專利名稱：癌癥疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，包 含腫瘤抑制基因Wilms’腫瘤I(WTl)的蛋白產(chǎn)物(在下文中有時簡稱為WTl蛋白)或其部 分肽(在下文中有時簡稱為WTl肽)。本發(fā)明還涉及用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥疫 苗組合物，包含編碼上面提到的WTl蛋白或WTl肽的DNA或RNA，以及用于誘導(dǎo)WTl特異性 CTLs的方法，用于誘導(dǎo)呈遞癌癥抗原的樹突狀細(xì)胞的方法，以及用于HLA-A*0206陽性人員 的癌癥診斷方法，和在HLA-A*0206陽性人員中治療或預(yù)防癌癥的方法。本發(fā)明還涉及用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物，包含WTl肽的修飾的 肽。
背景技術(shù)：
Wilms，腫瘤基因WTl作為Wilms，腫瘤，即一種兒童腎臟腫瘤(參見非專利文獻(xiàn) 1)中與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因被分離到。該基因編碼與細(xì)胞生長和分化、以及凋亡和組織發(fā) 育的調(diào)控機(jī)制有關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。WTl基因最初被分類為腫瘤抑制基因。但是，根據(jù)下面的⑴到(iii)中顯示的最 新證據(jù)(i)在各種人類惡性腫瘤和實體癌癥包括造血惡性腫瘤例如白血病和骨髓增生異 常綜合癥(MDS)中野生型WTl基因的高表達(dá)，(ii)用WTl反義寡核苷酸處理的人類白血病細(xì)胞和實體癌細(xì)胞的生長抑制，以及(iii)野生型WTl基因的組成性表達(dá)對小鼠骨髓性前體細(xì)胞的生長促進(jìn)和分化抑 制，表明野生型WTl基因?qū)Ω鞣N不同惡性疾病表現(xiàn)出致癌效應(yīng)強于腫瘤抑制效應(yīng)(參 見專利文獻(xiàn)1)。在實體腫瘤，例如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、 前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌中WTl基因的高表達(dá)，也是已知的(參見專利文獻(xiàn)2)?？偟膩碚f，用于消除外來物質(zhì)的免疫系統(tǒng)包括體液免疫，其中涉及了識別抗原并 用作抗原呈遞細(xì)胞的巨噬細(xì)胞，識別由巨噬細(xì)胞呈遞的抗原并產(chǎn)生各種不同淋巴因子以活 化其他T細(xì)胞的輔助T細(xì)胞，以及通過淋巴因子的作用分化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞； 以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，其中通過對抗原呈遞作出響應(yīng)進(jìn)行分化而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞(CTLs)，攻擊并破壞靶細(xì)胞。目前，已經(jīng)認(rèn)為癌癥免疫主要是基于其中涉及CTLs的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。在基于 CTL的癌癥免疫中，前體T細(xì)胞識別以I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)與癌抗原的復(fù)合物 的形式呈遞的癌抗原，從而分化并生長成攻擊并破壞癌細(xì)胞的CTLs。在這種情況下，癌細(xì)胞 在細(xì)胞表面上呈遞I類MHC抗原與癌抗原的復(fù)合物，所述復(fù)合物是CTLs的靶(參見非專利 文獻(xiàn)2到5)。MHC在人類中被稱為人類白細(xì)胞抗原(HLA)。據(jù)認(rèn)為，由癌細(xì)胞、即靶細(xì)胞表面上的I類MHC抗原呈遞的上述癌抗原，是通過在癌細(xì)胞中合成的抗原蛋白的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶介導(dǎo)的加工產(chǎn)生的大約8到12個氨基酸的肽 (參見非專利文獻(xiàn)2到5)。目前，對各種不同癌癥的抗原蛋白的搜索正在進(jìn)行之中，但是只 鑒定到幾個蛋白是癌癥特異性抗原。本發(fā)明人根據(jù)WTl基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列，合成了各由7到30個連續(xù)的氨 基酸組成的多肽，它們每個含有據(jù)推測用作與HLA-A*2402或HLA-A*0201結(jié)合的錨定氨 基酸的至少一個氨基酸，驗證了這些肽與HLA-A*2402或HLA-A*0201的結(jié)合(這些肽是 HLA-A*2402-或HLA_A*0201-限制性的)，并發(fā)現(xiàn)肽與HLA_A*2402或HLA_A*0201的結(jié)合誘 導(dǎo)了 CTLs，引起了對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答(在下文中簡稱為CTL應(yīng)答)。根據(jù)該事實，這 些肽被鑒定為源自于WTl基因表達(dá)產(chǎn)物(WT蛋白)的CTL表位。目前，鑒定到了只針對HLA-A*2402和HLA_A*0201 (參見專利文獻(xiàn)3)、 HLA-A*3303(參見專利文獻(xiàn)4)或HLA_A*1101 (參見專利文獻(xiàn)5)的WTl特異性CTL表位。 已證實，由上述文獻(xiàn)公開的多肽誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答受HLA-A*2402、HLA-A*0201、HLA-A*3303和 HLA-A^l 101 限制。這表明了腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物是有前途的腫瘤排斥抗原，也稱為腫瘤相 關(guān)抗原(TAA)的可能性。事實上，在健康獻(xiàn)血者的外周血中沒有觀察到高水平的WTl特異 性CTLs或高滴度抗WTl抗體，但是在癌癥患者的外周血中觀察到了。但是，HLA類型的多樣性足以用作鑒定個體的標(biāo)志物。在HLAs中，I類MHC抗原被 分類為HLA-A、HLA-B和HLA-C，II類MHC抗原被分類為HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。每種類 別具有幾種抗原類型。每種HLA的抗原結(jié)合位點具有遺傳多態(tài)性。例如，已知HLA-A、HLA-B 和HLA-C分別具有27種或以上，59種或以上，以及10種或以上的多態(tài)性(等位基因)。因此，對于與除了 HLA-A*2402、HLA-A*0201、HLA-A*3303 和 HLA_A*1101 之外其他 類型的HLAs結(jié)合，并誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的癌抗原的鑒定，從而向更廣泛的對象使用免疫療法，存 在著需求。同時，在兩個文獻(xiàn)中報道了下列三種修飾的WTl肽WTl187PlY 肽(YLGEQQYSV ； SEQ ID NO 12), WTl126PlY 肽(YMFPNAPYL ； SEQ ID NO 35)(對于上述兩種肽參見專利文獻(xiàn)6)，以及WT1126P9M肽(RMFPNAPYM ；SEQ ID NO 52)(參 見專利文獻(xiàn)7)。此外，在歐洲專利No. 1127068的審查的書面論證中報道了下列兩種肽WT1126P2L肽(RLFPNAPYL ；SEQ ID NO 39)禾口 WT1126P2L&P9V肽(RLFPNAPYV ；SEQ ID NO :75)(參見非專利文獻(xiàn)7)。但是，從未報道這些WT1修飾肽是否可用作與除了 HLA-A*2402、HLA_A*0201、 HLA-A*3303和HLA_A*1101之外其他類型的HLAs結(jié)合，并誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的癌抗原。專利文獻(xiàn)1 JP-A 9-104629專利文獻(xiàn)2 JP-A 11-035484專利文獻(xiàn)3 :W0 00/06602單行本專利文獻(xiàn)4 日本專利申請No. 2006-045287專利文獻(xiàn)5 日本專利申請No. 2006-355356專利文獻(xiàn)6 :W0 2005/053618單行本專利文獻(xiàn)7 :W0 2007/016466單行本
非專利文獻(xiàn)1 =Gessler, M.等，Nature, vol. 343，pp. 774-778，1990非專利文獻(xiàn) 2 :Cur. Opin. Immunol.，vol. 5，p. 709，1993非專利文獻(xiàn) 3 :Cur. Opin. Immunol.，vol. 5，p. 719，1993非專利文獻(xiàn)4 :Cell, vol. 82，p. 13，1995非專利文獻(xiàn)5 Immunol. Rev.，vol. 146，p. 167，1995非專利文獻(xiàn)6 :Mol. Cell. Biol.，vol. 11，p. 1707，1991非專利文獻(xiàn)7 歐洲專利No. 1127068的審查的書面論證發(fā)明簡述本發(fā)明待解決的問題本發(fā)明的目標(biāo)是將用于患有惡性腫瘤、包括白血病的患者的癌癥治療和/或預(yù)防 方法，進(jìn)一步施用于HLA-A*0206陽性人員，該方法是基于腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物 (WTl蛋白)或其部分肽(WTl肽)。解決問題的手段為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果，他發(fā)現(xiàn)各自源自于人 類WTl蛋白，已知只誘導(dǎo)HLA-A*0201-限制性CTLs的WTl187肽(SLGEQQYSV)和WTl126肽 (RMFPNAPYL)，令人吃驚地也誘導(dǎo)HLA_A*0206-限制性CTLs。在已知只有在WO 00/06602單 行本中描述的肽是誘導(dǎo)HLA-A*0201限制性CTLs的WTl肽的情況下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)WTl187 肽的修飾的肽(也被稱為修飾的WTl187肽)和WTl126肽的修飾的肽(也被稱為WTl126修飾 肽)，也與HLA-A*0201分子結(jié)合。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，并完成了本發(fā) 明。SP，本發(fā)明涉及下列(1)到(17)。(1)用于人類白細(xì)胞抗原(HLA)_A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，包含腫瘤抑 制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽。(2)上述⑴的組合物，其中腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物是下列(a)或(b)的蛋 白(a)由SEQ ID NO=I的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，或(b)由在氨基酸序列(a)中包含一個到幾個氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白，它們中任何一個在HLA-A*0206陽性人員中是免疫原性的。(3)上述⑴的組合物，其中部分肽是WTl87 月太:Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(SEQ IDNO2),
WTl26 肽:Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO3),
WTl87PlF|i:Phe Leu Gly Glu Gln Gln TyrSerVal(SEQIDNO11)，
WTl87P2M 肽:Ser Met Gly Glu Gln Gln TyrSerVal(SEQIDNO16)，
WTl87P3M 肽:Ser Leu Met Glu Gln Gln TyrSerVal(SEQIDNO20)，
WTl26PIF 肽:Phe Met Phe Pro Asn Ala ProTyrLeu (SEQIDNO34)，
WTl26P2L 肽:Arg Leu Phe Pro Asn Ala ProTyrLeu (SEQIDNO39)，
WTl26P3M 肽:Arg Met Met Pro Asn Ala ProTyrLeu (SEQIDNO46)或
WTl26P9V 肽:Arg Met Phe Pro Asn Ala ProTyrVal(SEQIDNO49)。 (4)上述(1)到(3)的組合物，還包含佐劑。
(5)用于HLA_A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，含有編碼腫瘤抑制基因WTl的 蛋白產(chǎn)物或其部分肽的DNA。(6)用于HLA_A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，含有編碼腫瘤抑制基因WTl的 蛋白產(chǎn)物或其部分肽的RNA。(7)用于誘導(dǎo)WTl特異性CTLs的方法，包括在存在腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物 或其部分肽的情況下，培養(yǎng)源自于HLA-A*0206陽性人員的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，以獲 得從其誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs。(8)用于誘導(dǎo)呈遞腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽的樹突狀細(xì)胞的方 法，包括在存在蛋白產(chǎn)物或其部分肽的情況下培養(yǎng)源自于HLA-A*0206陽性人員的未成熟 樹突狀細(xì)胞，以獲得從其誘導(dǎo)的呈遞蛋白產(chǎn)物或其部分肽的樹突狀細(xì)胞。(9)用于HLA_A*0206陽性人員的癌癥診斷方法，包括i)在來自HLA_A*0206陽性人員的樣品中檢測或定量腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn) 物或其部分肽、針對它們的抗體或WTl特異性CTLs的步驟，以及將蛋白產(chǎn)物或其部分肽、針 對它們的抗體或WTl特異性CTLs的量，與沒有發(fā)生癌癥情況下的量進(jìn)行比較的步驟，或ii)向HLA_A*0206陽性對象給藥通過上述(7)中提到方法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs 或通過上述(8)中提到的方法誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的步驟，以及確定CTLs或樹突狀細(xì)胞在 HLA-A*0206陽性對象中的位置或區(qū)域的步驟。(10)用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物，包含下列肽WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126 肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們?nèi)我环N都 是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是免疫原性 的。(11)上述(10)的組合物，其中修飾肽是WTl187PlF 肽:Phe Leu Gly Glu Gln GlnTyrSerVal(SEQIDNO11),
WT1187P2M 肽:Ser Met Gly Glu Gln GlnTyrSerVal(SEQIDNO16),
WT1187P3M 肽:Ser Leu Met Glu Gln GlnTyrSerVal(SEQIDNO20),
WTl126PlF 肽:Phe Met Phe Pro Asn AlaProTyrLeu (SEQIDNO34),
WT1126P2L 肽:Arg Leu Phe Pro Asn AlaProTyrLeu (SEQIDNO39),
WT1126P3M 肽:Arg Met Met Pro Asn AlaProTyrLeu (SEQIDNO46)或
WT1126P9V 肽:Arg Met Phe Pro Asn AlaProTyrVal(SEQIDNO49)。(12)治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向HLA_A*0206陽性人員給藥含有腫瘤抑制基 因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽的組合物。(13)腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽，用于在HLA_A*0206陽性人員中治
療或預(yù)防癌癥。(14)治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向HLA_A*0201陽性人員給藥含有下列肽的組 合物WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126 肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們?nèi)魏我环N 都是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是免疫原
7性的。(15)下列肽WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126 肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們?nèi)魏我环N 都是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是免疫原 性的，用于在HLA_A*0201陽性人員中治療或預(yù)防癌癥。(16)治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將編碼腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分 肽的RNA導(dǎo)入HLA-A*0206陽性人員的樹突狀細(xì)胞。(17)編碼腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽的RNA，用于在HLA_A*0206陽 性人員中治療或預(yù)防癌癥。本發(fā)明還涉及腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽在生產(chǎn)用于在 HLA-A*0206陽性人員中治療或預(yù)防癌癥的癌癥疫苗組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及使用下列肽WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126 肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們?nèi)魏我环N 都是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是免疫原 性的，來生產(chǎn)用于在HLA_A*0201陽性人員中治療或預(yù)防癌癥的癌癥疫苗組合物。本文使用的“癌癥疫苗組合物”是指通過接種或給藥于動物、包括人類，用來預(yù)防 或治療癌癥的藥物?！爸委煛背送耆斡膊顟B(tài)之外，還指通過將癥狀的發(fā)展和/或惡 化抑制到某種盡管沒有完全治愈的程度，來中止疾病狀態(tài)的發(fā)展；或在朝向治愈的方向上 改進(jìn)所有或部分疾病狀態(tài)。“預(yù)防”是指阻止、抑制或延遲疾病的發(fā)生。下列術(shù)語源自于HLA_A*0206陽性或HLA_A*0201陽性人員的外周血單核細(xì)胞、 未成熟樹突狀細(xì)胞、WTl特異性CTLs、樣品等，是指分別從HLA-A*0206陽性或HLA_A*0201 陽性人員分離或收集的外周血單核細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、WTl特異性CTLs、生物學(xué)樣本 等，例如血液。源自于HLA-A*0206陽性或HLA_A*0201陽性人員的WTl特異性CTLs，也包括 從HLA-A*0206陽性或HLA_A*0201陽性人員分離或收集的外周血單核細(xì)胞、未成熟樹突狀 細(xì)胞或生物學(xué)樣本例如血液誘導(dǎo)的CTLs。本發(fā)明的效果本發(fā)明能夠在HLA_A*0206陽性對象中體內(nèi)和體外誘導(dǎo)WTl特異性CTLs。盡管 使用含有WTl蛋白或WTl肽的疫苗進(jìn)行免疫治療的對象通常限于HLA-A*0201陽性患者和 HLA-A*2402陽性患者，但本發(fā)明可以將對象的范圍拓寬到HLA_A*0206陽性患者。HLA-A2， 這是I類HLA抗原的一種血清型，在高加索人中頻率最高(大約50% )，并且絕大多數(shù)具 有HLA-A*0201，而只有大約4 %的高加索人具有HLA_A*0206。另一方面，HLA-A24是日 本人中頻率最高的血清型(大約58% )，絕大多數(shù)具有HLA-A*2402。大約42%的日本 人具有HLA-A2。在他們當(dāng)中，只有大約43 %具有HLA_A*0201，其他人具有HLA_A*0206 或HLA-A*0207。換句話說，大約18%的日本人具有HLA_A*0201，大約17%的日本人具有 HLA-A*0206。因此，從日本人中鑒定到至少HLA_A*0206限制性CTL表位以及HLA_A*0201限制性CTL表位這個事實，對于將癌癥免疫療法的對象拓寬到HLA-A*0206陽性人員來說是 非常有用的。因為14%的中國人和9%的南朝鮮人具有該等位基因，因此有可能將本發(fā)明 的癌癥疫苗組合物應(yīng)用于更廣泛的對象。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物用于治療表達(dá)WTl的癌癥例如造血腫瘤和HLA_A*0206 陽性人員中的實體癌癥。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物也可用于在HLA-A*0206陽性人員中預(yù) 防癌癥的發(fā)生。


