專利名稱：嵌合水痘帶狀皰疹病毒病毒樣顆粒的制作方法
嵌合水痘帶狀皰疹病毒病毒樣顆粒相關(guān)申請本申請要求2007年9月9日提交的美國申請60/970，592,2008年5月20日提交的美國申請61/071，835、和2007年7月19日提交的美國申請60/950，707的優(yōu)先權(quán)，本文 出于所有目的通過提及而收錄所有申請。對電子形式提交的文本文件的描述本文通過提及而完整收錄與本文一起以電子形式提交的文本文件的內(nèi)容計算機可閱讀形式拷貝的序列列表(文件名N0VV 035 02W0SeqList_ST25. txt，2008年7月21日 記錄的數(shù)據(jù)，文件大小37千字節(jié))。
背景技術(shù)：
水痘帶狀皰疹病毒(VZV)(也稱為人皰疹病毒3(HHV_3))是病毒皰疹病毒科(Herpesviridae)白勺 α(alphaherpesvirus subfamily)白勺。VZV i—禾中 有包膜病毒，具有約125，000個核苷酸的線性雙鏈DNA基因組。它的基因組被二十面體核 殼體裝入。位于核殼體和病毒包膜間間隔的間層是由病毒編碼的蛋白質(zhì)和酶構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。 病毒包膜是從宿主細(xì)胞膜獲得的，并且含有病毒編碼的糖蛋白。人皰疹病毒中最小的VZV基因組編碼至少70個可讀框，其中8個編碼推定的 糖蛋白(gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM)，它們在病毒復(fù)制周期的不同步驟中發(fā)揮功能。 糖蛋白E(gE，也稱為ORF 68)對于病毒復(fù)制是必要的(Mallory等(1997) J. Virol. 71 8279-8288 ；Mo等(2002) Virology 304 176-186)，并且是受感染細(xì)胞以及成熟病毒體中存 在的最豐富的糖蛋白(Grose, 2002, The predominant varicella-zoster virus gE and gl glycoproteincomplex,In Structure-function relationships of human pathogenic viruses, Holzenburg 禾口 Bogner (編)，Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY)。糖蛋白I (gl，也稱為ORF 67)在受感染的細(xì)胞中與gE形成復(fù)合物，這便于兩種糖蛋 白質(zhì)的胞吞，并將它們引導(dǎo)至反式高爾基體(trans-Golgi)，在那里獲得最終的病毒包膜 (Olson 和 Grose (1998) J.Virol. 72 1542-1551)。糖蛋白 B(gB，也稱為 ORF 31)(認(rèn)為其在 病毒進入中發(fā)揮作用)結(jié)合中和性抗體，并且是第二普遍的糖蛋白(綜述于Arvin(1996) Clin. Microbiol. Rev. 9 361-381) 0認(rèn)為糖蛋白H(gH)具有便于病毒的細(xì)胞間傳播的 融合功能。針對gE、gB、和gH的抗體在天然感染后和疫苗接種后是普遍的，并且已經(jīng)顯 示了在體外中和病毒感染性(Keller 等(1984) J. Virol. 52 293-297 ；Arvin 等(1986) J. Immunol. 137 1346-1351 ；Vafai 等(1988)J.Virol. 62 :2544_2551 ；Forghani 等(1990) J.Clin. Microbiol. 28 :2500_2506)。用VZV的初次感染引起禽痘(水痘)，其特征在于主要在面部和軀干上發(fā)生的極端 傳染性的皮疹。初始感染后，病毒DNA可以整合入宿主神經(jīng)元細(xì)胞的基因組中，并保持潛伏 達(dá)數(shù)年。病毒可以再活化，并在成人中引起疾病帶狀皰疹(shingles，herpes zoster) 0帶 狀皰疹產(chǎn)生的皮疹不同于初次感染過程中產(chǎn)生的。皮疹與嚴(yán)重的疼痛有關(guān)，并且可以導(dǎo)致 更嚴(yán)重的疾患，諸如皰疹后神經(jīng)痛(post-herpetic neuralgia)。水痘疫苗(Varivax)是公眾可獲得的，并且已經(jīng)在數(shù)個國家(包括美國)被添加至推薦的兒童疫苗接種日程表。更濃的水痘疫苗(Zostavax)配制劑已得到食品藥品管理 局(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)用于在人群的老年成員中預(yù)防帶狀皰疹。雖然 已經(jīng)證明了水痘疫苗是安全的，但是有一些如下的證據(jù)，即由疫苗賦予的對VAV感染的免 疫隨時間而減弱(Chaves等(2007) N. Engl. J. Med. 356 :1121_1129)。因此，經(jīng)過疫苗接種的 個體仍會對帶狀皰疹，即由VZV引起的更為嚴(yán)重的疾患易感。另外，疫苗是由活的減毒病毒 制成的，這產(chǎn)生從疫苗接種形成禽痘或帶狀皰疹的個體的可能性。實際上，已經(jīng)有數(shù)例報告 的似乎由疫苗中使用的毒株所引起的帶狀皰疹病例(Matsubara等(1995). Acta Paediatr Jpn 37 648-50 ；Hammerschlag 等(1989). J Infect Dis. 160 :535_7)。疫苗中存在的活的 減毒病毒還限制了疫苗在無免疫應(yīng)答的個體中的應(yīng)用。
病毒樣顆粒(virus like particle ；VLP)在結(jié)構(gòu)上類似于成熟的病毒體，但是缺 乏病毒基因組而使其不可能發(fā)生病毒復(fù)制。VLP含有類似完整病毒的抗原性蛋白質(zhì)，諸如殼 體和病毒包膜蛋白，并且也可以進行構(gòu)建以在其表面上表達(dá)外來結(jié)構(gòu)蛋白。因此，VLP可以 作為免疫原性組合物(例如疫苗)安全施用。此外，因為VLP類似天然病毒，而且是多價顆 粒結(jié)構(gòu)，所以VLP可以比可溶性抗原更有效地誘導(dǎo)中和性抗體。先前已經(jīng)從不同皰疹病毒科成員生成了表達(dá)糖蛋白或間層蛋白的VLP。由有包膜 的間層蛋白構(gòu)成的輕顆粒(L顆粒)已經(jīng)獲自用單純皰疹病毒1型(HSV-I)、馬皰疹病毒 1 型(EHV-I)、或假狂犬病病毒感染的細(xì)胞(McLauchlan 和 Rixon (1992) J. Gen. Virol. 73 269-276 ；美國專利號5，384，122)?？梢酝ㄟ^在存在病毒DNA復(fù)制抑制劑的情況中用HSV-I 感染細(xì)胞來生成不同類型的VLP，其稱作病毒DNA復(fù)制前包膜顆粒(PREP)。PREP在結(jié)構(gòu)上 類似L顆粒，但是含有不同的蛋白質(zhì)組成(Dargan等(1995) J. Virol. 69 =4924-4932 ；美國 專利號5，994，116)。已經(jīng)通過使用由酵母Ty反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的蛋白pi進行的技術(shù)來 生成表達(dá)來自VZV的gE蛋白的片段的雜合VLP (Garcia-Valcarcel等(1997) Vaccine 15 709-719 ；Welsh 等(1999) J. Med. Virol. 59 :78_83 ；美國專利號 6，060，064)。本發(fā)明描述了 新的嵌合VLP，其包含至少一種VZV蛋白，但是不包含酵母Ty蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明包含一種純化的嵌合VLP，其包含病毒核心蛋白和至少一種水痘帶狀皰疹 病毒(VZV)蛋白，其中所述VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核酸。在一個實施方 案中，所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和異源蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域。在另一個實施方案中，所述異源蛋白與所述病毒核心蛋白結(jié)合。在另一個實施方案 中，所述VZV蛋白選自下組gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另一個實施方案中，所述 VZV蛋白是gE和/或gl。在另一個實施方案中，所述異源蛋白的所述跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu) 域來自流感病毒。在另一個實施方案中，所述流感病毒蛋白是血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸 酶(NA)。在另一個實施方案中，所述HA和/或NA來自甲型流感病毒/印尼/5/05。在另 一個實施方案中，所述病毒核心來自正粘病毒(orthomyxovirus)。在另一個實施方案中，所 述病毒核心來自副粘病毒(paramyxovirus)。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP包含SEQ ID NO. 1 和 / 或 SEQ ID N0. 9。本發(fā)明還包含一種生成嵌合VLP的方法，包括將編碼至少一種VZV蛋白和病毒核 心蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中，并在容許VLP形成的條件下表達(dá)所述嵌合VZV和 病毒核心蛋白，其中所述宿主細(xì)胞不包含酵母Ty蛋白。在一個實施方案中，所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和異源蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，所述VZV蛋白是gE和/或gl。在另一個實施方案中，所述異源蛋白與所述病毒 核心蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中，所述異源蛋白的所述跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域來自流 感病毒。在另一個實施方案中，所述核心是來自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感病毒Ml。本發(fā)明還包含一種抗原性配制劑，其包含VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一種VZV蛋白和病毒核心蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。