專利名稱：丙型肝炎抗體和其用途的制作方法
丙型肝炎抗體和其用途政府支持本發(fā)明是依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(United States National Institutes of Health)所授予的授權(quán)號(hào)HL079381在政府的支持下進(jìn)行的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
全世界有超過(guò)一億七千萬(wàn)人感染了丙型肝炎病毒(HCV)。急性感染通常是隱性感染(silent)，但大部分受感染的個(gè)體會(huì)發(fā)展持久性感染(梅杰(Major)等人，2001，“丙型肝炎病毒 Ofepatitis C viruses)，” 費(fèi)氏病毒學(xué)(Fields Virology)，1127-1162 ；以引用的方式并入本文中)。然而，少數(shù)急性感染會(huì)使病毒血癥隨著疾病消退而消退。由于穩(wěn)定且持續(xù)的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)會(huì)短暫地引起病毒清除，從而引起疾病消退，故細(xì)胞免疫是必要的(參見(jiàn)肖克雷(Shoukry)等人，2004，微生物學(xué)年評(píng)(Annu. Rev. Microbiol.)，58 :391中的綜述； 以引用的方式并入本文中)。單獨(dú)服用抗病毒藥物(例如干擾素或聚乙二醇化干擾素)或?qū)⒖共《舅幬锱c利巴韋林(ribavirin)(即，干擾病毒基因組復(fù)制的核苷類似物)組合服用，可用于治療感染慢性丙型肝炎的人，但治療成本極高。單獨(dú)用干擾素治療對(duì)于約10%到20%的患者有效，而干擾素與利巴韋林的組合則對(duì)約30%到50%的患者有效。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，可以開(kāi)發(fā)出適用于預(yù)防、治療和/或診斷HCV的抗體。開(kāi)發(fā)基于抗體的疫苗的一個(gè)重要問(wèn)題是，確定保守保護(hù)性表位，和產(chǎn)生特異性識(shí)別這些表位的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供結(jié)合于多種丙型肝炎病毒(HCV)基因型和/或亞型的單克隆抗體，包括人單克隆抗體。這些抗體適用于預(yù)防、治療、診斷和/或研究HCV。具體點(diǎn)說(shuō)，本發(fā)明提供結(jié)合于HCV包膜糖蛋白E2的保守構(gòu)象表位的單克隆抗體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HCV 抗體能夠結(jié)合于許多、大部分或所有狀態(tài)的HCV。在一些實(shí)施例中，單克隆抗體可用于多種診斷分析中。本發(fā)明的HCV抗體可用于被動(dòng)免疫療法中，用于降低受感染個(gè)體的病毒載量。 使用本發(fā)明的HCV抗體也可干擾目標(biāo)細(xì)胞的感染。識(shí)別保守表位的抗體可用于提供用來(lái)合理地設(shè)計(jì)肽和構(gòu)象確定的表位模擬物(例如有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、無(wú)機(jī)化合物、小分子等)的模板。在一些實(shí)施例中，提供的HCV E2蛋白和其片段的保守區(qū)可用于治療、預(yù)防、診斷和/或其它目的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是針對(duì)HCV E2蛋白的構(gòu)象表位。人們已經(jīng)使用一組單克隆抗體和一系列E2缺失構(gòu)建體鑒別出了 E2的構(gòu)象和線性表位。先前的研究(例如參見(jiàn)美國(guó)專利6，692，908 ；以及美國(guó)專利公開(kāi)案2006/0104980和2006/0188571 ；都以引用的方式并入本文中)曾報(bào)導(dǎo)一類結(jié)合于在HCV lb E2氨基酸411-644之間的構(gòu)象表位的抗體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，此類抗體可抑制E2與⑶81的相互作用。人們還發(fā)現(xiàn)，另一類抗體可結(jié)合于 HCV lb E2氨基酸470-644之間的構(gòu)象表位。第三類抗體結(jié)合于HCV lbE2氨基酸470-644之間的構(gòu)象表位，但無(wú)法抑制E2與CD81的結(jié)合。第四類抗體結(jié)合于HCV lb E2氨基酸 644-661之間的構(gòu)象表位。第五類結(jié)合于HCV lb El氨基酸230-313之間的構(gòu)象表位。第六類結(jié)合于來(lái)源于多種基因型的線性HCV El表位。第七類結(jié)合的構(gòu)象表位部分地包括HCV la E2 氨基酸 657-698。在一些實(shí)施例中，HCV抗體所針對(duì)的構(gòu)象表位在多種HCV基因型(例如基因型1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或其組合)之間是保守的。