施方案中，其包括步驟d):應(yīng)用具有下述可變的、依賴于免疫球蛋白濃度的跨膜壓力和橫向流的切向流過濾濃縮所獲得的水性、緩沖溶液i)在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，1.4巴至1.6巴的跨膜壓力和75m1/分鐘至90m1/分鐘的橫向流，ii)在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml的濃度范圍中，O.8巴至O.9巴的跨膜壓力和140m1/分鐘至160m1/分鐘的橫向流，以及iii)在超過45mg/ml的濃度范圍中，O.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。在另一實(shí)施方案中，該方法在步驟d)之前或步驟d)之后包括以下步驟e)純化含有所述異源免疫球蛋白的水性、緩沖溶液。步驟e)中的純化可通過不同的方法和技術(shù)完成，諸如色譜法步驟，或者不同或相似色譜步驟的組合，或沉淀，或鹽析，或超濾，或滲濾，或凍干，或緩沖劑變換(bufferchange)，或其組合等等。在另一實(shí)施方案中，所述異源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物。在一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞或PER,C6⑧細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、或BHK細(xì)胞、或HEK細(xì)胞、或Sp2/0細(xì)胞、或PER.C6⑧cell。提供了以下實(shí)施例和附圖以助于理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍如所述權(quán)利要求中所示。應(yīng)當(dāng)理解，可在給出的步驟中進(jìn)行修改，而不背離本發(fā)明的精神。在完成本發(fā)明時，抗-IL-IR抗體(例如參見WO2005/023872)和抗-P-選擇蛋白抗體(例如參見WO2005/100402)在我們的實(shí)驗(yàn)室中可足量獲得，因此本發(fā)明應(yīng)用這兩種免疫球蛋白進(jìn)行例示。通常，本發(fā)明同樣還可以用任何免疫球蛋白來實(shí)現(xiàn)。這一示范性描述僅僅是用于例示，而非限制本發(fā)明。附圖簡述圖l對于不同的恒定Ap模式和在90ml/分鐘的恒定CF下的濃縮方法，在沖洗膜之前通量對(versus)抗-IL-IR抗體溶液的蛋白濃度。1:恒定方法Ap=1.2巴，2:恒定方法Ap=1.8巴，3:恒定方法Ap=3.0巴，4:恒定方法CF90ml/分鐘。圖2用恒定方法濃縮抗-IL-IR抗體溶液之前和之后的顆粒數(shù)。1:濃縮之前，2:tw=216，3:tw=324，4:tw=541。圖3用不同方法濃縮之前和之后的抗-IL-IR抗體溶液顆粒數(shù)的比較。1:濃縮前，2:根據(jù)本發(fā)明的可變方法，3:恒定方法CF90ml/分鐘，4:tw=541。圖4通量對抗-IL-IR抗體溶液的蛋白濃度。1:恒定方法CF=90ml/分鐘，2:tw=541，3:根據(jù)本發(fā)明的可變方法。圖5對于50ml/分鐘(實(shí)心圓)、80ml/分鐘(實(shí)心三角形)和130ml/分鐘(實(shí)心正方形)的橫向流，跨膜通量對蛋白質(zhì)濃度5.3mg/ml的抗-IL-IR抗體溶液的跨膜壓力。圖6對于80ml/分鐘(實(shí)心圓)、130ml/分鐘(實(shí)心三角形)和150ml/分鐘(實(shí)心正方形)的橫向流，跨膜通量對蛋白質(zhì)濃度45mg/ml的抗_IL_IR抗體溶液的跨膜壓力。圖7對于50ml/分鐘(實(shí)心圓)、80ml/分鐘(實(shí)心三角形)和130ml/分鐘(實(shí)心正方形)的橫向流，跨膜通量對蛋白質(zhì)濃度90mg/ml的抗-IL-IR抗體溶液的跨膜壓力。圖8對于50ml/分鐘(實(shí)心圓)、80ml/分鐘(實(shí)心三角形)和130ml/分鐘(實(shí)心正方形)的橫向流，跨膜通量對蛋白質(zhì)濃度180mg/ml的抗-IL-IR抗體溶液的跨膜壓力。