在一個實施方案中，至少一種VZV蛋白 是嵌合的，并且選自下組gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另一個實施方案中，所述VZV 蛋白是gE和/或gl。在另一個實施方案中，所述VZV蛋白是gE和/或gl。在另一個實施 方案中，所述核心蛋白是來自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感病毒Ml。本發(fā)明還包含一種疫苗，其包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一種VZV蛋白和病毒核心蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。在一個實施方案中，至少一種VZV蛋白是嵌 合的，并且選自下組gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另一個實施方案中，所述VZV蛋白 是gE和/或gl。在另一個實施方案中，所述VZV蛋白是gE和/或gl。在另一個實施方案 中，所述核心蛋白是來自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感病毒Ml (SEQ ID NO. 9)。本發(fā)明還包含一種在人或動物中引發(fā)針對感染的保護性免疫的方法，包括給所述人或動物施用包含嵌合VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述嵌合VZV-VLP包含至少 一種VZV蛋白和病毒核心蛋白，其中所述嵌合VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核 酸。附圖簡述

圖1描繪了(A)AcMNPV桿狀病毒多角體蛋白啟動子(PolH)下游的嵌合VZV gE基 因與甲型禽流感/印尼/5/05 (H5W)的流感跨膜和C末端胞外域和(B)用考馬斯藍(lán)染色的 SDS-PAGE (左側(cè)小圖)和用抗E單克隆抗體進行的Western印跡(右側(cè)小圖)。圖2描繪了對純化的嵌合VZV gE VLP的EM分析。用PTA對VZV gE (HATM/CT) / Indo Ml嵌合VLP進行的電子顯微鏡(EM)負(fù)染色(高放大率)。黑色條帶表示lOOnm。圖3描繪了對純化的嵌合VZV gE VLP的免疫金EM分析。VZV gE (HATM/CT)/Indo Ml嵌合VLP的免疫金EM圖像。㈧是對照，而⑶描繪了位于嵌合VLP上的6nm金顆粒。 黑色條帶表示lOOnm。發(fā)明詳述如本文中所使用的，術(shù)語“病毒樣顆?！?VLP)指在至少一種屬性上類似病毒但是 已經(jīng)證明其沒有感染性的結(jié)構(gòu)。依照本發(fā)明的病毒樣顆粒不攜帶編碼所述病毒樣顆粒的蛋 白質(zhì)的遺傳信息，并且不包含Ty酵母蛋白或其部分。一般而言，病毒樣顆粒缺乏病毒基因 組，并且不能復(fù)制。另外，病毒樣顆粒通?？梢酝ㄟ^異源表達(dá)來大量生產(chǎn)，而且可以容易地 純化。該術(shù)語還指通過下文所描述的方法生成的任何亞病毒顆粒。此術(shù)語包括可以通過下 文所描述的或本領(lǐng)域中已知的任何方法純化的蛋白質(zhì)聚集物。如本文中所使用的，術(shù)語“嵌合的”或“嵌合蛋白，，指包含不是由VZV生成的模塊 的部分的蛋白質(zhì)。該術(shù)語排除酵母Ty-pl-VZV融合蛋白。一般而言，該術(shù)語指與異源蛋白 的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的VZV胞外域。如本文中所使用的，術(shù)語“核心”蛋白指驅(qū)動出芽和顆粒從宿主細(xì)胞的釋放的蛋白 質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語“核心”和“基質(zhì)”蛋白可互換使用。驅(qū)動出芽和顆粒從宿主細(xì)胞的釋放的核心蛋白的例子包含流感Ml和新城疫蛋白M。如本文中所使用的，術(shù)語“抗原性配制劑”或“抗原性組合物”指在給脊椎動物(例 如哺乳動物)施用時會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的制備物。如本文中所使用的，術(shù)語“純化的VLP ”指本發(fā)明的VLP制備物，其至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大地不含混合物 中其它分子(不包括溶劑在內(nèi))。例如，本發(fā)明的VLP可以基本上沒有與制備本發(fā)明的VLP 有關(guān)的其它病毒、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、和碳水化合物。該術(shù)語還涵蓋已經(jīng)從具有污染的VZV基因 組DNA或其部分的VLP分離的VLP。如本文中所使用的，術(shù)語“嵌合VLP”指含有來自至少兩種不同病毒的蛋白質(zhì)(異 源蛋白)或其部分的VLP。出于本發(fā)明的目的，所述蛋白質(zhì)之一衍生自可以驅(qū)動VLP自宿主 細(xì)胞形成的病毒(例如流感Ml)，而另一種蛋白質(zhì)是嵌合VZV蛋白。如本文中所使用的，術(shù)語“疫苗”指含有本發(fā)明VLP的配制劑，其處于能夠向脊椎 動物施用的形式，而且其誘導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答足以誘導(dǎo)免疫以預(yù)防和/或改善感染和/ 或減輕至少一種感染癥狀和/或增強另一劑VLP的功效。如本文中所使用的，術(shù)語“有效量”指實現(xiàn)想要的生物學(xué)效應(yīng)所必需的或足以實現(xiàn) 想要的生物學(xué)效應(yīng)的VLP的量。組合物的有效量將是達(dá)到選定結(jié)果的量，并且該量可以由 本領(lǐng)域技術(shù)人員作為常規(guī)事項確定。例如，用于預(yù)防、治療和/或改善感染的有效量可以是 引起免疫系統(tǒng)活化所必需的量，其導(dǎo)致在暴露于本發(fā)明VLP時形成抗原特異性免疫應(yīng)答。 該術(shù)語也是“足夠量”的同義詞。如本文中所使用的，術(shù)語“保護性免疫”或“保護性免疫應(yīng)答”指由脊椎動物(例 如人)展現(xiàn)出的針對感染原的免疫或引發(fā)針對感染原的免疫應(yīng)答，其阻止或改善感染或減 少至少一種其癥狀。如本文中所使用的，術(shù)語“脊椎動物”或“受試者”或“患者”指脊椎動物亞門 (subphylum cordata)的任何成員，包括但不限于人和其它靈長類，包括非人靈長類，諸如 黑獲獲(cgunoabzee)禾口其它猿類(apes)禾口猴物禾中(monkey species)。家畜(farm animal) (諸如牛、綿羊、豬、山羊和馬)；家養(yǎng)哺乳動物(domestic mammal)(諸如狗和貓)；實驗動 物(包括嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠)；鳥類(包括家禽、野鳥和獵禽， 諸如雞、火雞及其它鶉雞類鳥類、鴨、鵝)等也是非限制性例子。該定義中包括術(shù)語“哺乳動 物”和“動物”。意圖涵蓋成體和新生個體兩者。一般而言，病毒樣顆粒(VLP)缺乏病毒基因組，因此是非感染性的。另外，病毒樣 顆粒通常可以通過異源表達(dá)來生產(chǎn)，而且可以容易地純化。大多數(shù)VLP至少包含病毒核心 蛋白。此核心蛋白通常驅(qū)動出芽和顆粒從宿主細(xì)胞的釋放。然而，對于有效的疫苗或抗原 性產(chǎn)品，抗原應(yīng)當(dāng)在VLP上表達(dá)以正確呈遞從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明包含包含VZV蛋白 的嵌合VLP。在一個實施方案中，所述VZV蛋白是嵌合的。本發(fā)明的嵌合VLP可用于制備用 于治療、預(yù)防和/或改善VZV感染疫苗和抗原性組合物。所述嵌合VLP的一項重要特征在于在所述VLP的表面上表達(dá)蛋白質(zhì)的能力，使得脊椎動物的免疫系統(tǒng)可以誘導(dǎo)針對所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。然而，不是所有的蛋白質(zhì)都可 以在VLP的表面上表達(dá)。某些蛋白質(zhì)不在VLP的表面上表達(dá)或者在VLP的表面上表達(dá)不佳 可能有許多原因。一個原因在于所述蛋白質(zhì)不被引導(dǎo)至宿主細(xì)胞膜，或者所述蛋白質(zhì)不具有跨膜域。如此，一種提高VZV蛋白在VLP的表面上表達(dá)、和/或提高所述蛋白質(zhì)摻入VLP 中的方法是融合異源蛋白的胞質(zhì)域和/或跨膜域與VZV蛋白以創(chuàng)建VZV嵌合蛋白。在本 發(fā)明的一個實施方案中，所述異源胞質(zhì)域和/或跨膜域可以與所述核心蛋白結(jié)合。不限于 具體的理論，所述異源蛋白的胞質(zhì)域和/或跨膜域與核心的結(jié)合可能有助于驅(qū)動所述嵌合 VZV蛋白進入VLP中。如此，本發(fā)明的另一個實施方案包含嵌合VLP，其包含會驅(qū)動VLP生 成并有助于驅(qū)動嵌合VZV蛋白摻入VLP中的核心蛋白。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP 不包含酵母Ty蛋白。在一些實施方案中，本發(fā)明包含包含至少一種嵌合VZV蛋白的嵌合VLP，其中所述 嵌合VZV蛋白包含異源蛋白的跨膜域和/或胞質(zhì)域。在一個實施方案中，所述VLP包含驅(qū) 動VLP形成的核心蛋白。在另一個實施方案中，所述異源蛋白的跨膜域和/或胞質(zhì)域與所 述核心蛋白結(jié)合以驅(qū)動所述嵌合VZV蛋白進入VLP中。在另一個實施方案中，所述嵌合VZV 蛋白包含VZV蛋白的部分，所述VZV蛋白選自下組gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。在另 一個實施方案中，所述VZV蛋白是gE。在另一個實施方案中，所述VZV蛋白是gl。在另一 個實施方案中，嵌合VZV gE和嵌合VZV gl在同一 VLP中?？梢耘c本發(fā)明一起使用的核心蛋白是在細(xì)胞中表達(dá)時驅(qū)動VLP形成的病毒蛋白。 