圖1顯示了從HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs誘導(dǎo)的WTl187肽特異性CTLs 的細(xì)胞毒性活性。圖Ia顯示了針對51Cr標(biāo)記的B-LCLs的細(xì)胞毒性活性。圖Ib顯示了針 對51Cr標(biāo)記的自體B-LCLs的細(xì)胞毒性活性隨著用于脈沖PBMCs的WTl187肽的濃度平行地 增加。圖2顯示了從HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs誘導(dǎo)的WTl187肽特異性CTLs 的細(xì)胞毒性活性。圖2a和2b分別顯示了從圖Ia的獻(xiàn)血者之外的兩個健康獻(xiàn)血者獨立獲 得的CTLs針對51Cr標(biāo)記的B-LCLs的細(xì)胞毒性活性。圖3a顯示了 WTl187肽特異性CTLs針對用WTl基因轉(zhuǎn)化的B_LCLs，或用模擬載體 轉(zhuǎn)化的B-LCLs的細(xì)胞毒性活性。圖3b顯示了 WTl187肽特異性CTLs針對0206K562細(xì)胞、 K562細(xì)胞、KH88細(xì)胞或JY細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。圖4顯示了 I類和/或II類HLA抗體對WTl187肽特異性CTLs的細(xì)胞毒性活性的 抑制。圖5顯示了從HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs誘導(dǎo)的WTl126肽特異性CTLs 針對51Cr標(biāo)記的B-LCLs的細(xì)胞毒性活性。圖6a和6b分別顯示了從兩個不同供體獨立誘導(dǎo)的WTl126肽特異性CTLs針對 0206K562細(xì)胞、K562細(xì)胞、KH88細(xì)胞或JY細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。圖7顯示了用與WTl126肽結(jié)合的HLA四聚體和抗⑶8抗體染色的CTLs的流式細(xì) 胞分析結(jié)果。CTLs通過用修飾的肽刺激來自HLA-A*0201陽性供體1的PBMCs進(jìn)行誘導(dǎo)。圖8顯示了通過用WTl126PlF肽刺激來自HLA-A*0201陽性供體1的PBMCs而誘導(dǎo) 的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖9顯示了通過用WT1126P2L肽刺激來自HLA-A*0201陽性供體1的PBMCs而誘導(dǎo) 的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖10顯示了用與WTl126肽結(jié)合的HLA四聚體和抗⑶8抗體染色的CTLs的流式細(xì) 胞分析結(jié)果。CTLs通過用WT1126P2L肽刺激來自HLA-A*0201陽性供體2的PBMCs進(jìn)行誘導(dǎo)。圖11顯示了通過用WT1126P2L肽刺激來自供體2的PBMCs而誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞 毒性活性的測量結(jié)果。圖12顯示了通過用修飾的WTl126肽刺激來自HLA-A*0206陽性供體3的PBMCs而 誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖13顯示了通過用WT1126P9V肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體3的PBMCs而誘 導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。
圖14顯示了通過用修飾的WTl126肽刺激來自HLA-A*0206陽性供體4的PBMCs而 誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖15顯示了通過用修飾的WTl126肽刺激來自HLA-A*0206陽性供體4的PBMCs而 誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖16顯示了通過用修飾的WTl187肽刺激來自HLA_A*0201陽性供體的PBMCs而誘 導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖17顯示了通過用WTl187PlF肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體的PBMCs而誘導(dǎo) 的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖18顯示了通過用WT1187P2M肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體的PBMCs而誘導(dǎo) 的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖19顯示了對修飾的WTl187肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖20顯示了對修飾的WTl187肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖21顯示了對修飾的WTl187肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖22顯示了對修飾的WTl187肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖23顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖24顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖25顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖26顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖27顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖28顯示了對修飾的WTl187肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖29顯示了對修飾的WTl187肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖30顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖31顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。圖32顯示了對修飾的WTl126肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果。本發(fā)明的最佳實施方式在下文中，將對本發(fā)明進(jìn)行說明。當(dāng)在本說明書和附圖中對氨基酸殘基進(jìn)行縮寫時，使用下面的編碼。Ala或A 丙氨酸殘基Arg或R 精氨酸殘基Asn或N:天冬酰胺殘基Asp或D 天冬氨酸殘基Cys或C:半胱氨酸殘基Gln或Q 谷氨酰胺殘基Glu或E 谷氨酸殘基Gly或G 甘氨酸殘基His或H:組氨酸殘基Ile或I 異亮氨酸殘基Leu或L 亮氨酸殘基Lys或K:賴氨酸殘基
Met或M 甲硫氨酸殘基Phe或F:苯丙氨酸殘基Pro或P:脯氨酸殘基Ser或S:絲氨酸殘基Thr或T 蘇氨酸殘基Trp或W:色氨酸殘基Tyr或Y:酪氨酸殘基Val或V:纈氨酸殘基本發(fā)明的WTl蛋白可以是作為Wilms’腫瘤的致病基因分離到的鋅指類型的轉(zhuǎn)錄 因子的基因產(chǎn)物，能夠與HLA-A*0206分子結(jié)合，從而用作惡性腫瘤的靶抗原的基因產(chǎn)物。 更具體來說，本發(fā)明的WTl蛋白優(yōu)選為由449個氨基酸組成的人類WTl蛋白(序列列表SEQ ID NO :1)，或由在人類WTl蛋白的氨基酸序列中含有一個到幾個氨基酸(優(yōu)選大約2到6 個氨基酸)的缺失、取代或添加的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，并且它在HLA-A*0206陽性人員 中是免疫原性的。用于添加或取代的氨基酸除了 20種基因編碼的氨基酸之外，可以是非天 然氨基酸。WTl蛋白的部分肽(WTl肽)是指由構(gòu)成WTl蛋白的一部分氨基酸序列組成的肽。 WTl肽可以是由8到12個、優(yōu)選8到9個源自于WTl蛋白的氨基酸組成，并與HLA_A*0206 分子結(jié)合從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的肽。特別優(yōu)選的是WTl187肽(Ser Leu Gly Glu Gln Gln TyrSer Val ；SEQ ID NO 2)或 WTl126 肽(Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro TyrLeu ；SEQ ID NO 3)，二者都描述在WO 00/06602單行本中。包含了 WTl肽的一個或幾個氨基酸的缺失、取代或添加的修飾的肽，也可以用作 本發(fā)明的WTl肽，只要它在HLA-A*0206陽性人員中是免疫原性的。這樣的修飾的肽的例子 包括修飾的WTl187肽和修飾的WTl126肽。修飾的WTl187肽優(yōu)選是從N-末端起第4到8位上含有與WTl187肽在相應(yīng)位置上具 有的相同的氨基酸殘基(EQQYS)的肽，更優(yōu)選是從N-末端起第4到9位上含有與WTl187肽 在相應(yīng)位置上具有的相同的氨基酸殘基(EQQYSV)的肽。這樣的修飾的WTl187肽優(yōu)選是由 任何下列SEQ ID NO 4到26和54到62的氨基酸序列組成的肽。
0152]WTl1S7PlG 肽(GLGEQQYSVSEQIDNO4)0153]WTl1S7PlA 肽(ALGEQQYSVSEQIDNO5)0154]WTl1S7PlV 肽(VLGEQQYSVSEQIDNO6)0155]WTl1S7PlL 肽(LLGEQQYSVSEQIDNO7)0156]WTl1S7PlI 肽(ILGEQQYSVSEQIDNO8)0157]WTl1S7PlM 肽(MLGEQQYSVSEQIDNO9)0158]WTl1"Piw 肽(WLGEQQYSVSEQIDNO10)0159]WTl1S7PlF 肽(FLGEQQYSVSEQIDNO11)0160]WTl1S7PlY 肽(YLGEQQYSVSEQIDNO12)0161]WTl1s7P2V 肽(SVGEQQYSVSEQIDNO13)0162]WTl1B7P2Q 肽(SQGEQQYSVSEQIDNO14)0163]WTl1s7P2I 肽(SIGEQQYSVSEQIDNO15)
WTl1;7P2M 肽(SMGEQQYSVSEQIDNO16)
WTl1打P3L肽(SLLEQQYSVSEQIDNO17)
WTl1,7P3A 肽(SLAEQQYSVSEQIDNO18)
WTl1,7P3V 肽(SLVEQQYSVSEQIDNO19)
WTl1譯肽(SLMEQQYSVSEQIDNO20)
WTl1,7P3P 肽(SLPEQQYSVSEQIDNO21)
WTl1打P3W肽(SLWEQQYSVSEQIDNO22)
WTl1,7P3F 肽(SLFEQQYSVSEQIDNO23)
WTl1,7P3Y 肽(SLYEQQYSVSEQIDNO24)
WTl1,7P3S 肽(SLSEQQYSVSEQIDNO25)
WTl1,7P3I 肽(SLIEQQYSVSEQIDNO26)
WTl1打P9L肽(SLGEQQYSLSEQIDNO53)
WTl1uPlD 肽(DLGEQQYSVSEQIDNO54)
WTl1S7PlE 肽(ELGEQQYSVSEQIDNO55)
WTl1uPlH 肽(HLGEQQYSVSEQIDNO56)
WTl1S7PlK 肽(KLGEQQYSVSEQIDNO57)
WTl1^PlN 肽(NLGEQQYSVSEQIDNO58)
WTl1uPlP 肽(PLGEQQYSVSEQIDNO59)
WTl1S7PlQ 肽(QLGEQQYSVSEQIDNO60)
WTl1S7PlR 肽(RLGEQQYSVSEQIDNO61)
WTl1WIT肽(TLGEQQYSVSEQIDNO62)
修飾的WTl126肽優(yōu)選是從N-末端起第4到8位上含有與WTl126肽在相應(yīng)位置上
具有的相同的氨基酸殘基(PNAPY)的肽。這樣的修飾的WTl126肽優(yōu)選是由任何下列SEQ ID
NO 27至丨―52和63到75的氨基酸序列組成的肽。
WTl26P1G 肽(GMFPNAPYLSEQIDNO27)
WTl26P1A 肽(AMFPNAPYLSEQIDNO28)
WTl26P1V 肽(VMFPNAPYLSEQIDNO29)
WTl26P1L 肽(LMFPNAPYLSEQIDNO30)
WTl26P1I 肽(IMFPNAPYLSEQIDNO31)
WTl26P1M 肽(MMFPNAPYLSEQIDNO32)
WTl26P1W 肽(WMFPNAPYLSEQIDNO33)
WTl26P1F 肽(FMFPNAPYLSEQIDNO34)
WTl26P1Y 肽(YMFPNAPYLSEQIDNO35)
WTl26P2V 肽(RVFPNAPYLSEQIDNO36)
WTl26P2Q 肽(RQFPNAPYLSEQIDNO37)
WTl26P2A 肽(RAFPNAPYLSEQIDNO38)
WTl26P2L 肽(RLFPNAPYLSEQIDNO39)
WTl26P2I 肽(RIFPNAPYLSEQIDNO40)
WTl26P3I 肽(RMIPNAPYLSEQIDNO41)
12
wtl26p3l 肽(rmlpnapylseqidno42)
wtl26p3g 肽(rmgpnapylseqidno43)
wtl26p3a 肽(rmapnapylseqidno44)
wtl26p3v 肽(rmvpnapylseqidno45)
wtl26p3m 肽(rmmpnapylseqidno46)
wtl26p3p 肽(rmppnapylseqidno47)
wtl26p3w 肽(rmwpnapylseqidno48)
wtl26p9v 肽(rmfpnapyvseqidno49)
wtl26p9a 肽(rmfpnapyaseqidno50)
wtl26p9i 肽(rmfpnapyiseqidno51)
wtl26p9m 肽(rmfpnapymseqidno52)
wtl26pid 肽(dmfpnapylseqidno63)
wtl26pie 肽(emfpnapylseqidno64)
wtl26pih 肽(hmfpnapylseqidno65)
wtl26p1k 肽(kmfpnapylseqidno66)
wtl26ρ1ν 肽(nmfpnapylseqidno67)
wtl26ρ1ρ 肽(pmfpnapylseqidno68)
wtl26piq 肽(qmfpnapylseqidno69)
wtl26p1s 肽(smfpnapylseqidno70)
wtl26p1t 肽(tmfpnapylseqidno71)
26p2i&p9i肽(rifpnapyi ；seq id no 72) 26p2i&p9v肽(rifpnapyv ；seq id no 73) 26p2l&p9i肽(rlfpnapyi seq id no 74) 26p2l&p9v肽(rlfpnapyv ；seq id no 75)
wtl wtl wtl wtl
尤其是，修飾的wtl187