圖9通過不同方法獲得的在檸檬酸鹽緩沖液中的抗-IL-IR抗體溶液濃縮物的顆粒分析。1:濃縮前，2:根據(jù)本發(fā)明的可變方法，3:恒定方法CF90ml/分鐘，4:恒定方法Ap=1.8巴，5:恒定方法Ap=3.0巴。圖IO通過不同方法獲得的在檸檬酸鹽緩沖液中的抗-IL-IR抗體溶液的濃縮物的動態(tài)光散射分析。實(shí)心菱形濃縮前，實(shí)心正方形根據(jù)本發(fā)明的可變方法，實(shí)心三角形恒定方法CF90ml/分鐘，實(shí)心圓恒定方法Ap=1.8巴。圖11通過不同方法獲得的在檸檬酸鹽緩沖液中的抗-IL-IR抗體溶液的濃縮物的濁度測量。1:濃縮前，2:根據(jù)本發(fā)明的可變方法，3:恒定方法CF90ml/分鐘，4:恒定方法Ap=1.8巴，5:恒定方法Ap=3.0巴。圖12應(yīng)用不同的緩沖液，用根據(jù)本發(fā)明的方法和恒定方法獲得的抗-IL-IR抗體溶液的濃縮物的濁度測量。1:濃縮前在檸檬酸鹽緩沖液中，2:用檸檬酸鹽緩沖液的根據(jù)本發(fā)明的可變方法，3:用檸檬酸鹽緩沖液的恒定方法Ap=3.0巴，4:濃縮前在組氨酸緩沖液中，5:用組氨酸緩沖液的根據(jù)本發(fā)明的可變方法，6:用組氨酸緩沖液的恒定方法Ap=3.0巴。圖13通過不同的方法和在不同的緩沖液中獲得的濃縮物的動態(tài)光散射分析a)在檸檬酸鹽緩沖液中的抗-IL-IR抗體(實(shí)心菱形濃縮前，實(shí)心正方形用根據(jù)本發(fā)明的可變方法濃縮后，實(shí)心三角形恒定方法Ap=1.8巴)，b)在組氨酸緩沖液中的抗-IL-IR抗體(實(shí)心菱形濃縮前，實(shí)心正方形用根據(jù)本發(fā)明的可變方法濃縮后，實(shí)心三角形恒定方法Ap=3.0巴)。圖14在組氨酸緩沖液中的抗-P-選擇蛋白抗體濃縮物的濁度測量(a)和動態(tài)光散射(b)結(jié)果。1:濃縮前(實(shí)心菱形)，2:根據(jù)本發(fā)明的可變方法(實(shí)心正方形)，3:恒定11方法Ap=3.0巴(實(shí)心三角形)。圖15濃縮模式對濃縮的免疫球蛋白溶液濾過率的影響。實(shí)施例1分析方法a)濁度測量在抗體溶液吸收沒有內(nèi)在發(fā)色團(tuán)的350nm和550nm處測定吸光度(UV-VISapectrophotometerEvolution500，ThermoFisherScientific，Waltham，USA)。用未稀釋的樣品測量。使用適當(dāng)?shù)木彌_溶液作為參照介質(zhì)。每個測量實(shí)施3次。b)尺寸-排阻-HPLC在ASI-100HPLC系統(tǒng)(Dionex，Idstein，德國)上用TosohHaasTSK3000SWXL柱進(jìn)行色譜法。通過UV二極管陣列檢測器(Dionex)在280nm處檢測洗脫峰。在將濃縮樣本溶解至lmg/ml后，用由200mM磷酸二氫鉀和250mM氯化鉀組成的、pH7.0的緩沖液洗柱，直到達(dá)到穩(wěn)定的基線。應(yīng)用0.5ml/分鐘流速在等度條件下進(jìn)行分析，在室溫下歷時30分鐘。用Chromeleon(Dionex，Idstein，德國)手動積分色譜圖。通過將高分子量形式的曲線下面積(AUC)與單體峰的AUC比較來確定％聚集。c)光線遮蔽為監(jiān)測1-200ym范圍內(nèi)的顆粒負(fù)載，使用了SVSS-C顆粒分析儀(PAMASPartikelmess_undAnalysesysteme，Rutesheim，德國)。根據(jù)US藥典第24巻〈788>的要求，用近單一尺寸聚苯乙烯球校對系統(tǒng)。用0.5ml預(yù)沖洗體積進(jìn)行了0.5ml體積的3個測量。作為平均值計(jì)算結(jié)果并涉及1.0ml的樣本體積。所計(jì)算的顆粒數(shù)在探測器的濃度限度內(nèi)。d)動態(tài)光散射(DLS)DLS是用于測量顆粒大小(一般在亞微米級大小范圍)的非侵入技術(shù)。在本發(fā)明中，應(yīng)用具有溫控石英比色皿(25°C)的ZetasizerNanoS設(shè)備(MalvernInstruments,Worcestershire,UK)來監(jiān)測lnm和6iim之間的大小范圍。