具體地，病毒核心蛋白可以包括但不限于病毒Gag蛋白，具體的是逆轉(zhuǎn)錄病毒gag蛋白(例 如人免疫缺陷病毒(HIV)Gag病毒蛋白(GenBank序列號AAA44987和p55gag GenBank序列 號AAF43628)、猿免疫缺陷病毒(SIV) Gag病毒蛋白(GenBank序列號AAA91922))、鼠白血病 病毒(MuLV)Gag病毒蛋白(GenBank序列號NP040332))、桿狀病毒基質(zhì)蛋白M蛋白(例如水 泡性口炎病毒(vesicular stomatis virus，VSV)M蛋白(GenBank序列號CAM83684))、線狀 病毒病毒核心蛋白(例如埃博拉VP40病毒蛋白(GenBank登錄號AAN37506))、立夫特山谷 熱病毒(Rift Valley Fever virus)N蛋白(GenBank登錄號ABK91994)、冠狀病毒M、E和NP 蛋白(NP蛋白的GenBank登錄號為AAP49024、M蛋白為AAR86790、E蛋白為AAP82979 (SARS 冠狀病毒ShanghaiQXCl))、布尼亞病毒N蛋白(GenBank登錄號AAA47114)、流感Ml蛋白、 副粘病毒M蛋白(例如新城疫蛋白M(AAK55549)和呼吸道合胞病毒(RSV)M(NP_056860))、 沙粒病毒Z蛋白(例如拉沙熱病毒Z蛋白)、新城疫蛋白M(AAK55549)、副流感病毒M(例如 人副流感病毒1MAAB22344))和其組合。在一個實施方案中，所述核心或基質(zhì)蛋白來自正粘 病毒。在另一個實施方案中，所述正粘病毒核心不包括流感病毒Ml。在另一個實施方案中， 所述核心或基質(zhì)蛋白來自副粘病毒。在另一個實施方案中，所述副粘病毒核心不包括新城 疫病毒M、RSV M、或人副流感病毒M。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述異源蛋白可以與所述核心蛋白相互作用以有 助于驅(qū)動VZV嵌合蛋白進入VLP中。例如，若本發(fā)明的所述嵌合VLP包含流感M1，則與VZV 蛋白融合的所述異源跨膜域和/或胞質(zhì)域可以來自流感病毒HA和/或NA。已經(jīng)顯示了這 些蛋白質(zhì)有助于驅(qū)動異源蛋白進入VLP中(參見共同懸而未決的申請W02008/005777，本文 通過提及而完整收錄)。所述核心和異源蛋白不需要來自相同病毒。例如，已經(jīng)顯示了，可 以使用來自非HIV病毒的數(shù)種跨膜域和/或胞質(zhì)域來與來自HIV的p55gag核心一起進行 表達(dá)(參見Wang等，J. Virol.，81，10869-10878，本文通過提及而完整收錄)。在某些實施方案中，所述異源蛋白的跨膜域和/或胞質(zhì)域會來自相同的病毒。在 一個實施方案中，所述嵌合VLP包含流感病毒Ml和具有來自流感HA和/或NA的跨膜域和/或胞質(zhì)域的嵌合VZV蛋白。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP包含來自A/印尼/5/05的流感病毒Ml和具有來自流感病毒HA和/或NA的跨膜域和/或胞質(zhì)域的嵌合VZV蛋白。 在另一個實施方案中，所述來自流感HA和/或NA的跨膜域和/或胞質(zhì)域來自下組:A/鵪鶉 / 香港 /G1/97、A/ 香港 /1073/99,A/ 香港 /2108/03、鴨 /HK/Y280/97、CK/HK/G9/97、Gf/HK/ SSP607/03、Ph/HK/CSW1323/03、WDk/ST/4808/01、CK/HK/NT142/03、CK/HK/WF126/03、SCk/ HK/WF285/03、CK/HK/YU463/03、CK/HK/YU577/03、SCk/HK/YU663/03、Ck/HK/CSW161/03、和 GF/HK/NT101/03。在另一個實施方案中，流感病毒HA和/或NA的跨膜域和/或胞質(zhì)域來 自A/印尼/5/05。在另一個實施方案中，所述嵌合VZV蛋白包含gE的胞外域及流感HA和 /或NA的跨膜域和/或胞質(zhì)域。在另一個實施方案中，用所述流感HA和/或NA替換所述 gE的跨膜域。在一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO. 1。在另一個實施方案中， 所述嵌合VZV蛋白包含gl的胞外域及流感病毒HA和/或NA的跨膜域和/或胞質(zhì)域。在另 一個實施方案中，所述嵌合蛋白包含SEQ ID NO. 3。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP包 含流感病毒Ml、嵌合gE和嵌合gl。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP包含流感病毒Ml、 天然的gE和嵌合gl。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP包含流感病毒Ml、嵌合gE和天 然的gl。在另一個實施方案中，已經(jīng)對所述天然的gE和gl進行過工程化改造以除去它們 的天然跨膜域(分別為SEQ ID 10和12)。因為gE和gl產(chǎn)生異二聚體(heterodimer)，所 以為了摻入VLP中僅所述二聚體的一個成員會需要具有異源跨膜域和/或胞質(zhì)域。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述嵌合VLP包含新城疫病毒(NDV)蛋白M和具有 來自新城疫病毒蛋白的跨膜域和/或胞質(zhì)域的嵌合VZV蛋白。在一個實施方案中，所述來 自NDV蛋白的跨膜域和/或胞質(zhì)域來自融合物(F)和/或血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白 (NDV F的Genbank登錄號為CAA00288和NDV HN的為CAA00292)。在另一個實施方案中， 所述嵌合VLP包含NDV M和嵌合gE。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP進一步包含嵌合 gL·在本發(fā)明的一個實施方案中，所述嵌合VLP包含RSV蛋白M和具有來自RSV蛋白 的跨膜域和/或胞質(zhì)域的嵌合VZV蛋白。在一個實施方案中，所述來自RSV蛋白的跨膜域 和/或胞質(zhì)域來自融合物(F)和/或G蛋白(RSV F的Genbank登錄號為AAR14266和RSV G的為AAR14265)。在另一個實施方案中，所述嵌合VLP包含RSV M和嵌合gE。在另一個實 施方案中，所述嵌合VLP進一步包含嵌合gl。在某些實施方案中，所述異源蛋白(例如流感HA和/或NA)的跨膜域和/或胞質(zhì) 域包含蛋白質(zhì)區(qū)段之間的間隔物序列。所述間隔序列可以是對于VZV或所述異源蛋白而言 非天然的任何氨基酸。此間隔物序列對于在VLP的表面上表達(dá)所述VZV嵌合蛋白可能是重 要的。間隔物序列的例子包括多G氨基酸。所述間隔物的長度可以從1個至約100個氨基酸。本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明VLP之上或之中所表達(dá)的所述VZV蛋白的變體(包括所述嵌 合物)。所述變體可以含有在組分蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的變化。術(shù)語“變體”就多肽而言 指相對于參照序列改變了一個或多個氨基酸的氨基酸序列。變體可以具有“保守的”變化， 其中用于替代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如用異亮氨酸替換亮氨酸?；蛘撸?體可以具有“非保守的”變化，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的次要變化還可以包括氨基 酸缺失和/或插入。使用本領(lǐng)域公知的計算機程序，例如DNASTAR軟件，可以找到確定哪些氨基酸殘基可供取代、插入或缺失而不消除生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。描述可應(yīng)用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)(諸如克隆、突變、細(xì)胞培養(yǎng)等)的通 用教禾斗書包括 Berger 禾口 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods 于 Enzymology 卷 152Academic Press，Inc.，San Diego, Calif. (Berger) ；Sambrook 等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第 3 片反)，卷 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N. Y.，2000( ‘‘Sambrook，，)禾口 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，Current Protocols，ajoint venture between Greene Publishing Associates，Inc. and John Wiley & Sons，Inc.，( ‘‘Ausubel，，)。這 些教科書描述了誘變、載體的應(yīng)用、啟動子和許多其它相關(guān)的主題，所述主題涉及例如VZV 的gE、gl、gM、gH、gB或間層蛋白的克隆和突變等。如此，本發(fā)明還涵蓋使用已知的蛋白 質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法來改進或改變在本發(fā)明嵌合VLP之上或之中表達(dá)的蛋白質(zhì) 的特性?？梢允褂枚喾N類型的誘變來產(chǎn)生和/或分離編碼蛋白質(zhì)分子的變體核酸和/或 進一步修飾/突變本發(fā)明嵌合VLP之中或之上的蛋白質(zhì)。它們包括但不限于定點誘變、 隨機點誘變、同源重組(DNA改組)、使用含尿嘧啶模板進行的誘變、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變 (oligonucleotide-directed mutagenesis)、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙鏈體 DNA的誘變等。其它合適的方法包括點錯配修復(fù)(point mismatch r印air)、使用修復(fù)缺陷 的宿主株的誘變，限制選擇和限制純化、缺失誘變、通過全基因合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)寸?？寺”景l(fā)明VZV蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以從感染了 VZV病毒的細(xì) 胞提取多聚腺苷酸化mRNA，通過RT-PCR從中分離出編碼特定VZV蛋白的基因。所得的產(chǎn)物 基因可以作為DNA插入物克隆入載體中。術(shù)語“載體”指可用于擴增(propagate)核酸和 /或在生物體、細(xì)胞、或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移核酸的手段。載體包括自主復(fù)制或可整合入宿主 細(xì)胞的染色體中的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等。