肽優(yōu)選為 wtl187plf 肽(seq id no :11)，wt1187p2m 肽(seq id no :16)或 wt1187p3m肽(seq id no :20)，更優(yōu)選為 wtl187plf肽或 wt1187p2m肽，更優(yōu)選為 wt1187p2m 肽。修飾的 wtl126 肽優(yōu)選為 wtl126plf 肽(seq id no :34)，wt1126p2l 肽(seq id no :39),wtl126p3m|i (seq id no 46)或 wt1126p9v 肽(seq id no :49)，更優(yōu)選為 wt1126p2l 肽，wt1126p3m 肽或 wt1126p9v 肽，更優(yōu)選為 wt1126p9v 肽。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物中，wtl肽優(yōu)選為wtl187肽，wtl126肽，wtl187plf肽， wt1187p2m 肽，wt1187p3m 肽，wtl126plf 肽，wt1126p2l 肽，wt1126p3m 肽或 wt1126p9v 肽。更優(yōu)選 的是 wtl187 肽，wtl126 肽，wtl187plf 肽，wt1187p2m 肽，wt1126p2l 肽，wt1126p3m 肽或 wt1126p9v 肽。更優(yōu)選的是wtl187肽，wtl126肽，wt1187p2m肽或wt1126p9v肽。特別優(yōu)選的是wtl187肽或 wtl126 肽。wtl肽的衍生物也可以用作wtl肽。例如，wtl187或wtl126肽的衍生物可以由上面 提到的9個連續(xù)的氨基酸以及結(jié)合到其n和/或c末端的各種不同物質(zhì)的氨基酸序列形 成。各種不同的物質(zhì)可以是例如氨基酸、肽、其類似物等。這種與wtl187肽、wtl126肽或其修 飾的肽結(jié)合的物質(zhì)通過例如細(xì)胞內(nèi)加工等經(jīng)歷的體內(nèi)酶處理，最后產(chǎn)生了由上述的9個氨 基酸構(gòu)成的肽，并作為與hla-a*0206分子的復(fù)合物呈遞在細(xì)胞表面上。因此，可以在具有HLA-A*0206的患者中誘導(dǎo)WTl特異性CTL應(yīng)答。WTl肽可以通過在本技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的方法來制備，例如在《肽合成》 (Peptide Synthesis, Interscience，New York，1966)，《蛋白》(The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc.，New York，1976)，《月太合成》(Peptide synthesis, Maruzen Co.， LtcL ，1975)，《月太合成基石出禾口實驗》(Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co.，Ltd. 1985)，《藥物幵發(fā)續(xù)編》第 14 卷 1 太合成”(the Sequel to Development ofPharmaceuticals, Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa PublishingCompany，1991) 等中描述的肽合成方法。對于篩選WTl肽及其修飾的肽的方法來說，例如，優(yōu)選的方法包括在用肽單一刺 激的情況下，對某些具有HLA-A*0206的患者的PBMCs (外周血單核細(xì)胞)進(jìn)行IFN γ分析， 然后選擇顯示出良好響應(yīng)的肽，這種方法的優(yōu)點在于簡單。在本發(fā)明中，多核苷酸、例如編碼上述的在HLA_A*0206陽性人員中具有免疫原性 的WTl蛋白或WTl肽的DNA，也可以用作癌癥疫苗組合物的活性成分。也就是說，通過將編碼 WTl蛋白或WTl肽的多核苷酸插入到適合載體、優(yōu)選為表達(dá)載體中，然后將載體給藥到動物 包括人類中，可以在活的生物體內(nèi)產(chǎn)生癌癥免疫。多核苷酸的例子包括DNA、RNA等，優(yōu)選為 DNA或RNA。多核苷酸的堿基序列可以根據(jù)在HLA-A*0206陽性人員中具有免疫原性的WTl 蛋白或WTl肽的氨基酸序列來確定。多核苷酸可以通過已知的DNA或RNA合成方法、PCR方 法等來制備。這樣的用于HLA-A*0206陽性人員的、包含編碼WTl蛋白或WTl肽的DNA的癌 癥疫苗組合物，也是本發(fā)明的一個方面。WTl蛋白或WTl肽優(yōu)選為WTl肽，更優(yōu)選為WTl187 肽、WTl126肽或其修飾的肽，最優(yōu)選的是WTl187肽或WTl126肽。用于插入上述DNA的表達(dá)載 體沒有具體的限制。RNA不是必須插入到載體中，可以原樣用作組合物的活性成分。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物可以包含佐劑。佐劑沒有限制，只要在與用作抗原的WTl 蛋白或WTl肽一起或分別給藥后，它可以非特異性地增強對抗原的免疫應(yīng)答就行。佐劑的 例子包括引起沉淀類型的佐劑和油狀佐劑。引起沉淀類型的佐劑的例子包括氫氧化鈉、氫 氧化鋁、磷酸鈣、磷酸鋁、明礬、PEPES和羧基乙烯基聚合物。優(yōu)選的油狀佐劑是可以形成微 膠粒、使得油包圍著抗原的水溶液的佐劑。其具體例子包括液體石蠟、羊毛脂、弗氏佐劑、 Montanide ISA-763AVG、MontanideISA-51、不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑。這些佐劑也 可以作為其中兩種或多種的混合物使用。優(yōu)選的是油狀佐劑。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物中佐劑的量沒有具體限制，只要能夠非特異性增強針對 抗原的免疫應(yīng)答就行。其量可以根據(jù)佐劑的種類等適合地選擇。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物可以口服或腸胃外(例如腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、 靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)等)給藥。在腸胃外給藥的情況下，活性成分、即WTl蛋白或WTl肽，也可以通 過將疫苗組合物施加到皮膚，或通過在皮膚上黏貼含有疫苗組合物的貼片，經(jīng)皮吸收。本發(fā) 明的疫苗組合物也可以通過吸入等給藥。疫苗組合物優(yōu)選腸胃外給藥，更優(yōu)選皮內(nèi)或皮下 給藥。皮內(nèi)或皮下給藥的身體部位優(yōu)選為例如上臂等。依賴于給藥途徑，本發(fā)明的癌癥疫苗組合物可以采用各種不同的劑型，其示例性 劑型包括固體制劑和液體制劑。癌癥疫苗組合物可以采取例如用于口服的內(nèi)用固體或液體 制劑，用于腸胃外給藥的注射劑等的形式。用于口服的內(nèi)用固體制劑的例子包括片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑和顆粒劑。
為了制備內(nèi)用固體制劑，WTl蛋白或WTl肽不用處理，與添加劑混合，或成粒(按 照例如攪拌成粒，流化床成粒，干法成粒，旋轉(zhuǎn)攪拌流化床成粒等)，然后按照通常的方法進(jìn) 行加工。例如，膠囊劑可以通過囊封等制備，片劑可以通過制片等制備。在固體制劑中可以 適當(dāng)?shù)負(fù)饺胍环N或兩種或以上的添加劑。添加劑的例子包括賦形劑例如乳糖、甘露糖醇、 葡萄糖、微晶體纖維素和玉米淀粉；黏合劑例如羥丙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮和偏硅酸鋁 鎂；分散劑例如玉米淀粉；崩解劑例如羧甲基纖維素鈣；潤滑劑例如硬脂酸鎂；增溶劑例如 谷氨酸和天冬氨酸；穩(wěn)定劑；水溶性聚合物包括纖維素，例如羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖 維素和甲基纖維素，以及合成的聚合物例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇；以及甜 味劑例如白糖，糖粉，蔗糖，果糖，葡萄糖，乳糖，還原麥芽糖糖漿(麥芽糖醇糖漿)，還原麥 芽糖糖漿粉(麥芽糖醇糖漿粉)，高葡萄糖玉米漿，高果糖玉米漿，蜂蜜，山梨糖醇，麥芽糖 醇，甘露糖醇，木糖醇，赤蘚糖醇，阿斯巴甜，糖精和糖精鈉。如果需要，顆?；蚱瑒┛梢杂冒鼘觿┑雀采w，可以用兩個或多個層覆蓋。包層劑的 例子包括白糖，明膠，羥丙基纖維素和鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素。膠囊可以通過將活性 成分與普侖司特水合物和從上述賦形劑適合地選擇的賦形劑混合，可選地將混合物成粒， 以及可選地用包層劑覆蓋獲得的顆粒，然后進(jìn)行膠囊填充，來制備?？蛇x地，膠囊可以通過 向適合的膠囊基材(明膠等)添加甘油、山梨糖醇等以增加其塑性，然后用獲得的基材囊封 活性成分，來制備。如果需要，可以向膠囊基材添加著色劑或防腐劑(二氧化硫；以及對羥 基苯甲酸酯例如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯)。膠囊包括硬 膠囊和軟膠囊。用于口服的內(nèi)用液體制劑的例子包括水，懸液/乳液，糖漿，在使用前溶解的制劑 例如干糖漿，以及酏劑。為了制備內(nèi)用的液體制劑，將WTl蛋白或WTl肽溶解、懸浮或乳化 在常用于內(nèi)用液體制劑的稀釋劑中。稀釋劑的例子包括純水，乙醇及其混合物。液體制劑 可以進(jìn)一步包含潤濕劑，懸浮劑，乳化劑，甜味劑，調(diào)味劑，香料，防腐劑或緩沖劑。干糖漿可 以通過例如將活性成分與普侖司特水合物和附加成分例如白糖、糖粉、蔗糖、果糖、葡萄糖 和乳糖混合，來制備。干糖漿也可以常用的方式制成顆粒。用于腸胃外給藥的劑型的例子包括注射劑、軟膏、凝膠、霜劑、貼片、氣溶膠和噴霧 劑。優(yōu)選的是注射劑。例如，注射劑優(yōu)選包含帶有WTl蛋白或WTl肽的常規(guī)載體。用于腸胃外給藥的注射劑可以是水性注射劑或油狀注射劑。水性注射劑可以按照 已知方法制備，例如通過向水性溶劑(用于注射的水，純水等)適當(dāng)?shù)靥砑涌伤幱锰砑觿┮?制成溶液，將WTl蛋白或WTl肽與溶液混合，使用濾器等對獲得的混合物進(jìn)行過濾除菌，然 后將得到的濾液裝填無菌容器?？伤幱锰砑觿┑睦影ㄉ厦嫣岬降淖魟?；等滲劑例如氯 化鈉，氯化鉀，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖和丙二醇；緩沖劑例如磷酸鹽 緩沖溶液，乙酸鹽緩沖溶液，硼酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液，檸檬酸鹽緩沖溶液，TriS緩 沖溶液，谷氨酸鹽緩沖溶液和ε _氨基己酸鹽溶液；防腐劑例如對羥基苯甲酸甲酯，對羥基 苯甲酸乙酯，對羥基苯甲酸丙酯，對羥基苯甲酸丁酯，氯代丁醇，苯甲醇，苯扎氯銨，脫氫乙 酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，硼酸和硼砂；增稠劑例如羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯醇和 聚乙二醇；穩(wěn)定劑例如亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸和二 丁基羥基甲苯；以及ρΗ調(diào)節(jié)劑例如鹽酸，氫氧化鈉，磷酸和乙酸。注射劑可以進(jìn)一步含有適 合的增溶劑，其例子包括醇類例如乙醇；多元醇例如丙二醇和聚乙二醇；以及非離子表面活性劑例如聚山梨酸酯80，聚氧乙烯氫化蓖麻油50，溶血卵磷脂和普盧蘭尼克(pluronic) 多元醇。此外，蛋白例如牛血清白蛋白和匙孔血藍(lán)蛋白，多糖例如氨基葡聚糖等，可以包含 在注射劑中。為了制備油狀注射劑，使用例如芝麻油或大豆油作為油性溶劑，作為增溶劑可 以混合有苯甲酸芐酯或苯甲醇。制備的注射劑通常儲存在適合的安瓿、玻璃小瓶等中。液 體制劑例如注射劑，也可以通過低溫保存或冷凍干燥來去除水分和保存。冷凍干燥的制備 物可以在使用前通過將它們復(fù)溶在添加的注射用蒸餾水等中，以備使用。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物的另一種劑型可以是含有WTl蛋白或WTl肽的脂質(zhì)體， 如果需要，多糖和/或其他成分可以混合在癌癥疫苗組合物中。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物的劑量，隨著使用的WTl蛋白、WTl肽或DNA的種類，患 者的年齡和體重，待治療的疾病等而變化。例如，在疫苗組合物含有WTl肽、例如WTl187肽或 WTl126肽的情況下，每日劑量以WTl肽的量計，優(yōu)選為大約0. lyg/kg bw到lmg/kg bw。WTl 肽的劑量通常為0. OOOlmg到IOOOmg,優(yōu)選為0. Olmg到IOOOmg,更優(yōu)選為0. Img到IOmgo 該量優(yōu)選在幾天到幾個月內(nèi)一次給藥。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物是用于HLA_A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物。用作 選擇HLA-A*0206陽性人員的標(biāo)準(zhǔn)的HLA類型，可以從例如供體的外周血測定。測定HLA類 型的方法的例子包括已知方法，例如DNA分型方法，例如SBT (基于測序的分型)方法或SSP 方法，以及HLA分型方法。在SBT方法中，將PCR擴(kuò)增的DNA的堿基序列與已知等位基因的 堿基序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以精確鑒定HLA基因類型。在SSP方法中，在使用各種不同的特異 性針對相應(yīng)HLA等位基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，然后進(jìn)行電泳以檢查陽性條帶。因此，可 以鑒定HLA基因類型。當(dāng)本發(fā)明的癌癥疫苗組合物已被給藥到HLA_A*0206陽性人員中時，疫苗組合 物中的HLA-A*0206限制性WTl蛋白或WTl肽，或從疫苗組合物中的DNA或RNA表達(dá)的 WTl蛋白或WTl肽，結(jié)合到HLA-A*0206陽性人員的抗原呈遞細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞)表面上 的HLA-A*0206分子上。這誘導(dǎo)了特異性抗腫瘤免疫，即WTl特異性CTLs，其破壞對象 (HLA-A*0206陽性人員)中的癌細(xì)胞。這種抗腫瘤免疫可以通過例如WTl特異性CTL應(yīng) 答、針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(例如51Cr釋放細(xì)胞毒性試驗)等來檢查。例如，各由來 自WTl蛋白的9個氨基酸組成，并已被報道能夠誘導(dǎo)WTl特異性CTL應(yīng)答的HLA-A*0201 限制性WTl187肽和WTl126肽，能夠誘導(dǎo)HLA-A*0206限制性應(yīng)答。大約17 %的日本人是 HLA-A*0206陽性的，而幾乎同樣比例的是HLA_A*0201陽性的。在下面的實施例1到5中， 從三個HLA-A*0206陽性獻(xiàn)血者的PBMCs制備了 WTl187肽特異性CTLs。誘導(dǎo)的CTLs對表 達(dá)WTl的HLA-A*0206陽性的白血病細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性效應(yīng)。因為WTl187肽和WTl126肽 特異性CTL的活性可以被抗I類HLA抗體抑制，因此發(fā)現(xiàn)了活性由I類HLA限制性的CTLs 表現(xiàn)。包含WTl187肽和/或WTl126肽或其修飾的肽的WTl蛋白或WTl肽，可以作為疫苗用 于HLA-A*0206陽性癌癥患者以及HLA_A*0201陽性癌癥患者。因此，基于WTl蛋白或WTl 肽的、用于患有惡性腫瘤例如造血腫瘤和實體癌癥的患者的免疫療法，可以進(jìn)一步應(yīng)用于 HLA-A*0206陽性癌癥患者。包括將本發(fā)明的癌癥疫苗組合物給藥到HLA_A*0206陽性人員 中的HLA-A*0206陽性人員中治療和/或預(yù)防癌癥的方法是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案之一。在HLA_A*0206陽性人員中，本發(fā)明的癌癥疫苗組合物可以用于治療和/或預(yù)防伴 隨有WTl基因表達(dá)增加的癌癥例如造血腫瘤例如白血病，骨髓增生異常綜合癥，多發(fā)性骨
16髓瘤和惡性淋巴瘤；以及實體癌癥例如胃癌，結(jié)腸癌，肺癌，乳腺癌，生殖細(xì)胞癌，肝癌，皮膚 癌，膀胱癌，前列腺癌，子宮癌，宮頸癌和卵巢癌。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物的示例性給藥方法是下述方法，包括從HLA_A*0206陽 性患者的外周血收集PBMCs，從PBMCs提取樹突狀細(xì)胞，用作為活性成分包含在本發(fā)明的癌 癥疫苗組合物中的肽例如WTl187肽或WTl126肽、或多核苷酸例如DNA或RNA對樹突狀細(xì)胞進(jìn) 行脈沖，以及通過皮下給藥等將樹突狀細(xì)胞返回到患者。用于使用WTl肽等脈沖樹突狀細(xì) 胞的條件沒有具體限制，只要能夠獲得本發(fā)明的效果就行，可以是常用的條件。在使用編碼WTl蛋白或WTl肽的RNA作為癌癥疫苗組合物的情況下，優(yōu)選給 藥組合物，使得RNA被導(dǎo)入到HLA-A*0206陽性人員的樹突狀細(xì)胞中。用于將RNA導(dǎo)入 HLA-A*0206陽性人員的樹突狀細(xì)胞中的示例性方法是下述方法，包括以與上述相同的方式 從HLA-A*0206陽性人員收集樹突狀細(xì)胞，以及使用電脈沖將RNA導(dǎo)入樹突狀細(xì)胞。在樹突 狀細(xì)胞中從導(dǎo)入的RNA表達(dá)的WTl蛋白或WTl肽，允許呈遞在其表面上。通過將用RNA脈沖 過的樹突狀細(xì)胞返回到HLA-A*0206陽性人員中，可以在活的生物體中快速產(chǎn)生癌癥免疫。 這樣的癌癥治療或預(yù)防方法，包括將編碼WTl蛋白或WTl肽的RNA導(dǎo)入HLA-A*0206陽性人 員的樹突狀細(xì)胞，是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案之一。本發(fā)明的另一個實施方案涉及通過在存在WTl蛋白或WTl肽的情況下，培養(yǎng)源自 于HLA-A*0206陽性人員的PBMCs，以獲得從其誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs，來誘導(dǎo)WTl特異 性CTLs的方法。PBMCs所源自的對象沒有具體限制，只要對象是HLA-A*0206陽性的就行。 WTl蛋白或WTl肽的例子包括WTl187肽、WTl126肽及其修飾的肽，優(yōu)選為WTl187肽和WTl126 肽。例如，可以通過在存在WTl187肽(或WTl126肽)的情況下培養(yǎng)源自HLA-A*0206陽性人 員的PBMCs，從PBMCs中的CTL前體細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTLs。用于源自HLA_A*0206陽性 人員的PBMCs的培養(yǎng)條件沒有具體限制，可以是常用的條件。這樣獲得的CTLs識別WTl187 肽(或WTl126肽)與HLA-A*0206分子的復(fù)合物。因此，通過使用本發(fā)明誘導(dǎo)的WTl特異性 CTLs，可以在HLA-A*0206陽性人員中特異性破壞高表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞，由此可以治療和 /或預(yù)防對象，即HLA-A*0206陽性人員中的造血腫瘤和實體癌癥。用于將這種WTl特異性 CTLs給藥到HLA-A*0206陽性對象中的方法沒有具體限制，例如可以與上述的癌癥疫苗組 合物給藥方法相同。本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于誘導(dǎo)WTl特異性CTLs的試劑盒，包含 HLA-A*0206限制性WTl蛋白或WTl肽作為基本組分。優(yōu)選情況下，試劑盒用于上面提到的 誘導(dǎo)源自于HLA-A*0206陽性人員的WTl特異性CTLs的方法。這樣的試劑盒可以包含例如 收集PBMCs的手段，佐劑和反應(yīng)容器，以及HLA-A*0206限制性WTl蛋白或WTl肽。利用試 劑盒，可以有效地誘導(dǎo)識別癌癥抗原例如WTl187肽和WTl126肽與HLA-A*0206分子的復(fù)合物 的WTl特異性CTLs。本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于誘導(dǎo)呈遞WTl蛋白或WTl肽的樹突狀細(xì)胞的方 法，方法通過在存在WTl蛋白或WTl肽的情況下，培養(yǎng)源自于HLA-A*0206陽性人員的未成 熟樹突狀細(xì)胞，來獲得從其誘導(dǎo)的呈遞WTl蛋白或WTl肽的樹突狀細(xì)胞。WTl蛋白或WTl肽 的例子包括WTl187肽、WTl126肽及其修飾的肽，優(yōu)選為WTl187肽和WTl126肽。未成熟樹突狀 細(xì)胞所源自的對象沒有具體限制，只要對象是HLA-A*0206陽性的就行。因為未成熟樹突狀 細(xì)胞存在于PBMCs等中，因此也可以將PBMCs在例如存在WTl187肽或WTl126肽的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。通過將這樣獲得的樹突狀細(xì)胞給藥于HLA-A*0206陽性人員，有效地誘導(dǎo)了上面提到 的WTl特異性CTLs，由此可以治療和/或預(yù)防對象中的造血腫瘤和實體癌癥。用于將這種 樹突狀細(xì)胞給藥到HLA-A*0206陽性對象中的方法沒有具體限制，例如可以與上述的癌癥 疫苗組合物的給藥方法相同。本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于誘導(dǎo)呈遞WTl蛋白或WTl肽的樹突狀細(xì)胞的試 劑盒，包含HLA-A*0206限制性WTl蛋白或WTl肽作為基本組分。優(yōu)選情況下，試劑盒用于 上面提到的用于誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的方法。這樣的試劑盒可以包含例如收集未成熟樹突狀細(xì) 胞和PBMCs的手段，佐劑和反應(yīng)容器，以及HLA-A*0206限制性WTl蛋白或WTl肽。利用試 劑盒，可以有效地誘導(dǎo)通過HLA-A*0206分子呈遞WTl蛋白或WTl肽的樹突狀細(xì)胞。