專利名稱：針對銅綠假單胞菌pcrv抗原的抗體的制作方法
針對銅綠假單胞菌PCRV抗原的抗體相關申請的交叉引用本申請要求于2007年11月30日提交的美國第60/991，679號臨時申請的權益， 該申請通過引用的方式并入本文中。
背景技術：
銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)是機會致病菌，其極少在健康人體內(nèi)引起疾病，但 對于危重病人或免疫受損的個體卻是個嚴重問題。在囊性纖維化(CF)的個體內(nèi)，感染是主 要問題，其中，銅綠假單胞菌在由反復和慢性呼吸道細菌感染引起的肺功能進行性衰竭中 是致病因子。其他面臨銅綠假單胞菌感染風險的人包括機械通氣的患者、嗜中性粒細胞減 少的癌癥患者和燒傷患者。銅綠假單胞菌通常對大多數(shù)抗生素具有抗藥性，因此亟需新的 治療方法。III型分泌系統(tǒng)是重要的毒力因子決定子，原因是它抑制宿主的防御體系。被激活 時，III型分泌器官將毒素轉移到宿主細胞的細胞質內(nèi)，導致細胞變圓、浮起，以及通過壞死 或凋亡的細胞死亡。PcrV是III型分泌器官的主要成分。阻斷PcrV能夠抑制毒素分泌物 通過III型分泌系統(tǒng)，由此允許自然清除機制消除細菌。在迄今檢測的所有銅綠假單胞菌 品系試驗中，PcrV是保守的。針對假單胞菌PcrV抗原的抗體為本領域所熟知。本發(fā)明提供了例如用于治療銅 綠假單胞菌感染的改良的PcrV抗體。發(fā)明概述本發(fā)明涉及工程抗體，其以例如大約50nM或大約IOnM或更低的高親和力，結合到 來自銅綠假單胞菌的PcrV抗原。這種抗體通常是III型分泌的功能拮抗劑，即為結合到 PcrV并抑制III型分泌系統(tǒng)的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明中的抗體可以結合到PcrV 并募集免疫系統(tǒng)的多種類型的細胞，以刺激巨噬細胞的吞噬作用、巨噬細胞或NK細胞的抗 體依賴性細胞毒性作用(ADCC)、補體級聯(lián)的活化和/或嗜中性粒細胞氧化爆發(fā)的發(fā)生。本發(fā)明的抗體具有與人種系Vh和\序列高度一致性的可變區(qū)，并且在人體內(nèi) 免疫原性較低。本發(fā)明的重鏈和輕鏈的CDR3序列包含一對來自單克隆抗-PcrV抗體 Mab 166 (Frank et al，J. Infections Dis. 186 :64_73，2002)的結合特異性決定子(BSD)。 本發(fā)明的抗體通常能夠與Mabl66競爭對PcrV蛋白上的中和表位的結合。CDRH3中的BSD序列具有氨基酸序列NRGDIYYDFTY。CDRL3中的BSD是FWXTP (其 中的X可以是S或G)。完整的V區(qū)通過如下方式產(chǎn)生，即其中的BSD形成部分⑶R3，另外 的序列用于完成⑶R3和增加FR4序列。一般地，除去BSD的⑶R3部分和完整FR4由人種系 序列組成。優(yōu)選地，除去BSD的CDR3-FR4序列與人種系序列(human germ-line sequence) 的差異在每鏈上不超過兩個氨基酸。CDR3-FR4與V-節(jié)段連接，所述V-節(jié)段與人種系V-節(jié) 段具有高度一致性，例如至少80%、或至少90%或更多。在某些方面，本發(fā)明提供了抗-Pcrv抗體，其展示了對PcrV的高親和力結合，例如 IOnM或更高，并且是III型分泌系統(tǒng)的拮抗劑。在許多實施例中，選擇性地結合到PcrV的本發(fā)明的抗-PcrV抗體包含包含含有
6FffGTP的⑶R3的\區(qū)。在典型的實施例中，這種抗體具有與人類種系V節(jié)段至少80% — 致性的\區(qū)V節(jié)段。FR4區(qū)與人類種系J節(jié)段的FR4區(qū)通常具有至少90%的一致性。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-PcrV抗體包含含有FWGTP的⑶R3、FR4和V節(jié)段， 其中FR4包含與人JK2種系基因節(jié)段的FR4區(qū)至少90%的一致性或與JL2種系序列至少 90%的一致性；以及V節(jié)段包含與人種系Vk I或VK III序列至少80 %的一致性，或與人 種系Va序列至少80%的一致性。在某些實施方案中，\區(qū)⑶R3具有序列Q(Q/H)FWGTPYT。 在某些實施方案中，抗體進一步包含Vh區(qū)，所述的Vh區(qū)包含具有序列NRGDIYYDFTY的⑶R3、 FR4和V節(jié)段，其中FR4包含與人JH3或人JH6節(jié)段的FR4區(qū)至少90%的一致性，以及V節(jié) 段包含與人VH1-18亞類V節(jié)段或與人VH3-30. 3V節(jié)段至少80%的一致性。在某些實施方 案中，該Vh區(qū)包含具有序列NRGDIYYDFTYA(MziF)DX1的CDR3，其中X1是I、Q、Y或S。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了結合PcrV的抗-PcrV抗體，其包含Vh區(qū)，所 述Vh區(qū)包含⑶R3、FR4和V節(jié)段，所述⑶R3具有序列NRGDIYYDFTYAMDX:，其中X1是I、Q、Y 或S ；其中FR4包含與人種系JH3節(jié)段的FR4區(qū)或人種系JH6節(jié)段的FR4區(qū)至少90%的一 致性，以及V節(jié)段包含與人種系VH1-18亞類V節(jié)段或與人種系VH3-30. 3亞類V節(jié)段至少 80%的一致性，條件是當X1是Y時，F(xiàn)R4區(qū)不是WGQGTSVTVSS。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了結合PcrV的抗-PcrV抗體，其包含Vh區(qū)和\區(qū)， 所述Vh區(qū)包含CDR3、FR4和V節(jié)段，所述CDR3具有序列NRGDIYYDFTYAMDX:，其中X1是I、 Q、Y或S，其中FR4包含與人種系JH3節(jié)段的FR4區(qū)或人種系JH6節(jié)段的FR4區(qū)至少90% 的一致性，以及V節(jié)段包含與人種系VH1-18亞類V節(jié)段或與人種系VH3-30. 3亞類V節(jié)段 至少80%的一致性，條件是當X1是Y時，F(xiàn)R4區(qū)不是WGQGTSVTVSS ；以及所述Vl區(qū)包含具有 Fff (S/G) TP的CDR3、FR4和V節(jié)段，其中FR4包含與人種系JK2基因節(jié)段的FR4區(qū)或人種系 幾2節(jié)段的FR4區(qū)至少90%的一致性；以及V節(jié)段包含與人種系VKI L12序列至少80%的 一致性、或與Vk III序列至少80%的一致性、或與人種系Va2 2(3或￥；^331節(jié)段至少80% 的一致性。在某些實施方案中，本發(fā)明抗體的Vh區(qū)的FR4具有序列WGQGTX2VTVSS，其中X2是 T或M。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體具有含有序列Q(H/Q)FW(G/S)TPYT的輕鏈 CDR3。在某些實施方案中，Vl區(qū)的FR4具有序列TOQGTKLEIK或FGGGTKLTVL。本發(fā)明還提供了抗-PcrV抗體，其中Vh區(qū)V節(jié)段與人種系VH3-30. 3節(jié)段具有至少 80%的一致性。以及重鏈區(qū)CDRl包含序列X3X4X5X6H,其中X3是S、T或N ;X4是Y或A ；X5是 A、G 或 P ；以及 X6 是 Μ、I 或 L。以及重鏈區(qū) CDR2 包含序列 X7IX8YX9GXltlX11X12X13Y (A/I) X14SVKG, 其中 X7 是 V、F 或 N ;X8 是 S 或 W ;X9 是 D 或 N ；X10 是 S、K、R 或 Y ；X11 是 N、S、D 或 E ；X12 是 K、I 或E ；X13是Y、S、D或W ；以及X14是D或S。在某些實施方案中，抗體與VH3-30. 3V節(jié)段具有 至少90%的一致性。在某些實施方案中，CDRl是1々61^、5丫61!1、5￥61^、5￥ 1^或附 ]\ 。在 某些實施方案中，CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG、FISYDGSEKYYASSVKG、VISYDGSEKWYADSVKG、 VIWYDGRNKYYADSVKG、VIffYDGYNKDYADSVKG 或 NIWYDGSSESYIDSVKG。在某些實施方案 中，CDRl 是 TAGMH、SYGIH、SYGMH、SYPLH 或 NYPMH ；以及 CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG, FISYDGSEKYYASSVKG、VISYDGSEKWYADSVKG、VIWYDGRNKYYADSVKG, VIffYDGYNKDYADSVKG 或NIWYDGSSESYIDSVKG。本發(fā)明還提供了抗-PcrV抗體，其中Vh區(qū)V節(jié)段與人種系VH1-18亞類V節(jié)段具 有至少80%的一致性或至少90%的一致性，以及⑶Rl具有序列DHAIS，且⑶R2具有序列 WISPYSGNPNYAQSLQGo本發(fā)明還提供了結合到PcrV的抗-PcrV抗體，包含具有⑶R3序列 NRGDIYYDFTYAFDI、CDRl 序列 DHAIS 和 CDR2 序列 WISPYSGNPNYAQSLQG 的 Vh 區(qū)。在某些實施方案中，Vh區(qū)包含選自 SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、26、27、29和35的氨基酸序列的V節(jié)段區(qū)。例如，Vh區(qū)能夠包含選自SEQ ID NOs 1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了抗-PcrV，其中八區(qū)V節(jié)段包含與人種系Vk I 1^12或￥&111序列 至少80%或90%的一致性；或與人種系V λ 331或與V λ 22c序列至少80%或90%的一致 性。在某些實施方案中，\區(qū)V節(jié)段與人種系VKI L12節(jié)段具有至少80 %或90 %的一致性， 以及 CDRl 具有序列 RASX15X16X17X18X19X20X21A,其中 X15 是 Q 或 E ；X16 是 S 或 G ；X17 是 I 或 V ；X18 是S或D ；X19是S、R或T ；X20是W或Y ；X21是L或V ；以及CDR2具有序列X21ASX22LX23S,其中X21 是D或A ；X22是S、A或T ；X23是E、Q或K。在某些實施方案中，CDRl具有序列RASQGISTYLA、 RASQGI SSffLA, RASQSI SRffVA 或 RASEGVDRWLA ；或 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS、AASSLQS、 DASALQS 或 DASTLQS。在某些實施方案中，CDRl 具有序列 RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、 RASQSISRffVA 或 RASEGVDRWLA ；以及 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS、AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。本發(fā)明還提供了抗-PcrV抗體，其中八區(qū)V節(jié)段與人種系VKIIIL2序列具有 至少80 %或至少90 %的氨基酸序列的一致性，以及⑶Rl具有序列RASNSVGAYNLA或 RASQSVSSNLA ；或CDR2具有序列(A/G) AS (T/R) RA (T/P)。在某些實施方案中，CDRl具有序列 RASNSVGAYNLA 或 RASQSVSSNLA ；以及 CDR2 具有序列(A/G) AS (T/R) RA (T/P)。另外，本發(fā)明提供了抗-PcrV抗體，其中\(zhòng)區(qū)V節(jié)段與人種系V λ L331節(jié)段具有至 少80%或至少90%的氨基酸序列的一致性，以及⑶Rl具有序列QGDSLRS (Y/L) YAS ；或⑶R2 具有序列(G/S)KN(N/S)RPS。在某些實施方案中，CDRl具有序列QGDSLRS (Y/L) YAS;以及 CDR2 具有序列(G/S)KN(N/S)RPS。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了抗-PcrV抗體，其中\(zhòng)區(qū)V節(jié)段與人種系 VXL22c節(jié)段具有至少80%或至少90%的氨基酸序列的一致性，以及⑶Rl具有序列 TGTSSDVGAYNYVS 或 TGTSSDYVS ；或 CDR2 具有序列(E/D)VT(K/N)RPS。在某些實施方案中， CDRl 具有序列 TGTSSDVGAYNYVS 或 TGTSSDYVS ；以及 CDR2 具有序列(E/D) VT (K/N) RPS。本發(fā)明的抗-PcrV抗體能夠具有包含選自SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22、24、28、30、32、34、36和37的氨基酸序列的V節(jié)段的區(qū)域。例如Vl區(qū)能夠包含選自 SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列。本發(fā)明因此提供了抗-PcrV抗體，其包含具有選自SEQ ID N0sl、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列 區(qū)；以及具有選自 SEQ ID NOs 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列的 Vl 區(qū)。