在一些實(shí)施例中，HCV抗體所針對(duì)的構(gòu)象表位在多種 HCV 亞型(例如亞型 la、lb、lcJa、2b、2c、3a、;3b、4a、4b、4c、4d、4e、^i、 6a、7a、7b、8a、mK9a、10a、lla和/或其組合)之間是保守的。在一些實(shí)施例中，HCV抗體所針對(duì)的構(gòu)象表位在多種HCV病毒株之間是保守的。據(jù)估計(jì)，存在超過(guò)100種HCV病毒株，分別以基因型和亞型指示后加上數(shù)字編號(hào)(例如1、2、3等)表示。本發(fā)明提供識(shí)別HCV E2表位的單克隆抗體，與上述任一種表位相比較，這些 HCVE2表位的定義更為精確。本發(fā)明抗體與先前描述的一些抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)。然而，在相關(guān)模型系統(tǒng)中，一些本發(fā)明的抗體中和HCV的效力比先前描述的抗體高。因此，本發(fā)明認(rèn)識(shí)到， 本文中所述的新近鑒別的抗體可提供比先前描述的抗體高的治療和/或預(yù)防益處。在一些實(shí)施例中，抗HCV E2抗體選自由以下組成的群組人單克隆抗體HC-I，由美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)以寄存編號(hào)PTA-9416 保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；人單克隆抗體HC-3，由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9417保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；人單克隆抗體HC-11，由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9418保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；和人單克隆抗體CBH-23，由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9419保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌。本發(fā)明的抗體可與醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑組合，以提供醫(yī)藥調(diào)配物。本發(fā)明提供用于治療、預(yù)防和/或診斷丙型肝炎感染的醫(yī)藥組合物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包含能夠結(jié)合于HCV包膜糖蛋白E2且能夠在體外和體內(nèi)中和HCV感染的人類抗體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可包含實(shí)質(zhì)上保留完整抗體的抗原結(jié)合特征的HCV抗體(例如HC-1、HC-3、HC-Il和/或CBH-23)的片段。在一些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物可包含借助此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的重組方法產(chǎn)生的HCV抗體。本發(fā)明提供本發(fā)明HCV抗體的各種治療、預(yù)防和/或診斷應(yīng)用。在一些實(shí)施例中， 包含HC-1、HC-3、HC-Il和CBH-23抗體的醫(yī)藥組合物可用于治療慢性和/或急性丙型肝炎感染，這可通過(guò)對(duì)患者投予治療有效量的能夠結(jié)合于HCV E2的抗體或其片段實(shí)現(xiàn)。治療有效量是足以實(shí)現(xiàn)一種或一種以上特定生物效應(yīng)的量。治療有效量可在單一時(shí)間以單次劑量投予，或者可在一段時(shí)間內(nèi)以多個(gè)個(gè)別劑量(相同或不同規(guī)格)分配，或經(jīng)由連續(xù)遞送(以恒定或變化的速率)分配。在某些實(shí)施例中，治療有效量是有效實(shí)現(xiàn)一個(gè)或一個(gè)以上所需的生物結(jié)果的量，所述生物結(jié)果包括(但不限于)(i)減輕HCV感染的一種或一種以上癥狀；(ii)減少個(gè)體體內(nèi)和/或個(gè)體的任一器官(例如肝)中循環(huán)病毒粒子的數(shù)量；(iii)預(yù)防HCV感染再度發(fā)生、降低再度發(fā)生可能性和/或延緩其一種或一種以上癥狀的再度發(fā)生； 和/或(iv)防止感染HCV個(gè)體體內(nèi)和/或個(gè)體任一器官(例如肝)中循環(huán)病毒粒子數(shù)量增加，降低其可能性和/或延緩其發(fā)作。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可用于預(yù)防HCV感染、減少其復(fù)發(fā)和/或延緩其發(fā)作。例如，其可用于使近期暴露于HCV或有暴露于HCV風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體、HCV 呈陽(yáng)性的母親所生育的新生兒和/或肝移植患者(例如，防止此類患者可能復(fù)發(fā)HCV感染) 被動(dòng)免疫。