HLA_A*0206陽性人員中的癌癥，可以利用下述物質(zhì)診斷(I)WTl蛋白或WTl肽，由上述方法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs，或由上述方法誘導(dǎo)的 樹突狀細(xì)胞，或(2)針對下列的抗體WT1蛋白或WTl肽，由上述方法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs，或 由上述方法誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞。這樣的癌癥診斷方法也是本發(fā)明的一個方面。在上述(1)中，癌癥診斷優(yōu)選使用 由上述方法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs進(jìn)行。WTl蛋白或WTl肽的例子包括WTl187肽、WTl126肽 及其修飾的肽，優(yōu)選為WTl187肽和WTl126肽。根據(jù)本發(fā)明，用于HLA_A*0206陽性人員的癌癥診斷的示例性方法，包括在來自 HLA-A*0206陽性人員的樣品中檢測或定量WTl蛋白或WTl肽、針對它們的抗體或WTl特異 性CTLs的步驟，以及將蛋白或其部分肽、針對它們的抗體或WTl特異性CTLs的量，與沒有 發(fā)生癌癥的情況下的量進(jìn)行比較的步驟。在癌癥患者樣品(例如血液)中，存在著從癌細(xì)胞釋放的WTl肽和/或WTl蛋白， 并且針對癌抗原的免疫應(yīng)答增強了。也就是說，癌癥患者樣品具有增加量的針對WTl肽或 WTl蛋白的抗體、WTl特異性CTLs等。因此，當(dāng)樣品中WTl肽或WTl蛋白、針對它們的抗體 或WTl特異性CTLs的量，與沒有發(fā)生癌癥情況下的量相比增加時，可能發(fā)生了癌癥?？贵w 的量可以通過例如ELISA方法測量。WTl特異性CTLs可以通過使用WTl多聚體、例如下面 描述的MHC四聚體的方法來檢測?？蛇x地，也可以通過將上述CTLs、樹突狀細(xì)或抗體與來自HLA_A*0206陽性對象的 樣品一起溫育，或?qū)⑸鲜鯟TLs、樹突狀細(xì)或抗體給藥到HLA-A*0206陽性對象中，然后確定 CTLs、樹突狀細(xì)胞或抗體的位置、區(qū)域、量等，來進(jìn)行癌癥診斷。因為CTLs和樹突狀細(xì)胞具 有聚集在癌細(xì)胞周圍的性質(zhì)，可以通過將CTLs或樹突狀細(xì)胞給藥到對象中，并檢測其位置 或區(qū)域，來進(jìn)行癌癥診斷。用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥診斷方法，包括將通過上述方 法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs或樹突狀細(xì)胞給藥到HLA-A*0206陽性對象中的步驟，以及確定 CTLs或樹突狀細(xì)胞在HLA-A*0206陽性對象中的位置或區(qū)域的步驟，也是本發(fā)明的一個方 也可以通過將CTLs或樹突狀細(xì)胞與來自HLA_A*0206陽性對象的樣品一起溫育以 允許它們反應(yīng)，加入針對CTLs或樹突狀細(xì)胞的抗體，繼續(xù)溫育，并通過與抗體結(jié)合的標(biāo)記 物等檢測或定量癌細(xì)胞和CTLs的抗體結(jié)合復(fù)合物、抗體結(jié)合的樹突狀細(xì)胞等，來進(jìn)行癌癥 的診斷。當(dāng)癌細(xì)胞和CTLs的抗體結(jié)合復(fù)合物或抗體結(jié)合的樹突狀細(xì)胞的量，與沒有發(fā)生癌癥的情況下的量相比增加時，可能發(fā)生了癌癥。上面提到的CTLs、樹突狀細(xì)胞或抗體可 以被標(biāo)記。標(biāo)記能夠使診斷有效地進(jìn)行。來自HLA-A*0206陽性對象的樣品的例子包括從 HLA-A*0206陽性人員獲得的生物學(xué)樣本，例如尿液、血液、組織提取液、唾液、淚液和其他體 液，血液是優(yōu)選的。使用上述WTl蛋白或WTl肽對HLA_A*0206陽性人員進(jìn)行癌癥診斷的方法的例子， 包括MHC四聚體分析、MHC五聚體分析和MHCdextramer分析，其中每種分析方法使用了 WTl 肽作為抗原。例如，在使用WTl187肽或WTl126肽作為抗原肽的MHC四聚體分析或MHC五聚體 分析中，可以使用MHC/WT1187肽復(fù)合物或MHC/WT1126肽復(fù)合物作為探針，在HLA-A*0206陽性 人員中檢測WTl特異性CTLs。因為癌癥患者顯示出WTl特異性CTLs的高表達(dá)，因此可以 通過測量HLA-A*0206陽性人員中WTl特異性CTLs的表達(dá)來診斷癌癥。因為癌癥患者顯示 出針對癌抗原的增強的免疫應(yīng)答，因此也可以通過在HLA-A*0206陽性人員中檢測針對WTl 蛋白或WTl肽的免疫應(yīng)答，來診斷癌癥。檢測免疫應(yīng)答的方法的例子包括通過ELISA測量 針對WTl蛋白或WTl肽的抗體的方法。這種使用腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物或其部分肽 對HLA-A*0206陽性人員進(jìn)行癌癥診斷的方法，也是本發(fā)明的一個方面。MHC四聚體分析和 MHC五聚體分析可以通過已知的方法，使用可商購試劑盒來進(jìn)行，例如“WT1四聚體”試劑盒 (Medical&Biological Laboratories,Co.，Ltd.) 0用于HLA_A*0206陽性人員的癌癥診斷也可以通過下述方法來進(jìn)行，方法包括將 來自HLA-A*0206陽性對象的樣品與針對下列物質(zhì)的抗體進(jìn)行反應(yīng)的步驟WT1蛋白或WTl 肽，由上述方法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs或由上述方法誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞；以及對抗體與 WTl蛋白或WTl肽的復(fù)合物、或抗體與WTl特異性CTLs或樹突狀細(xì)胞的復(fù)合物進(jìn)行檢測或 定量的步驟。當(dāng)抗體與WTl蛋白或WTl肽的復(fù)合物、或抗體與WTl特異性CTLs或樹突狀細(xì) 胞的復(fù)合物的量，與沒有發(fā)生癌癥的情況下的量相比增加時，可能發(fā)生了癌癥。針對樹突狀細(xì)胞的抗體的例子包括識別WTl肽/HLA_A*0206復(fù)合物的抗體。因為 這樣的抗體能夠識別WTl肽和HLA-A*0206分子，因此抗體可以識別通過I類HLA呈遞WTl 肽的樹突狀細(xì)胞。識別CTLs的WTl肽/HLA_A*0206/TCR (Τ細(xì)胞抗原受體)復(fù)合物的抗體，也可以用 作針對樹突狀細(xì)胞的抗體。這樣的抗體能夠識別樹突狀細(xì)胞與CTL的復(fù)合物，以及癌細(xì)胞 與CTL的復(fù)合物?？梢酝ㄟ^將這樣的抗體與來自HLA_A*0206陽性對象的樣品一起溫育以允許它們 形成復(fù)合物，并通過抗體發(fā)射的熒光對癌細(xì)胞和CTLs的抗體結(jié)合復(fù)合物、呈遞WTl肽的抗 體結(jié)合的樹突狀細(xì)胞等進(jìn)行檢測或定量，來進(jìn)行癌癥的診斷。當(dāng)癌細(xì)胞和CTLs的抗體結(jié)合 復(fù)合物、呈遞WT肽的抗體結(jié)合的樹突狀細(xì)胞等的量，與沒有發(fā)生癌癥的情況下的量相比增 加時，可能發(fā)生了癌癥。包括將含有WTl蛋白或WTl肽的組合物給藥到HLA_A*0206陽性人員中的治療或 預(yù)防癌癥的方法，也是本發(fā)明的一個方面。含有WTl蛋白或WTl肽的組合物及其優(yōu)選實施 方案，與對于上述癌癥疫苗組合物所描述的相同。使用WTl蛋白或WTl肽在HLA_A*0206陽性人員中治療或預(yù)防癌癥，及其在用于在 HLA-A*0206陽性人員中治療或預(yù)防癌癥的癌癥疫苗組合物的生產(chǎn)中的應(yīng)用，也是本發(fā)明的 一個方面。WTl蛋白或WTl肽及其優(yōu)選實施方案，與對于上述癌癥疫苗組合物所描述的相同。用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物，也是本發(fā)明的一個方面，該癌癥疫 苗組合物包含WTl187肽(SEQ ID NO 2)或WTl126肽(SEQ ID NO 3)的修飾的肽，其中任何 一個都是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中具有 免疫原性。修飾的WTl187肽或修飾的WTl126肽的例子，包括含有上述WTl187肽或WTl126肽的一 個或幾個氨基酸缺失、取代或添加的肽。修飾的WTl187肽優(yōu)選為在從N末端起第4到8位上 含有與WTl187肽在相應(yīng)位置上含有的相同的氨基酸殘基的肽。就此而言，修飾的肽優(yōu)選為上 述的 SEQ ID NOS 4 至Ij 12，15 禾口 16，18 至Ij 20 禾口 22 至Ij 25 的月太。WT1187P9L 肽(SLGEQQYSL ；SEQ ID NO 53)也是優(yōu)選的。修飾的WTl126肽優(yōu)選為在從N末端起第4到8位上含有與WTl126 肽在相應(yīng)位置上含有的相同的氨基酸殘基的肽。例如，優(yōu)選的是上述的SEQ ID N0S:27到 37和39到52的肽。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，上述的SEQ ID NOS 4到26和53到62的肽 可以用作修飾的WTl187肽，上述的SEQ ID NOS 27到52和63到75的肽可以用作修飾的 WTl126 肽。在 SEQ ID NOS :4 到 75 的修飾的肽中，除了 WTl187PlD 肽、WTl187PlE 肽、WTl187PlH 肽、WTl187PlP 肽和 WT1187P2Q 肽，以及 WTl126PlD 肽、WTl126PlE 肽、WTl126PlP 肽、WT1126P2A 肽和 WT1126P2Q肽之外的肽，都是優(yōu)選的。尤其是，修飾的WTl187肽優(yōu)選為WTl187PlF肽、WT1187P2M肽或WT1187P3M肽，更優(yōu)選 為 WTl187PlF 肽或 WTl 187P2M 肽。修飾的 WTl126 肽優(yōu)選為 WTl126PlF 肽、WT1126P2L 肽、WT1126P3M 肽或WT1126P9V肽，更優(yōu)選為WTl126PlF肽或WT1126P2L肽。 在HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原性的修飾的WTl187肽或WTl126肽的使 用量，與上述用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物中WTl肽的使用量相同。用 于HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物的其他成分及其優(yōu)選實施方案，與上述用于 HLA-A*0206陽性人員的疫苗組合物的相同。編碼上述在HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原性的修飾的WTl187肽或WTl126肽的 DNA和RNA，也可以用作用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物的活性成分。這樣的 用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物，也是本發(fā)明的一個方面。在用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物中除了上述DNA和RNA之外的其 他成分及其優(yōu)選實施方案，與上述用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物的相同。可以通過將PBMCs在上述HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原性的修飾的WT1187肽 或WTl126肽存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，從源自于HLA-A*0201陽性人員的PBMCs誘導(dǎo)WTl特異 性CTLs。這種誘導(dǎo)WTl特異性CTLs的方法也是本發(fā)明的一個方面。在HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原性的修飾的WTl187肽或WTl126肽的優(yōu)選實施 方案，與用于上述的用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物的相同?？梢酝ㄟ^將未成熟樹突狀細(xì)胞在上述HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原性的修 飾的肽存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，從源自于HLA-A*0201陽性人員的未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo) 呈遞修飾的WTl187肽或WTl126肽的樹突狀細(xì)胞。這種用于誘導(dǎo)呈遞修飾的WTl187肽或WTl126 肽的樹突狀細(xì)胞的方法，也是本發(fā)明的一個方面。修飾的肽的優(yōu)選例子與用于上述的用于 HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物的相同。
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可以通過使用在HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原性的修飾的WTl187肽或修飾 的WTl126肽、針對它們的抗體、由修飾的肽誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs或由修飾的肽誘導(dǎo)的樹 突狀細(xì)胞，在HLA-A*0201陽性人員中診斷癌癥。這種用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥診 斷方法，也是本發(fā)明的一個方面。用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥診斷方法及其優(yōu)選實施 方案，與上述的用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥診斷方法及其優(yōu)選實施方案相同。用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥診斷方法的例子包括MHC四聚體分析、MHC五 聚體分析和MHC dextramer分析，其中每種使用了在HLA_A*0201陽性人員中具有免疫原 性的修飾的WTl187肽或修飾的WTl126肽作為抗原。修飾的肽的優(yōu)選例子與用于上述的用于 HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物的相同。HLA_A*0201陽性人員中的癌癥可以通過使用針對下列物質(zhì)的抗體進(jìn)行診斷上 述的在HLA-A*0201陽性人員中具有免疫原性的修飾的WTl187肽或修飾的WTl126肽，由修飾 的肽誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs或由修飾的肽誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞。這種用于HLA-A*0201陽 性人員的癌癥診斷方法也是本發(fā)明的一個方面。修飾的肽的優(yōu)選例子與用于上述的用于 HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物的相同。用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥診斷方 法及其優(yōu)選實施方案，與上述用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥診斷方法及其優(yōu)選實施方 案相同。治療或預(yù)防癌癥的方法也是本發(fā)明的一個方面，所述方法包括向HLA_A*0201陽 性人員給藥含有下列肽的癌癥疫苗組合物
WTl187肽(SEQ ID NO 2)的修飾肽或WTl126肽(SEQ ID NO 3)的修飾肽，任何一個 都是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中具有免疫原性。修飾的肽的優(yōu)選例子與用于上述的用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物 的相同。癌癥疫苗組合物及其優(yōu)選實施方案與對于上述的用于HLA-A*0201陽性人員的疫 苗組合物所描述的相同。本發(fā)明涉及使用下述肽WTl187肽(SEQ ID NO 2)的修飾肽或WTl126肽(SEQ ID NO 3)的修飾肽，任何一個 都是腫瘤抑制基因WTl的蛋白產(chǎn)物的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中具有免疫 原性，用于在HLA_A*0201陽性人員中治療或預(yù)防癌癥，以及使用它們生產(chǎn)用于在 HLA-A*0201陽性人員中治療或預(yù)防癌癥的癌癥疫苗組合物。修飾的肽的優(yōu)選例子與用于上述的用于HLA_A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物 的相同。癌癥疫苗組合物及其優(yōu)選實施方案與對于上述的用于HLA-A*0201陽性人員的疫 苗組合物所描述的相同。
實施例下面，將通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明不限于此。在實施例中 的縮寫表示下列含義。合成的肽從SIGMA GENOSYSJAPAN購買。DCs 樹突狀細(xì)胞sPBMCs 外周血單核細(xì)胞