因此， 在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含SEQID N0:1&VH區(qū)和SEQ ID NO :2的Vl區(qū)；或SEQ ID NO 3 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 4 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 5 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 6 的 Vl 區(qū)；或 SEQ ID NO 7 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 8 的 \ 區(qū)；或 SEQ IDNO 11 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 12 的 Vl 區(qū)；或 SEQ ID NO 9 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 10 的 Vl 區(qū)；或 SEQ ID NO 13 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 10 的 Vl 區(qū)；或 SEQ ID NO 13 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 4 的 \ 區(qū)；或 SEQID NO 13 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 37 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 21 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 18 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 17 的 Vh 區(qū)和 SEQ IDNO 18 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 26 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 24 的 Vl 區(qū)；或 SEQ ID NO 25 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 24 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 23 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 24 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 35 的 Vh 區(qū)和 SEQID NO 36 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 29 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 20 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 29 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 28 的 \ 區(qū)；或 SEQ IDNO 29 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO :30 的八區(qū)；或 SEQ ID NO 29 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 34 的 \ 區(qū)；或 SEQ ID NO 3 的 Vh 區(qū)和 SEQ ID NO 32 的 Vl 區(qū)。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗-PcrV抗體包含如圖1中所示的重鏈和/或如圖2 中所示的輕鏈；或具有至少一個，通常至少兩個，以及在某些實施方案中至少三個分別來自 圖1或圖2中所示的重鏈或輕鏈之一的⑶Rs。在許多實施方案中，該⑶Rl和/或⑶R2序 列不是種系序列。在某些實施方案中，該抗體是Fab'片段。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是Fab或Fab'，其具有大約IOnM或更低的親 和力。在某些實施方案中，該抗體具有與Mab 166Fab或Fab'的親和力相等或更佳的親和 力。本發(fā)明的抗體例如Fab在抑制銅綠假單胞菌III型分泌系統(tǒng)的活性方面的效能與 Mab 166Fab通常是等價的(在基于細胞的檢測中處于二倍活性之內(nèi))。在某些實施方案中， 本發(fā)明的抗體在阻止由銅綠假單胞菌引起的細胞毒性方面比Mab 166更有效。在某些實施方案中，該抗體包含鉸鏈區(qū)。在其他實施方案中，該抗體是IgG或IgA。在某些實施方案中，該抗體是聚乙二醇化的。例如，該抗體可以是雙-聚乙二醇化 的。在某些實施方案中，Vh區(qū)或\區(qū)，或者Vh區(qū)和\區(qū)兩者的氨基酸序列在N末端包 含甲硫氨酸。另一方面，本發(fā)明提供了治療感染銅綠假單胞菌的患者的方法，該方法包含給予 治療有效量的此處所描述的抗體。在某些實施方案中，該抗體通過靜脈內(nèi)、皮下或通過吹入 法被給予。


圖1顯示了抗-PcrV抗體的Vh區(qū)的序列。⑶R序列用下劃線標示。將VHl序列與 人種系序列VH1-18比對。將顯示的VH3-亞類抗體與人種系序列VH3-30. 3比對。將J-節(jié) 段與人種系JH3或JH6比對。圖1中描述的Vh-節(jié)段的序列對應于直達CDR3序列的序列相當。圖2顯示了抗-PcrV抗體的八區(qū)的序列。⑶R序列用下劃線標示。V κ -亞類抗 體被展示與人種系序列VKI L12比對。J-節(jié)段與人種系JK2比對。νλ-亞類抗體被展示 與人種系序列V1331比對。J-節(jié)段與人種系幾2比對。
圖3顯示了能夠連接到Fab'重鏈和輕鏈的示例性恒定區(qū)序列。用于結合巰基反 應性馬來酰亞胺衍生物的鉸鏈區(qū)中的兩個半胱氨酸殘基用下劃線標示。參與鏈間二硫鍵形 成的半胱氨酸殘基用方框標示。圖4顯示了雙-聚乙二醇化的Fab'結構的示意圖，其中mPEG-馬來酰亞胺的兩個 分子通過硫醚鍵連接到Fab'蛋白的鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基。示例性的抗體由人Fd'重鏈 和人κ輕鏈組成，該Fd'重鏈和κ輕鏈通過兩條鏈間的由交叉棒(cross bar)表示的二 硫鍵連接。(Fab和PEG部分不按比例)圖5提供的數(shù)據(jù)顯示了在以致死劑量的PA103激發(fā)時用不同劑量的針對PcrV的 抗體治療的小鼠的存活時程。Mabl66和Fab片段與1. 5x106細菌經(jīng)由氣管內(nèi)徑路被共 同滴入(每組5只小鼠，4只小鼠用于Mabl66Fab組)。對照是不結合PcrV或任何銅綠 假單胞菌蛋白的非特異性Fab。以下列抗體劑量治療小鼠A)10yg，B)5yg, C)2.5yg, D) 1. 25 μ g，對于 Fab 1A8 對Mabl66Fab，*P = 0. ΟΙΕ) 0· 625 μ g，對于 1A8 對Mabl66Fab，*P = 0. 002F)0. 3125μ g，G)0. 16μ g，H)0. 08 μ g。用于表示治療組間差異的P值通過Mantel-Cox 時序檢驗來測定。圖6提供的數(shù)據(jù)顯示了用抗-PcrV抗體治療的小鼠的體溫分析。顯示了 48小時 或直至死亡的直腸溫度。抗體劑量A) 10 μ g，Β)5μ g, C)2. 5μ g, D) 1. 25 μ g Ε)0. 625 yg F) 0. 3125 μ g, G) 0. 16 μ g, H) 0. 08 μ g。圖7提供的數(shù)據(jù)顯示了銅綠假單胞菌通過抗-PcrV從感染小鼠肺部的清除率。小 鼠用1.5xl06cfu PA 103感染，所述PA 103與所示劑量(以μ g表示)的Mab 166IgG，Mab 166Fab或人Fab 1A8共滴入。該圖顯示了從在48小時存活的個體小鼠分離的每肺的cfu。 在這一時間點的死亡小鼠的數(shù)目顯示在該圖上方。每組存活小鼠的中值cfu/肺用棒(bar) 表不。發(fā)明詳述如本文所用的，“抗體”指蛋白，該蛋白在功能上被定義為結合蛋白，在結構上被定 義為包含的氨基酸序列被本領域技術人員公認為來自產(chǎn)生抗體的動物的免疫球蛋白編碼 基因的框架區(qū)?？贵w能夠包含一個或多個基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段 編碼的多肽。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε*μ恒定區(qū)基因，以及多 種免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，其依次分別 定義免疫球蛋白類型IgG，IgM, IgA, IgD和IgE0已知典型的免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。每個四聚體由兩對完全相 同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N 末端確定了由大約100-110或更多的氨基酸構成的可變區(qū)，主要負責抗原識別。術語可變 輕鏈和可變重鏈(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。此處使用的術語“抗體”包括保留結合特異性的抗體片段。例如，有許多表征清楚 的抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵下游消化抗體，以產(chǎn)生F(ab) ! 2，F(xiàn)ab 的二聚體，該二聚體自身是通過二硫鍵連接到VH-CHl (Fd)的輕鏈。該F(ab)、能夠在溫和 條件下被還原，以破壞在鉸鏈區(qū)的二硫鍵，從而將(Fab' )2 二聚體轉化為Fab'單體。該 Fab'單體本質上是帶有全部或部分鉸鏈區(qū)的Fab (參見Fundamental Immunology (基礎免 疫學)，1丄.？3111，6(1.，1^%11 Press, N. Y. (1993)，對于其他抗體片段的更具體的描述)。盡
10管根據(jù)完整抗體的消化定義了多種抗體片段，本領域技術人員會認識到能夠以化學方式或 通過利用重組DNA方法學從頭合成片段。因此，此處使用的術語抗體還包括通過完整抗體 的修飾產(chǎn)生的或利用重組DAN方法學合成的抗體片段。本發(fā)明的抗體包括諸如二聚體、Vh 二聚體或\ 二聚體的二聚體，包括單鏈抗 體(以單多肽鏈存在的抗體)，諸如單鏈Fv抗體(sFv或scFv)，其中可變重鏈區(qū)和可變輕 鏈區(qū)連接在一起(直接地或通過肽連接子)以形成連續(xù)的多肽。單鏈Fv抗體是共價連接 的Vh-Vl異源二聚體，其從包括直接連接的或通過肽編碼連接子連接的Vh-和編碼序列 的核酸表達(例如，Huston, et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA, 85 :5879_5883，1988)。雖然 Vh 和\作為單多肽鏈相互連接，但Vh和\結構域的結合是非共價的。可選擇地，該抗體可以 是另一片段，諸如二硫化物穩(wěn)定的Fv(dsFv)。還可以包括利用重組技術產(chǎn)生其他片段。將 來自抗體V區(qū)的天然聚合但以化學方法分離的輕及重多肽鏈轉化成折疊為三維結構的分 子的scFv抗體和許多其他結構是本領域技術人員已知的，所述三維結構基本上與抗原結 合位點的結構相似。(參見諸如 U. S. Patent Nos. 5，091，513，5，132，405，及 4，956，778)。 在某些實施方案中，抗體包括那些已經(jīng)通過噬菌體展示的或通過利用載體的重組技術產(chǎn)生 的那些，所述載體中，鏈被分泌為例如SCFV、FV、Fab、(Fab' )2的可溶蛋白或通過利用其中 鏈被分泌為可溶蛋白的載體的重組技術產(chǎn)生。用于本發(fā)明的抗體還可以包括雙抗體和微型 抗體。本發(fā)明的抗體還包括例如來自駱駝科動物抗體的重鏈二聚體。由于駱駝科動 物體內(nèi)的重鏈二聚體IgG的Vh區(qū)不必與輕鏈之間形成疏水作用，因此，通常接觸輕鏈的 重鏈中的該區(qū)在駱駝科動物體內(nèi)被改變?yōu)橛H水性氨基酸殘基。重鏈二聚體IgGs的Vh結 構域被稱為VHH結構域。本發(fā)明的抗體包括單域抗體(dAbs)和納米抗體(參見例如 Cortez-Retamozo, et al, Cancer Res. 64 :2853_2857,2004)。如本文所用的，“V-區(qū)”指抗體可變區(qū)結構域，該結構域包含框架1、⑶R1、框架2、 ⑶R2和框架3，包括⑶R3和框架4節(jié)段，這些節(jié)段作為B細胞分化期間重鏈和輕鏈V基因 重排的結果被加到V-節(jié)段上。本文使用的“V-節(jié)段”指由V基因編碼的V-區(qū)(重或輕鏈) 的區(qū)。重鏈可變區(qū)的V-節(jié)段編碼FRl-⑶R1-FR2-⑶R2和FR3。出于本發(fā)明的目的，輕鏈可 變區(qū)的V-節(jié)段被定義為通過FR3延伸直到⑶R3。如本文所用的，術語“J-節(jié)段”指編碼的可變區(qū)的亞序列，其包含⑶R3和FR4的C 末端部分。內(nèi)源性J-節(jié)段由免疫球蛋白J基因編碼。如本文所用的，術語“互補性決定區(qū)(CDR) ”指每條鏈上的三個高變區(qū)，其中斷由輕 和重鏈可變區(qū)確立的四個“框架”區(qū)。這些⑶R主要負責結合到抗原表位。每條鏈的⑶Rs 通常指從N末端開始順序編號為⑶R1、⑶R2和⑶R3，以及通常被其中有特定⑶R的鏈所確 定。因此，例如，Vh⑶R3位于它被發(fā)現(xiàn)的抗體重鏈可變結構域；而Vl⑶Rl是來自它被發(fā)現(xiàn) 的抗體輕鏈可變結構域的CDRl。不同輕或重鏈的框架區(qū)的序列在同一物種內(nèi)是相對保守的?？贵w的框架區(qū)是組成 型輕和重鏈的組合框架區(qū)，用于在三維空間定位和排列⑶Rs。CDRs和框架區(qū)的氨基酸序列可以利用為本領域技術人員所熟知的不同的定義來 確定，例如Kabat、Chothia、國際免疫遺傳學數(shù)據(jù)庫(IMGT)和AbM(參見例如Johnson et al，supra;Chothia&Lesk，1987，Canonical structures for the hypervariable regionsof immunoglobulins (用于免疫球蛋白高變區(qū)的極限結構式).J. MoI. Biol. 196,901-917 ； Chothia C. et al. ,1989,Conformations of immunoglobulin hypervariableregions( jki 疫球蛋白高變區(qū)的構造).Nature 342，877-883 ；Chothia C. etal.