載體還可以 是非自主復(fù)制性的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一條鏈內(nèi)由DNA和RNA兩者組成 的多核苷酸、聚賴氨酸綴合的DNA或RNA、肽綴合的DNA或RNA、脂質(zhì)體綴合的DNA等。在許 多但不是所有的常見實施方案中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。如此，本發(fā)明包括克隆入表達(dá)載體的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸(例如核心蛋白和至少 一種VZV蛋白或嵌合VZV蛋白)，所述載體可在細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)本發(fā)明嵌合VLP的形成。 “表達(dá)載體”是能夠促進摻入其中的核酸的表達(dá)以及復(fù)制的載體，諸如質(zhì)粒。通常，要表達(dá)的 核酸與啟動子和/或增強子“可操作連接”，并受該啟動子和/或增強子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制。 在一個實施方案中，所述核苷酸編碼VZV gE(0RF 68)蛋白或嵌合VZV gE蛋白。在另一個 實施方案中，所述載體包含如下的核苷酸，其編碼VZV gE和至少一種另外的VZV蛋白(例 如gl或嵌合gl)。在另一個實施方案中，所述載體包含如下的核苷酸，其編碼VZV gE蛋白 和gI(0RF 67)、gM(0RF 50)、gH、gB和/或間層VZV蛋白(或所述蛋白質(zhì)的嵌合型式)。在 另一個實施方案中，所述載體還包含能夠驅(qū)動VLP形成的核心蛋白。在另一個實施方案中， 所述表達(dá)載體是桿狀病毒載體。在本發(fā)明的一些實施方案中，蛋白質(zhì)可以包含含有如下變化的突變，所述變化產(chǎn) 生沉默的取代、添加或缺失，但是不改變所編碼蛋白質(zhì)的特性或活性或者生成所述蛋白質(zhì) 的方式。可以出于多種原因而產(chǎn)生核苷酸變體，例如為了針對特定宿主優(yōu)化密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變?yōu)槔ハx細(xì)胞諸如Sf9細(xì)胞優(yōu)選的那些密碼子)。另外，可對核苷酸測序以確保正確的編碼區(qū)得到克隆，且不含有任何不想要的突變?？梢詫⑺龊塑账醽喛寺∪氡磉_(dá)載體(例如桿狀病毒)中用于在任意細(xì)胞中表達(dá)。上 文僅僅是如何能夠克隆VZV病毒蛋白的一個例子。本發(fā)明技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，其它方 法也是可用和可能的。本發(fā)明還提供了如下的構(gòu)建體和/或載體，其包含編碼VZV蛋白(包括gE、gI、gM、 gH、gB、間層蛋白、其嵌合蛋白或部分)的VZV核苷酸。所述載體可以是例如噬菌體、質(zhì)粒、 病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。包含VZV基因(包括gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白、它們的嵌合 物、或其部分)的構(gòu)建體和/或載體應(yīng)當(dāng)與合適的啟動子可操作連接，諸如AcMNPV多角體 蛋白啟動子(或其它桿狀病毒)、λ噬菌體PL啟動子、大腸桿菌laC、phoA和tac啟動子、 SV40早期和晚期啟動子、和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子是非限制性例子。根據(jù)想要的宿主細(xì) 胞和/或表達(dá)率，本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道其它合適的啟動子。表達(dá)構(gòu)建體將進一步含有轉(zhuǎn) 錄起始位點、終止位點、以及被轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。所述構(gòu)建體所表達(dá)的 轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選在要翻譯的多肽的起始處包含翻譯起始密碼子，而在該多肽末尾處 的合適位置上含有終止密碼子。表達(dá)載體將優(yōu)選包含至少一種選擇標(biāo)志物。此類標(biāo)志物包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的 二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌和其它細(xì)菌的四環(huán)素、卡那霉 素或氨芐青霉素抗性基因。優(yōu)選的載體包括病毒載體，諸如桿狀病毒、痘病毒(例如牛痘病 毒、禽痘病毒(avipox virus)、金絲雀痘病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)、浣熊痘病毒、豬 痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。可與本發(fā)明一起使用的其它 載體包括用于細(xì)菌的載體，包括pQE70、pQE60和pQE_9，pBluescript載體、Phagescript載 體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的 真核載體是 pFastBacl pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、禾口 pSVL。 其它合適的載體會是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。接下來，上文所提及的重組構(gòu)建體可以用來轉(zhuǎn)染、感染、或轉(zhuǎn)化，并且可以在真核 細(xì)胞和/或原核細(xì)胞中表達(dá)嵌合VZV蛋白，其包含gE、gl、gM、gH、gB、和間層蛋白或其部分 和至少一種核心蛋白。如此，本發(fā)明提供了包含載體(或多個載體)的宿主細(xì)胞，所述載體 含有的核酸編碼嵌合VZV蛋白，所述嵌合VZV蛋白包含gE、gl、gM、gH、gB、和間層蛋白或其 部分和至少一種核心蛋白，并且在容許形成VLP的條件下表達(dá)嵌合VZV基因。真核宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲、兩棲類、禽類、植物、秀麗隱桿線蟲(C. elegans) (或線蟲)和哺乳動物宿主細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞的非限制性例子有草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (SF)細(xì)胞、例如 Sf9, Sf21,粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細(xì)胞，例如 High Five細(xì)胞，和果蠅(DrOSOphila)S2細(xì)胞。真菌(包括酵母)宿主細(xì)胞的例子有釀酒 酵母(S. cerevisiae)、乳克魯維酵母(Kluyveromyceslactis ；K. Iactis)、假絲酵母屬 (Candida)菌種包括白色假絲酵母(C. albicans)和光滑假絲酵母(C. glabrata)、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe ；S. pombe)、巴其Jf德 畢赤酵母(Pichia pastoris)、和解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)。哺乳動物細(xì)胞的 例子有COS細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚 腎(HEK)細(xì)胞和非洲綠猴細(xì)胞、CVl細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、Vero和H印-2細(xì)胞。非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細(xì)胞，或兩棲類來源的其它細(xì)胞也可以使用。原核宿主細(xì)胞包 括細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和分枝桿菌。可以依照本領(lǐng)域公知的方法將載體，例如包含VZV基因(或嵌合VZV基因)的多 核苷酸的載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所述VZV基因(或嵌合VZV基因)包含編碼gE、gl、gM、 gH、gB、和間層蛋白或其部分和至少一種核心蛋白的基因。例如，可以通過磷酸鈣共沉淀、電 穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染、和采用多胺轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染來將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞中。在一個實 施方案中，所述載體是重組桿狀病毒。在另一個實施方案中，所述重組桿狀病毒被轉(zhuǎn)染入真 核細(xì)胞中。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。在另一個實施方案中，所述昆 蟲細(xì)胞是Sf9細(xì)胞。在另一個實施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞包含如下的核苷酸，所述核苷酸 編碼嵌合VZV蛋白gE、或其部分。在另一個實施方案中，所述載體和/或宿主細(xì)胞基本上由 編碼嵌合VZV蛋白gE、或其部分的核苷酸組成。在又一個實施方案中，所述載體和/或宿 主細(xì)胞包含如下的核苷酸，其編碼嵌合VZV蛋白gI、gM、gH、gB、和/或間層蛋白，或其部分。 在一些實施方案中，上文所描述的載體和/或宿主細(xì)胞含有嵌合VZV gE、gl、gM、gH、gB、或 間層蛋白、或其部分，和任選地任何另外的嵌合VZV蛋白，并且可以含有另外的細(xì)胞組分， 諸如細(xì)胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物等。本發(fā)明還提供了生成嵌合VLP的方法，所述方法包括在容許VLP形成的條件下表 達(dá)至少一種核心蛋白和至少一種嵌合VZV基因，其包含gE、gl、gM、gH、gB、間層蛋白或其部 分。