⑶分化簇(白細(xì)胞分化抗原)GM-CSF 粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子IL:白介素TNFa 腫瘤壞死因子-aPGE 前列腺素Gy 灰質(zhì)(gray)B-LCLs :B-類淋巴母細(xì)胞系EB 病毒:Epstein-Barr 病毒tBu 叔丁基Trt:三苯甲基Fmoc :9_芴基甲氧基羰基 實施例1 (能夠與WTl肽結(jié)合的HLA分子的預(yù)測)能夠與WTl187肽(SEQ ID NO 2)結(jié)合的HLA分子使用NetMHC2. 0服務(wù)器預(yù)測程序 進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果，能夠誘導(dǎo)WTl特異性CTLs的HLA_A*0201限制性WTl187肽，在與HLA_A*0206 分子的結(jié)合親和性方面，在NetMHC2. 0服務(wù)器預(yù)測程序(http://www. cbs. dtu. dk/ services/NetMHC-2. 0/)中排序高。實施例2 (從HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs制備WTl187肽特異性CTLs，以 及CTLs的細(xì)胞毒性試驗)(1)分離HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs，以及DCs的制備首先，從每個HLA_A*0206健康獻(xiàn)血者(三個人)的外周血通過Ficoll-Hypaque 密度梯度離心分離PBMCs。然后，使用抗人類⑶14磁性珠-DM(由Becton，Dickinson and company (BD)制造)，從PBMCs中篩選⑶14陽性細(xì)胞。在這種情況下，認(rèn)為在單核 細(xì)胞群體中存在大量CD14陽性細(xì)胞。將選擇的CD14陽性細(xì)胞在X-VIV015培養(yǎng)基(由 Bioffhittaker, ffalkersville, MD制造)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加有1 ν/ν %人類AB血清， 800IU/mL GM-CSF( Pepro Tech INC,Rocky ■1^了制造)和 1000叨/1^ IL_4(由 P印ro Tech INC制造)，以制備DCs。(2)自體成熟DCs的誘導(dǎo)將在上述(1)中制備的DC在37°C下培養(yǎng)1天，然后向含有DCs的培養(yǎng)孔添加含 有 10ng/mL TNFa (腫瘤壞死因子-α ；Pepro Tech INC,Rocky Hill,NJ) UOng/mL IL-β , 1000IU/mL IL-6和1 μ g/mL PGE2的成熟化細(xì)胞因子混合物。在37°C培養(yǎng)24小時后，獲得 了自體的成熟DCs。(3) WTl187肽特異性CTLs的誘導(dǎo)將自體成熟DCs用WTl187肽脈沖，使用30Gy輻射進(jìn)行輻照，并與從HLA_A*0206陽 性健康獻(xiàn)血者獲得的富含⑶8陽性T細(xì)胞的PBMCs共培養(yǎng)。DCs用WTl187肽的脈沖通過將 DCs在存在10 μ g/mL的WTl187肽的情況下在37°C培養(yǎng)30分鐘來進(jìn)行。使用⑶8微珠和MS 柱(由Miltenyi Biotec GmbH制造)從HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者富集⑶8陽性T細(xì)胞。從第二次刺激開始，已經(jīng)用肽脈沖然后用輻射輻照過的自體PBMCs被用作選擇性 刺激細(xì)胞。在第二次刺激后2天，向培養(yǎng)基中加入濃度分別為10IU/mL和lOng/mL的重組IL-2 (由 Shionogi&Co.，Ltd.提供)和 IL-7 (由 Pepro Tech INC 制造)。在第 4 次刺激 后，將細(xì)胞在37°C培養(yǎng)10天，然后使用離心機(jī)通過離心收集獲得的細(xì)胞(CTLs)。通過51Cr 釋放細(xì)胞毒性試驗檢測這些細(xì)胞(CTLs)針對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。(4)細(xì)胞毒性試驗細(xì)胞毒性試驗通過51Cr釋放細(xì)胞毒性試驗來進(jìn)行。51Cr釋放細(xì)胞毒性試驗如下進(jìn) 行。首先，將靶細(xì)胞(IX IO7細(xì)胞/mL)在存在IOOyL51CH比活性lmCi/ml)的情況下，在 添加有 10%胎牛血清的 RPMI1640 (由 NIHON PHARMACEUTICAL CO. ,LTD.制造)中，在 37°C 溫育1. 5小時，以便用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞。然后，將51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞添加到含有不同數(shù)量的 在上述(3)中獲得的CTLs(懸浮在IOOyL測定培養(yǎng)基中)的96孔圓底板的孔中，與CTLs 混合，然后在37°C溫育4小時。這些細(xì)胞被混合成使得E/T比例(細(xì)胞數(shù)比例)為1 1， 5 1，20 1或25 1，其中CTLs和51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞分別用“E”和“T”表示。在溫育 完成后，從每個孔收集100 μ L上清液。測定從標(biāo)記細(xì)胞釋放的51Cr的量，并基于51Cr的釋 放計算比裂解率(％ )。比裂解率(％ )按照下述方式計算。比裂解率(％)=(測試樣品的釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)XlOO在公式中，自發(fā)釋放的量是指在只含有靶細(xì)胞的孔中培養(yǎng)上清液的熒光量，最大 釋放量是指其中靶細(xì)胞已經(jīng)通過1質(zhì)量％的TritonX-IOO的處理完全裂解的培養(yǎng)基的熒光量。使用的靶細(xì)胞是B-LCLs、Κ562細(xì)胞，、JY細(xì)胞和ΚΗ88細(xì)胞，它們將在下面詳細(xì)描 述。ΚΗ88細(xì)胞與在下面實施例9中使用的KH880F8細(xì)胞相同。B-LCLs，通過從HLA_A*0206陽性獻(xiàn)血者獲得的外周血B淋巴細(xì)胞的EB病毒介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化而建立，不表達(dá)WTl。K562細(xì)胞，從慢性粒細(xì)胞性白血病急變期患者建立起來，是表達(dá)WT1、不表達(dá)I 類HLA的細(xì)胞系。本發(fā)明人不能獲得表達(dá)WTl的HLA-A*0206陽性的野生型白血病細(xì)胞 系。因此，也使用了用HLA-A*0206基因轉(zhuǎn)化K562細(xì)胞而制備的0206K562細(xì)胞。使用抗 HLA-A2抗體(克隆BB7. 2 ；由BD Biosciences Pharmingen制造)進(jìn)行的FACS分析顯示， 用HLA-A*0206基因轉(zhuǎn)化的0206K562細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)HLA_A*0206分子。Western印記分析顯示，用WTl基因轉(zhuǎn)化的B-LCL細(xì)胞表達(dá)WTl。用模擬載體轉(zhuǎn)化 的B-LCL細(xì)胞用作對照。JY細(xì)胞是通過EB病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化建立的不表達(dá)WTl的HLA_A*0206陰性B細(xì)胞系。KH88細(xì)胞是表達(dá)WTl的HLA_A*0206陰性白血病細(xì)胞系。每種細(xì)胞系在添加有10v/v%熱失活的胎牛血清、50IU/mL青霉素和50mg/mL鏈霉 素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(5)抗體和流式細(xì)胞術(shù)分析抗人類CD14、CD86、CD80、CD83和HLA-DR mAbs購自BD。DCs的濃度和成熟通過 使用上面列出的單克隆抗體(mAbs)分析細(xì)胞表面抗原來證實。樣品使用流式細(xì)胞術(shù)(FACS Calibur ；由BD制造)使用了 CellQest軟件進(jìn)行分析。(6)結(jié)果檢測了是否可以從HLA_A*0206陽性獻(xiàn)血者的PBMCs制備WTl187肽特異性CTLs。使
23用通過用WTl187肽脈沖的自體DCs或PBMCs重復(fù)地刺激來自HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的 富含⑶8陽性T細(xì)胞的PBMCs而獲得的CTLs，檢測了 WTl187肽特異性細(xì)胞毒性活性。CTLs 針對WTl187肽脈沖的自體B-LCL細(xì)胞，與針對非WTl187肽脈沖的B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更 強的細(xì)胞毒性活性(圖la)。在圖Ia中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過肽刺激 獲得的CTLs (效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(E/T比率)。實心三角形表示用 10 μ g/mL WTl187肽脈沖的細(xì)胞，實心正方形表示沒有用WTl187肽脈沖的細(xì)胞。從兩個不同 的HLA-A*0206陽性健康獻(xiàn)血者分離的PBMCs類似制備的CTLs，也顯示了與上述相同的細(xì)胞 毒性活性(圖2a和2b)。在圖2中，實心三角形表示用10yg/mL WTl187肽脈沖的細(xì)胞，封 閉的正方形表示沒有用WTl187肽脈沖的細(xì)胞。這些結(jié)果顯示出每種細(xì)胞毒性活性對WTl187 肽都是特異性的。CTLs的細(xì)胞毒性活性隨著用于脈沖DCs或PBMCs的WTl187肽的濃度平行地增加， 在肽濃度為0. 1 μ g/mL處達(dá)到平臺(圖lb)。WT1187肽比裂解的半最高濃度(半最高裂解值) 是大約5 X Kr5 μ g/mL。這顯示出CTLs的TCRs (T細(xì)胞抗原受體)對WTl187肽/HLA_A*0206 復(fù)合物的親和性相當(dāng)高。該結(jié)果有力地表明，使用WTl187肽誘導(dǎo)的CTLs能夠識別WTl187肽。按照與上述同樣的方式，使用通過用WT1187肽脈沖的DCs或PBMCs刺激來自 HLA-A*0206陽性獻(xiàn)血者的富含⑶8陽性T細(xì)胞的PBMCs而獲得的CTLs，檢測了針對外源表 達(dá)WTl的各種不同靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。結(jié)果顯示在圖3a和3b中。在圖3a和3b中顯 示的對于靶細(xì)胞的相應(yīng)細(xì)胞毒性活性是在同時測定的。圖3a顯示了 WTl187肽特異性CTLs 針對用WTl基因轉(zhuǎn)化的B-LCLs (表達(dá)WT1，HLA-A*0206陽性；實心三角形)或用模擬載體轉(zhuǎn) 化的B-LCLs (不表達(dá)WT1，HLA-A*0206陽性；實心正方形)的細(xì)胞毒性活性。圖3b顯示了 WTl187肽特異性CTLs針對0206K562細(xì)胞(表達(dá)WT1，HLA_A*0206陽性；實心正方形)、K562 細(xì)胞(表達(dá)WT1，HLA-A*0206陰性；空心正方形)、KH88細(xì)胞(表達(dá)WT1，HLA_A*0206陰性； 實心圓圈)或JY細(xì)胞(不表達(dá)WT1，HLA-A*0206陰性；實心三角形)的細(xì)胞毒性活性。CTLs針對用WTl轉(zhuǎn)化的B-LCLs (表達(dá)WT1，HLA_A*0206陽性)，與針對用模擬載 體轉(zhuǎn)化的B-LCLs (不表達(dá)WTl，HLA-A*0206陽性)相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖 3a)。此外，如圖3b中所示，CTLs針對用HLA-A*0206轉(zhuǎn)化的0206K562細(xì)胞(表達(dá)WTl， HLA-A*0206陽性)，與針對K562細(xì)胞(表達(dá)WT1，HLA_A*0206陰性)、KH88細(xì)胞(表達(dá)WTl， HLA-A*0206陰性)或JY細(xì)胞(不表達(dá)WT1，HLA_A*0206陰性)相比，顯示出更強的細(xì)胞毒 性活性。換句話說，CTLs針對表達(dá)WTl的HLA-A*0206陽性的靶白血病細(xì)胞顯示出顯著的 細(xì)胞毒性活性，但是針對不表達(dá)WTl的和/或HLA-A*0206陰性細(xì)胞不顯示細(xì)胞毒性活性。 該結(jié)果證明，在體外制備的WTl187肽特異性CTLs，對內(nèi)源表達(dá)WTl的例如白血病細(xì)胞并且 HLA-A*0206陽性的腫瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性活性。圖3b中的結(jié)果有力地表明，WTl187肽特 異性CTLs的細(xì)胞毒性活性受到I類HLA-A的限制。這是基于針對0206K562細(xì)胞比針對 K562細(xì)胞觀察到了更強的細(xì)胞毒性活性這一事實。上述結(jié)果證明了上面提到的培養(yǎng)的CTLs是WTl187肽特異性CTLs。每張圖的結(jié)果是典型的數(shù)據(jù)，基本上可以一定的偏差重現(xiàn)。實施例3 (驗證限制WTl187肽特異性CTLs的HLA的類型)檢驗了在實施例2中獲得的WTl187肽特異性CTLs的細(xì)胞毒性活性是否受I類HLA 的限制。在存在或不存在針對I類HLA或II類HLA WmAbs的情況下，進(jìn)行了 51Cr釋放細(xì)胞毒性試驗。使用自體B-LCLs作為靶細(xì)胞。在本實驗中，E/T比例是5 1。結(jié)果顯示在圖4中。圖4a顯示了使用B-LCLs (不表達(dá)WTl187, HLA_A*0206陽性) 作為靶細(xì)胞，在不存在針對I類HLA的mAbs (抗I類HLA mAbs)和針對II類HLA的mAbs (抗 II類HLA mAbs)的情況下進(jìn)行的試驗的結(jié)果。圖4b顯示了使用WTl187肽脈沖的B-LCLs (表 達(dá)WTl187，HLA-A*0206陽性)作為靶細(xì)胞，在不存在抗I類HLA mAbs和存在抗II類HLA mAbs的情況下進(jìn)行的試驗的結(jié)果。圖4c顯示了使用WTl187肽脈沖的B-LCLs (表達(dá)WTl187， HLA-A*0206陽性)作為靶細(xì)胞，在存在抗I類HLA mAbs和不存在抗II類HLA mAbs的情況 下進(jìn)行的試驗的結(jié)果。圖4d顯示了使用WTl187肽脈沖的B-LCLs (表達(dá)WTl187，HLA_A*0206 陽性)作為靶細(xì)胞，在不存在抗I類HLA mAbs和抗II類HLA mAbs的情況下進(jìn)行的試驗的 結(jié)果。如圖4中所示，WTl187肽特異性CTLs的細(xì)胞毒性活性被添加抗I類HLA抗體完全 抑制了，但是不被抗II類HLA抗體抑制。結(jié)果表明，正如預(yù)計的，WTl187肽特異性CTLs的細(xì) 胞毒性活性受到I類HLA的限制。實施例4 (針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗)使用在實施例2中獲得的WTl187肽特異性CTLs，在體外進(jìn)行了針對表達(dá)WTl的 HLA-A*0206陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗。細(xì)胞毒性試驗按照在實施例2中描述的51Cr釋 放細(xì)胞毒性試驗進(jìn)行。結(jié)果，WTl187肽特異性CTLs顯示出針對表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞 毒性活性(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例5 (制備WTl126肽特異性CTLs，以及CTLs的細(xì)胞毒性試驗)WTl126肽特異性CTLs按照與實施例2(3)中相同的方式制備，區(qū)別只是用WTl126 肽(SEQ ID NO :3)代替了 WTl187肽。細(xì)胞毒性試驗使用這些CTLs，按照與實施例2中相 同的方式進(jìn)行，測定了 WTl126肽特異性的細(xì)胞毒性活性。圖5顯示了從與圖2b中相同的 HLA-A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs誘導(dǎo)的WTl126肽特異性CTLs的細(xì)胞毒性活性。在圖5 中，實心三角形表示用10 μ g/mL WTl126肽脈沖的細(xì)胞，實心正方形表示沒有用WTl126肽脈沖 的細(xì)胞。CTLs針對WTl126肽脈沖的自體B-LCL細(xì)胞，與針對沒有用WTl126肽脈沖的B-LCL細(xì) 胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖5)。該結(jié)果顯示出CTLs的細(xì)胞毒性活性對WTl126 肽是特異性的。按照與實施例2中相同的方式，使用通過用WTl126肽脈沖的DCs或PBMCs刺激來 自HLA-A*0206陽性獻(xiàn)血者的富含⑶8陽性T細(xì)胞的PBMCs而制備的CTLs，檢測了針對各種 不同的內(nèi)源表達(dá)WTl的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。針對每種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性顯示在圖 6a和6b中。在圖6a和6b中的靶細(xì)胞是0206K562細(xì)胞(表達(dá)WT1，HLA_A*0206陽性；實 心正方形)、K562細(xì)胞(表達(dá)WTl，HLA-A*0206陰性；空心正方形)、KH88細(xì)胞(表達(dá)WTl， HLA-A*0206陰性；實心圓圈)和JY細(xì)胞(不表達(dá)WT1，HLA_A*0206陰性；實心三角形)。圖 6a顯示了從與圖2a中相同的HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的PBMCs誘導(dǎo)的WTl126肽特異 性CTLs的細(xì)胞毒性活性。圖6b顯示了從與圖2b中相同的HLA-A*0206陽性健康獻(xiàn)血者的 PBMCs誘導(dǎo)的WTl126肽特異性CTLs的細(xì)胞毒性活性。 與WTl187肽特異性CTLs相同，WTl126肽特異性CTLs對表達(dá)WTl的HLA_A*0206陽 性靶白血病細(xì)胞顯示出顯著的細(xì)胞毒性活性，但是對不表達(dá)WTl的和/或HLA-A*0206陰性 細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性活性。該結(jié)果證明，在體外制備的WTl126肽特異性CTLs，對內(nèi)源表達(dá)WTl
25的例如白血病細(xì)胞和HLA-A*0206陽性的腫瘤細(xì)胞，顯示出細(xì)胞毒性活性。圖6a和6b的結(jié) 果有力地表明，WTl126肽特異性CTLs的細(xì)胞毒性活性受到I類HLA-A的限制。這是基于針 對0206K562細(xì)胞比針對K562細(xì)胞觀察到了更強的細(xì)胞毒性活性這一事實。上述結(jié)果證明了獲得的CTLs是WTl126肽特異性CTLs。每張圖的結(jié)果是典型的數(shù)據(jù)，基本上可以以一定的偏差重現(xiàn)。實施例6 (疫苗組合物的制備)制備了下述癌癥疫苗組合物1到8。它們僅僅是本發(fā)明的癌癥疫苗組合物的例子。癌癥疫苗組合物1WTl187 肽3mgMontanide ISA-51400mg5%葡萄糖水溶液400mg將上述成分混合，混合物命名為癌癥疫苗組合物1。癌癥疫苗組合物2WTl187 肽ImgMontanide ISA-51400mg5%葡萄糖水溶液400mg將上述成分混合，混合物命名為癌癥疫苗組合物2。癌癥疫苗組合物3WTl187 肽0. OOlmgMontanide ISA-51400mg5%葡萄糖水溶液400mg將上述成分混合，混合物命名為癌癥疫苗組合物3。癌癥疫苗組合物4WTl187 肽IOmgMontanide ISA-51 400mg5%葡萄糖水溶液 400mg將上述成分混合，混合物命名為癌癥疫苗組合物4。癌癥疫苗組合物5到8癌癥疫苗組合物5到8按照與上述癌癥疫苗組合物1到4中相同的方式制備，不 同之處在于用WTl126肽代替WTl187肽。實施例7 (修飾的肽對HLA_A*0206分子的親和性)對于WTl187肽、WTl126肽和在從WTl187肽或WTl126肽的N末端起的第1、2、3或9位 上含有氨基酸取代的修飾的肽，使用NetMHC2. O服務(wù)器預(yù)測程序分析了對HLA_A*0206分子 的親和性。修飾的WTl187肽和修飾的WTl126肽的分析結(jié)果分別顯示在表1和2中。較小的 值(肽在較低濃度下具有結(jié)合能力)表示較高的親和性。表 1 表2 實施例8 (修飾的肽對HLA_A*0201分子的親和性)對于WTl187肽、WTI126肽和在從WTl187肽或WTl126肽的N末端起的第1、2、3或9位 上含有氨基酸取代的修飾的肽，使用NetMHC2. 0服務(wù)器預(yù)測程序分析了對HLA_A*0201分子 的親和性。修飾的WTl187肽和修飾的WTl126肽的分析結(jié)果分別顯示在表3和4中。較小的 值表示較高的親和性。表3