，1992，structural repertoire of the human VH segments (人 VH 節(jié)段的結構集合)· J. MoI. Biol. 227， 799-817 ；Al-Lazikani et al, J. MolBiol 1997，273 (4))。抗原結合位點的定義還在下 列文章中被描述Ruiz et al.，IMGT，國際免疫遺傳學數(shù)據(jù)庫。Nucleic Acids Res. 28， 219-221(2000)；以及Lefranc，Μ. -P. IMGT,國際免疫遺傳學數(shù)據(jù)庫。核酸研究，Janl ； 29(1) 207-9 (2001) ；MacCalIum et al, Antibody-antigen interactions :Contact analysis and binding site topography (抗體-抗原相互作用接觸分析及結合位點布 局)，J. Mol. Biol.，262 (5) ,732-745(1996)；以及Martin et al,Proc. Natl Acad. Sci. USA， 86,9268-9272(1989) ；Martin, etal, Methods Enzymol，203，12卜153，(1991) ；Pedersen et al, Immimomethods, 1,126, (1992)；以及 Rees et al, In Sternberg Μ. J. Ε. (ed.), Protein Structure Prediction (蛋白質結構予頁測)· Oxford UniversityPress, Oxford, 141-1721996)?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”指抗體與其結合的抗原上的位點。表位可以通過連續(xù)的 氨基酸或經(jīng)由蛋白三級折疊緊靠的非連續(xù)的氨基酸形成。暴露于變性劑時，通過連續(xù)的氨 基酸形成的表位通常保持，而通過三級折疊形成的表位通常在用變性劑處理時消失。表位 在獨特的空間構象中通常包括至少3個，以及更通常地至少5個或8-10個氨基酸。確定表 位空間構象的方法包括例如X射線晶體學和二維核磁共振。參見例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology () Vol. 66，Glenn E. Morris, Ed(1996)。本發(fā)明上下文中使用的術語“結合特異性決定簇”或“BSD”指在CDR區(qū)內(nèi)用于確 定抗體結合特異性所必需的最小的連續(xù)或非連續(xù)氨基酸序列。在本發(fā)明中，該最小結合特 異性決定簇位于抗體重鏈和輕鏈的⑶R3序列的部分或全長內(nèi)。如本文所用的，術語“PcrV拮抗抗體”或“抗-PcrV抗體是銅綠假單胞菌III型 分泌系統(tǒng)的拮抗劑”可互相替換使用，指結合到PcrV并抑制III型分泌系統(tǒng)的抗體。與不 受抗體拮抗劑作用的分泌相比，當經(jīng)由III型分泌系統(tǒng)的分泌減少至少約10%，例如減少 至少大約25%、50%、75%，或完全抑制時，則發(fā)生了抑制作用。除非另有陳述，否則術語 “抗-PcrV抗體”和“PcrV抗體”同義使用。術語“平衡解離常數(shù)(Kd) ”指除以結合速率常數(shù)(ka，時間-Ι,Μ—1)的解離速率常數(shù) (kd，時間―1)。平衡解離常數(shù)可以利用本領域技術人員所熟知的任一方法測量。本發(fā)明的抗 體是高親和力抗體。這種抗體具有優(yōu)于500nM，通常優(yōu)于50nM或IOnM的親和力。因此，在 某些實施方案中，本發(fā)明的抗體具有范圍為500nM-100pM，或者范圍為50或25nM-100pM，或 者范圍介于為50或25nM-50pM，或者范圍為50nM或25nM_lpM的親和力。如本文所用的，“人源化抗體(humanized antibody)，，指將來自供體抗體的CDRs 移植到人框架序列的的免疫球蛋白分子。人源化抗體還可以在框架序列中包含供體來源 的殘基。人源化抗體還可以包含人免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。人源化抗體還可以 包含既不是在受體抗體也不是在輸入的CDR或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。人源化能夠利用 本領域所熟知的方法來實現(xiàn)(例如，Jones et al, Nature 321 522~525 ； 1986 ；Riechmannet al. , Nature 332 323-327,1988 ；Verhoeyen et al，Science 239:1534-1536,1988)； Presta,Curr. Op. Struct. Biol 2 :593_596，1992 ；U. S. Patent No. 4，816，567)，包括諸如〃 超人化(superhumanizing)“抗體(Tan et al, J. Immunol 169 1119，2002)和〃表面重 塑(resurfacing) 〃 (e.g.,Staelens et al,MoL Immunol 43 1243,2006 ；and Roguska et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 91 :969，1994)的技術。本發(fā)明上下文中的“人工程化”抗體(“humaneered” antibody)指具有參照抗體 結合特異性的工程化人抗體。用于本發(fā)明的“人工程化”抗體具有包含從供體免疫球蛋白 衍生的最小序列的免疫球蛋白分子。通常地，抗體通過將編碼來自參照抗體重鏈CDR3區(qū) 的結合特異性決定簇(BSD)的DNA序列連接到人Vh節(jié)段序列，以及將來自參照抗體輕鏈 ⑶R3BSD連接到人\節(jié)段序列被“人工程化”。“BSD”指介導結合特異性的⑶R3-FR4區(qū)，或 該區(qū)的一部分。因此，結合特異性決定簇可以是⑶R3-FR4、⑶R3、⑶R3的最小必需結合特異 性決定簇(其指當存在于抗體V區(qū)時賦予結合特異性的任一小于CDR3的區(qū))、D節(jié)段(關 于重鏈區(qū))，或賦予參照抗體結合特異性的CDR3-FR4的其他區(qū)。人工程化的方法在公布號 為20050255552的美國專利申請和公布號為20060134098的美國專利申請中被提供。當術語“雜種”被用于提及核酸或蛋白的部分時，表示該核酸或蛋白包含兩個或多 個序列，這些序列通常不是在自然界發(fā)現(xiàn)的彼此有相同親緣關系的序列。例如，該核酸通常 通過被排列來生產(chǎn)新的功能性核酸的無關聯(lián)的基因以重組方式產(chǎn)生，其具有兩個或多個序 列。近似地，雜種化蛋白指通常不是在自然界發(fā)現(xiàn)的彼此有相同親緣關系的序列的兩個或 多個序列。當術語“重組”被用于提及諸如細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白 或載體已經(jīng)通過下列方式被修飾異源性核酸或蛋白的導入，或者天然核酸或蛋白的改造， 或者細胞衍生自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非重組的)形式的細 胞中沒有發(fā)現(xiàn)的基因或表達天然基因，否則該天然基因會異常表達、低表達或完全不表達。 至于此處的術語“重組核酸”，指一般通過對核酸的處理，例如以自然界不常見的形式利用 聚合酶和內(nèi)切核酸酶，最初在體外形成的核酸。通過這種方法，可以實現(xiàn)不同序列間的可操 作連接。由此，以線性形式存在的分離的核酸或通過連接正常不被連接的DNA分子在體外 形成的表達載體都被視為出于本發(fā)明目的的重組?？梢岳斫?，一旦重組核酸被形成并再導 入宿主細胞或生物體，它將以非重組形式復制，即利用宿主細胞的體內(nèi)細胞機制，而不是通 過體內(nèi)操縱。然而，這種核酸一旦以重組的形式生產(chǎn)，盡管此后以非重組形式復制，仍被視 為出于本發(fā)明目的的重組。類似地，“重組蛋白”是利用重組技術制備的蛋白，即通過如上所 述的重組核酸的表達。當指蛋白或肽時，短語“特異性(或選擇性)結合”到抗體或“與之發(fā)生特異性(或 選擇性)免疫反應”指其中抗體結合到感興趣蛋白的結合反應。在本發(fā)明的上下文中，抗體 通常結合PcrV的親和力為500nM或更低，并對其他抗原具有5000nM或更高的親和力。在兩個或更多個多肽(或核酸)序列的情況下，術語“一致的”或“一致性”百分 比指相同的兩個或更多個序列或亞序列，或者具有相同的氨基酸(或核苷酸)殘基的特定 百分比的兩個或更多個序列或亞序列(即，當在比較窗口或指定區(qū)域上進行比較和比對， 以得到最大相符時，在特定區(qū)域上大約60 % —致性，優(yōu)選地70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 91 %，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高的一致)，如利用帶有下述缺省參數(shù)的BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法或通過人工比對和目視檢測方法所測量的(參見 例如NCBI網(wǎng)站)。那么，這種序列被描述為“基本上一致的”?！盎旧弦恢碌摹毙蛄羞€包括 具有刪除和/或添加的序列，以及具有取代以及天然存在的那些，例如多態(tài)性或等位變異 體和人造變異體。如下所述的，優(yōu)選的算法能夠將空位等考慮在內(nèi)。優(yōu)選地，蛋白序列一致 性存在于至少大約25個氨基酸長度的區(qū)，或更優(yōu)選地存在于50-100個氨基酸長度的區(qū)，或 整個蛋白長度。如本文所用的，“比較窗”包括參照一般選自20-600、通常約50-約200、更通常約 100至約150個連續(xù)位置數(shù)的一個的節(jié)段，其中在將兩序列最佳比對后，可以將序列與相同 連續(xù)位置數(shù)的參照序列比較。用于比較的序列的比對方法為本領域的技術人員所熟知。用 于比較的序列的最佳比對可以例如通過Smith & Waterman, Adv. App 1. Math. 2 =482(1981) 的局部同源性算法，通過Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol 48:443(1970)的同源性比對 算法，通過 Pearson & Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci USA 85 2444(1988)的對相似性方 法的研究，通過這些算法的計算機實現(xiàn)(威斯康星遺傳學軟件包中的GAP，BESTFIT, FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575Science Dr.，Madison, WI)，或通過人工比對和 目視檢測(參見例如Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學通用技術) (Au sub el et al.，eds. 1995supplement))進行。適于測定序列一致性百分比和序列相似性的優(yōu)選的算法實例包括BLAST和BLAST 2.0 算法，這些算法在 Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25 3389-3402 (1977)和 Altschul et al, J. Mol. Biol 215 :403_410 (1990)中被描述。具有本文所描述的參數(shù)的BLAST和 BLAST 2.0被用于測定本發(fā)明中的核酸和蛋白的序列一致性百分比。BLASTN程序(對于 核苷酸序列)使用的缺省值是字長(W)為11、期望值(E)為10、M = 5、N = -4以及進 行雙鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省值是字長為3和期望值(E)為 10,以及 BL0SUM62 記分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 10915(1989))比對值(B)為50、期望值(E)為10、M = 5、N = -4以及進行雙鏈的比較。術語“分離的”、“純化的”或“生物學純的”指物質基本上或實質上沒有通常如在其 天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的伴隨的組分。純度和同質性通常利用諸如聚丙烯凝膠電泳和高效液相色 譜法的分析化學技術來測定。存在于制劑中的主要種類的蛋白是基本上純化的。術語“純 化的”在某些實施方案中表示在電泳凝膠中基本上產(chǎn)生一條帶的蛋白。優(yōu)選地，它表示蛋白 是至少85%純的，更優(yōu)選地至少95%純的，以及最優(yōu)選地至少99%純的。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可以互相替換使用，用于指氨基酸殘基的多聚 體。該術語適用于氨基酸多聚體，該氨基酸多聚體中的一個或多個氨基酸殘基是與對應的 天然存在的氨基酸的人工化學模擬物。此外，該術語還適用于天然存在的氨基酸多聚體、包 含修飾的殘基的那些，以及非天然存在的氨基酸多聚體。術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，此外還指在功能上與天然存在的氨 基酸類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些， 以及后來被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類 似物指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學結構的化合物，例如與氫結合成鍵的α碳、 羧基、氨基、R基，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物可 以具有修飾的R基(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物指具有與氨基酸一般化學結構不同的結構的化合物，但其功 能與天然存在的氨基酸類似。本文的氨基酸可以通過它們公知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委 員會推薦的單字母符號被提及。