本發(fā)明還提供一種醫(yī)藥組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明抗體與至少一種作為額外活性成分的另一抗病毒劑的組合。所述抗病毒劑可包括(但不限于)干擾素(例如干擾素α _2b、干擾素-Y等)、抗HCV單克隆抗體、抗HCV多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、 蛋白酶抑制劑、利巴韋林、IRES抑制劑、解螺旋酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、反義化合物、短干擾 RNA、短發(fā)夾RNA、微RNA、RNA適體、核糖酶和其組合。本發(fā)明的抗體可確定HCV E2蛋白的構(gòu)象表位，并且本發(fā)明提供含有所述表位的組合物和化合物。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供包含HCV E2蛋白的構(gòu)象表位的蛋白質(zhì)、肽和小分子。 肽可含有一個(gè)或一個(gè)以上由本發(fā)明抗體識(shí)別的表位。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是具有任選使用的連接序列的多聯(lián)體肽鏈，其中至少一者含有HCV的至少一個(gè)構(gòu)象表位。肽鏈中的肽可含有不同的HCV E2蛋白構(gòu)象表位?；蛘撸逆溨械碾目啥己邢嗤砦?。一般說(shuō)來(lái)，理想的情況是，肽鏈中的肽適當(dāng)折疊，由此呈現(xiàn)與其在自然界所觀察的實(shí)質(zhì)上相同的構(gòu)象表位。 這些蛋白質(zhì)和肽可用于調(diào)配疫苗或用于診斷測(cè)試中。本發(fā)明還提供根據(jù)針對(duì)HCV的免疫反應(yīng)對(duì)患者分級(jí)的方法，以及鑒別可能對(duì)HCV 免疫療法良好反應(yīng)的那些患者的方法。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用患者的血清來(lái)測(cè)試針對(duì)特定HCV 表位的抗體的存在。如果患者不具有針對(duì)所述表位(具體點(diǎn)說(shuō)，HCV E2蛋白的構(gòu)象表位) 的適宜抗體水平，那么可對(duì)患者投予針對(duì)所述表位的人單克隆抗體?？衫帽景l(fā)明抗體或其組合物來(lái)補(bǔ)充患者自身的免疫反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，免疫療法有助于清除HCV病毒和/ 或使HCV感染消退。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的免疫療法可治療和/或預(yù)防慢性HCV感染。定義氨基酸本文中使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”的最廣泛意義是指可并入多肽鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，氨基酸一般結(jié)構(gòu)(R)-C00H。在一些實(shí)施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些實(shí)施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些實(shí)施例中， 氨基酸是D-氨基酸；在一些實(shí)施例中，氨基酸是L-氨基酸?！皹?biāo)準(zhǔn)氨基酸”是指天然存在的肽中常見(jiàn)的20種標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸中的任一種。“非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸”是指除標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外的任何氨基酸，不考慮其是以合成方式制備還是從天然來(lái)源獲得。如本文中所使用，“合成氨基酸” 涵蓋化學(xué)修飾的氨基酸，包括(但不限于)鹽、氨基酸衍生物(諸如酰胺類)和/或取代。 肽中包括羧基和/或氨基末端氨基酸在內(nèi)的氨基酸可通過(guò)甲基化、酰胺化、乙?；?、保護(hù)基和/或以其它化學(xué)基團(tuán)取代來(lái)進(jìn)行修飾，這些修飾可改變肽的循環(huán)半衰期，而不會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生不利影響。氨基酸可參與二硫鍵。氨基酸可包含一種或一種以上翻譯后修飾，諸如與一個(gè)或一個(gè)以上化學(xué)實(shí)體(例如甲基、乙酸酯基、乙?；?、磷酸酯基、甲?；糠?、類異戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂質(zhì)部分、碳水化合物部分、生物素部分等)締合。術(shù)語(yǔ) “氨基酸”可與“氨基酸殘基”互換使用，并且可以指游離氨基酸和/或肽中的氨基酸殘基。 從使用這一術(shù)語(yǔ)的上下文中會(huì)顯而易見(jiàn)其是指游離氨基酸還是指肽中的殘基。