根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞，在表達(dá)重組蛋白和形成嵌合VLP的條件下通過培養(yǎng) 用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來生成VLP。在一個實施方案中，本發(fā)明包含一種生成嵌合VLP 的方法，包括將編碼病毒核心蛋白和嵌合VZV gE蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中，并 在容許VLP形成的條件下表達(dá)所述蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含一種生成嵌 合VLP的方法，包括將編碼病毒核心蛋白、嵌合VZV gE和嵌合VZV gl蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合 適的宿主細(xì)胞中，并在容許VLP形成的條件下表達(dá)所述蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述 真核細(xì)胞選自酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲類細(xì)胞、禽類細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞組成的組。在另 一個實施方案中，所述嵌合VLP不包含酵母Ty蛋白。合適的培養(yǎng)條件的選擇在本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員的技術(shù)之內(nèi)。培養(yǎng)經(jīng)過工程化改造而生成本發(fā)明嵌合VLP的細(xì)胞的方法包括但不限于分批、分 批補料、連續(xù)和灌注(perfusion)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)意思是在生物反應(yīng)器(發(fā)酵室) 中使細(xì)胞生長和增殖，細(xì)胞在生物反應(yīng)器中增殖并表達(dá)蛋白(例如重組蛋白)以供純化和 分離用。典型地，細(xì)胞培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中無菌、受控的溫度和大氣條件下進行。生物反應(yīng) 器是用于培養(yǎng)細(xì)胞的腔室(chamber)，其中可以監(jiān)控環(huán)境條件諸如溫度、大氣、攪拌和/或 pH。然后使用保持嵌合VLP完整性的方法來分離嵌合VLP，諸如通過梯度離心，例如氯 化銫、蔗糖和碘克沙醇(iodixanol)梯度離心，以及標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，包括例如離子交換和凝 膠過濾層析。在一個實施方案中，本發(fā)明包含本發(fā)明的純化的嵌合VLP。在另一個實施方案 中，本發(fā)明的所述嵌合 VLP 至少 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%, 96%,97%,98%,99%或更多地沒有混合物中存在的其它分子(不包括溶劑在內(nèi))。在另一 個實施方案中，本發(fā)明的所述嵌合VLP基本上沒有與制備本發(fā)明的嵌合VLP有關(guān)的其它病毒、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、和碳水化合物。以下是可以如何制備、分離和純化本發(fā)明的嵌合VLP的一個例子。通常，嵌合VLP是由重組細(xì)胞系生成的，所述細(xì)胞系經(jīng)過工程化改造從而當(dāng)所述細(xì) 胞在細(xì)胞培養(yǎng)(見上文)中生長時產(chǎn)生嵌合VLP。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以使用 其它的方法來制備和純化本發(fā)明的嵌合VLP，如此本發(fā)明不限于所述的方法。本發(fā)明VLP的生產(chǎn)可首先將Sf9細(xì)胞(未感染的)接種到搖瓶中，使細(xì)胞隨著細(xì) 胞生長繁殖而膨脹和規(guī)模放大(例如從125ml燒瓶到50L Wave袋)。培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng) 基是為合適的細(xì)胞系配制的(優(yōu)選無血清培養(yǎng)基，例如昆蟲培養(yǎng)基ExCell-420，JRH)。接 著，用重組桿狀病毒以效率最高的感染復(fù)數(shù)(例如每個細(xì)胞約1個到約3個噬斑形成單位) 感染所述細(xì)胞。一旦發(fā)生感染，嵌合VZV蛋白和/或其它蛋白質(zhì)自裝配成嵌合VLP，并在感 染后大約24到72小時從細(xì)胞分泌。通常，在細(xì)胞處于生長的對數(shù)中期(mid-log phase) (4-8xl06個細(xì)胞/ml)且至少約90%存活時，感染效率最高。可以在感染后大約48到96小時，在細(xì)胞培養(yǎng)基中嵌合VLP水平接近最大值但在 廣泛的細(xì)胞溶解之前收獲本發(fā)明的嵌合VLP。收獲時的Sf9細(xì)胞密度和生存力可以為約 0. 5xl06個細(xì)胞/ml至約1. 5xl06個細(xì)胞/ml，生存力至少為20%，如染料排除測定法所示。 接著，取出培養(yǎng)基并將其澄清。可以向培養(yǎng)基添加NaCl至濃度為約0. 4至約1. 0M，優(yōu)選至 約0. 5M，以避免VLP聚集。可利用一次性使用的預(yù)滅菌中空纖維0. 5或1. 00 μ m筒式濾器 或類似的裝置，通過切向流過濾(TFF)來實現(xiàn)從含有本發(fā)明VLP的細(xì)胞培養(yǎng)基中除去細(xì)胞 和細(xì)胞碎片。接著，可以使用一次性的、預(yù)滅菌的500，000分子量截留中空纖維筒通過超濾來 濃縮經(jīng)過澄清的培養(yǎng)基中的嵌合VLP?？梢詫⒔?jīng)過濃縮的VLP對10倍體積的含0.5M NaCl 的pH 7. 0至8. 0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行滲濾(diafiltrate)來除去殘余的培養(yǎng)基 成分?？梢詫⒔?jīng)過濃縮、滲濾的VLP在含0. 5M NaCl的pH 7. 2PBS緩沖液中20% -60%不 連續(xù)蔗糖梯度上，于約4°C至約10°C以6，500xg離心18小時來進一步純化。通常，嵌合VLP 將在約30%至約40%蔗糖之間或者在界面上(在20%和60%的分步梯度中)形成顯著可 見的條帶，可從該梯度中收集該條帶并保存?？上♂屧摦a(chǎn)物使其包含200mM NaCl,以準(zhǔn)備純 化過程的下一步。該產(chǎn)物含有嵌合VLP，并可能含有完整的桿狀病毒顆粒?？梢酝ㄟ^陰離子交換層析或者44%等密度蔗糖墊層(cushion)離心來實現(xiàn)嵌合 VLP的進一步純化。在陰離子交換層析中，將來自蔗糖梯度(見上文)的樣品上樣入含有帶 陰離子的介質(zhì)(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的柱中，并經(jīng)由鹽梯度(從約0. 2M至 約1.0M NaCl)洗脫，該梯度可以將嵌合VLP與其它雜質(zhì)(例如桿狀病毒和DNA/RNA)分開。 在蔗糖墊層方法中，將包含嵌合VLP的樣品添加到44%蔗糖墊層，并在30，OOOg離心約18 小時。VLP在44%蔗糖的頂部形成條帶，而桿狀病毒沉淀于底部，其它污染蛋白停留在頂部 的0%蔗糖層中。收集嵌合VLP峰或嵌合VLP帶。若想要的話，可以將完整的桿狀病毒滅活。可以通過化學(xué)方法，例如甲醛或β-丙 內(nèi)酯(BPL)滅活。還可以使用本領(lǐng)域已知的選擇性沉淀和層析方法，如上文例示的，來大部 分實現(xiàn)完整桿狀病毒的除去和/或滅活。滅活方法包括將含有VLP的樣品在0. 2% BPL中 于約25°C至約27°C溫育3小時。還可以通過將含有VLP的樣品在0. 05% BPL于4°C溫育 3天，然后在37°C溫育1小時，來滅活桿狀病毒。滅活/除去步驟后，可使含有VLP的產(chǎn)物運行經(jīng)過另一滲濾步驟以除去任何來自滅活步驟的試劑和/或任何殘余的蔗糖，并將嵌合VLP置入期望的緩沖液(例如PBS)中。包含嵌合VLP的溶液可以通過本領(lǐng)域已知的方法(例如無菌過濾)滅菌，并保存在冰箱或 冷凍箱中。上文的技術(shù)可以在多種規(guī)模上實施。例如，T形瓶(T-flasks)、搖瓶、轉(zhuǎn)瓶 (spinner bottle)、乃至工業(yè)尺寸的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可包括不銹鋼罐或預(yù)滅菌的 塑料袋(例如，Wave Biotech, Bridgewater, NJ出售的系統(tǒng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道用 于其目的的最佳選擇。藥物或疫苗配制劑和施用本文中有用的藥物組合物含有本發(fā)明的嵌合VLP和藥學(xué)可接受載體(包括任何合 適的稀釋劑或賦形劑)，所述藥學(xué)可接受載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的脊椎 動物有害的免疫應(yīng)答、并且可以不帶有異常毒性地(Without undue toxicity)施用的任何 藥劑。如本文中所使用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的”指獲得聯(lián)邦或州政府監(jiān)管部門批準(zhǔn)，或者 在美國藥典、歐洲藥典或其它公認(rèn)的藥典中列出的用于哺乳動物，更具體地用于人類中。這 些組合物可以用作疫苗和/或抗原性配制劑，用于在脊椎動物中誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答。本 發(fā)明涵蓋一種抗原性配制劑，其包含如下的嵌合VLP，所述嵌合VLP包含至少一種VZV蛋白 (例如嵌合gE蛋白)，但不包括VZV核酸或酵母Ty蛋白。在另一個實施方案中，所述抗原 性配制劑包含如下的嵌合VLP，其包含至少一種另外的摻入VLP中的嵌合VZV蛋白。在另一 個實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含gl (0RF 67)蛋白。在另一個實施方案中，所 述另外的嵌合VZV蛋白包含gM(0RF 50)蛋白。在另一個實施方案中，所述另外的嵌合VZV 蛋白包含gH。在另一個實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含gB。