同樣地，核苷酸可以通過它們公認的單字母代碼被提及?！氨Ｊ匦孕揎椀淖凅w”適用于氨基酸和核酸序列兩者。對于特定的核酸序列，保守 性修飾的變體指那些編碼一致的或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或者如果核酸不編碼 氨基酸序列，指基本上一致的或關聯(lián)的，例如天然連續(xù)的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大 量的功能上一致的核酸編碼大多數(shù)蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸 丙氨酸。因此，在由密碼子指定丙氨酸的每一個位置，密碼子可以被改變?yōu)榱硪粋€對應的所 述密碼子，而被不改變被編碼的多肽。這種核酸變異是“沉默變異”，其是一種保守性修飾的 變異。本文每一個編碼多肽的核酸序列還描述了核酸的沉默變異。本領域的技術人員會認 識到，在特定背景下，核酸(除了 AUG，其通常是唯一的用于甲硫氨酸的密碼子；以及TGG，其 通常是唯一的用于色氨酸的密碼子)中的每個密碼子都能夠被修飾，以產(chǎn)生功能相同的分 子。因此，對于表達產(chǎn)物，而不是對于實際的探針序列，隱含了編碼多肽的核酸的經(jīng)常性沉 默變異。對于氨基酸序列，本領域的技術人員會認識到，對改變、添加或刪除單個氨基酸或 編碼序列中的小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白序列的個別置換、刪除或添加是“保 守性修飾的變體”，其中的改變產(chǎn)生了用化學上相似的氨基酸對氨基酸取代。諸如BLOSUM 的保守取代表和取代矩陣提供了功能上相似的氨基酸，這是為本領域所熟知的。這種保守 性修飾的變體還包括并不排除本發(fā)明中的多態(tài)變異體、種間同系物和等位基因。典型的相 互間保守取代包括1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺 (N)，谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)， 纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；以及8) 半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如Creighton, Proteins (1984))。I.簡介本發(fā)明涉及以高親和力結合到來自銅綠假單胞菌的PcrV抗原的抗體，并且通常 是III型分泌系統(tǒng)的功能性拮抗劑。該抗體包含與人種系Vh和\序列具有高度同源性 的可變區(qū)。重和輕鏈的⑶R3序列包含一對來自單克隆抗-PcrV抗體Mabl66的結合特異 性決定簇(BSD) (Frank et al.，J. Infectious Dis. 186 :64_73，2002 ；and U. S. Patent No6, 827，935)，并且本發(fā)明的抗體與Mab 166競爭對PcrV蛋白上的中和表位的結合(參見 例如 U. S. Patent No. 6，827，935)。⑶RH3中的BSD序列具有氨基酸序列NRGDIYYDFTY。在某些實施方案中，本發(fā)明的 抗體具有重鏈⑶R3序列NRGDIYYDFTYA (M/F) DX，其中的X是I、S或Q。⑶RL3中的BSD是FWXTP (其中X可以是S或G)。完整的V區(qū)通過如下方式產(chǎn)生 在其中，BSD形成部分⑶R3，另外的序列用于完成⑶R3和添加FR4序列。通常，⑶R3除BSD 之外的部分和整個FR4由人種系序列組成。在優(yōu)選的實施方案中，除BSD之外的⑶R3-FR4 序列與人種系序列的區(qū)別在每條鏈上不超過2個氨基酸。人種系V節(jié)段的集合由51個重鏈V節(jié)段、40 κ輕鏈V節(jié)段和31 λ輕鏈V節(jié)段組 成，產(chǎn)生共計3，621個種系V區(qū)對。另外還有針對這些V節(jié)段的大多數(shù)的穩(wěn)定等位變異體，
15但這些變異體對種系集合的結構多樣性的貢獻是有限的。所有人種系V節(jié)段基因的序列都 是已知的，并可以在由英國劍橋蛋白質工程中心(MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom)(還參見 Chothia et al,1992, JMol Biol227 :776_798 ； Tomlinson et al，1995，EMBO J 14 4628-4638 ；Cook et al (1995)Immunol. Today 16: 237-242and Williams et al, 1996, J Mol Biol 264 :220_232)提供的基于V的數(shù)據(jù)庫或國 際免疫遺傳學數(shù)據(jù)庫(the international ImMunoGeneTics database, IMGT)中獲取。這 些序列可用作本發(fā)明抗體的人種系節(jié)段的參照來源。本文所描述的抗體或抗體片段能夠在原核或真核微生物系統(tǒng)中、或者在諸如哺乳 動物細胞的更高級的真核生物細胞中表達。本發(fā)明中所用的抗體可以是任何形式。例如，在某些實施方案中，該抗體可以是 包含恒定區(qū)，例如人的恒定區(qū)的完整抗體，或者可以是完整抗體的片段或衍生物，例如Fab， Fab'，F(xiàn) (ab ‘ ) 2，scFv, Fv,或者是單域抗體，例如納米抗體或駱駝科動物抗體。II.重鏈本發(fā)明的抗-PcrV抗體的重鏈包含具有下列元件的重鏈V區(qū)1)包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人重鏈V節(jié)段序列2)包含氨基酸序列NRGDIYYDFTY的CDRH3區(qū)3)由人種系J基因節(jié)段提供的FR4。圖1中顯示了支持結合到PcrV的V節(jié)段序列及前面所述的⑶R3-FR4節(jié)段及互 補的\區(qū)的實例。該V節(jié)段可以來自人的VHl或VH3亞類。在某些實施方案中，該V節(jié)段 是與種系節(jié)段VH3-30. 3具有高度氨基酸序列一致性的人Vh3亞類節(jié)段。例如該V節(jié)段與 VH3-30. 3的區(qū)別不超過15個殘基，以及優(yōu)選地不超過7個殘基。本發(fā)明的抗體的FR4序列由人的J節(jié)段提供。6個重鏈JH區(qū)編號為1-6。由此， 該FR4序列可以由JH1，JH2，JH3，JH4，JH5或JH6基因片段提供。通常地，本發(fā)明的抗體 的FR4區(qū)與提供FR4的人種系J片段的FR4區(qū)具有至少90 %，通常至少91 %，92 %，93 %， 94%,95% 96%，97%，98%，99%或 100%的一致性。在某些實施方案中，該FR4序列由人種系JH3節(jié)段提供，并具有序列WGQGTMVTVSS。 在其他的實施方案中，該FR4由人種系JH6節(jié)段提供，并具有序列WGQGTTVTVSS。⑶RH3還包含來自人的J節(jié)段的序列。通常地，除去BSD的⑶RH3-FR4序列人種 系J節(jié)段的區(qū)別不超過2個氨基酸。在典型的實施方案中，CDRH3中的J節(jié)段序列來自用 于FR4序列的同樣的J節(jié)段。由此，在某些實施方案中，該CDRH3-FR4區(qū)包含BSD和完整的 人JH3種系基因片段。CDRH3和FR4序列的示例性組合如下所示，其中BSD用粗體、人種系 J片段殘基用下劃線表示。CDR3NRGDIYYDFTYAFDIffGQGTMVTVSS (FR4 = JH3)NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTMVTVSS (FR4 = JH3)NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTTVTVSS (FR4 = JH6)在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含與種系節(jié)段VH330. 3或與種系VH1-18節(jié)段 具有至少 90% —致性，或至少 91%，92% 93%，94%，95%，965，97%，98%，99%或 100% — 致性的V節(jié)段，或者與圖1所示的的一個V節(jié)段，諸如SEQ ID NOs 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，26，27，29和35的V節(jié)段部分具有上述一致性在某些實施方案中，VH區(qū)的V節(jié)段具有如圖1所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 發(fā)明的抗體可以具有包含序列TAGMH、SYGIH、SYGMH、SYPLH或NYPMH的CDRl ；或包含序列 VIffYNGKEISYADSVKG,FISYDGSEKYYASSVKG 或 VISYDGSEKWYADSVKG 的 CDR2。在某些實施方案 中，VH區(qū)的CDR2具有帶負電荷的氨基酸，該氨基酸位于CDR2的大致中間，例如第8或9位。在特定的實施方案中，抗體具有來自圖1所示的節(jié)段的一個的CDRl 和 CDR2，以及包含 NRGDIYYDFTY 的 CDR3 如 NRGDIYYDFTYAFDI 或 NRGDIYYDFTYAMDI。由 此，本發(fā)明的抗-PcrV抗體可以例如，具有包含序列NRGDIYYDFTYAFDIWGQGTMVTVSS， NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTMVTVSS 或 NRGDIYYDFTYAMDIWGQGTTVTVSS 的 CDR3-FR4。在其他的實 施方案中，該抗體可以包含具有序列NRGDIYYDFTYA(M/F)D(Q/S)的⑶R3。III.輕鏈本發(fā)明的抗-PcrV抗體的輕鏈包含具有下列元件的輕鏈V區(qū)1)包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人輕鏈V節(jié)段序列2)包含序列FWXTP (其中X可以是S或G)的⑶RL3區(qū)3)由人種系J基因節(jié)段提供的FR4。八區(qū)包含V λ或VK V節(jié)段。圖2中提供了支持結合的V λ和VK序列及互補的 Vh區(qū)的實例。Vk節(jié)段在人種系JK2節(jié)段的上游被克隆，V λ片段在種系JL2節(jié)段的上游被克隆。⑶RL3序列包含衍生自V節(jié)段和J節(jié)段的序列。在典型的實施方案中，⑶RL3中的 J節(jié)段序列來自用于FR4的同樣的J節(jié)段。由此，與人κ種系V節(jié)段和J節(jié)段序列的差異 可以不超過2個氨基酸。在某些實施方案中，該⑶RL3-FR4區(qū)包含BSD和完整的人JK2種 系基因節(jié)段。用于κ鏈的示例性CDRL3-FR4組合如下所示，其中BSD用粗體、JK2序列用 下劃線表示。CDR3QQFffSTPYTFGQGTKLEIK (JK2)QHFffGTPYTFGQGTKLEIK (JK2)用于λ鏈的優(yōu)選的⑶R3-FR4如下所示，其中BSD用粗體、JL2序列用下劃線表示。CDR3QHFffSTPYTFGGGTKLTVL (JL2)本發(fā)明的抗體的FR4序列由人的J節(jié)段提供。5個人Jk區(qū)節(jié)段標記為1_5，以及 4個JX區(qū)節(jié)段標記為1、2、3、7。由此，該FR4序列可以由這些種系序列中的任何一個提供。 通常地，本發(fā)明的抗體的FR4區(qū)與提供FR4的人種系J節(jié)段的FR4區(qū)具有至少90 %，通常至 少 91%，92%，93%，94%，95% 96%，97%，98%，99%或 100%的一致性。VK節(jié)段通常屬于VKI或VKIII亞類。在某些實施方案中，該節(jié)段具有與人種系 VKI或VKIII亞類至少80%的序列一致性，例如與人種系VKI L12序列或與人種系VKIII L2或VKIII All序列至少80%的一致性。例如，Vk片段可以與VKI L12的區(qū)別不超過18 個殘基，或與VKIII All或VKIII L2的區(qū)別不超過12個殘基。在其他實施方案中，本發(fā)明 的抗體的八區(qū)V節(jié)段與人種系VKI L12或人種系VkIII L2序列或人種系VKIII All序列 或圖 2 中所示的 Vl 區(qū)的 κ V 節(jié)段序列，例如 SEQ ID NOs. 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24或37的V節(jié)段序列，具有至少85 %的一致性，或至少90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %， 96%,97%,98%,99%^； 100% 的一致性。在某些實施方案中，八的V節(jié)段對應人種系V λ節(jié)段。因此，在某些實施方案中，V 節(jié)段與圖2中的Vl區(qū)的V λ V節(jié)段，諸如SEQ IDNOs. 28，30，32或34的V節(jié)段序列具有至少 85 % 的一致性，或至少 90 %，91 %，92 %，93 %，94%，95 %，96 %，97 %，98 %，99 %或 100 %
的一致性。在某些實施方案中，八區(qū)的V節(jié)段具有如圖2所示的⑶Rl和/或⑶R2。例如，本 發(fā)明的抗體可以具有 CDRl 序列 RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、RASQSISRWVA、RASQGISTYLA 或 RASEGVDRffLA ；或 CDR2 序列 AASSLQS、DASSLKS、AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。在其他的實 施方案中，該抗體可以具有CDRl序列QGDSLRSYYA、TGTSSDVGAYNYVS或TGTSSDYV ；或CDR2 序列 GKNNRPS、EVTKRPS 或 DVTNRPS。在特定的實施方案中，本發(fā)明的抗-PcrV抗體可以具有組合顯示在圖2中所示的 Vl區(qū)的一個V節(jié)段的⑶Rl和⑶R2，以及包含F(xiàn)WXTP的⑶R3序列，其中X為S或G，例如 CDR3可以是QQFWSTPYT、QHFffGTPYT或QHFWSTPYT。在某些實施方案中，這種抗-PcrV抗體 可以包含F(xiàn)R4區(qū)，該FR4區(qū)是reQGTKLEIK或FGGGTKLTVL。因此本發(fā)明的抗-PcrV抗體可以 包含例如，來自圖2所示的一個\區(qū)的⑶Rl和⑶R2，以及⑶R3-FR4區(qū)，該⑶R3-FR4區(qū)是 QFWSTPYTFGQGTKLEIK、QHFffGTPYTFGQGTKLEIK 或 QHFWSTPYTFGGGTKLTVL。IV. PcrV抗體的制備本發(fā)明的抗體可以包含SEQ ID NOs. 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，26， 27，29 或 35 的 Vh 區(qū)的任一個及 SEQ ID NOs. 2,4,6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，28，30，