動(dòng)物本文中使用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”是指動(dòng)物界的任何成員。在一些實(shí)施例中，“動(dòng)物” 是指任一性別以及處于任何發(fā)育階段的人類。在一些實(shí)施例中，“動(dòng)物”是指處于任何發(fā)育階段的非人類動(dòng)物。在某些實(shí)施例中，所述非人類動(dòng)物為哺乳動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物、小鼠、 大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和/或豬)。在一些實(shí)施例中，動(dòng)物包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類、昆蟲類和/或蠕蟲。在某些實(shí)施例中，動(dòng)物易受HCV感染。在一些實(shí)施例中，動(dòng)物可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、遺傳工程改造的動(dòng)物和/或克隆動(dòng)物(clone)。抗體本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指天然或者完全或部分由合成產(chǎn)生的任何免疫球蛋白。這一術(shù)語(yǔ)中也包括其保留特異性結(jié)合能力的所有衍生物。這一術(shù)語(yǔ)還涵蓋結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或在很大程度上同源的任何蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可來(lái)源于天然來(lái)源，或者部分或完全由合成產(chǎn)生?？贵w可以是單克隆或多克隆抗體?？贵w可以是任一免疫球蛋白種類的成員，包括以下任一人類種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在某些實(shí)施例中，抗體可以是IgG免疫球蛋白種類的成員。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗體片段”或“抗體的特征性部分”可互換使用，并且指不到全長(zhǎng)的抗體的任何衍生物。一般說(shuō)來(lái)，抗體片段保留至少大部分全長(zhǎng)抗體的特異性結(jié)合能力。抗體片段的實(shí)例包括(但不限于)Fab、Fab'、 F(ab' )2、sCFV、FV、dsFV微型雙功能抗體(diabody)和Fd片段?？贵w片段可借助任何方式產(chǎn)生。舉例來(lái)說(shuō)，可利用酶或化學(xué)方法使完整抗體片段化來(lái)產(chǎn)生抗體片段，和/或可由編碼部分抗體序列的基因重組產(chǎn)生抗體片段?；蛘呋蛄硗?，抗體片段可完全或部分由合成產(chǎn)生?？贵w片段可任選包含單鏈抗體片段?；蛘呋蛄硗?，抗體片段可包含多條鏈，這些鏈例如借助二硫鍵聯(lián)連接在一起?？贵w片段可任選包含多分子復(fù)合物。功能性抗體片段通常包含至少約50個(gè)氨基酸，更通常包含至少約200個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，抗體可以是人類抗體。在一些實(shí)施例中，抗體可以是人源化抗體。大約(Approximately)當(dāng)應(yīng)用于一個(gè)或一個(gè)以上相關(guān)值時(shí)，本文中使用的術(shù)語(yǔ) “大約”或“約”是指與指定參考值類似的值。在某些實(shí)施例中，除非另作說(shuō)明，或另外從上下文中顯而易見(jiàn)，否則術(shù)語(yǔ)“大約”或“約”是指值的范圍在指定參考值任一方向(大于或小于)的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、 7^^6^^5^^4%. 3^^2^^1%或以下的范圍內(nèi)(所述數(shù)字超過(guò)可能值的100%的情形除外)。生物活性本文中使用的短語(yǔ)“生物活性”是指在生物系統(tǒng)(例如細(xì)胞培養(yǎng)物、 生物體等)中具有活性的任何物質(zhì)的特征。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)投予生物體時(shí)會(huì)對(duì)所述生物體具有生物作用的物質(zhì)被視為具有生物活性。在特定實(shí)施例中，在蛋白質(zhì)或多肽具有生物活性的情況下，所述蛋白質(zhì)或多肽中共有蛋白質(zhì)或多肽的至少一種生物活性的一部分通常稱為 “生物活性”部分。特征性部分本文中使用的術(shù)語(yǔ)物質(zhì)的“特征性部分”的最廣泛意義是指與完整物質(zhì)共有某種程度的序列或結(jié)構(gòu)一致性的部分。在某些實(shí)施例中，特征性部分與完整物質(zhì)共有至少一種功能特征。舉例來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)或多肽的“特征性部分”是含有連續(xù)氨基酸片段或者一起為蛋白質(zhì)或多肽的特征的連續(xù)氨基酸片段集合的部分。