在173°角檢測反散射激光的強(qiáng)度。該強(qiáng)度以依賴于顆粒擴(kuò)散速度的速率波動，所述顆粒擴(kuò)散速度又由顆粒大小控制。因此，可從散射光強(qiáng)度波動的分析產(chǎn)生顆粒大小數(shù)據(jù)(Dahneke，B.E.(編車茸)，MeasurementofSuspendedParticlesbyQimsielectricLightScattering,WileyInc.(1983);Pecora，R.，DynamicLightScattering-ApplicationofPhotonCorrelationSpectroscopy，PlenumPress(1985))。應(yīng)用DTS軟件(Malvern)的倍數(shù)狹小模式(multiplenarrowmode)計(jì)算通過強(qiáng)度的大小分布。用未稀釋的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。e)傅立葉-變換紅外光譜通過應(yīng)用具有與恒溫器連接的流通傳輸池(AquaSpec)的Tensor27分光計(jì)(Bruker0ptik，Ettlingen，德國)記錄未稀釋蛋白質(zhì)溶液的FT-IR光譜。對于每一光譜，在單光束模式下以4cm—^勺分辨率收集120-掃描的干涉圖。應(yīng)用合適的滲透物作為參照介質(zhì)。將所收集的蛋白質(zhì)和緩沖液系統(tǒng)的干涉圖進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換。此外，針對相應(yīng)緩沖系統(tǒng)的光譜，校正蛋白質(zhì)的光譜。實(shí)施例2TMP和CF條件的確定通過應(yīng)用自動TFF系統(tǒng)AKTAcr0SSfl0W(GEHealthcare,AmershamBioscienceAB，Uppsala，瑞典)，其應(yīng)用具有Hydrosart可再生纖維素膜(其具有30kDa的標(biāo)稱分子量截?cái)嘀岛蚾.02m2的膜面積)的可調(diào)大小的平板盒(Sartorius，Gimingen，德國)，將經(jīng)調(diào)整和過濾的抗-IL-IR抗體的擰檬酸鹽緩沖水性溶液(pH5.5)濃縮20倍至高達(dá)ioomg/mi。進(jìn)行了由控制AKTAerossflowTM的unicorn軟件產(chǎn)生的不同濃縮程序?？偟哪ぽd量約為400g/m2。在待濃縮的免疫球蛋白溶液的不同免疫球蛋白濃度下，就不同的橫向流確定在四個預(yù)置膜壓力下的通量和壓力曲線。將TMP設(shè)置為o.3巴、0.5巴、0.9巴或2.0巴。對于每一TMP和蛋白質(zhì)濃度的橫向流為50ml/分鐘、80ml/分鐘、130ml/分鐘(不在45mg/ml蛋白質(zhì)濃度下)和150ml/分鐘(僅在45mg/ml蛋白質(zhì)濃度下)。不同的蛋白質(zhì)濃度是5.3mg/ml、45mg/ml、90mg/ml和180mg/ml。結(jié)果顯示于圖5至8。已發(fā)現(xiàn)，在濃縮處理過程中，高供給(feed)通量和高供給壓力導(dǎo)致好的跨膜通量。但是在濃縮過程中，尤其是在末尾，建立了極化層，其導(dǎo)致膜超壓并且還減少(滲透物)通量。還發(fā)現(xiàn)，升高的供給壓力導(dǎo)致較高的通量，并且因此導(dǎo)致快的濃縮過程，但是這一加速伴隨增加的聚集物形成(圖9至11)。考慮到以上內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)對于改良的免疫球蛋白濃縮方法的范圍和條件是-在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，1.4巴至1.6巴的跨膜壓力和75ml/分鐘至90ml/分鐘的橫向流，-在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml的濃度范圍中，o.8巴至0.9巴的跨膜壓力和140ml/分鐘至160ml/分鐘的橫向流，以及-在超過4511^/1111的濃度范圍中，0.