32，34，36或37的Vl區(qū)的任一個?？贵w可經(jīng)測試，以確定該抗體保留拮抗III型分泌系統(tǒng)的活性。拮抗劑活性能夠 利用多種指標確定，包括細胞毒性測定。示例性的測定在例如美國第6，827，935號專利中 被描述。被給予治療銅綠假單胞菌感染的抗體優(yōu)選地保留至少75%，優(yōu)選地80%，90%， 95%或100%的Mabl66的III型分泌通路拮抗劑活性(美國第6，827，935號專利)?？梢岳檬熘臏y定來鑒定高親和力抗體，以確定結合活性和親和力。這種技術 包括ELISA測定，以及利用表面等離子共振或干涉測量技術測定的結合測定。例如，親和力 可以通過利用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物傳感器的生物膜層干涉測量技術測 定。本發(fā)明的抗體通常與Mabl66競爭對PcrV的結合。Mabl66結合到的PcrV的區(qū)已 經(jīng)被識別(美國專利No. 6，827，935)。結合Mabl66的PcrV或其片段可被用于競爭性結合 測定。本文所描述的抗體阻斷Mabl66或與Mabl66競爭對PcrV的結合的能力表明，該抗體 與Mabl66結合相同的表位，或結合到與Mabl66結合的表位接近的表位，例如與Mabl66結 合的表位交疊的表位。在其他的實施方案中，本文所述的抗體，例如表1中所示的包含Vh* 八區(qū)組合的抗體，可以被用作參照抗體，以評價是否有另一抗體競爭對PcrV的結合。在測試 抗體存在的情況下，如果參照抗體對抗原的結合減少至少30%，通常至少大約40%、50%、 60%或75%，以及經(jīng)常至少約90%，則測試抗體被視為競爭性地抑制參照抗體的結合。在某些實施方案中，抗PcrV抗體不需要拮抗III型分泌序列。例如，結合到PcrV 的本發(fā)明的抗體能夠募集免疫系統(tǒng)多種類型的細胞，以刺激巨噬細胞的吞噬作用、巨噬細胞或NK細胞的抗體導向性細胞毒性(ADCC)、補體級聯(lián)的激活和/或中性粒細胞氧化爆發(fā) 的生成，從而導致細菌，例如銅綠假單胞菌的死亡。此外，所有的抗體可變區(qū)都能夠催化來 自由活化的中性粒細胞提供的單態(tài)氧的氧化還原反應，導致直接損傷細菌的多種高效力的 氧化劑生成(參見例如 Wentworth et al. , Proc. Natl Acad. Sci USA 97 10930-10935, 2000)，包括臭氧，一種也能夠刺激炎癥應答的有效的抗菌劑(參見例如Babior et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100 :3031_3034，2003)。實際上，由補體激活和臭氧生成引起的 炎癥具有募集免疫系統(tǒng)的其他成分，以進一步促進免疫的潛能。這種抗體通常具有50nM或 更低的親和力，通常低于約ΙΟηΜ。與抗生素結合使用的非中和及中和抗PcrV抗體提供了強治療效應。先前已經(jīng)描述了帶有與人種系序列接近的V區(qū)序列的抗體的分離方法(美國專利 申請20050255552和20060134098)?？贵w庫可以在適合的宿主細胞中表達，包括哺乳動物 細胞、酵母細胞或原核細胞。為了在某些細胞體系中表達，可以在N-末端引入信號肽，以將 分泌導向細胞外介質。有或無信號肽的抗體可以從諸如大腸桿菌(E.coli)的細菌細胞分 泌。在美國專利申請20070020685中描述了抗體片段從大腸桿菌的無信號分泌。為了生成PcrV-結合抗體，本發(fā)明的一個Vh區(qū)與本發(fā)明的一個八區(qū)結合，并 在適合的表達系統(tǒng)中以許多形式中的任一種表達。由此，該抗體可以表達為ScFV、Fab、 Fab'(包含免疫球蛋白鉸鏈序列)、F(ab' )2(通過兩個Fab'分子鉸鏈序列間形成二硫鍵 結構而形成)、完整的免疫球蛋白或截短的免疫球蛋白，或在原核或真核宿主細胞中，無論 是在宿主細胞內(nèi)還是通過分泌方式，表達為融合蛋白。甲硫氨酸殘基可以任選地存在于多 肽的N末端，所述多肽例如產(chǎn)生在無信號表達系統(tǒng)中的多肽。本文描述的每一個Vh區(qū)都可 以與每一個\區(qū)成對，以生成抗-PcrV抗體。例如VH3 1080-2F被從庫中識別與兩條不同 的 λ 輕鏈成對(1080-2F 和 1080-11Ε)。κ 鏈 1069-3F 被識別與 VH3 1069-3F 和 VH31100-3 成對。表1中展示了示例性的重鏈和輕鏈的組合。表1-示例性的抗體重鏈和輕鏈的組合 在許多實施方案中，本發(fā)明的抗體拮抗銅綠假單胞菌III型分泌系統(tǒng)，并通常顯 示結合到PcrV的高親和力。如果抗體的親和力低于500或ΙΟΟηΜ，例如低于50nM或低于 25nM，或低于ΙΟηΜ，或低于InM，例如低于大約ΙΟΟρΜ，則抗體與抗原之間存在高親和力。當 使用諸如ELISA、表面等離子共振測定或干涉測量技術被檢測為Fabs時，本發(fā)明的抗體通 常具有50nM或更低，經(jīng)常IOnM或更低的親和力。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體在細胞毒性檢測方面比Mabl66更有效?？梢岳枚喾N表達系統(tǒng)，包括原核的和真核的表達系統(tǒng)來生產(chǎn)抗體。許多這種系 統(tǒng)可以從供應商處廣泛獲取。在抗體包含Vh和\區(qū)兩者的實施方案中，該Vh和\區(qū)可以 利用單一載體來表達，例如在雙順反子表達單元中或在不同啟動子控制下。在其他的實施 方案中，該區(qū)可以利用分別的載體來表達。本發(fā)明的抗體可以在N末端具有或不具 有甲硫氨酸的情況下被表達。因此，本文所描述的Vh或\區(qū)可以在N末端任選地包含甲硫 氨酸。本發(fā)明的抗體可以通過多種形式來生產(chǎn)，包括作為Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv或 dAB。本發(fā)明的抗體還能夠包括人的恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)可以是人的κ或λ恒定區(qū)。重 鏈恒定區(qū)通常是 鏈恒定區(qū)，例如Y-l、Y-2, γ-3或Y-4恒定區(qū)。在其他的實施方案
20中，該抗體可以是IgA。在某些實施方案中，抗體給予人時是“非免疫原性”的。本文所使用的術語“非免 疫原性”指當給予人時，本發(fā)明的PcrV抗體不激發(fā)針對抗-PcrV抗體的抗體生成?？梢岳?用已知的檢測方法測定抗體的免疫原性，例如實施例5中所描述的電化學發(fā)光免疫測定。 這種測定檢測存在于患者體內(nèi)，例如來自患者血清樣本的抗體水平，該抗體與給予患者的 抗-PcrV抗體發(fā)生反應。當樣本中不存在針對抗-PcrV抗體的可檢測的抗體時，例如通過與 來自沒有給予該抗體的個體的對照樣本相比較，測定被視為表明該抗體是非免疫原性的。V.抗體的聚乙二醇化在某些實施方案中，例如其中抗體是片段，該抗體能夠被結合到另一分子，例如聚 乙二醇(聚乙二醇化)或血清蛋白，以在體內(nèi)提供延長的半衰期?？贵w片段聚乙二醇化的實 例在Knight et al. Plateletsl5 :409，2004(用于阿昔單抗)；Pedley et al. ,Br. J. Cancer 70 :1126，1994(用于抗-CEA 抗體)；Chapman et al, Nature Biotech. 17 :780，1999 ；以及 Humphreys, et al.，Protein Eng. Des. 20 227,2007)中被提供。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體以Fab'片段的形式存在。全長輕鏈通過將八 區(qū)融合到人的κ或λ恒定區(qū)產(chǎn)生。任一恒定區(qū)可被用于任何輕鏈。然而，在典型的實施 方案中，κ恒定區(qū)與VK可變區(qū)聯(lián)用，以及λ恒定區(qū)被用于與νλ可變區(qū)聯(lián)用。Fab'的重鏈是Fd'片段，其是通過將本發(fā)明的Vh區(qū)融合到人重鏈恒定區(qū)序列，第 一恒定結構域(CHl)和鉸鏈區(qū)產(chǎn)生的。該重鏈恒定區(qū)序列可以來自任何的免疫球蛋白類， 但通常來自IgG，以及可以來自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。本發(fā)明的Fab'抗體還可以是雜 種序列，例如鉸鏈序列可以來自一個免疫球蛋白亞類，CHl結構可以來自不同的亞類。在優(yōu) 選的實施方案中，包含CHl結構域和鉸鏈序列的重鏈恒定區(qū)來自人的IgGl。Fab'分子可以是利用已知的方法聚乙二醇化的。重鏈的鉸鏈區(qū)包含適合于結合 到聚乙二醇衍生物的半胱氨酸殘基。該鉸鏈序列可以是免疫球蛋白重鏈的完整的天然鉸鏈 區(qū)，或可以是通過一個或多個氨基酸截短的。在某些實施方案中，該鉸鏈區(qū)可以是被修飾的 或合成的序列。在進一步的實施方案中，該鉸鏈是天然免疫球蛋白鉸鏈序列，并包含兩個半 胱氨酸殘基。在某些實施方案中，F(xiàn)ab'分子能夠通過位點特異性結合結合到甲氧基聚乙二醇 的馬來酰亞胺衍生物(mPEG-mal)。該mPEG-mal能夠具有例如介于10_40kD之間的平均分 子量。該PEG可以是分枝PEG或線性PEG。在某些實施方案中，該mPEG-mal是線性分子， 并且具有大約30kD的分子量。mPEG-mal的一個或多個分子結合到每個Fab'分子。該 mPEG分子經(jīng)由mPEG-mal的馬來酰亞胺部分和Fab‘重鏈鉸鏈區(qū)中的一個或多個半胱氨酸 殘基間的硫醚鍵連接，以形成聚乙二醇化的Fab'分子。在適合的緩沖劑中以及在適于硫醚 形成的條件下，利用本領域已知的用于馬來酰亞胺衍生物結合到蛋白上的巰基的方法結合 mPEG-mal。Fab'可以以如下的形式從表達系統(tǒng)中生產(chǎn)，即該形式中的鉸鏈半胱氨酸基團以 氧化形式存在。在這種情況下，該Fab'在結合之前可以經(jīng)歷還原的步驟。適合自由鉸鏈 巰基生成的還原劑和鉸鏈半胱氨酸選擇性還原的方法為本領域所熟知，并包括二硫蘇糖醇 (DTT)、β -巰基-乙醇、β -巰基-乙胺(MEA)和諸如三(2-羧乙基)磷化氫的非巰基還原 劑的使用。在某些實施方案中，還原在如下條件下實現(xiàn)，即鉸鏈半胱氨酸被選擇地還原，并且聚乙二醇化主要發(fā)生在鉸鏈。通常，聚乙二醇化的Fab'包含由鉸鏈上的兩個半胱氨酸殘 基聚乙二醇化產(chǎn)生的mPEG的兩個分子。在某些實施方案中，突變可以引入鉸鏈區(qū)，用于以 另一個氨基酸取代一個半胱氨酸殘基。這種帶有mPEG-mal的突變體的衍生導致單-聚乙 二醇化的Fab'生成。適合的鉸鏈序列的實例是用于雙-聚乙二醇化的天然的人Y-I鉸鏈 THTCPPCPA用于單-聚乙二醇化的突變體鉸鏈-1THTAPPCPA用于單-聚乙二醇化的突變體鉸鏈-2THTCPPAPA聚乙二醇化的其他方法，例如其中PEG不被引入鉸鏈，也是已知的。例如 Humphreys et al，在上，描述了通過破壞Fab重鏈和輕鏈之間的鍵間二硫鍵在鉸鏈區(qū)外進 行半胱氨酸殘基聚乙二醇化的方法。用于聚乙二醇化Fab'的純化，以及包含更大數(shù)量PEG部分的期望的單或雙聚乙 二醇化Fab'與未發(fā)生反應的mPEG-馬來酰亞胺和Fab'分子的分離的方法為本領域所熟 知。這種方法包括，例如尺寸排阻或離子交換色譜法。VI.用于治療銅綠假單胞菌感染的PcrV抗體的給藥。本發(fā)明還提供了通過給予本發(fā)明的抗體來治療已經(jīng)感染了銅綠假單胞菌或正面 臨感染銅綠假單胞菌風險的患者的方法。在某些實施方案中，這種患者患有囊性纖維化、 呼吸機相關性肺炎(VAP)、癌癥相關性嗜中性粒細胞減少癥或燒傷癥狀。本發(fā)明的方法包 含利用適于疾病治療的給藥方案、以治療有效的量將PcrV抗體作為藥物組合物給予感染 了銅綠假單胞菌的患者。該組合物可以被配制為用于多種藥物遞送系統(tǒng)。一種或多種生理 學上可接受的賦形劑或載體也可以包括在組合物中用于適當?shù)闹苿?。適合用于本發(fā)明的制 齊[J在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓氏藥物科學)，Mack Publishing Company,Philadelphia,PA, 17th ed. (1985)中可以找到。對于藥物遞送方法的簡述，參見 Langer, Science 249 :1527_1533(1990)。PcrV抗體以適合注射入患者體內(nèi)的溶液形式提供，例如用于注射的無菌等滲水溶 液。該抗體在可接受的載體中以適合的濃度被溶解或懸浮。在某些實施方案中，載體是水 性的，例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等等。組合物可以包含接近生理條件所需的輔助性藥 物物質，例如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑等等。本發(fā)明的藥物組合物以足以治愈或至少部分阻止疾病或疾病的癥狀及其并發(fā)癥 的量給予患者，例如感染銅綠假單胞菌的囊性纖維化患者。足以實現(xiàn)這一目的的量被定義 為“治療有效劑量”。治療有效劑量通過監(jiān)測患者對治療的反應來確定。指示治療有效劑量 的一般基準包括患者體內(nèi)感染癥狀的改善，或患者體內(nèi)銅綠假單胞菌水平的降低。用于這 一用途的有效的量將取決于疾病的嚴重程度和患者的綜合健康狀況，包括諸如年齡、體重、 性別、給藥途徑等其他因素?？贵w的單次或多次給藥可以按照患者所需和耐受的劑量及頻 率給予。在任一情形下，該方法提供了有效地治療患者的足夠量的PcrV抗體?？贵w可以單獨給予，或與其他治療聯(lián)合給予，以治療銅綠假單胞菌感染?？贵w可以通過經(jīng)由包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)途徑的任何適合 途徑的注射或輸注給藥。在某些實施方案中，該抗體可以通過噴射給予。在示例性的實施方 案中，抗體可以在4°C以10mg/ml儲存在無菌等滲注射用鹽水溶液中，并且在給予患者前，