在另一個實施方案 中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含間層蛋白。在另一個實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋 白包含gI、gM、gH、gB或間層蛋白的組合。在另一個實施方案中，所述嵌合VZV VLP不包含 VZV 殼體蛋白(例如 ORF 20、ORF 40、ORF 41)。通常，疫苗包含本發(fā)明組合物懸浮或溶解于其中的常規(guī)鹽水或緩沖的水溶液介 質(zhì)。處于這種形式，便可以方便地使用本發(fā)明的組合物以預(yù)防、改善或以其它方式治療感 染。導(dǎo)入宿主中后，疫苗能夠刺激免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體和/或細(xì)胞因子的生成和/ 或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、樹突細(xì)胞的活化和/或其它細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明還涵蓋一種疫苗配制劑，其包含如下的嵌合VLP，所述嵌合VLP包含至少一 種VZV蛋白(例如嵌合gE蛋白)，但不包括VZV核酸或酵母Ty蛋白。在另一個實施方案 中，所述疫苗配制劑包含如下的嵌合VLP，其包含至少一種另外的摻入VLP中的嵌合VZV蛋 白。在另一個實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gl (0RF 67)蛋白。在另一個 實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gM(0RF 50)蛋白。在另一個實施方案中， 所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gH。在另一個實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包 含嵌合gB。在另一個實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合間層蛋白。在另一個 實施方案中，所述另外的嵌合VZV蛋白包含嵌合gI、gM、gH、gB或間層蛋白的組合。在另一 個實施方案中，所述VZV VLP不包含VZV殼體蛋白(例如ORF 20、ORF 40、ORF 41)。本發(fā)明的所述抗原性和疫苗配制劑包含如上文所描述的本發(fā)明的VLP和藥學(xué)可 接受載體或賦形劑。藥學(xué)可接受載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖(dextrose)、 水、甘油、無菌等滲緩沖水溶液，和它們的組合。對藥學(xué)可接受載體、稀釋劑和其它賦形劑的全面討論呈現(xiàn)于 Remington' sPharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N. J. current edition)中。配制劑應(yīng)當(dāng)適合施用模式。在一個優(yōu)選的實施方案中，配制劑適于給人施用， 優(yōu)選是無菌、非顆粒性(non-particulate)和/或非熱原性的。若想要的話，藥學(xué)組合物還可以含有小量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。組合 物可以是固體形式，諸如適于重構(gòu)的凍干粉末；液體溶液；懸液；乳液；片劑；丸劑；膠囊； 持續(xù)釋放配制劑；或粉劑。口服配制劑可包括標(biāo)準(zhǔn)的載體，諸如藥品級的甘露糖醇、乳糖、淀 粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。本發(fā)明提供了嵌合VLP配制劑包裝在標(biāo)示組合物量的密封容器諸如安瓿或小藥 囊(sachette)中。在一個實施方案中，所述嵌合VLP組合物作為液體提供，在另一個實施 方案中，作為密封容器中的干燥無菌凍干粉末或無水濃縮物提供，并且可以用例如水或鹽 水重構(gòu)為用于向受試者施用的合適濃度。在一個可選的實施方案中，在標(biāo)示嵌合VLP組合物的量和濃度的密封容器中以 液體形式提供嵌合VLP組合物。優(yōu)選地，在密封容器中以至少約50 u g/ml、更優(yōu)選至少約 100 u g/ml、至少約200 u g/ml、至少500 u g/ml、或至少lmg/ml提供液體形式的嵌合VLP組 合物?！愣裕景l(fā)明的嵌合的VZV VLP以足以刺激針對一種或多種VZV毒株的免疫 應(yīng)答的有效量或數(shù)量施用。優(yōu)選地，施用本發(fā)明的嵌合VLP引發(fā)針對VZV的免疫。典型地， 可以根據(jù)例如年齡、身體健康狀況(physicalcondition)、體重、性別、飲食、施用時間和其 它臨床因素，在該范圍內(nèi)調(diào)節(jié)該劑量。預(yù)防性疫苗配制劑是全身施用的，例如通過使用針頭 和注射器或無針頭注射裝置進行皮下或肌內(nèi)注射來施用?；蛘?，疫苗配制劑是鼻內(nèi)施用的， 通過滴劑、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)、或噴霧入上呼吸道中。雖然上文的任何遞送途 徑均導(dǎo)致免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)施用還帶來額外的益處，即在許多病毒(包括VZV)進入的部位 引發(fā)粘膜免疫。如此，本發(fā)明還包括誘導(dǎo)哺乳動物中針對感染或其至少一種癥狀的免疫的疫苗或 抗原性組合物的配制方法，包括向所述配制劑添加有效劑量的嵌合的VZV VLP。在一個實 施方案中，所述感染是VZV感染。“有效劑量” 一般指足以誘導(dǎo)免疫、預(yù)防和/或改善感染 或減輕至少一種感染癥狀、和/或增強另一劑嵌合VLP的功效的本發(fā)明VLP的量。有效劑 量可以指足以延遲感染發(fā)作或使之最小化的嵌合VLP的量。有效劑量還可以指在感染的 治療或控制中提供治療益處的嵌合VLP的量。此外，有效劑量是就單獨的或與其它療法組 合在感染的治療或控制中提供治療益處的本發(fā)明嵌合VLP而言的量。有效劑量還可以是 足以增強受試者(例如人)自己針對后來向感染原暴露的免疫應(yīng)答的量。免疫水平可以 通過例如測量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量來加以監(jiān)測，所述測量例如通過噬斑中 禾口(plaque neutralization)、補體結(jié)合(complement fixation)、醇聯(lián)免疫吸附、或微中禾口 (microneutralization)測定法來進行。在疫苗的情況中，“有效劑量”是預(yù)防疾病和/或 降低癥狀嚴(yán)重性的劑量。如上文所提及，本發(fā)明的VLP預(yù)防或減輕受試者中VZV感染的至少一種癥狀。由 VZV感染引起的兩種疾病的癥狀是本領(lǐng)域中公知的。由初次VZV感染產(chǎn)生的禽痘(水痘) 的癥狀包括發(fā)熱、不適(malaise)、頭痛、腹痛、疲勞、食欲缺乏(anorexia)、和主要在頭皮、 面部和軀干上發(fā)生的皮膚損傷。源自于潛伏VZV再活化的帶狀皰疹的特征在于下列癥狀通常在胸部生皮節(jié)單側(cè)出現(xiàn)的皮疹、急性神經(jīng)炎痛(neuritic pain)、和超敏感性。如此，本發(fā)明的方法包括預(yù)防或減輕與VZV感染有關(guān)的至少一種癥狀。癥狀的減輕可以主觀地或者 客觀地確定，例如通過受試者的自我評估、由內(nèi)科醫(yī)生評估、或通過實施合適的測定或測量 (例如體溫)，包括例如生活質(zhì)量評價、VZV感染或其它癥狀的進展減慢、VZV癥狀的嚴(yán)重程 度降低或者合適的測定法(例如抗體效價和/或T細(xì)胞活化測定法)?？陀^評價包括動物 和人的評價。雖然優(yōu)選用單劑刺激免疫，但是可以通過相同或不同路徑施用額外的劑量，以達(dá) 到想要的效果。例如在新生兒和嬰兒中，可能需要多次施用來引發(fā)足夠的免疫水平。按照 維持足夠水平的抗感染(例如VZV感染)保護的需要，可以在整個兒童期以一定間隔繼續(xù) 進行施用。類似地，特別容易受到反復(fù)或嚴(yán)重的感染的成年人，例如衛(wèi)生保健工作者、日間 護理工作者、幼兒的家人、老年人、以及心肺功能受損的個體等，可能需要進行多次免疫來 建立和/或維持保護性免疫應(yīng)答。可以通過例如測量中和性分泌和血清抗體的量來監(jiān)測誘 導(dǎo)產(chǎn)生的免疫的水平，并按照引發(fā)和維持期望的保護水平的需要來調(diào)整劑量或重復(fù)接種。施用包含嵌合VLP的組合物(疫苗和/或抗原性配制劑)的方法包括，但不限于， 胃腸外施用(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜夕卜、和粘膜(例如鼻內(nèi)和口腔或肺途徑 或通過栓劑)。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的組合物通過口服、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜 內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。組合物可以通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或推注，通過 經(jīng)由上皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘膜、結(jié)腸、結(jié)膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱和腸粘 膜等)的吸收，并且可以與其它生物學(xué)活性劑一起施用。在一些實施方案中，含本發(fā)明嵌合 VLP的組合物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑可以誘導(dǎo)顯著高于其它施用途徑的抗體或其它免 疫應(yīng)答。在另一個實施方案中，含本發(fā)明嵌合VLP的組合物的鼻內(nèi)或其它粘膜施用途徑可 誘導(dǎo)這樣的抗體或其它免疫應(yīng)答，所述抗體或其它免疫應(yīng)答會誘導(dǎo)針對其它VZV毒株的交 叉保護。施用可以是全身性的或者是局部的。本發(fā)明的疫苗和/或抗原性配制劑還可以按照劑量日程表(dosageschedule)來 施用，例如用疫苗組合物進行初次施用，隨后進行加強施用。在具體的實施方案中，第二劑 組合物在初次施用后大約兩周至一年的任何時間，優(yōu)選約1個月、約2個月、約3個月、約4 個月、約5個月到約6個月施用。