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。這些參數(shù)產(chǎn)生具有減少的聚集物形成和短濃縮時間的方法。實(shí)施例3根據(jù)本發(fā)明的可變方法和恒定方法的比較將根據(jù)本發(fā)明的方法與不同的用于產(chǎn)生濃縮免疫球蛋白溶液的恒定參數(shù)方法進(jìn)行比較。目標(biāo)濃度設(shè)定為90mg/ml。用根據(jù)實(shí)施例2的裝置進(jìn)行切向流過濾。進(jìn)行比較的方法的不同參數(shù)(方法1至4是恒定方法，方法5是根據(jù)本發(fā)明的可變方法)如下方法1:跨膜壓力=0.6巴橫向流二90ml/分鐘Ap二0.7巴方法2:跨膜壓力=0.6巴Ap=1.2巴方法3:跨膜壓力=0.6巴Ap=1.8巴方法4:跨膜壓力=0.6巴Ap=3.0巴方法5:a)跨膜壓力=1.5巴，Ap=0.5巴；b)跨膜壓力=0.85巴，Ap=1.2巴；13c)跨膜壓力=0.85巴。使免疫球蛋白溶液的濃度達(dá)到90mg/ml免疫球蛋白濃度的不同參數(shù)和時間如表2所示。表2:不同濃縮方法的參數(shù)比較方法APTMP供給壓力出口(Ret)壓力供給流出口流顆粒>1fun/ml時間10.7巴0.6巴1.2巴0.5巴100ml/分鐘90ml/分鐘7321820149分鐘1,2巴0.6巴1.4巴0.2巴170ml/分鐘160ml/分鐘15403850126分鐘31.8巴0.6巴2.1巴0.3巴230ml/分鐘21SmI/分鐘16989540125分鐘43.0巴0.6巴2.8巴0.2巴300ml/分鐘280ml/分鐘19415180116分鐘0.5巴1.5巴2.0巴1.5巴100ml/分鐘80ml/分鐘12182240118分鐘1.2巴0.85巴1.7巴0.5巴165ml/分鐘150ml/分鐘0.850.5巴135ml/130ml/巴分鐘分鐘從不同方法的結(jié)果可以看到，與方法2-4相比，應(yīng)用方法5(即應(yīng)用可變方法)可顯著減少聚集物形成，并且因此得到具有改良性質(zhì)的免疫球蛋白濃縮物。與方法l相比，濃縮過程可以更快。實(shí)施例4在不同緩沖系統(tǒng)中的抗-IL-IR抗體的濃縮應(yīng)用實(shí)施例2的裝置和根據(jù)本發(fā)明的方法(實(shí)施例3的方法5)進(jìn)行用檸檬酸鹽緩沖劑或組氨酸緩沖劑緩沖的抗-IL-IR抗體水性溶液的比較濃縮。結(jié)果顯示于圖12和13中。分別從圖12和圖13中可看出，所應(yīng)用的緩沖劑對根據(jù)本發(fā)明的濃縮方法沒有影響。實(shí)施例5抗-P-選擇蛋白抗體的濃縮根據(jù)實(shí)施例2的方法進(jìn)行抗-P-選擇蛋白抗體的濃縮，結(jié)果顯示于圖14中。實(shí)施例6濃縮溶液的過濾在切向流過濾后，應(yīng)用0.75巴的壓力使根據(jù)實(shí)施例2的方法獲得的濃縮溶液通過Dur即ore(PVDF，MilliporeGmbH，Schwalbach，德國)膜(4.52cm2過濾器面積)過濾。發(fā)現(xiàn)高度濃縮的免疫球蛋白溶液的過濾性取決于所應(yīng)用的濃縮方法。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)與其它固定的方法比較時，用根據(jù)本發(fā)明的可變方法獲得的濃縮的免疫球蛋白溶液顯示出減小的過濾流下降(圖15)。權(quán)利要求通過切向流過濾濃縮免疫球蛋白溶液的方法，其特征在于跨膜壓力和橫向流是可變的i)在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，1.4巴至1.6巴的跨膜壓力和75ml/分鐘至90ml/分鐘的橫向流，ii)在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml的濃度范圍中，0.8巴至0.9巴的跨膜壓力和140ml/分鐘至160ml/分鐘的橫向流，以及iii)在超過45mg/ml的濃度范圍中，0.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟c)中的濃度范圍是45mg/ml至高達(dá)130mg/ml。3.