29 表 4 實施例9(由各種不同的修飾的WTl126肽誘導(dǎo)的HLA_A*0201限制性CTLs的比較)(1)目的根據(jù)實施例8 的結(jié)果，選擇了 WTl126P IF肽(SEQ ID NO 34)、WT1126P2L肽(SEQ ID NO 39)、WT1126P3M肽(SEQ ID NO 46)和 WT1126P9V肽(SEQ ID NO 49)作為待測試的修飾的 WTl126肽，并進(jìn)行了下列實驗以篩選能夠誘導(dǎo)具有高細(xì)胞毒性活性的CTLs的修飾的WTl126 肽。除非特別指明，在實施例9到12中使用的反應(yīng)試劑、培養(yǎng)基、實驗方法等，與實施例1 中相同。在實施例9到12中，除非特別指明，否則培養(yǎng)在37°C進(jìn)行。(2)材料與方法從顯示出表達(dá)HLA_A*0201分子的健康人類供體(HLA_A*0201陽性健康獻(xiàn)血者) 分離PBMCs，使用抗人類⑶14磁性粒-DM從PBMCs中分離⑶14陽性細(xì)胞。通過向補充有 lv/v%人類 AB 血清的 X-VIV015 培養(yǎng)基中添加 800IU/mL GM-CSF 和 1000IU/mL IL-4，制備 了培養(yǎng)基，并將CD14陽性細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。向上述培養(yǎng)物中添加含有 10ng/mL TNFa UOng/mL IL-β、1000IU/mL IL-6 和 1 μ g/mL PGE2的成熟化細(xì)胞因子混合物。在繼續(xù)培養(yǎng)1天后，獲得了自體的成熟DCs。將自體成熟DCs用10 μ g/mL在實施例13中獲得的WTl126修飾肽(WTl126PlF肽， WT1126P2L肽，WT1126P3M肽或WT1126P9V肽)脈沖，培養(yǎng)4小時，并用35Gy輻射進(jìn)行輻照。將 這樣獲得的細(xì)胞用作刺激細(xì)胞，用于CTL誘導(dǎo)。將用作應(yīng)答細(xì)胞的PBMCs (2 X IO6細(xì)胞/孔)與上述的DCs (2 X IO5細(xì)胞/孔)在 24孔板中共培養(yǎng)。一周后，通過加入已經(jīng)用肽脈沖過并用75Gy輻射輻照過的T2細(xì)胞，進(jìn)行 重新刺激。在重新刺激后3天，加入20IU/mL IL-2。通過加入肽脈沖過的、輻照過的T2細(xì) 胞，將同樣的重新刺激再重復(fù)3次，然后富集應(yīng)答細(xì)胞中的⑶8陽性細(xì)胞。對于⑶8陽性T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析了對與WTl126肽結(jié)合的HLA_A*0201四聚體的反應(yīng)性，并檢測了針對各種不同靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。使用的靶細(xì)胞是K562細(xì)胞、0206K562細(xì)胞、JY細(xì)胞、KH880F8細(xì)胞、TF-I細(xì)胞和 THP-I細(xì)胞，它們顯示在表5中。這些細(xì)胞的特點顯示在表5中。從HLA-A*0201陽性供體 的血液通過EB病毒感染建立的B-類淋巴母細(xì)胞系(B-LCL)，也被用作靶細(xì)胞。表 5 (3)結(jié)果圖7顯示了來自HLA_A*0201陽性供體1，使用不同的修飾WTl126肽刺激，然后 用與WTl126肽結(jié)合的PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的HLA-A*0201四聚體(Medical&Biological Laboratories, Co.，Ltd.)和APC_Cy7標(biāo)記的抗CD8抗體(APC_Cy7 別藻藍(lán)蛋白-花青 素_7)染色的PBMCs的流式細(xì)胞分析的結(jié)果。當(dāng)PBMCs用上面提到的四聚體和抗CD8抗體 染色時，通過修飾的肽刺激而誘導(dǎo)的CTLs與四聚體和抗CD8抗體結(jié)合，由此可以分別檢測 到四聚體發(fā)射的熒光和抗CD8抗體發(fā)射的熒光。在圖7a到7e中，垂直軸表示HLA_A*0201 四聚體發(fā)射的熒光的強度，水平軸表示抗CD8抗體發(fā)射的熒光的強度。圖7a到7e中的每 個框顯示了誘導(dǎo)的、能夠識別WTl126肽的HLA-A*0201限制性CTLs的頻率(% ) 0圖7a顯 示了沒有用任何WTl126修飾肽刺激并用上述四聚體和抗CD8抗體染色的PBMCs (背景)的 分析結(jié)果。圖7b顯示了用WTl126PlF肽刺激并染色的PBMCs的分析結(jié)果。圖7c顯示了用 WT1126P2L肽刺激并染色的PBMCs的分析結(jié)果。圖7d顯示了用WT1126P3M肽刺激并染色的 PBMCs的分析結(jié)果。圖7e顯示了用WT1126P9V肽刺激并染色的PBMCs的分析結(jié)果。上述的通過用WTl126PlF肽刺激PBMCs而誘導(dǎo)的CTLs的頻率是0. 14% (圖7b)。 上述的通過用WT1126P2L肽刺激PBMCs而誘導(dǎo)的CTLs的頻率是0. 37% (圖7c)。使用這些 肽單獨誘導(dǎo)的CTLs是HLA四聚體陽性，⑶8陽性的，并能夠與結(jié)合WTl126肽的HLA_A*0201四 聚體結(jié)合。這些結(jié)果顯示，使用修飾的WTl126肽刺激PBMCs誘導(dǎo)了能夠識別野生型肽(WTl126 肽)的CTLs。圖8顯示了通過使用WTl126PlF肽刺激來自供體1的PBMCs所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞 毒性活性的測量結(jié)果。在圖8中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ比率)。實心菱形表示 其中使用JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用WTl126PlF肽脈沖過的JY細(xì)胞 作為靶細(xì)胞的組。JY細(xì)胞是HLA_A*0201陽性和WTl陰性的。CTLs針對WTl126PlF肽脈沖過的JY細(xì) 胞，與針對沒有用WTl126PlF肽脈沖過的JY細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性。該結(jié)果 顯示，誘導(dǎo)了對于用于上述刺激的肽是特異性的，并受HLA-A*0201的限制的CTLs。圖9顯示了通過使用WT1126P2L肽刺激來自供體1的PBMCs所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞 毒性活性的測量結(jié)果。在圖9中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過肽刺激獲得的 CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞=E)相對于靶細(xì)胞(靶=T)的比率(Ε/Τ比率)。在圖9a中，實心 菱形表示其中使用JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用WT1126P2L肽脈沖過 的JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。在圖9b中，實心菱形表示其中使用TF-I細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組， 實心正方形表示其中使用THP-I細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心三角形表示其中使用KH880F8 細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，十字表示其中使用B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。誘導(dǎo)的CTLs針對WT1126P2L肽脈沖過的JY細(xì)胞，與針對沒有用WT1126P2L肽脈沖 過的JY細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖9a)。誘導(dǎo)的CTLs針對TF-I細(xì)胞和 THP-I細(xì)胞，二者都是HLA-A*0201陽性和WTl陽性的，與針對HLA_A*0201陰性和WTl陽 性的KH880F8細(xì)胞、以及HLA-A*0201陽性和WTl陰性的B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì) 胞毒性活性(圖9b)。正如從結(jié)果清楚地看到的，使用WT1126P2L肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs受 HLA-A*0201的限制，能夠破壞內(nèi)源性表達(dá)WTl的癌細(xì)胞。圖10顯示了來自HLA_A*0201陽性供體2，使用WT1126P2L肽刺激，然后用與WTl126 肽結(jié)合的PE標(biāo)記的HLA-A*0201四聚體和APC_Cy7標(biāo)記的抗⑶8抗體染色的PBMCs的流式 細(xì)胞分析的結(jié)果。即圖10顯示了用與WTl126肽結(jié)合的HLA四聚體和抗CD8抗體染色的誘 導(dǎo)的CTLs的流式細(xì)胞分析的結(jié)果。垂直軸表示HLA-A*0201四聚體發(fā)射的熒光的強度，水 平軸表示抗CD8抗體發(fā)射的熒光的強度。圖10的右上區(qū)中的細(xì)胞是受HLA_A*0201限制并能夠識別WTl126肽的誘導(dǎo) 的CTLs。用WT1126P2L肽刺激的PBMCs中5. 43 %的淋巴細(xì)胞，是能夠與結(jié)合WTl126肽的 HLA-A*0201的四聚體結(jié)合的HLA四聚體陽性、⑶8陽性的CTLs。該結(jié)果顯示，使用修飾的 肽刺激PBMCs，誘導(dǎo)能夠識別野生型肽的⑶8陽性CTLs。圖11顯示了通過使用WT1126P2L肽刺激來自供體2的PBMCs所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì) 胞毒性活性的測量結(jié)果。在圖Ila和lib中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過肽 刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ比率)。在 圖Ila中，實心菱形表示其中使用JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用WTl126 肽脈沖過的JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。在圖lib中，實心菱形表示其中使用JY細(xì)胞作為靶 細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用WT1126P2L肽脈沖過的JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。誘導(dǎo)的CTLs針對WTl126肽脈沖的JY細(xì)胞，與針對沒有用WTl126肽脈沖過的JY細(xì) 胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖Ila)。誘導(dǎo)的CTLs針對WT1126P2L肽脈沖過的JY 細(xì)胞，與針對沒有用WT1126P2L肽脈沖過的JY細(xì)胞相比，也顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖 lib)。正如從結(jié)果清楚地看到的，使用WT1126P2L肽刺激而誘導(dǎo)的CTLs能夠識別WT1126P2L 肽和野生型WTl126肽二者。
實施例10(由各種不同的修飾的WTl126肽誘導(dǎo)的HLA_A*0206限制性CTLs的比較)(1)目的根據(jù)實施例7 的結(jié)果，選擇了 WTl126PlF 肽、WT1126P2L 肽、WT1126P3M 肽和 WT1126P9V 肽作為待測試的修飾的WTl126肽，并進(jìn)行了下列實驗以篩選能夠誘導(dǎo)具有高細(xì)胞毒性活性 的CTLs的修飾的WTl126肽。(2)材料與方法從顯示出表達(dá)HLA-A*0206分子的健康人類供體(HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者) 分離PBMCs，使用抗人類⑶14磁性粒-DM從PBMCs中分離⑶14陽性細(xì)胞。通過向補充有 lv/v%人類 AB 血清的 X-VIV015 培養(yǎng)基中添加 800IU/mL GM-CSF 和 1000IU/mL IL-4，制備 了培養(yǎng)基，并將CD14陽性細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。向上述培養(yǎng)物中添加含有 10ng/mL TNFa UOng/mL IL-β、1000IU/mL IL-6 和 1 μ g/mL PGE2的成熟化細(xì)胞因子混合物。在繼續(xù)培養(yǎng)1天后，獲得了自體的成熟DCs。將自體成熟DCs用10 μ g/mL在實施例13中獲得的WTl126修飾肽(WTl126PlF肽， WT1126P2L肽，WT1126P3M肽或WT1126P9V肽)脈沖，培養(yǎng)4小時，并用35Gy輻射進(jìn)行輻照。將 這樣獲得的細(xì)胞用作刺激細(xì)胞，用于CTL誘導(dǎo)。將富含CD8陽性T細(xì)胞的PBMCs (2X IO6細(xì)胞/孔)與上述的DCs (2 X IO5細(xì)胞/ 孔)在24孔板中共培養(yǎng)。10天后，通過加入已經(jīng)用肽脈沖過并用35Gy輻射輻照過的PBMCs， 進(jìn)行重新刺激。在重新刺激后2天，加入10IU/mL IL-2和lOng/mL IL-I0通過將同樣的重 新刺激再重復(fù)4次，富集了 CD8陽性T細(xì)胞。檢測了 CD8陽性T細(xì)胞針對各種不同靶細(xì)胞 的細(xì)胞毒性活性。使用的靶細(xì)胞是從HLA_A*0206陽性供體的血液通過EB病毒感染建立的B-LCL， K562細(xì)胞和0206K562細(xì)胞。(3)結(jié)果圖12顯示了使用不同的肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體3的PBMCs所誘導(dǎo)的 CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖12a顯示了用WT1126P2L肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞 毒性活性。圖12b顯示了用WT1126P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。圖12c顯示 了用WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。在圖12a到12c中，垂直軸表示細(xì) 胞毒性活性，水平軸表示通過肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞 (靶T)的比率(E/T比率)。實心菱形表示其中使用自體B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實 心正方形表示其中使用與上述刺激中使用的相同的修飾的WTl126肽脈沖過的自體B-LCL細(xì) 胞作為靶細(xì)胞的組。用WT1126P2L肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對HLA_A*0206陽性和WTl陰性的WT1126P2L 肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞，與針對沒有用WT1126P2L肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞相比，顯 示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖12a)。用WT1126P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對HLA_A*0206 陽性和WTl陰性的WT1126P3M肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞，與針對沒有用WT1126P3M肽脈沖過 的自體B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖12b)。用WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo) 的CTLs，針對HLA-A*0206陽性和WTl陰性的WT1126P9V肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞，與針對 沒有用WT1126P9V肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖12c)。這些結(jié)果顯示，誘導(dǎo)了對于上述刺激所用的肽是特異性的，并受HLA_A*0206的限
35制的CTLs。圖13顯示了使用WT1126P9V肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體3的PBMCs所誘導(dǎo)的 CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。在圖13中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過 肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ比率)。 實心菱形表示其中使用自體B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用WTl基 因轉(zhuǎn)染的自體B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。在圖13中，使用WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對通過將WTl基因轉(zhuǎn)染到最初 為HLA-A*0206陽性和WTl陰性的B-LCL細(xì)胞中而制造成WTl陽性的自體B-LCL細(xì)胞，與針 對沒有用WTl基因轉(zhuǎn)染的自體B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖12c)。正 如從結(jié)果中清楚地看到的，使用WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs受到HLA-A*0206的限制， 并通過識別內(nèi)源性呈遞的野生型WTl126肽而顯示出細(xì)胞毒性活性。圖14顯示了使用不同的肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體4的PBMCs所誘導(dǎo)的 CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。圖14a顯示了用WT1126P2L肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞 毒性活性。圖14b顯示了用WT1126P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。圖14c顯示 了用WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。在圖14a到14c中，垂直軸表示細(xì) 胞毒性活性，水平軸表示通過肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞 (靶T)的比率(E/T比率)。實心菱形表示其中使用自體B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實 心正方形表示其中使用與上述刺激中使用的相同的修飾的WTl126肽脈沖過的自體B-LCL細(xì) 胞作為靶細(xì)胞的組。用WT1126P2L肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對HLA_A*0206陽性和WTl陰性的WT1126P2L 肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞，與針對沒有用WT1126P2L肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞相比，顯示 出更強的細(xì)胞毒性活性(圖14a)。用WT1126P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對HLA_A*0206陽 性和WTl陰性的WT1126P3M肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞，與針對沒有用WT1126P3M肽脈沖過的 自體B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖14b)。用WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的 CTLs，針對HLA-A*0206陽性和WTl陰性的WT1126P9V肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞，與針對沒 有用WT1126P9V肽脈沖過的自體B-LCL細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖14c)。