在一些實(shí)施例中，所述連續(xù)片段一般各自含有至少2、5、10、15、20、50或更多個(gè)氨基酸。一般來(lái)說(shuō)，物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、 抗體等)的特征性部分是除上文說(shuō)明的序列和/或結(jié)構(gòu)一致性外，還與相關(guān)完整物質(zhì)共有至少一種功能特征的部分。在一些實(shí)施例中，特征性部分可具生物活性。表達(dá)本文中使用的核酸序列的“表達(dá)”是指以下一個(gè)或一個(gè)以上事件(1)由DNA 序列產(chǎn)生(例如通過(guò)轉(zhuǎn)錄)RNA模板；( 加工(例如，通過(guò)剪接、編輯、5'帽子形成和/或 3'端形成)RNA轉(zhuǎn)錄物；(3)將RNA翻譯成多肽或蛋白質(zhì)；和/或⑷多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。功能性本文中使用的“功能性”生物分子是呈展現(xiàn)其特征性特性和/或活性的形式的生物分子。基因本文中使用的術(shù)語(yǔ)“基因”是此項(xiàng)技術(shù)中所了解的含義。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)“基因”可包括基因調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)和/或內(nèi)含子序列。還應(yīng)理解，基因的定義包括不編碼蛋白質(zhì)而是編碼功能性RNA分子(諸如tRNA、RNAi 誘導(dǎo)因子等)的核酸。為清楚起見(jiàn)，應(yīng)注意，本申請(qǐng)案中使用的術(shù)語(yǔ)“基因”一般是指編碼蛋白質(zhì)的一部分核酸；此術(shù)語(yǔ)可任選涵蓋調(diào)控序列，這一點(diǎn)所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員從上下文中可以看出。此定義不打算排除術(shù)語(yǔ)“基因”于非編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)單元中的應(yīng)用，但很明顯，在大多數(shù)情況下，本發(fā)明中使用的這一術(shù)語(yǔ)是指編碼蛋白質(zhì)的核酸?；虍a(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物本文中使用的術(shù)語(yǔ)“基因產(chǎn)物”或“表達(dá)產(chǎn)物”一般是指由基因轉(zhuǎn)錄的RNA(加工前和/或加工后的RNA)，或者由基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA所編碼的多肽 (修飾前和/或修飾后的多肽)。同源性本文中使用的術(shù)語(yǔ)“同源性”是指聚合物分子之間，例如核酸分子(例如 DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。在一些實(shí)施例中，如果聚合物分子之間的序列至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或99 % —致，那么認(rèn)為所述分子彼此“同源”。在一些實(shí)施例中，如果聚合物分子之間的序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%類似，那么認(rèn)為所述分子彼此“同源”。一致性本文中使用的術(shù)語(yǔ)“一致性”是指聚合物分子之間，例如核酸分子(例如 DNA分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間的總體相關(guān)性。舉例來(lái)說(shuō)，可出于最佳比較的目的，比對(duì)兩個(gè)序列(例如，可在第一和第二核酸序列中的一者或兩者中引入空位以供最佳比對(duì)，且可忽略不一致的序列來(lái)達(dá)到比較的目的)，由此計(jì)算出兩個(gè)核酸序列的一致性百分比。在某些實(shí)施例中，出于比較目的而比對(duì)的序列的長(zhǎng)度是參考序列長(zhǎng)度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或?qū)嵸|(zhì)上100%。隨后比較相應(yīng)核苷酸位置的核苷酸。當(dāng)占據(jù)第一序列中某一位置的核苷酸與第二序列中的相應(yīng)位置相同時(shí)，認(rèn)為這些分子在所述位置一致。兩個(gè)序列之間的一致性百分比隨序列共有的一致位置的數(shù)量而變化，其中須考慮為實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳比對(duì)而引入的空位的數(shù)量和每一空位的長(zhǎng)度。序列的比較和兩個(gè)序列之間一致性百分比的確定可以使用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用梅爾斯(Meyers)和米勒(Miller) (CABI0S，1989，4 11-1)的算法來(lái)確定兩個(gè)核苷酸序列之間的一致性百分比，這一算法已經(jīng)并入ALIGN程序