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于跨膜壓力和橫向流是-步驟a)中1.5巴和80ml/分鐘，-步驟b)中0.85巴和150ml/分鐘，和/或-步驟c)中0.85巴和130ml/分鐘。4.用于生產(chǎn)異源免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟a)提供重組哺乳動物細(xì)胞，其包含一種或多種編碼異源免疫球蛋白的核酸；b)在適于表達(dá)該異源免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)所述的細(xì)胞；c)從所述重組哺乳動物細(xì)胞或培養(yǎng)基回收異源免疫球蛋白；d)應(yīng)用具有可變跨膜壓力和橫向流的切向流過濾濃縮所獲得的包含所述異源免疫球蛋白的水性、緩沖溶液。5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于步驟d)包括應(yīng)用具有以下可變跨膜壓力和橫向流的切向流過濾濃縮所獲得的水性、緩沖溶液i)在待濃縮溶液最高達(dá)每ml30mg免疫球蛋白的濃度范圍中，1.4巴至1.6巴的跨膜壓力和75ml/分鐘至90ml/分鐘的橫向流，ii)在15mg/ml至高達(dá)55mg/ml濃度范圍中，O.8巴至0.9巴的跨膜壓力和140ml/分鐘至160ml/分鐘的橫向流，以及iii)在超過45mg/ml的濃度范圍中，0.8巴至0.9巴的跨膜壓力和120ml/分鐘至140ml/分鐘的橫向流。6.權(quán)利要求4或5中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于在步驟d)之前或步驟d)之后包括以下步驟e)純化含有所述異源免疫球蛋白的水性、緩沖溶液。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述異源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段、或免疫球蛋白綴合物。8.權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞或卩1:1^(:6@細(xì)胞。9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于所述切向流過濾應(yīng)用具有20至50kDa分子量截?cái)嘀档哪ぁ?0.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于所述免疫球蛋白溶液具有pH3.0至pHlO.O的pH值。11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述pH值為pH3.0至pH7.0。12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于所述方法是可變切向流過濾方法，其中待濃縮溶液中的免疫球蛋白的實(shí)際濃度決定所施加的跨膜壓力和橫向流。13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于可以在重疊濃度范圍中的任意濃度值改變跨膜壓力和橫向流。14.權(quán)利要求l或5中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于所述濃度范圍是步驟a)中為5至25mg/ml，步驟b)中為25至50mg/ml，以及在步驟c)中為50至140mg/ml。全文摘要本發(fā)明公開了通過切向流過濾濃縮免疫球蛋白溶液的方法，其中跨膜壓力和橫向流是可變的。文檔編號C07K1/34GK101754977SQ200880025063公開日2010年6月23日申請日期2008年7月15日優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日發(fā)明者E·羅森伯格,G·溫特,S·黑普比爾迪克勒,W·庫恩申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司;慕尼黑路德維希馬克西米利安斯大學(xué)