這 些結(jié)果顯示，誘導(dǎo)了對于上述刺激所用的肽是特異性的，并受HLA-A*0206的限制的CTLs。圖15顯示了使用不同的肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體4的PBMCs所誘導(dǎo)的 CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。使用的靶細(xì)胞是HLA-A*0206陰性、WTl陽性的K562細(xì) 胞，以及通過在其中轉(zhuǎn)染HLA-A*0206基因而制造成內(nèi)源性呈遞WTl抗原肽的K562細(xì)胞 (0206K562細(xì)胞)。圖15a顯示用WT1126P2L肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。圖15b 顯示了用WT1126P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。圖15c顯示了用WT1126P9V肽刺 激所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性。在圖15a到15c中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸 表示通過肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ 比率)。實心菱形表示其中使用Κ562細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中0206Κ562 細(xì)胞、即通過在其中轉(zhuǎn)染HLA-A*0206基因而制造成內(nèi)源性呈遞WTl抗原肽的K562細(xì)胞作 為靶細(xì)胞的組。在圖15a到15c中，在每種情況下，使用WT1126P2L肽、WT1126P3M肽或WT1126P9V肽刺 激所誘導(dǎo)的CTLs，針對0206K562細(xì)胞與針對K562細(xì)胞相比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性。正如從結(jié)果清楚地看到的，使用任何這些修飾的肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs受到HLA-A*0206的 限制，并通過識別內(nèi)源性呈遞的野生型WTl126肽而顯示出細(xì)胞毒性活性。實施例11 (由各種不同的修飾的WTl187肽所誘導(dǎo)的HLA_A*0201限制性CTLs的比 較)(1)目的根據(jù)實施例8 的結(jié)果，選擇了 WTl187PlF 肽(SEQ ID NO :11)、WT1187P2M 肽(SEQ ID NO 16)和WT1187P3M肽(SEQ ID NO 20)作為待測試的修飾的WTl187肽，并進(jìn)行了下列實驗 以篩選能夠誘導(dǎo)具有高細(xì)胞毒性活性的CTLs的修飾的WTl187肽。(2)材料與方法從顯示出表達(dá)HLA_A*0201分子的健康人類供體(HLA_A*0201陽性健康獻(xiàn)血者) 分離PBMCs，使用抗人類⑶14磁性粒-DM從PBMCs中分離⑶14陽性細(xì)胞。通過向補充有 lv/v%人類 AB 血清的 X-VIV015 培養(yǎng)基中添加 800IU/mL GM-CSF 和 1000IU/mL IL-4，制備 了培養(yǎng)基，并將CD14陽性細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。向上述培養(yǎng)物中添加含有 10ng/mL TNFa UOng/mL IL-β、1000IU/mL IL-6 和 1 μ g/mL PGE2的成熟化細(xì)胞因子混合物。在繼續(xù)培養(yǎng)1天后，獲得了自體的成熟DCs。將自體成熟DCs用10 μ g/mL在實施例13中獲得的修飾的WTl187肽(WTl187PlF肽， WT1187P2M肽或WT1187P3M肽)脈沖，培養(yǎng)4小時，并用35Gy輻射進(jìn)行輻照。將這樣獲得的細(xì) 胞用作刺激細(xì)胞，用于CTL誘導(dǎo)。將用作響應(yīng)細(xì)胞的PBMCs (2 X IO6細(xì)胞/孔)與上述的DCs (2 X IO5細(xì)胞/孔)在 24孔板中共培養(yǎng)。一周后，通過加入已經(jīng)用肽脈沖過并用75Gy輻射輻照過的T2細(xì)胞，進(jìn)行 重新刺激。在重新刺激后3天，加入20IU/mL IL-2。通過加入肽脈沖過的、輻照過的T2細(xì) 胞，將同樣的重新刺激再重復(fù)3次，然后富集了應(yīng)答細(xì)胞中的CD8陽性細(xì)胞。檢測了 CD8陽 性T細(xì)胞針對靶細(xì)胞，在這里即是JY細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。(3)結(jié)果圖16顯示了使用WTl187PlF肽(圖16a)或WT1187P2M肽(圖16b)刺激來自 HLA-A*0201陽性供體的PBMCs所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。在圖16a和16b 中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞 E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ比率)。實心菱形表示其中使用JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞 的組，實心三角形表示其中使用WTl187肽脈沖過的JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表 示其中使用在上述刺激中使用的WTl187修飾肽(WTl187PlF肽)脈沖過的JY細(xì)胞作為靶細(xì)胞 的組。JY細(xì)胞是HLA-A*0201陽性的，WTl陰性的。使用WTl187PlF肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，對WTl187肽脈沖過的JY細(xì)胞和WTl187PlF肽 脈沖過的JY細(xì)胞顯示出相等的細(xì)胞毒性活性，與針對沒有用肽脈沖過的JY細(xì)胞相比，活 性更強(圖16a)。使用WT1187P2M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs,對WTl187肽脈沖過的JY細(xì)胞和 WT1187P2M肽脈沖過的JY細(xì)胞顯示出相等的細(xì)胞毒性活性，與針對沒有用肽脈沖過的JY細(xì) 胞相比，活性更強(圖16b)。正如從結(jié)果清楚地看到的，使用修飾的肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs， 可以識別修飾的肽和野生型WTl187肽二者。實施例12 (由各種不同的修飾的WTl187肽所誘導(dǎo)的HLA_A*0206限制性CTLs的比 較)
(1)目的根據(jù)實施例7的結(jié)果，選擇了 WTl187PlF肽、WT1187P2M肽和WT1187P3M肽作為待測試 的修飾的WTl187肽，并進(jìn)行了下列實驗以篩選能夠誘導(dǎo)具有高細(xì)胞毒性活性的CTLs的修飾 的 WTl187 肽。(2)材料和方法從顯示出表達(dá)HLA_A*0206分子的健康人類供體(HLA_A*0206陽性健康獻(xiàn)血者) 分離PBMCs，使用抗人類⑶14磁性粒-DM從PBMCs中分離⑶14陽性細(xì)胞。通過向補充有 lv/v%人類 AB 血清的 X-VIV015 培養(yǎng)基中添加 800IU/mL GM-CSF 和 1000IU/mL IL-4,制備 了培養(yǎng)基，并將CD14陽性細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天。向上述培養(yǎng)物中添加含有 10ng/mL TNFa UOng/mL IL-β、1000IU/mL IL-6 和 1 μ g/mL PGE2的成熟化細(xì)胞因子混合物。在繼續(xù)培養(yǎng)1天后，獲得了自體的成熟DCs。將自體成熟DCs用在實施例13中獲得的修飾的WTl187肽(WTl187PlF肽，WT1187P2M 肽或WT1187P3M肽)脈沖，培養(yǎng)4小時，并用35Gy輻射進(jìn)行輻照。將這樣獲得的細(xì)胞用作刺 激細(xì)胞，用于CTL誘導(dǎo)。將富含CD8陽性T細(xì)胞的PBMCs (2X IO6細(xì)胞/孔)與上述的DCs (2 X IO5細(xì)胞/ 孔)在24孔板中共培養(yǎng)。10天后，通過加入已經(jīng)用肽脈沖過并用35Gy輻射輻照過的PBMCs， 進(jìn)行重新刺激。在重新刺激后2天，加入10IU/mL IL-2和lOng/mL IL-I0將同樣的重新刺 激再重復(fù)4次，富集了 CD8陽性T細(xì)胞。檢測了 CD8陽性T細(xì)胞針對各種不同靶細(xì)胞的細(xì) 胞毒性活性。使用的靶細(xì)胞是從HLA_A*0206陽性供體的血液通過EB病毒感染建立的B-LCL， K562細(xì)胞和0206K562細(xì)胞。(3)結(jié)果圖17顯示了使用WTl187PlF肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體的PBMCs所誘導(dǎo)的 CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。在圖17中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過 肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ比率)。 在圖17a中，實心菱形表示其中使用B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用 WTl187肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心三角形表示其中使用WTl187PlF肽脈沖 過的B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。在圖17b中，實心菱形表示其中使用K562細(xì)胞作為靶細(xì) 胞的組，實心正方形表示其中使用0206K562細(xì)胞、即通過在其中轉(zhuǎn)染HLA-A*0206基因而制 造成內(nèi)源性呈遞WTl抗原肽的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。使用WTl187PlF肽刺激所誘導(dǎo)的CTLsJf WTl187肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞和WTl187PlF 肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞顯示出相等的細(xì)胞毒性活性，與針對沒有用肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞 相比，活性更強(圖17a)。當(dāng)使用HLA-A*0206陰性、WTl陽性的K562細(xì)胞，以及通過在其 中轉(zhuǎn)染HLA-A*0206基因而制造成內(nèi)源性呈遞WTl抗原肽的K562細(xì)胞(0206K562細(xì)胞)作 為靶細(xì)胞時，使用WTl187PlF肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對0206K562細(xì)胞與針對K562細(xì)胞相 比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖17b)。正如從結(jié)果清楚地看到的，使用WTl187PlF肽刺 激所誘導(dǎo)的CTLs能夠識別WTl187PlF肽和野生型WTl187肽二者。類似地，發(fā)現(xiàn)了 CTLs受到 HLA-A*0206的限制，并通過識別內(nèi)源性呈遞的野生型WTl187肽顯示出細(xì)胞毒性活性。圖18顯示了使用WT1187P2M肽刺激來自HLA_A*0206陽性供體的PBMCs所誘導(dǎo)的CTLs的細(xì)胞毒性活性的測量結(jié)果。在圖18中，垂直軸表示細(xì)胞毒性活性，水平軸表示通過 肽刺激獲得的CD8陽性T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞E)相對于靶細(xì)胞(靶T)的比率(Ε/Τ比率)。 在圖18a中，實心菱形表示其中使用B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心正方形表示其中使用 WTl187肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組，實心三角形表示其中使用WT1187P2M肽脈沖 過的B-LCL細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。在圖18b中，實心菱形表示其中使用K562細(xì)胞作為靶細(xì) 胞的組，實心正方形表示其中使用0206K562細(xì)胞、即通過在其中轉(zhuǎn)染HLA-A*0206基因而制 造成內(nèi)源性呈遞WTl抗原肽的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞的組。使用WT1187P2M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，對WTl187肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞和WT1187P2M 肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞顯示出相等的細(xì)胞毒性活性，與針對沒有用肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞 相比，活性更強(圖18a)。當(dāng)使用HLA-A*0206陰性、WTl陽性的K562細(xì)胞，以及通過在其 中轉(zhuǎn)染HLA-A*0206基因而制造成內(nèi)源性呈遞WTl抗原肽的K562細(xì)胞(0206K562細(xì)胞)作 為靶細(xì)胞時，使用WT1187P2M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，針對0206K562細(xì)胞與針對K562細(xì)胞相 比，顯示出更強的細(xì)胞毒性活性(圖18b)。正如從結(jié)果清楚地看到的，使用WT1187P2M肽刺 激所誘導(dǎo)的CTLs能夠識別WT1187P2M肽和野生型WTl187肽二者。類似地，發(fā)現(xiàn)了 CTLs受到 HLA-A*0206的限制，并通過識別內(nèi)源性呈遞的野生型WTl187肽顯示出細(xì)胞毒性活性。正如從實施例9到12的結(jié)果清楚地看到的，用修飾的WTl126肽，即WTl126PlF肽、 WT1126P2L肽、WT1126P3M肽或WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，受到HLA_A*0206的限制，并通 過識別內(nèi)源性呈遞的野生型WTl126肽顯示出細(xì)胞毒性活性。特別是，WT1126P9V肽、WT1126P2L 肽和WT1126P3M肽高度有效。正如從上述結(jié)果清楚地看到的，用修飾的WTl187肽，即WTl187PlF肽、WT1187P2M肽或 WT1187P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，受到HLA-A*0206的限制，并通過識別內(nèi)源性呈遞的野生型 WTl187肽顯示出細(xì)胞毒性活性。特別是，WT1187P2M肽和WTl187PlF肽高度有效。因此，顯示了這些修飾的肽，可以有效地用于在HLA_A*0206陽性人員中治療和預(yù) 防伴隨有WTl基因表達(dá)增加的癌癥。正如從上述結(jié)果清楚地看到的，用修飾的WTl126肽，即WTl126PlF肽、WT1126P2L肽、 WT1126P3M肽或WT1126P9V肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，受到HLA_A*0201的限制，并通過識別內(nèi)源性 呈遞的野生型WTl126肽顯示出細(xì)胞毒性活性。特別是，WTl126PlF肽和WT1126P2L肽是高度有 效的。正如從上述結(jié)果清楚地看到的，用修飾的WTl187肽，即WTl187PlF肽、WT1187P2M肽或 WT1187P3M肽刺激所誘導(dǎo)的CTLs，受到HLA-A*0201的限制，并通過識別內(nèi)源性呈遞的野生型 WTl187肽顯示出細(xì)胞毒性活性。特別是，WT1187P2M肽和WTl187PlF肽高度有效。因此，顯示了 這些修飾的肽，有效地用于在HLA-A*0201陽性人員中治療和預(yù)防伴隨有WTl基因表達(dá)增加
的癌癥。實施例13WT1187P2V 肽(SVGEQQYSV ；SEQ ID NO 13 ；H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-ΟΗ)的合成1.合成保護(hù)的肽樹脂(H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Ty r (tBu) -Ser (tBu) -Val-Alko-樹脂)將0. 4g Fmoc-Val-Alko-樹脂(Alko 是對烷氧基苯甲醇)(由 WATANABE CHEMICALINDUSTRIES, LTD 制造；0. 80mmol/g)放置在由 Advanced ChemTech 制造的 ACT496 固相合 成儀的反應(yīng)容器中，用DMF(N，N’ - 二甲基甲酰胺)洗滌(步驟1)，用25%哌嗪在DMF中 的溶液處理(5分鐘Xl次，30分鐘Xl次)以除去Fmoc基團(tuán)(步驟2)，再次用DMF洗 滌(步驟3)以獲得H-Val-Alko-樹脂。向該反應(yīng)容器中加入0. 7mL NMP(N_甲基吡咯 烷酮)和121mg(0. 96mmol)DIPCI(N，N，- 二異丙基碳二亞胺)在0. 9mL NMP中的溶液， 然后加入 368mg (0. 96mmol) Fmoc-Ser (tBu) -OH 和 147mg (0. 96mmol) HOBT (1-羥基苯并三 唑)一水化物在1.8mL NMP中的溶液。偶聯(lián)反應(yīng)在室溫進(jìn)行60分鐘(步驟4)。附加的 偶聯(lián)反應(yīng)使用與上述相同量的Fmoc-Ser (tBu)-OH、HOBT 一水化物和DIPCI進(jìn)行(步驟 5)。將獲得的樹脂用DMF洗滌(步驟6)，去保護(hù)(步驟7)，并再次洗滌(步驟8)以給出 H-Ser (tBu) -Val-Alko-樹脂。然后，通過使用 Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmoc-Gln (Trt) -0H、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Val-OH 和 Fmoc-Ser(tBu)-OH 重復(fù)步驟4到8，連續(xù)地進(jìn)行偶聯(lián)。從反應(yīng)容器收集獲得的肽樹脂，用乙醚洗滌，然后在真空 干燥，得到 980mgH-Ser (tBu) -Val-Gly-Glu (OtBu) -Gln (Trt) -Gln (Trt) -Tyr (tBu) -Ser (tBu )-Val-Alko-樹脂。上面提到的合成過程的概要顯示在表6中。<合成過程>表6 2.保護(hù)的肽樹脂的去保護(hù)向 980mgH-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser (tB u) -Val-Alko-樹脂中加入5mL三氟乙酸/水/三異丙基硅烷的混合溶液(95/2. 5/2. 5 (體 積比))。將混合物在室溫攪拌2. 5小時。過濾除去樹脂，將得到的濾液加入到冰冷的乙醚 中。使用玻璃濾器收集產(chǎn)生的沉淀。將殘余物用乙醚洗滌，真空干燥，得到268mg粗肽。3.粗肽的純化將268mg獲得的粗肽溶解在20%的乙酸水溶液中，通過反相液相色譜進(jìn)行純化。泵Shimadzu LC-8A柱YMC-PackPro C18AS12S11-2530WT 3cmO X25cm洗脫液1 :Η20/0· 1% TFA洗脫液2 (第二種洗脫液)CH3CN/0. 1 % TFA流速10mL/min檢測UV220nm在用濃度為的第二種洗脫液平衡后，將柱子裝載粗肽溶液。然后，允許第二種 洗脫液的濃度在30分鐘內(nèi)增加到8%，隨后在120分鐘內(nèi)增加到14%。收集含有目標(biāo)化合 物的級份，在真空中蒸發(fā)掉乙腈，然后將殘余物冷凍干燥。由此獲得了 105mg目標(biāo)WT1187P2V 肽(SVGEQQYSV ;SEQ ID NO 13 ;H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val_OH)。用于純化的肽的HPLC分析和質(zhì)譜的條件如下。HPLC 分析(Shimadzu LC-IOAvp)柱YMC-PackPro C18 AS-3024. 6mmΦ X150mm洗脫液1 :Η20/0· 1% TFA洗脫液2 :CH3CN/0. 1 % TFA梯度允許洗脫液2的濃度在30分鐘內(nèi)從10%增加到40%。流速lmL/min檢測UV220nm純度:97. 4%，保留時間11. 22分鐘氨基酸分析(Hitachi L-8500氨基酸分析儀)水解l%苯酚/6N鹽酸水溶液，ll(rC，24小時分析方法茚三酮方法Ser: 1.78(2) Glx :3· 26 (3) *Gly (1) Val 2. 04(2) Tyr: 1.06(1)*)Gly =標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，括號中的數(shù)字是理論值。質(zhì)譜(AppliedBiosystems API I5OEX 質(zhì)譜儀)m/z = 996. 9[M+1]+ (理論值=996. 5)氨基酸序列分析(Applied Biosystems 491蛋白測序儀)從N末端Ser到C末端Val，對氨基酸序列進(jìn)行了連續(xù)檢查。按照與上述相同的方式合成了在表7和8中顯示的肽。表 7