22在IOOml或200ml 0. 9%的注射用氯化鈉中稀釋。在1小時的時程以0. 2-10mg/kg的劑量 通過靜脈內(nèi)輸注的方式給予抗體。在其他的實施方案中，抗體通過靜脈內(nèi)輸注的方式被給 予的時間段為15分鐘-2小時。在其他的實施方案中，給藥操作通過皮下彈丸注射。選擇抗體的劑量以為患者提供有效的治療，所述劑量為小于0. lmg/kg體重至 25mg/kg體重的范圍，或為lmg-2g/患者的范圍。優(yōu)選地，該劑量為l_10mg/kg或大約 50mg-1000mg/患者的范圍。該劑量可以以適當?shù)念l率重復，根據(jù)抗體的藥代動力學(例如， 抗體在循環(huán)中的半衰期)和藥效反應(例如，抗體療效的持續(xù)時間)，該頻率可以為每天一 次至每三個月一次。在某些實施方案中，在體內(nèi)的半衰期為約7-約25天，以及在每周一次 至每三個月一次的范圍內(nèi)重復抗體給藥。在其他的實施方案中，抗體以大約每月一次給藥。在另外的實施方案中，抗體是聚乙二醇化的。例如，本發(fā)明的抗體可以利用諸如本 文所描述的方法聚乙二醇化，并給予感染銅綠假單胞菌的患者。本發(fā)明的Vh區(qū)和/或八區(qū)還可以用于診斷目的。例如，Vh區(qū)或八區(qū)可以用于臨 床分析，例如檢測來自已經(jīng)感染銅綠假單胞菌或疑似感染銅綠假單胞菌患者的樣本中的銅 綠假單胞菌。本發(fā)明的Vh區(qū)或\區(qū)還可以用于例如生產(chǎn)抗-Id抗體。
實施例實施例1-工禾旱化的人杭-PcrV Fab分子的鑒定。如美國專利申請20050255552中所描述的，產(chǎn)生表位聚集的工程化的人抗體Fab 庫。衍生自人免疫球蛋白序列集合(r印ertoires)的V節(jié)段序列被克隆在每一重鏈和輕鏈 的選定的⑶R3-FR4序列的上游。對于重鏈集合，⑶RH3包含來自先前鑒定的抗-PcrV單克隆抗體(Mab 166 ；Frank et al 2002 J. Infectious Dis. 186 :64_73)的序列 D 節(jié)段衍生序列(NRGDIYYDFTY)，其構 成結合特異性決定簇。重鏈集合的完整⑶RH3-FR4序列的序列如下所示。對于VHl庫1015，所用的CDR3-FR4組合是CDR3NRGDIYYDFTYAFDIffGQGTMVTVSS(FR4 = JH3)對于VH3庫，所用的⑶R3-FR4組合的差異在于⑶RH3中的單個氨基酸CDR3NRGDIYYDFTYAMDIffGQGTMVTVSS(FR4 = JH3)對于輕鏈集合，包含？1 1-0)虬1寸1 2-0)虬2寸1 3的人￥1^或νλ序列被插入選定 的⑶RL3-FR4序列的上游。該⑶RL3包含來自Mabl66輕鏈的結合特異性決定簇，具有序列 FWXTP (其中X可以是S或G)。對于V κ庫，⑶RL3和FR4的C末端殘基由人種系JK2序列 IIFGQGTKLEIK (⑶RL3中的JK2殘基以下劃線表示)構成。對于V λ庫，F(xiàn)R4區(qū)由JL2種系 序列FGGGTKLTVL構成。JL2種系序列與JL3序列完全相同。在某些情況下，如美國專利申請20060134098所描述的，構建盒式文庫(cassette libraries)(文庫1070)。對于文庫1080，全長λ鏈被篩選與VH盒式文庫結合。重鏈和輕鏈多肽被表達為成熟的蛋白，即沒有信號肽，并在大腸桿菌細胞中被分 泌，所述細胞表達如美國專利申請20070020685中所描述的突變SecY基因。因此，被表 達的該肽具有N末端甲硫氨酸。如美國專利申請20050255552中所描述的，重組Fabs與PcrV的結合通過利用包被有GST-PcrV融合蛋白標記物的硝化纖維素濾膜的濾膜結合試驗 (filter-binding assay)來鑒定。結合活性通過利用包被GST-PcrV的板的抗原ELISA來 確認，以及親和力通過利用ForteBio Octet生物傳感器的生物膜層干涉測量技術來測定。示例性的高親和力抗-PcrV抗體的V區(qū)的序列如圖1和圖2中所示。每個Fabs都具有對PcrV的高親和力。通過利用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物傳感器的生物膜層干涉測量技術所確定的，幾個Fabs被鑒定為具有至少與 Mabl66Fab相等(大約1. 4nM)的親和力。上述鑒定的V1^P八區(qū)能夠被用于各種組合。例如與包含SEQ IDN0. 11的Vh結合， 或與包含SEQ ID NO 3的Vh結合，Vk輕鏈SEQ IDNO 12支持對PcrV的高親和力結合。1070-9E抗體是利用美國專利申請NO. 20060134098中所描述的方法由V區(qū)盒式交 換衍生的高親和力抗體的實例。為了分離這一抗體，構建了 4個V區(qū)取代盒(!^placement cassette) :1)重鏈前端盒(由人VH3FR1-CDR1-FR2序列組成)，2)重鏈中間盒(由人 VH3FR2-CDR2-FR3序列組成)，1)輕鏈前端盒(由人VKIFRl-CDR1-FR2序列組成)，2)輕鏈 中間盒(由人的VK1FR2-⑶R2-FR3序列組成)。每一盒與另外來自Mab 166的V區(qū)序列和 選定的⑶R3-FR4區(qū)組裝而成，并在大腸桿菌TOPlO細胞中表達為Fab片段，所述細胞用過 表達突變SecY基因的治療轉化以允許無信號Fabs的分泌。然后，在包被GST-PcrV濾膜上 篩選盒式Fab庫，以鑒定PcrV結合物。然后，將從支持PcrV結合的Fabs選擇的序列重組 和再次篩選，以鑒定支持對PcrV高親和力結合的完全是人的V節(jié)段。通過盒式重組分離的Fab 1070-9E，對重組PcrV具有1. 48nM的親和力，這可通過 生物膜層干涉測量技術測定。高親和力抗-PcrV Fabs還是銅綠假單胞菌III型分泌系統(tǒng)有效的拮抗劑，并在基 于細胞的細胞毒性檢測中抑制由銅綠假單胞菌株PA 103導致的銅綠假單胞菌外毒素介導 的P3-X63Ag8骨髓瘤細胞的殺傷作用。實施例2-聚乙二醇化的Fab丨在本實施例中，F(xiàn)ab'是聚乙二醇化的，該Fab'由以下組成=IgGl亞類的人Fd' 重鏈和人κ輕鏈，它們由涉及κ鏈的C末端半胱氨酸和重鏈的半胱氨酸殘基C227(從成熟 蛋白的N末端連續(xù)編碼)的鏈間二硫鍵連接。重組Fd'重鏈包含IgGlCHl結構域和包括2 個半胱氨酸殘基的IgGl鉸鏈區(qū)，該半胱氨酸殘基還原后可用于結合到馬來酰亞胺基團。因 此，表達的抗體蛋白是Fd'重鏈和κ輕鏈的二硫化物連接的異源二聚體，包含共計452個 氨基酸。示例性的Fd'恒定區(qū)序列如圖3所示。為了生成體內(nèi)清除比率降低的免疫結合物，從而得到改善的藥代動力學譜，F(xiàn)ab' 被結合到聚乙二醇(PEG)。在雙-聚乙二醇化的Fab ‘中，每個Fab ‘分子通過位點特異性 連接在鉸鏈區(qū)結合到2個長鏈PEG分子，該位點特異性連接利用鉸鏈半胱氨酸殘基上2個 可用的反應巰基和馬來酰亞胺衍生的PEG，即甲氧基-聚乙二醇馬來酰亞胺(mPEG-mal)。該 mPEG-mal分子經(jīng)由馬來酰亞胺部分和鉸鏈半胱氨酸殘基間的硫醚鍵結合。為了生成雙-聚乙二醇化的Fab'，從NOF公司獲得平均分子量為30kD的 mPEG-mal。將從大腸桿菌表達和分泌的Fab ‘，在pH值為6. 5、含2mM EDTA的檸檬酸鹽緩沖 液中制備為4mg/ml的濃度。在室溫條件下加入還原劑(IOmM MEA，pH為6. 5) 30分鐘，并利 用使用IOmM甘氨酸(pH 3)和2mM EDTA預平衡的Zeba脫鹽柱將反應混合物立即脫鹽。在室溫條件下加入mPEG-mall小時，并利用購自GEHealthcare的Akta純化系統(tǒng)上的HiTrap SP瓊脂糖柱將雙_聚乙二醇化的Fab'與其他聚乙二醇化的種類和與未反應的Fab'分離。圖4中示意性提供了雙-聚乙二醇化Fab'的結構。在本實施例中聚乙二醇化的 示例性雙-聚乙二醇化Fab'以高親和力結合到PcrV (通過表面等離子共振分析確定的 0. 6nM的親和力)，并且是銅綠假單胞菌III型分泌系統(tǒng)有效的拮抗劑。單-聚乙二醇化的Fab'可以利用僅包含一個鉸鏈半胱氨酸的Fab'的突變體衍 生物生成。突變鉸鏈的序列是野生型人Y-I鉸鏈 THTCPPCPA突變鉸鏈-1THTAPPCPA突變鉸鏈-2THTCPPAPA實施例3-用干檢測具有針對銅綠假單胞,菌III型分泌系統(tǒng)的有效中和活性的抗體和Fab片段的細胞毒件測定建立了利用P3-X63-Ag8(X63)小鼠骨髓瘤細胞(ATCC)作為靶標的依賴TTSS的細 胞毒性測定。細胞被培養(yǎng)在含10% FBS(Hyclone)的RPMI 1640 (Media Tech)中。在Fab 存在下，在96孔板的孔中的0. Iml體積的培養(yǎng)基中，將約IO5細胞以感染復數(shù)(MOI)IO用銅 綠假單胞菌株PA103感染。在加入Fab和哺乳動物細胞之前，PA103被培養(yǎng)在MinS培養(yǎng)基 (Hauser AR et al. (1998) Infect Immun. 66. 1413-1420)中，以誘導 TTSS 的表達。在 5% C02、37°C下，與多種濃度的抗-PcrV Fab孵育3小時后，將細胞轉移到12x75mm的流式細胞 用管中，并按照生產(chǎn)商的說明用碘化丙啶(Sigma)染色。透性化細胞的比例通過利用FACS Caliber流式細胞儀的流式細胞術定量。數(shù)據(jù)利用Prism4軟件(Graphpad)進行分析。(細 胞毒性被標準化到未處理樣本中的死亡細胞)。為了比較不同F(xiàn)abs的效力，從至少三個獨 立的測定中獲得50%抑制所需的平均濃度(IC50)。幾種示例性Fabs的結果如下面的表2 所示。表2. Fabs在細胞毒性測定中的效力 每一種檢測的Fab都顯示了 TTSS的強中和作用以及保護哺乳動物細胞免受細胞
毒性作用。在該測定中，幾種Fabs比Mab 166Fab更為有效。因此，本發(fā)明的抗PcrV抗體一 般相對于Mab 166Fab顯示出增強的效力。實施例4利用肺炎小鼠樽型的本發(fā)明抗體的體內(nèi)作用。利用人工程化的Fabs進行在體實驗，以評價抗體在肺炎小鼠模型中的作用。Fab 1A8具有人VH3亞類重鏈，包含人IgGl的第一恒定結構域，以及人VKI亞類κ輕鏈。通過 Biacore測定的Fab 1Α8的親和力為0. 6nM。Fab 1Α8以比Mab 166Fab高大約2倍的親和 力結合到PcrV。假單胞菌肺炎的急性致死模型被用于評價與Mab 166相比較的Fab 1A8的體內(nèi) 功效。銅綠假單胞菌株PA103以1.5X106cm/鼠的劑量通過氣管內(nèi)給藥直接滴注進小鼠 的肺部，這是先前所示的足夠導致100%動物的死亡(3xLD9C1)的接種物(Sawa et al, Nat Med. 5 :392-8，1999)。監(jiān)測存活率和體溫48小時，并處死在這一時間點存活的小鼠，以測 定肺部內(nèi)的細菌計數(shù)。存活數(shù)據(jù)(圖5)表明，人Fab 1A8和鼠Fab能夠防止由高細胞毒性 PA103菌株引起的死亡。用PA103感染的對照小鼠和用不相關的對照Fab治療的小鼠在接 種后24小時內(nèi)全部死亡。用10 μ g Mab 166或Fab 1A8對小鼠的治療導致小鼠在48小 時100%的存活率。由于Fab 1A8缺少抗體Fc-區(qū)，因此抗體的效應器功能對于預防死亡 不是必需的。Fab 1A8在阻止死亡方面比Mabl66Fab明顯更有效。Fab 1A8以1.25yg和 0. 625 μ g/小鼠的劑量提供了有效的保護，以防止死亡。以相同劑量的小鼠Mabl66Fab治療 的動物顯示出100%的死亡率(對于2. 5 μ g、l. 25 μ g和0. 625 μ g劑量的Fab 1A8和Mab 166Fab間的差異，P < 0. 05)。在防止死亡方面，F(xiàn)ab 1A8的活性可與Mab 166IgG相比。Fab 1A8在誘導恢復體溫方面也是有效的，其表示防止敗血癥(圖6)。未治療 的感染PA103的小鼠在感染后的最初幾小時內(nèi)顯示出體溫迅速下降。在用抗體治療的組 中，體溫在12-24小時內(nèi)的恢復與隨后的存活相關。1.25 μ g/小鼠的低劑量的Fab 1A8或 Mab 166導致體溫的迅速恢復，并能防止至少80%的小鼠死亡。然而，這一劑量的小鼠Mab 166Fab片段不足以使體溫恢復，并且在這一組中的所有小鼠在感染后48小時全部死亡。還分析了感染后48小時存活小鼠的肺中殘留假單胞菌的存在。值得注意的是， 被分析的Mab 166和Fab 1A8片段刺激了細菌的顯著清除(圖7)。48小時后，在用IOyg Fab 1A8治療的所有小鼠中，細菌計數(shù)從1. 5xl06cm/小鼠的感染劑量減低至少1000倍。48 小時后，在用這一劑量Fab 1A8治療的80%的小鼠肺部中沒有顯示出可檢測的假單胞菌。 在用小鼠Mab 166Fab治療的小鼠中，檢測到更高的殘留細菌計數(shù)。在這一分析中，人Fab 1A8具有可與完整IgG Mab 166相比的功效，其表明Fc效應器功能對抗體刺激細菌清除的 能力沒有顯著的貢獻。還利用肺炎小鼠模型在體內(nèi)評價了具有Mab 166最小的必需結合特異性決定簇 的另一人工程化Fab。通過氣管內(nèi)給藥為雌性Balb/c小鼠(體重約20g ；Charles River)接種IxlO6的銅綠假單胞菌株PA103。在接種前，PA 103細菌于37°C下在YPT肉湯中生長過 夜，然后將其在新鮮培養(yǎng)基中以1 5稀釋，后在37°C下生長2小時，直至它們達到指數(shù)生 長期。在室溫下，將培養(yǎng)物以2000xg離心10分鐘，并將沉淀重懸于SmL磷酸緩沖鹽(PBS) 中。通過600nm處的吸光度對細菌進行定量，并通過胰蛋白酶大豆(TS)瓊脂平板(Teknova， Half Moon Bay, CA)上的菌落生長來驗證細菌菌落形成單位。將抗體Fab 2片段與細菌預 混合，隨即進行氣管內(nèi)滴入。監(jiān)測被感染小鼠48小時的體溫(直腸溫度)和存活。僅用鹽水溶液治療的對照小鼠在細菌接種24小時內(nèi)顯示出100%的死亡率。用 IOyg Fab 2治療的小鼠顯示出免于死亡的完全保護；用Fab治療的小鼠在48小時100% 存活。因此，這一實施例說明本發(fā)明的人工程化的抗體展示出有效的抗銅綠假單胞菌的 體內(nèi)活性。Fabs在體內(nèi)比母株M166Fab更有效。實施例5-評估人工稈化的Fab在人體內(nèi)的免疫原件。