版)，使用PAM120殘基權(quán)重表，空位長(zhǎng)度罰分(gaplength penalty)為12，且空位法分為4。或者，可以使用GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna. CMP矩陣確定兩個(gè)核苷酸序列之間的一致性百分比。經(jīng)分離本文中使用的術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離”是指物質(zhì)和/或?qū)嶓w(1)已與最初產(chǎn)生(無(wú)論在自然界中和/或在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中)時(shí)與其締合的至少一些組分分離；和/或(2)是由人工產(chǎn)生、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與最初與其締合的其它組分約10%、 約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約94%、約95%、約96% )、約97% ο、約98%、約99%或超過(guò)約99%分離。在一些實(shí)施例中，分離的試劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、 約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或超過(guò)約99 %純。如本文中所使用，如果一種物質(zhì)實(shí)質(zhì)上不含其它組分，那么其是“純”的。如本文中所使用，分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w的純度百分比的計(jì)算不應(yīng)包括賦形劑(例如緩沖劑、溶劑、水等)。模擬表位本文中使用的術(shù)語(yǔ)“模擬表位”是指模擬表位結(jié)構(gòu)的大分子。在一些實(shí)施例中，模擬表位引起的抗體反應(yīng)與其對(duì)應(yīng)的表位所引起的反應(yīng)一致或相似。在一些實(shí)施例中，識(shí)別表位的抗體也識(shí)別模擬所述表位的模擬表位。在一些實(shí)施例中，模擬表位是肽。 在一些實(shí)施例中，模擬表位是小分子、碳水化合物、脂質(zhì)或核酸。在一些實(shí)施例中，模擬表位是構(gòu)象保守的HCV表位的肽或非肽模擬表位。在一些實(shí)施例中，通過(guò)模擬構(gòu)象確定的病毒表位的結(jié)構(gòu)，模擬表位例如通過(guò)結(jié)合于其天然結(jié)合搭配物本身(例如HCV目標(biāo)受體、El蛋白等)，來(lái)干擾HCV病毒粒子結(jié)合其天然結(jié)合搭配物的能力。核酸本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”的最廣泛意義是指并入或可并入寡聚核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，核酸是經(jīng)由或可以經(jīng)由磷酸二酯鍵并入寡聚核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，“核酸”是指?jìng)€(gè)別核酸殘基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些實(shí)施例中，“核酸”是指包含個(gè)別核酸殘基的寡聚核苷酸鏈。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”與“多聚核苷酸”可互換使用。在一些實(shí)施例中，“核酸”涵蓋 RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或cDNA。此外，術(shù)語(yǔ)“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或類似術(shù)語(yǔ)還包括核酸類似物，即，具有非磷酸二酯主鏈的類似物。舉例來(lái)說(shuō)，在主鏈中具有肽鍵代替磷酸二酯鍵的此項(xiàng)技術(shù)中已知的所謂“肽核酸”被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括互為簡(jiǎn)并形式和/或編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。 編碼蛋白質(zhì)和/或RNA的核苷酸序列包括內(nèi)含子。核酸可由天然來(lái)源純化得到；使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生并任選經(jīng)過(guò)純化；以化學(xué)方式合成等。適當(dāng)時(shí)，例如在以化學(xué)方式合成的分子的情況下，核酸可包含核苷類似物，諸如具有以化學(xué)方式修飾的堿基或糖、主鏈修飾等的類似物。除非另作指示，否則提供的核酸序列是5'到3'方向。術(shù)語(yǔ)“核酸區(qū)段”在本文中用于指作為較長(zhǎng)核酸序列的一部分的核酸序列。在許多實(shí)施例中，核酸區(qū)段包含至少3、4、5、 6、7、8、9、10或更多個(gè)殘基。