另外，可以在第二劑之后，且在距初次施用后約3個月至 約兩年甚至更長時間，優(yōu)選約4個月、約5個月、或者約6個月、或者約7個月至約1年施用 第三劑。在第二劑后在受試者的血清和/或尿或者粘膜分泌物中沒有檢測到或者檢測到低 水平的特異性免疫球蛋白時，可任選地施用第三劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二劑在第 一次施用后約1個月施用，而第三劑在第一次施用后約6個月施用。在另一個實施方案中， 第二劑在第一次施用后約6個月施用。在另一個實施方案中，所述本發(fā)明的嵌合VLP可以 作為聯(lián)合療法的一部分施用。例如，本發(fā)明的嵌合VLP可以與其它免疫原性組合物、抗病毒 劑和/或抗生素一起配制。技術(shù)人員可以容易地確定藥物配制劑的劑量，例如通過首先鑒定有效引發(fā)預(yù)防性 或治療性免疫應(yīng)答的劑量，例如通過測量病毒特異性免疫球蛋白的血清效價或通過測量血 清樣品或尿樣品或粘膜分泌物中抗體的抑制比。所述劑量可以由動物研究確定。用于研究 疫苗功效的動物的非限制性目錄包括豚鼠、倉鼠、雪貂(ferret)、灰鼠(chinchilla)、小鼠 和棉鼠。大多數(shù)動物不是感染原的天然宿主，但仍可用于該疾病的各個方面的研究。例如，可以對任何上文的動物定量給予疫苗候選物，例如本發(fā)明的嵌合VLP，以部分地表征所誘發(fā) 的免疫應(yīng)答，和/或確定是否生成了任何中和性抗體。例如，已經(jīng)在小鼠模型中進行了許多 研究，因為小鼠體型小，而且它們的成本低使得研究者可以進行更大規(guī)模研究。另外，技術(shù)人員可以進行人體臨床研究來確定用于人的優(yōu)選有效劑量。這樣的臨 床研究是常規(guī)的，且為本領(lǐng)域公知。要使用的確切劑量還將依賴于施用途徑?？梢詮脑醋?體外或動物試驗系統(tǒng)的劑量_應(yīng)答曲線外推得到有效劑量。如本領(lǐng)域中還公知的，可以使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物來增強特定組合物的 免疫原性，這樣的刺激物稱為佐劑。術(shù)語“佐劑”指這樣的化合物，在其與特定的免疫原(例 如VLP)在配制劑中組合使用時，會增進或以其它方式改變或修飾由此所致的免疫應(yīng)答。對 免疫應(yīng)答的修飾包括對抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的強化或使其特異性增寬。對免疫應(yīng)答的 修飾還可以意味著降低或抑制某些抗原特異性免疫應(yīng)答。實驗上已經(jīng)使用佐劑來促進針對 未知抗原的免疫的普遍增加(例如美國專利號4，877，611)。免疫規(guī)程使用佐劑來刺激應(yīng)答 已有多年，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對佐劑是熟知的。有些佐劑影響抗原呈遞的方式。例 如，在蛋白抗原被明礬沉淀時，免疫應(yīng)答增加?？乖娜榛惭娱L抗原呈遞的持續(xù)時間。本 發(fā)明的范圍意圖涵蓋Vogel 等，“ACompendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (第 2版)，”(本文通過提述收錄該文獻(xiàn)全部內(nèi)容用于所有目的)中所述任何佐劑。示例性的佐劑包括完全弗氏佐劑(一種免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，含有已殺死 的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。其 它佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP化合物諸如thur_MDP和nor_MDP、CGP (MTP-PE)、脂 質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì)A(MPL)。還設(shè)想使用RIBI，其在2%角鯊烯/Tween 80乳劑中含有從細(xì) 菌提取的3種成分MPL、海藻糖二霉菌酸(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)。還可以使用MF-59、 Novasomes 、MHC 抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述佐劑是少片層(paucilamellar)脂質(zhì)小泡，其 具有大約2到10個雙層，它們排列成多個基本呈球形的殼的形式，其由水性層隔開，所述 水性層圍繞著不含脂質(zhì)雙層的無定形中心大空腔。少片層脂質(zhì)小泡可以通過數(shù)種方式起 作用來刺激免疫應(yīng)答作為非特異性刺激物、作為抗原的載體、作為其它佐劑的載體，以及 這些方式的組合。例如，在通過混合抗原與預(yù)先形成的小泡，使得抗原相對于小泡保持在 胞外的方法制備疫苗時，少片層脂質(zhì)小泡起非特異性免疫刺激物的作用。通過將抗原包囊 在小泡的中心空腔中，小泡起到免疫刺激物和抗原載體兩方面的作用。在另一個實施方案 中，小泡主要由非磷脂小泡構(gòu)成。在其它實施方案中，小泡是Novasomes 。Novasomes 是約lOOnm到約500nm范圍的少片層非磷脂小泡。它們包含Brij 72、膽固醇、油酸和角鯊 烯。Novasomes已被證明是流感抗原的有效佐劑(參見美國專利5，629，021、6，387，373和 4,911,928,本文通過提述收錄它們的全部內(nèi)容用于所有目的)。本發(fā)明的嵌合VLP還可以與“免疫刺激物”一起配制。術(shù)語“免疫刺激物”指經(jīng)由 身體自身的化學(xué)信使(細(xì)胞因子)增強免疫應(yīng)答的化合物。這些分子包括具有免疫刺激、 免疫強化和促炎癥活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，諸如白介素(例如IL-I、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生長因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)集落刺激因子 (CSF))；及其它免疫刺激分子，諸如巨噬細(xì)胞炎性因子、Flt3配體、B7. 1 ；B7. 2等。免疫刺 激物分子可以在與本發(fā)明VLP相同的配制劑中施用，或者可以分開施用?？梢允┯玫鞍踪|(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。如此，在一個實施方案中，本發(fā)明包含包 含佐劑和/或免疫刺激物的抗原性和疫苗配制劑。通過下面的實施例進一步例示本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)解釋為限制性的。本文通 過提述收錄本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和已公開的專利申請，以及附圖和序列表 用于所有目的。
實施例實施例1下文描述了嵌合VZV VLP在Sf9昆蟲細(xì)胞中的克隆、表達(dá)和純化方法，所述嵌合 VZV VLP包含嵌合gE(HA TM/CT)糖蛋白(SEQ ID No. 1)和禽流感Ml (A/印尼/5/05H5m毒 株)基質(zhì)蛋白(SEQ ID No. 9) 克隆嵌合gE和禽流感Ml，并在容許VLP形成的條件下在桿 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。圖1A中描繪了此構(gòu)建體。為了證實VLP得到制備，在桿狀病毒感染后64小時通過低速離心來使Sf9細(xì)胞培 養(yǎng)基離心，所述Sf9細(xì)胞培養(yǎng)基含有用包含VZV gE(HA TM/CT)/IndoMl嵌合構(gòu)建體的桿狀 病毒感染的Sf9細(xì)胞。通過用500kDa MWC0中空纖維濾膜(GE healthcare)進行的超濾 (UF)來濃縮無細(xì)胞的培養(yǎng)基。通過滲濾(DF)使保留物與25mM TrisCl pH 8. 0,500mM NaCl 進行緩沖液交換。在相同緩沖液中平衡的離子交換柱(Fractogel TMAE)上加載UF/DF保 留物。接著，用超濾進一步濃縮含有VLP和桿狀病毒的流過級分，之后加載至用25mM TrisCl pH 8.0 300mM NaCl 平衡的 S印hacryl S500 大小排阻柱(GEhealthcare)上。在 S500柱的空隙體積中洗脫VLP和桿狀病毒級分，而在稍后的層析級分中洗脫可溶性蛋白質(zhì) 和細(xì)胞片段。將來自S500柱的空隙峰(voidpeak)以300mM NaCl加載至第二 TMAE柱。在這 些條件下，VLP不結(jié)合陰離子樹脂，而帶更多負(fù)電荷的桿狀病毒結(jié)合該柱。這是至關(guān)重要的 分開步驟，其依賴于如下事實，即VLP缺乏DNA或RNA基因組，而桿狀病毒含有大的137KDa 雙鏈DNA基因組，其增加桿狀病毒的負(fù)電荷，如此提高該病毒的結(jié)合特征。通過流過30% 蔗糖墊層進行的超速離心(100Kg小時)來濃縮含有VLP的第二 TMAE流過級分(圖4B，第 2道)。接著，使用純化的嵌合VZVgE(HA TM/CT)/Indo Ml嵌合VLP進行SDS PAGE分析、 Western印跡分析、電子顯微鏡(EM)和免疫金分析。如先前所描述的那樣實施SDS PAGE和Western印跡分析。圖1B中顯示了這些結(jié) 果。第1道是來自第二 TMAE離子交換層析柱的VLP，而第2道和第3道分別是高速離心后 30%蔗糖界面頂部附近回收的VLP和沉淀物。注意到，通過超速離心使痕量的桿狀病毒和 VZV嵌合VLP沉淀，但是大部分gE/Ml嵌合VLP是較高浮力密度的，并且接近30 %蔗糖界面。 注意到，嵌合gE(HATM/CT)具有與桿狀病毒蛋白GP64相同的分子量，在凝膠上所述條帶重 疊。如此，第2道中的64kDa蛋白質(zhì)(包含純化的VLP)主要是嵌合gE(HATM/CT)，而第3道 中的相同大小的條帶(包含VLP和桿狀病毒)主要是桿狀病毒包膜糖蛋白GP64。通過比較 經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的凝膠和抗gE Western印跡得出此結(jié)論。純化的嵌合VZV VLP (第1道) 具有大于90%的純度，其中主要的蛋白質(zhì)是Ml和沒有完全由SDS破壞的Ml 二聚物(25KDa 和50KDa)和嵌合gE(60KDa)。如此，這些結(jié)果顯示了，生成了嵌合VLP，并得到了純化。接著，用電子顯微術(shù)(EM)負(fù)染色來使嵌合VLP成像(圖2)。這些EM圖像顯示了，嵌合VLP具有球狀核心，其具有高度結(jié)構(gòu)化的包膜。實施對VLP的免疫金染色以確定VZV gE是否在嵌合VLP的表面上得到表達(dá)。拍 攝EM圖像前，將嵌合VLP與正常的小鼠IgG (A)或小鼠抗VZV-gE (來自Santa Cruz的克隆 9C8) (B) 一起溫育，接著與金標(biāo)記的針對小鼠的第二抗體一起溫育。位于嵌合