評估人工程化的抗體聚乙二醇化的Fab'片段在受試人體內(nèi)的安全性、免疫原性 和血漿/血清半衰期。受試者通過靜脈(i. v.)注射接受1、3或10mg/kg的一個劑量。人工程化的抗體在所有劑量水平都是良好耐受的。利用固定在微量滴定板上的 PcrV抗原通過ELISA來測量藥物在血漿中的濃度。將GST-PcrV固定在微量滴定板上于4°C 過夜。洗滌板并加入封閉/稀釋緩沖液封閉所有非吸附的位點至少60分鐘。洗滌板后，將 分析物分配至預包被的微量滴定板上并孵育至少60分鐘。洗滌板并加入含有對所述人工 程化的抗體特異的生物素化抗體的溶液至少45分鐘。洗滌板，然后加入HRP-偶聯(lián)的溶液 30分鐘。經(jīng)過最后的洗滌步驟后，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化物酶底物溶液并孵育約6 分鐘。用磷酸溶液終止反應。產(chǎn)生的顏色與存在的聚乙二醇化Fab成比例。在利用兩個濾 光片(450nm用于檢測，背景用620nm)的讀板儀上讀板。在通過將光密度(OD)與濃度作圖 獲得的標準曲線上確定濃度。利用四參數(shù)邏輯斯特(logistic)擬合生成校準曲線。該方法 在人血清中的范圍是血清中0. 200至12. 8ng/mL(100%血清中為20. 0ng/mL至1280ng/ mL) ο人工程化抗體在人受試者體內(nèi)的藥代動力學譜 該人工程化的抗體具有大約14天的終末血漿半衰期。在輸注前和輸注后8天、15天、29天、70天檢測抗藥物抗體，即針對人工程化抗 體生成的抗體的存在。利用電化學發(fā)光測定(ECLA)來測量抗藥物抗體。用稀釋緩沖液按 1 25稀釋陽性對照和陰性對照血清。通過加入等體積的0.8%的醋酸按1 2進一步稀 釋對照(產(chǎn)生2X溶液)，然后在環(huán)境溫度下孵育大約15分鐘。接著，利用Label Master Mix (0. 5 μ g/mL終工作濃度的抗體-生物素和抗體-SulfoTag)按1 2對樣本進行再次稀 釋，得到最終的1 100稀釋度。然后通過輕搖在室溫下孵育所有對照1小時。通過加入 稀釋緩沖液封閉包被有鏈霉抗生素蛋白的標準MA240096孔微量滴定板60分鐘。通過吸出 從板孔移除稀釋緩沖液，然后將對照血清加到板上，孵育60分鐘。吸出和洗滌板后，加入帶 有表面活性劑的IX MesoScaleDiscovery (MSD)讀數(shù)緩沖液Τ。于MSD電化學發(fā)光檢 測器上在1分鐘內(nèi)讀板。產(chǎn)生的相對光單位(RLU)的強度與存在的抗藥物抗體量成比例。在任何時間點都沒有檢測到抗藥物抗體。因此該實施例表明了人工程化的抗體在 人體中沒有可檢測的免疫原性。下面提供了本發(fā)明的抗-PcrV抗體V區(qū)的示例性列表示例性的抗-PcrV V區(qū)SEQ ID NO IVh (VHl)EIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHAISffVRQAPGQGLEffMGffISPYSGNPNYAQSLQGRVS LTTDRSTRTAYMELRSLKSDDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAFDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :2VkIDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGRAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT GFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :3VhQVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSTAGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :4VkI DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISRWVAWYQQRPGKAPNLLIYDASSLKSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDIATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :5VhQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIffYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :6VkIAIQLTQSPSFLSASV⑶RVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :7VhQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNLKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :8VkIDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAffYQQKRGKAPKLLISAASSLQSGVPSRFSGSVSGT DFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :9VhQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VSRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO =IOVkIDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASALQSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO:IlVhEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSTAGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGKEISYADSVKGRFT VFRDNPKNTLYLQMSSLRTEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :12VkIDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISRWVAWYQQRPGKAPNLLIYDASSLKSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDIATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :13VhQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFT ISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :14Vk DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASALQSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDVATYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :15VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCTASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGRNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :16VkIIIEIVLTQFPGTLSLSPGERATLSCRASQNVGSAYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRAPGIPDRFSGSGSG TDFTLTlNRLEPEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :17VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGYNKDYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :18VkIIIEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :19VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :20VkIIIEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLFYAASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :21VhEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVANIWYDGSSESYIDSVKGRFT VSRDDSRNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :22VkIIIEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQFffSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :23VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDQWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :24VK DIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffGTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :25VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDSWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :24VKDIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffGTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :26VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :24VKDIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffGTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID NO :35VHEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYPMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSEKWYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLEMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDYWGQGTTVTVSSSEQ ID NO :36VKDIQLTQSPSTLSASVGDSVTITCRASEGVDRWLAWYQQKPGRAPKLLIYDASTLQSGVPSRFSGSGSGT EFSLTISSLQPDDVATYYCQHFffSTPYTFGQGTKLEIK具有λ輕鏈的示例性抗體的V-區(qū)SEQ ID NO :27VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFT ISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID no :28V1
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDYVSWYQQHPGKAPKLIIYDVTNRPSGVPDRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCQHFffSTPYTFGGGTKLTVLSEQ ID NO :29VhEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYPLHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGSEKYYASSVKGRFT ISRDNSENTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARNRGDIYYDFTYAMDIWGQGTMVTVSSSEQ ID NO :30V1SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNT ASLTITGAQAEDEADYYCQHFffSTPYTFGGGTKLTVL另外的Vl區(qū)SEQ ID NO :32V1SSELTQDPAVSVALGQTVTITCQ⑶SLRSLYASWYQQKPGQAPVLVLYSKNSRPSGIPDRFSGSSSGNT ASLTITGARAEDEADYYCQHFffSTPYTFGGGTKLTVLSEQ ID NO :34V1QSVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQYPGKVPKLIIYEVTKRPSGVPDRFSGSKS GNTASLTVSGLRAEDEADYYCQHFWSTPYTFGGGTKLTVLSEQ ID NO :37VkIDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISRWVAWYQQRPGKAPNLLIYDASSLKSGVPSRFSGSGSGT EFTLTISSLQPEDIATYYCQQFffGTPYTFGQGTKLEIK出于清楚理解的目的，盡管已經(jīng)通過說明和舉例在一些細節(jié)上描述了前述發(fā)明， 但結合本發(fā)明的教導，對本領域技術人員顯而易見的是，可以對本發(fā)明作出某些變化和修 飾而不偏離所附權利要求書的精神或范圍。本說明書引用的所有出版物、目錄號、專利和專利申請都通過引用的方式并入本 文，如同各自被特別和單獨地指明通過引用的方式并入一樣。