41 表8
同樣地合成了表9到12中顯示的肽，但是用于純化的肽的HPLC分析和質(zhì)譜條件 如下。HPLC 分析(Agilent HP1100 或 Thermo Fisher Scientific Surveyor)柱Thermo Fischer Scientific BioBasic-183mmO X 250mm洗脫液1 :Η20/0· 1% TFA
洗脫液 2 :CH3CN/0. 1 % TFA梯度允許洗脫液2的濃度在20分鐘內(nèi)變化到表中顯示的濃度。流速0. 4mL/min檢測215nm質(zhì)譜Thermo Bioanalysis Dynamo Mifft (MALDI-T0F)表9 表 10 表11 表 12 實施例14(使用表達(dá)HLA_A*0201的轉(zhuǎn)基因小鼠評估修飾的肽誘導(dǎo)特異性免疫細(xì)胞的活性， 并驗證誘導(dǎo)的特異性免疫細(xì)胞與野生型肽的交叉反應(yīng)性)〈方法〉(1)修飾的肽候選物對于WTl187肽、WTl126肽及其修飾的肽(在WTl187肽或WTl126肽從N末端起的第1、 2、3和/或9位上含有一個或兩個氨基酸殘基的取代的肽)，使用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方 法，即下列4種計算機(jī)數(shù)據(jù)庫介導(dǎo)的方法，分析了針對HLA-A*0201分子的親和性BIMAS (http //www, mpi ib~berl in. mpg. de/MAPPP/binding, html)， SYFPEITHI(http://www. mpiib-berlin. mpg. de/MAPPP/binding. html)， RANLPEP(http:// immunax.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)禾口 NetMHC3. O (http: //www, cbs. dtu. dk/services/NetMHC/)。WT I187肽及其修飾肽的分析結(jié)果顯示在表13到16和21中。WTl126 肽及其修飾肽的分析結(jié)果顯示在表17到20和22到23中。預(yù)測的親和性用分值顯示。表 13 表 16 表17 表 18 表 19 表 20 表 21 表 22 選擇至少在一個數(shù)據(jù)庫中被預(yù)測為與野生型肽(WTl187肽或WTl126肽)相比具有相 等或更高親和性的修飾的肽，與野生型肽一起在下面的(2)到(4)中作為測試樣品。(2)肽制備物的制備和給藥將在實施例13中合成并冷凍干燥的肽，在DMSO(由NacalaiTesque，Inc.制造) 中制備成40mg/mL的濃度。然后，將32. 5 μ L制備的肽的DMSO溶液與540 μ L注射用蒸餾水 (由Otsuka PharmaceuticalFactory, Inc.制造)混合。接下來，使用玻璃注射器將550 μ L 混合物與70(^1^弗氏不完全佐劑^011切1^如ISA-51)混合，以制備油包水乳液。通過將 300 μ L制備物(油包水乳液)皮下注射到尾根，對表達(dá)HLA-A*0201的轉(zhuǎn)基因小鼠(株系 名稱HLA-A2+HLA-DR1+/Ia0 ° β 2m,EMMA ID號EM 01783)進(jìn)行免疫接種。每種肽使用2 或3只小鼠進(jìn)行評估。(3)脾細(xì)胞的制備在免疫接種后7天分離脾臟。通過在載玻片泡沫部分上進(jìn)行摩擦，將脾臟壓碎，然 后使用ACK裂解緩沖液(由Lonza Co.制造)進(jìn)行溶血處理來制備脾細(xì)胞。在該實驗中， 使用CTM (T細(xì)胞完全培養(yǎng)基在RPMI-1640培養(yǎng)基(由Invitrogen Corporation制造)中 添加有10%FBS，10mM HEPES,20mM L-谷氨酰胺，ImM丙酮酸鈉，ImMMEM非必需氨基酸，1 % MEM維生素和55μΜ 2-巰基乙醇，前提是這些濃度都是終濃度)作為脾細(xì)胞的培養(yǎng)基，細(xì)胞 懸液被制備成濃度為5 X IO6細(xì)胞/mL。(4) Elispot 方法通過ELISP0T方法，使用IFNy作為指標(biāo)，檢測了給藥的肽是否具有誘導(dǎo)WTl特 異性免疫細(xì)胞的活性。方法按照隨附的手冊進(jìn)行。在以50 μ L/孔的量將CTM加入到用于 ELISP0T的板(由BD Japan制造，目錄號No. 551083)中之后，在板中加入體積為100 μ L 的脾細(xì)胞懸液(5Χ IO5細(xì)胞/孔)。然后，向其中加入量為50 μ L/孔的給藥的肽或野生型 肽(肽的終濃度2yg/mL)。該測定方法已知是能夠預(yù)測細(xì)胞毒性活性的一種替代方法
51(J. Immunological Methods,1995,181,45-54)。< 結(jié)果 >對于修飾的WTl187肽來說，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的活性的評估結(jié)果顯示在 圖19到22和28到29中，對于修飾的WTl126肽來說，顯示在圖23到27和30到32中。在 圖19到32的每張圖中，垂直軸表示在5X105個脾細(xì)胞中抗原肽特異性應(yīng)答細(xì)胞的數(shù)量 (斑點/5X IO5細(xì)胞)，水平軸表示用于評估的個體小鼠(2或3只小鼠)。白色條表示在沒 有用抗原肽刺激的情況下應(yīng)答的特異性免疫細(xì)胞的數(shù)量?；疑珬l表示對使用野生型肽的刺 激應(yīng)答的特異性免疫細(xì)胞的數(shù)量。黑色條表示對使用給藥的(修飾)肽的刺激應(yīng)答的特異 性免疫細(xì)胞的數(shù)量。
肽，f
肽，f
肽，f肽。
肽，f
肽，f
肽，f
肽，f肽。
肽，f
圖19到32顯示了下列肽誘導(dǎo)特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的相應(yīng)活性 圖 19a =WTl187PlA 肽，b !WTl187PlM 肽。 圖 20a=WTl
WT1187P2V 肽。
圖 21a :WT1 WT1187P3P 肽。 圖 22a :WT1
圖 23a :WT1 WTl126PlM 肽。
圖 24a :WT1 WT1126P2Q 肽。
圖 25a :WT1 WT1126P3M 肽。
圖 26a :WT1 WT1126P9M 肽。 圖 27 =WTl126. 圖 28a :WT1 圖 29a :WT1
87P1V 肽，b 87P3A 肽，b 87P3S 肽，b 26P1A 肽，b
26P1V 肽，b 26P2V 肽，b
26
,P3P 肽，b
=WTl187PlF 肽，c =WTl187Plff 肽，c :WT1187P3F 肽，c :WT1187P3V 肽，c =WTl126PlF 肽，c =WTl126P IW 肽，c :WT1126P3A 肽，c :WT1126P3V 肽，c
P9V 肽。 87P1D 肽，b 87P1N 肽，b
IffTl187PlE 肽，c IffTl187PlP 肽，c
WTl187PlG 肽，d WT1187P2I 肽，d WT1187P3I 肽，d WT1187P3W 肽，d WTl126PlG 肽，d :WT1126P2A 肽，d WT1126P3G 肽，d WT1126P3W 肽，d
IffTl187PlH 肽，d !WTl187PlQ 肽，d
WTl187PlI 肽，e WT1187P2M 肽，e WT1187P3L 肽，e WT1187P3Y 肽，e WTl126PlI 肽，e :WT1126P2I 肽，e WT1126P3I 肽，e WT1126P9A 肽，e
!WTl187PlK 肽。 !WTl187PlR 肽，e
IffTl187PlL
:WT1187P2Q
:WT1187P3M
:WT1187P9L
ITl126PlL
:WT1126P2L
:WT1126P3L
:WT1126P9I
:WT1187P1T
WTl126PlN
圖 30a =WTl126PlD 肽，b =WTl126PlE 肽，c =WTl126PlH 肽，d =WTl126PlK 肽，e WTl126PlP 肽。
圖 31a =WTl126PlQ 肽，b =WTl126PlS 肽，c =WTl126PlT 肽，d :WT1126P2I&P9I 肽，e
WT1126P2I&P9V 肽，f :WT1126P2L&P9I 肽。圖 32 :WT1126P2L 禾口 P9V 肽。如這些結(jié)果中顯示的，當(dāng)除了WTl187PlD 肽、WTl187PlE 肽、WTl187PlH 肽、WTl187PlP 肽 和 WT1187P2Q 肽，以及 WTl126PlD 肽、WTl126PlE 肽、WTl126PlP 肽、WT1126P2A 肽和 WT1126P2Q 肽之 外的修飾的肽給藥到小鼠中時，明顯地以有效的方式誘導(dǎo)了特異性免疫細(xì)胞。接下來，分析了通過修飾的肽的刺激所誘導(dǎo)的特異性免疫細(xì)胞與野生型肽的交叉反應(yīng)性(表24和25)。結(jié)果顯示，特別是WTl187修飾肽中的WTl187PlA肽，WTl187PlI肽， WTl187PlL 肽，WTl187PlM 肽，WTl187PlN 肽，WTl187PlQ 肽，Tl187PlT 肽，WTl187PlV 肽，WT1187P2V 肽， WT1187P2M 肽，WT1187P2I 肽，WT1187P3A 肽，WT1187P3F 肽，WT1187P3P 肽，WT1187P3S 肽，WT1187P3V 肽和 WT1187P9L 肽；以及 WT1126 修飾肽中的 WT1126P1S 肽，WT1126P21 肽，WT1126P2L 肽，WT1126P2V 肽，WT1126P3ff肽，WT1126P91肽，WT1126P9M肽和WT1126P9V肽，能夠誘導(dǎo)可以有效識別修飾的肽 和野生型肽二者的特異性免疫細(xì)胞。
表 24 表 25 工業(yè)實用性本發(fā)明的癌癥疫苗組合物可用作藥物，用于在HLA_A*0206陽性人員中治療和預(yù) 防表達(dá)WTl的癌癥。本發(fā)明的癌癥疫苗組合物還可用作藥物，用于在HLA-A*0201陽性人員 中治療和預(yù)防表達(dá)WTl的癌癥。
權(quán)利要求
用于人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，包含作為腫瘤抑制基因WT1的基因產(chǎn)物的蛋白或其部分肽。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的蛋白是下列(a)或 (b)的蛋白(a)由SEQID NO 1的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白，或(b)由在氨基酸序列(a)中包含一個到幾個氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白，它們中任何一個在HLA-A*0206陽性人員中都是免疫原性的。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中部分肽是WTl87肽-.Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ IDNO2),WTl26 肽:Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO3),WTl87PlF|i:Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQIDNO11)，WTl87P2M 肽:Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQIDNO16)，WTl87P3M 肽:Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQIDNO20)，WTl26PIF 肽:Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQIDNO34)，WTl26P2L 肽:Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQIDNO39)，WTl26P3M 肽:Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQIDNO46)或WTl26P9V 肽:Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQIDNO49)。
4.權(quán)利要求1或2的組合物，還包含佐劑。
5.用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，含有編碼作為腫瘤抑制基因WTl的基 因產(chǎn)物的蛋白或其部分肽的DNA。
6.用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，含有編碼作為腫瘤抑制基因WTl的基 因產(chǎn)物的蛋白或其部分肽的RNA。
7.用于誘導(dǎo)WTl特異性CTLs的方法，包括在存在作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的 蛋白或其部分肽的情況下，培養(yǎng)源自于HLA-A*0206陽性人員的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)， 以獲得從其誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs。
8.用于誘導(dǎo)呈遞作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的蛋白或其部分肽的樹突狀細(xì)胞 的方法，包括在存在蛋白或其部分肽的情況下培養(yǎng)源自于HLA-A*0206陽性人員的未成熟 樹突狀細(xì)胞，以獲得從其誘導(dǎo)的呈遞蛋白或其部分肽的樹突狀細(xì)胞。
9.用于HLA-A*0206陽性人員的癌癥診斷方法，包括i)在來自HLA-A*0206陽性人員的樣品中檢測或定量作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn) 物的蛋白或其部分肽、針對它們的抗體或WTl特異性CTLs的步驟，以及將蛋白或其部分肽、 針對它們的抗體或WTl特異性CTLs的量，與沒有發(fā)生癌癥情況下的量進(jìn)行比較的步驟，或ii)向HLA-A*0206陽性對象給藥通過權(quán)利要求7中所述的方法誘導(dǎo)的WTl特異性CTLs 或通過權(quán)利要求8中所述的方法誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的步驟，以及確定CTLs或樹突狀細(xì)胞在 HLA-A*0206陽性對象中的位置或區(qū)域的步驟。
10.用于HLA-A*0201陽性人員的癌癥疫苗組合物，包含下列肽WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126 肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們中的任一種都是 作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的蛋白的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是免疫原性的。
11.權(quán)利要求10的組合物，_其中修飾肽是WTl187P1F 肽=PheLeuGlyGluGlnGlnTyrSerVal(SEQIDNO11),WTl187P2M 肽:SerMetGlyGluGlnGlnTyrSerVal(SEQIDNO16),WTl187P3M 肽:SerLeuMetGluGlnGlnTyrSerVal(SEQIDNO20),WTl126P1F 肽:PheMetPheProAsnAlaProTyrLeu (SEQIDNO34),WTl126P2L 妝:ArgLeuPheProAsnAlaProTyrLeu (SEQIDNO39),WTl126P3M 肽:ArgMetMetProAsnAlaProTyrLeu (SEQIDNO46)或WTl126P9V 肽:ArgMetPheProAsnAlaProTyrVal(SEQIDNO49)。
12.治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向HLA-A*0206陽性人員給藥含有作為腫瘤抑制基因 WTl的基因產(chǎn)物的蛋白或其部分肽的組合物。
13.作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的蛋白或其部分肽，用于在HLA-A*0206陽性人 員中治療或預(yù)防癌癥。
14.治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向HLA-A*0201陽性人員給藥含有下列肽的組合物 WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們中的任一種都是 作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的蛋白的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是 免疫原性的。
15.下列肽WTl187 肽Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO 2)的修飾肽或 WTl126 肽Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ IDNO 3)的修飾肽，它們中的任一種都是 作為腫瘤抑制基因WTl的基因產(chǎn)物的蛋白的部分肽，修飾的肽在HLA-A*0201陽性人員中是 免疫原性的，用于在HLA-A*0201陽性人員中治療或預(yù)防癌癥。
全文摘要
本申請涉及用于人類白細(xì)胞抗原(HLA)-A*0206陽性人員的癌癥疫苗組合物，含有腫瘤抑制基因WT1的蛋白產(chǎn)物或其部分肽。
文檔編號C07K7/06GK101888852SQ20088011913
公開日2010年11月17日 申請日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者杉山治夫 申請人:株式會社癌免疫研究所