金顆粒證實了 VLP上存在gE蛋白。如圖3所顯示的，所述抗體確實染色VLP。如此，VLP確實表達(dá)VZV gE。這些數(shù)據(jù)顯示了，可以生成并純化包含嵌合VZV蛋白的嵌合VZV VLP。本文通過提及而收錄所有專利、出版物和專利申請，其程度就像明確且單獨指明 通過提及而收錄每篇單獨的專利、出版物或所引用的專利申請一樣。僅為了理解的清楚而提供了上述詳細(xì)的說明書，并且不應(yīng)當(dāng)將此理解成不必要的 限制，因為各種修飾形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。并不承認(rèn)本文中所提供的 任何信息都是現(xiàn)有技術(shù)或與目前要求保護的發(fā)明有關(guān)，或者明確或隱含提及的任何出版物 都是現(xiàn)有技術(shù)。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員一般理解的相同的含義。雖然已經(jīng)描述了本發(fā)明以及其具體的實施方案，但是可理解的是，其能夠進一步 進行修飾，并且本申請意圖覆蓋本發(fā)明的任何變化、用途、或改編，它們一般遵循本發(fā)明的 原理，并且包括對本公開內(nèi)容在本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或習(xí)慣實踐之內(nèi)的、且可適用于 上文所列出的和所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的本質(zhì)特征的偏離。
權(quán)利要求
一種嵌合VLP，其包含病毒核心蛋白和至少一種水痘帶狀皰疹病毒(VZV)蛋白，其中VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核酸。
2.權(quán)利要求1的嵌合VLP，其中所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和 異源蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的嵌合VLP，其中所述異源蛋白與所述病毒核心蛋白結(jié)合。
4.權(quán)利要求2的嵌合VLP，其中所述VZV蛋白選自下組gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、和gM。
5.權(quán)利要求4的嵌合VLP，其中所述VZV蛋白是gE。
6.權(quán)利要求4的嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含gE和gl。
7.權(quán)利要求2的嵌合VLP，其中異源蛋白的所述跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域來自流感病毒。
8.權(quán)利要求7的嵌合VLP，其中所述流感病毒蛋白是血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶 (NA)。
9.權(quán)利要求8的嵌合VLP，其中所述HA和/或NA來自甲型流感病毒/印尼/5/05。
10.權(quán)利要求1的嵌合VLP，其中所述病毒核心來自正粘病毒或副粘病毒。
11.權(quán)利要求1的嵌合VLP，其中所述病毒核心選自下組流感病毒M1、NDVM、RSVM和 HIV gag。
12.權(quán)利要求11的嵌合VLP，其中所述病毒核心是流感病毒Ml。
13.權(quán)利要求12的嵌合VLP，其中所述流感Ml來自甲型流感病毒/印尼/5/05。
14.權(quán)利要求1的嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ IDN0. 9。
15.權(quán)利要求1的嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ IDNO. 9。
16.一種生成嵌合VLP的方法，包括將一種或多種編碼至少一種VZV蛋白和病毒核心蛋 白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞中，并在容許VLP形成的條件下表達(dá)所述嵌合VZV和病毒 核心蛋白，其中所述宿主細(xì)胞不包含酵母Ty蛋白。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域和異 源蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述異源蛋白與所述病毒核心蛋白結(jié)合。
19.權(quán)利要求17的方法，其中至少一種VZV蛋白選自下組ge、gl、gB、gH、gK、gL、gC、 禾口 gM。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述VZV蛋白是gE或gl。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述VZV蛋白是gE和gl。
22.權(quán)利要求17的方法，其中異源蛋白的所述跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域來自流感病毒。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述流感病毒蛋白是HA和/或NA。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述HA和/或NA來自甲型流感病毒/印尼/5/05。
25.權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒核心來自正粘病毒。
26.權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒核心來自副粘病毒，附加條件為所述核心或基 質(zhì)蛋白來自呼吸道合胞病毒(RSV)M。
27.權(quán)利要求16的方法，其中所述病毒核心選自下組流感病毒Ml、NDVM、RSV M和 HIV gag。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述病毒核心是流感病毒Ml。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述流感Ml來自甲型流感病毒/印尼/5/05。
30.權(quán)利要求16的方法，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 9。
31.權(quán)利要求16的方法，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 9。
32.—種抗原性配制劑，其包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一種VZV蛋白和 病毒核心蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。
33.權(quán)利要求32的抗原性配制劑，其中所述VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞 外域和異源蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
34.權(quán)利要求33的抗原性配制劑，其中所述異源蛋白與所述病毒核心蛋白結(jié)合。
35.權(quán)利要求32的抗原性配制劑，其中至少一種VZV蛋白選自下組gE、gI、gB、gH、gK、 gL、gC、和 gM。
36.權(quán)利要求35的抗原性配制劑，其中所述VZV蛋白是gE或gl。
37.權(quán)利要求35的抗原性配制劑，其中所述VZV蛋白是gE和gl。
38.權(quán)利要求32的抗原性配制劑，其中所述核心蛋白是來自甲型流感病毒/印尼 /5/05的流感Ml。
39.權(quán)利要求32的抗原性配制劑，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 9。
40.權(quán)利要求32的抗原性配制劑，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 9。
41.一種疫苗，其包含嵌合VLP，其中所述嵌合VLP包含至少一種VZV蛋白和病毒核心 蛋白，并且不包含酵母Ty蛋白。
42.權(quán)利要求41的疫苗，其中所述嵌合VZV蛋白是嵌合的，并且包含VZV蛋白的胞外域 和異源蛋白的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
43.權(quán)利要求42的疫苗，其中所述異源蛋白與所述病毒核心蛋白結(jié)合。
44.權(quán)利要求40的疫苗，其中至少一種VZV蛋白選自下組gE、gl、gB、gH、gK、gL、gC、 禾口 gM。
45.權(quán)利要求44的疫苗，其中所述VZV蛋白是gE或gl。
46.權(quán)利要求44的疫苗，其中所述VZV蛋白是gE和gl。
47.權(quán)利要求41的疫苗，其中所述核心蛋白是來自甲型流感病毒/印尼/5/05的流感Ml。
48.權(quán)利要求41的疫苗，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 9。
49.權(quán)利要求41的疫苗，其中所述嵌合VLP包含SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 9。
50.一種在人或動物中引發(fā)針對感染的保護性免疫的方法，包括給所述人或動物施用 包含嵌合VZV-VLP的抗原性配制劑或疫苗，其中所述嵌合VZV-VLP包含至少一種嵌合VZV 蛋白和病毒核心蛋白，其中所述嵌合VLP不包含酵母Ty蛋白，而且不包含VZV核酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的嵌合水痘帶狀皰疹病毒(VZV)病毒樣顆粒(VLP)，其包含嵌合VZV糖蛋白。本發(fā)明還公開了嵌合VZV-VLP的疫苗配制劑和在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號C07K14/11GK101801411SQ200880108050
公開日2010年8月11日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日
發(fā)明者彼得·普什科, 蓋爾·史密斯 申請人:諾瓦瓦克斯股份有限公司