在一些實(shí)施例中，核酸是以下物質(zhì)或包含以下物質(zhì)天然核苷 (例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)；核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)；經(jīng)化學(xué)修飾的堿基；經(jīng)生物修飾的堿基(例如甲基化堿基)；插入的堿基；經(jīng)修飾的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖和己醣)；和/或經(jīng)修飾的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5' -N-氨基磷酸酯鍵)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明特別針對(duì)“未修飾的核酸”，其意思是未經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾以促進(jìn)或?qū)崿F(xiàn)遞送的核酸(例如多聚核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷)。蛋白質(zhì)本文中使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”是指多肽(即，至少兩個(gè)氨基酸借助于肽鍵連接在一起形成的鏈)。蛋白質(zhì)可包括除氨基酸外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以其它方式加工或修飾。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)理解，“蛋白質(zhì)”可以是由細(xì)胞產(chǎn)生的完整多肽鏈(具有或不具有信號(hào)序列)，或者可以是其特征性部分。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)理解，蛋白質(zhì)有時(shí)可包括例如經(jīng)由一個(gè)或一個(gè)以上二硫鍵連接或借助其它方式締合的一個(gè)以上多肽鏈。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或二者，并且可含有此項(xiàng)技
10術(shù)中已知的多種氨基酸修飾或類似物中的任一種。有用的修飾包括例如末端乙?；?、酰胺化、甲基化等。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其組合。術(shù)語(yǔ)“肽”一般用于指長(zhǎng)度小于約100個(gè)氨基酸、小于約50個(gè)氨基酸、小于20個(gè)氨基酸或小于10個(gè)氨基酸的多肽。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是抗體、抗體片段、其生物活性部分，和/或其特征性部分。復(fù)發(fā)性HCV感染本文中使用的“復(fù)發(fā)性HCV感染”是指臨床上和/或?qū)嶒?yàn)室有證據(jù)顯示感染再度發(fā)生，例如一種或一種以上感染癥狀，或在個(gè)體的肝中存在循環(huán)HCV粒子和/或HCV粒子。在一些實(shí)施例中，復(fù)發(fā)性HCV感染是指先前已感染HCV但已接收肝移植的個(gè)體的此種病狀。小分子一般說(shuō)來(lái)，此項(xiàng)技術(shù)中所理解的“小分子”是小于約2000g/mol、小于約 1500g/mol、小于約1000g/mol、小于約800g/mol或小于約500g/mol的有機(jī)分子。在一些實(shí)施例中，小分子不是聚合物。在一些實(shí)施例中，小分子不是蛋白質(zhì)、肽或氨基酸。在一些實(shí)施例中，小分子不是核酸或核苷酸。在一些實(shí)施例中，小分子不是糖或多糖。個(gè)體本文中使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”或“患者”是指可以投予本發(fā)明組合物以例如實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)、診斷、預(yù)防和/或治療目的的任何生物體。典型的個(gè)體包括動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物， 諸如小鼠、大鼠、兔、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人；昆蟲；蠕蟲等)。在一些實(shí)施例中，個(gè)體感染了、 罹患和/或易患HCV。實(shí)質(zhì)上本文中使用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上”是指展現(xiàn)全部或接近全部范圍或程度的相關(guān)特征或特性的定性條件。生物學(xué)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員應(yīng)理解，生物學(xué)和化學(xué)現(xiàn)象很少(如果發(fā)生過(guò))會(huì)達(dá)到完全和/或進(jìn)行到完全或者實(shí)現(xiàn)或避免絕對(duì)結(jié)果。