權利要求
包含VL區(qū)的抗 PcrV抗體，所述VL區(qū)包含含有FWGTP的CDR3，其中所述抗 PcrV抗體選擇性地結合PcrV。
2.如權利要求1所述的抗體，其中所述抗體包含Vh區(qū)，所述具有包含序列 NRGDIYYDFTY 的 CDR3。
3.如權利要求1所述的抗體，其中所述\區(qū)節(jié)段與人種系V節(jié)段具有至少80%的一 致性。
4.如權利要求1所述的抗體，其中所述\區(qū)包含F(xiàn)R4，所述FR4與人種系JK1、JK 2、 J K 3、J κ 4或J κ 5節(jié)段的FR4區(qū)具有至少90%的一致性，或者與人種系J λ 1、J λ 2、J λ 3 或JX 7節(jié)段的FR4區(qū)具有至少90%的一致性。
5.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)包含F(xiàn)R4和V節(jié)段，所述FR4 與人JK2種系基因片段的FR4區(qū)具有至少90%的一致性，或與JL2種系序列具有至少90% 的一致性；以及所述V節(jié)段與人種系Vk I或VK III序列具有至少80%的一致性，或與人 種系V λ序列具有至少80%的一致性。
6.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中\(zhòng)區(qū)CDR3具有序列Q(Q/H)FWGTPYT。
7.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其還包含Vh區(qū)，所述Vh區(qū)包含具有序列NRGDIYYDFTY的⑶R3、FR4和V節(jié)段，其中所述FR4包含 與人JH3或人JH6節(jié)段的FR4區(qū)至少90 %的一致性，以及所述V節(jié)段包含與人VH1-18亞類 V節(jié)段或與人VH3-30. 3V節(jié)段至少80%的一致性。
8.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)包含具有序列 NRGDIYYDFTYA(M/F)DX1 的 CDR3，其中 X1 是 I、Q、Y 或 S。
9.結合PcrV的抗-PcrV抗體，其包含vH區(qū)，所述vH區(qū)包含具有序列Nrgdiyydftyamdx1的cdr3、fr4和ν節(jié)段，其中X1是I、 Q、Y或S ；其中所述FR4包含與人種系JH3節(jié)段的FR4區(qū)或人種系JH6節(jié)段的FR4區(qū)至少 90%的一致性，以及所述V節(jié)段包含與人種系VH1-18亞類V節(jié)段或與人種系VH3-30. 3亞 類V節(jié)段至少80%的一致性，條件是當X1是Y時，F(xiàn)R4區(qū)不是WGQGTSVTVSS。
10.結合PcrV的抗-PcrV抗體，其包含vH區(qū)，所述vH區(qū)包含具有序列Nrgdiyydftyamdx1的cdr3、fr4和ν節(jié)段，其中X1是I、 Q、Y或S ；其中所述FR4包含與人種系JH3節(jié)段的FR4區(qū)或人種系JH6節(jié)段的FR4區(qū)至少 90 %的一致性，以及所述V節(jié)段包含與人種系VH1-18亞類V節(jié)段或與人種系VH3-30. 3亞 類V節(jié)段至少80%的一致性，條件是當X1是Y時，F(xiàn)R4區(qū)不是WGQGTSVTVSS ；Vl區(qū)，所述Vl區(qū)包含含有FW(S/G) TP的CDR3、FR4和V節(jié)段，其中所述FR4包含與人種 系JK2基因節(jié)段的FR4區(qū)或與人種系JL2節(jié)段的FR4區(qū)至少90%的一致性，以及所述V節(jié) 段包含與人種系VKIL12序列至少80%的一致性，或與Vk III序列至少80%的一致性，或 與人種系V λ 22c或V λ 331節(jié)段至少80 %的一致性。
11.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)的FR4具有序列 WGQGTX2VTVSS，其中 X2 是 T 或 M。
12.如權利要求9-11中任一項所述的抗體，其中輕鏈CDR3具有序列Q(H/Q)FW(G/S) TPYT。
13.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)的FR4具有序列TOQGTKLEIK或 FGGGTKLTVL。
14.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中Vh區(qū)V節(jié)段與人種系VH3-30.3節(jié)段具 有至少80%的一致性，以及重鏈區(qū)⑶Rl包含序列X3X4X5X6H,其中X3是S、T或N，X4是Y或 A，X5 是 A、G 或 P，且 X6 是 Μ、I 或 L ；以及重鏈區(qū) CDR2 包含序列 X7IX8YX9GX10X11X12X13Y (A/I) X14SVKG,其中 X7 是 V、F 或 N，X8 是 S 或 W，X9 是 D 或 N，Xltl 是 S、K、R 或 Y，X11 是 N、S、D 或 E， X12 是 K、I 或 E，X13 是 Y、S、D 或 W，且 X14 是 D 或 S。
15.如權利要求14所述的抗體，其中所述Vh區(qū)V節(jié)段與VH3-30.3V節(jié)段具有至少90 % 的一致性。
16.如權利要求14或權利要求15所述的抗體，其中所述⑶Rl是TAGMH、SYGIH、 SYGMH、SYPLH 或 NYPMH ；或者所述 CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG、FISYDGSEKYYASSVKG、 VISYDGSEKWYADSVKG, VIffYDGRNKYYADSVKG, VIffYDGYNKDYADSVKG 或 NIWYDGSSESYIDSVKG。
17.如權利要求14或權利要求15所述的抗體，其中所述⑶Rl是TAGMH、SYGIH、 SYGMH、SYPLH 或 NYPMH，以及所述 CDR2 是 VIWYNGKEISYADSVKG、FISYDGSEKYYASSVKG、 VISYDGSEKWYADSVKG, VIffYDGRNKYYADSVKG, VIffYDGYNKDYADSVKG 或 NIWYDGSSESYIDSVKG。
18.如權利要求1-13中任一項所述的抗體，其中Vh區(qū)V節(jié)段與人種系VH1-18 亞類V節(jié)段具有至少80 %的一致性，以及⑶Rl具有序列DHAIS和⑶R2具有序列 WISPYSGNPNYAQSLQGo
19.如權利要求18所述的抗體，其中所述Vh區(qū)V節(jié)段與人種系VH1-18亞類V節(jié)段具 有至少90%的一致性。
20.結合PcrV的抗-PcrV抗體，其包含Vh區(qū)，所述Vh區(qū)具有CDR3序列NRGDIYYDFTYAFDI、CDRl序列DHAIS和CDR2序列 WISPYSGNPNYAQSLQGo
21.如權利要求20所述的抗體，其中所述Vh區(qū)的V節(jié)段包含與人種系VH1-18亞類V 節(jié)段至少80%的一致性。
22.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述Vh區(qū)包含選自SEQID NOs 1、3、 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列的 V 節(jié)段區(qū)。
23.如權利要求22所述的抗體，其中所述Vh區(qū)包含選自SEQIDNOs 1、3、5、7、9、11、13、 15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列。
24.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)V節(jié)段包含與人種系Vκ I L12或Vk III序列至少90%的一致性，或與人種系V λ 331或與V λ 22c序列至少90%的一 致性。
25.如前述權利要求1-20中任一項所述的抗體，其中所述八區(qū)V節(jié)段與人種系VKIL12 節(jié)段具有至少80%的氨基酸序列一致性，以及CDRl具有序列RASX15X16X17X18X19X2tlX21A,其中 X15是Q或E，X16是S或G，X17是I或V，X18是S或D，X19是S、R或T，X2tl是W或Y，且X21是 L或V ；以及CDR2具有序列X21ASX22LX23S,其中X21是D或A，X22是S、A或T，且X23是E、Q或 K0
26.如權利要求25所述的抗體，其中所述八區(qū)V節(jié)段與人種系VKIL12節(jié)段具有至少 90%的一致性。
27.如權利要求25或權利要求26所述的抗體，其中所述⑶Rl具有序列RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、RASQSISRffVA 或 RASEGVDRWLA ；或者所述 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS、 AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。
28.如權利要求25、26或27中任一項所述的抗體，其中所述CDRl具有序列 RASQGISTYLA、RASQGISSWLA、RASQSISRffVA 或 RASEGVDRWLA ；以及所述 CDR2 具有序列 AASSLQS、DASSLKS, AASSLQS、DASALQS 或 DASTLQS。
29.如前述權利要求1-23中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)V節(jié)段與人種系 VKIII L2序列具有至少80%的氨基酸序列一致性，且所述⑶Rl具有序列RASNSVGAYNLA或 RASQSVSSNLA ；以及所述 CDR2 具有序列(A/G) AS (T/R) RA (T/P)。
30.如權利要求29所述的抗體，其中所述&區(qū)V節(jié)段與人種系VKIIIL2節(jié)段具有至 少90%的一致性。
31.如前述權利要求1-23中任一項所述的抗體，其中所述八區(qū)V節(jié)段與人種系Vλ 331 節(jié)段具有至少80%的氨基酸序列一致性，且所述⑶Rl具有序列QGDSLRS (Y/L) YAS ；以及所 述 CDR2 具有序列(G/S)KN(N/S)RPS。
32.如權利要求31所述的抗體，其中所述\區(qū)V節(jié)段與人種系Vλ 331節(jié)段具有至少 90%的一致性。
33.如前述權利要求1-23中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)V節(jié)段與人種系Vλ 22c 節(jié)段具有至少80%的氨基酸序列一致性，且⑶Rl具有序列TGTSSDVGAYNYVS或TGTSSDYVS ； 以及 CDR2 具有序列(E/D) VT (K/N) RPS。
34.如權利要求33中所述的抗體，其中所述\區(qū)V節(jié)段與人種系Vλ 22c節(jié)段具有至 少90%的一致性。
35.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述\區(qū)包含選自SEQID NOs 2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列的 V 節(jié)段。
36.如權利要求35所述的抗體，其中所述Vl區(qū)包含選自SEQIDNO :2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、28、30、32、34、36 和 37 的氨基酸序列。
37.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是銅綠假單胞菌III型分泌 系統(tǒng)的拮抗劑。
38.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是Fab'片段。
39.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是IgG。
40.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中所述抗體是聚乙二醇化的。
41.如權利要求40所述的抗體，其中所述抗體是雙-聚乙二醇化的。
42.如前述權利要求中任一項所述的抗體，其中Vh區(qū)或\區(qū)，或者Vh和\區(qū)二者的氨 基酸序列在N末端包含甲硫氨酸。
43.抗-PcrV抗體，其是III型分泌系統(tǒng)的拮抗劑，所述抗-PcrV抗體包含具有選自 SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、26、27、29 和 35 的氨基酸序列的 Vh 區(qū)； 以及具有選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、30、32、34、36和 37 的氨 基酸序列的八區(qū)。
44.如權利要求43所述的抗體，其中Vh區(qū)或\區(qū)，或者Vh和\區(qū)二者具有存在于N 末端的甲硫氨酸。
45.如權利要求43所述的抗體，其中所述抗體是雙-聚乙二醇化的Fab'。
46.治療感染銅綠假單胞菌的患者的方法，所述方法包含給予前述權利要求中任一項 所述的抗體。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述抗體在人體內(nèi)不是免疫原性的。
48.如權利要求46所述的方法，其中通過靜脈內(nèi)、皮下或通過吹入法給予所述抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了針對銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PcrV蛋白的高親和力抗體，其被給予以治療銅綠假單胞菌感染時具有降低的免疫原性。
文檔編號C07K16/12GK101910197SQ200880124705
公開日2010年12月8日 申請日期2008年12月1日 優(yōu)先權日2007年11月30日
發(fā)明者克里斯托弗·R·貝炳東, 杰弗里·T·亞蘭東, 肯尼思·魯爾森, 馬克·百爾 申請人:卡羅拜奧斯制藥公司