因此，術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上” 在本文中用于捕捉許多生物學(xué)和化學(xué)現(xiàn)象中所固有的潛在完全性缺乏。罹患“罹患”疾病、病癥和/或病狀(例如HCV感染)的個(gè)體已經(jīng)被診斷患有疾病、病癥和/或病狀，和/或展現(xiàn)疾病、病癥和/或病狀的一種或一種以上癥狀。易患“易患”疾病、病癥和/或病狀(例如HCV感染)的個(gè)體尚未被診斷患有疾病、病癥和/或病狀。在一些實(shí)施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個(gè)體可展現(xiàn)出所述疾病、病癥和/或病狀的癥狀。在一些實(shí)施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個(gè)體可能未展現(xiàn)所述疾病、病癥和/或病狀的癥狀。在一些實(shí)施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個(gè)體將發(fā)展所述疾病、病癥和/或病狀。在一些實(shí)施例中，易患疾病、病癥和/或病狀的個(gè)體將不會(huì)發(fā)展所述疾病、病癥和/或病狀。治療有效量本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指當(dāng)向罹患或易患某種疾病、病癥和/或病狀(例如HCV感染)的個(gè)體投予時(shí)足以治療、診斷、預(yù)防所述疾病、病癥和/或病狀和/或延緩其發(fā)作的本發(fā)明組合物的量。治療劑本文中使用的短語(yǔ)“治療劑”是指當(dāng)投予個(gè)體時(shí)具有治療作用和/或引起所需的生物和/或藥理學(xué)作用的任何藥劑。在一些實(shí)施例中，治療劑是可用于減輕、改善、 緩解、抑制、預(yù)防HCV感染的一種或一種以上癥狀或特征；延緩其發(fā)作；降低其嚴(yán)重程度和/ 或降低其發(fā)生率的任何物質(zhì)。治療本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指用于部分或完全減輕、改善、緩解、抑制、預(yù)防疾病、病癥和/或病狀(例如HCV感染)的一種或一種以上癥狀或特征；延緩其發(fā)作；降低其嚴(yán)重程度，和/或降低其發(fā)生率的任何方法。治療可投予未展現(xiàn)疾病、病癥和/或病狀的病征的個(gè)體。在一些實(shí)施例中，治療可投予只展現(xiàn)疾病、病癥和/或病狀的早期病征的個(gè)體，以便降低發(fā)展與所述疾病、病癥和/或病狀相關(guān)的病理的風(fēng)險(xiǎn)。載體本文中使用的“載體”是指一種核酸分子，其能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其所締合的另一核酸。 在一些實(shí)施例中，載體能夠在諸如真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞等宿主細(xì)胞中染色體外復(fù)制和 /或表達(dá)其所連接的核酸。能夠引導(dǎo)可操作性連接的基因的表達(dá)的載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。HCV命名法所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，HCV命名法通常會(huì)利用阿拉伯?dāng)?shù)字(例如“ 1 ”、“ 2 ”、 “3”、“4”等)來(lái)表示HCV基因型，并利用小寫字母(例如“a”、“b”等)表示HCV亞型。盡管命名的規(guī)則一般為此項(xiàng)技術(shù)中所認(rèn)可，但所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在出版物、陳述、會(huì)談等中，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員并不總是嚴(yán)格遵循這些命名的規(guī)則。因此，舉例來(lái)說(shuō)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，隱含的意思是“HCV la”、“HCV基因型la”和“HCV亞型la”可供所屬領(lǐng)域技術(shù)人員互換使用，且這三個(gè)術(shù)語(yǔ)都打算指HCV基因型1亞型a。本文中使用的阿拉伯?dāng)?shù)字(例如“1”、“2”、“3”、“4”等)是用于指HCV基因型，而小寫字母(例如“a”、“b”等)是用于指HCV亞型。還應(yīng)了解，當(dāng)本文中提到特定基因型的 HCV時(shí)，其擬涵蓋指定基因型的所有亞型。舉個(gè)例子，“基因型1”在本文中用于指基因型1 的所有亞型(例如基因型1亞型a ；基因型1亞型b等)。如本文中所使用，在基因型和亞型名稱后出現(xiàn)的任何阿拉伯?dāng)?shù)字(例如“1”、“2”、 “3”、“4”等)應(yīng)理解為指HCV病毒株。


圖1 借助間接免疫熒光分析檢測(cè)與不同HCV基因型的結(jié)合。用帶有基因型1至IJ 6 的E1E2序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后M小時(shí)，將細(xì)胞固定于載波片上，并利用熒光顯微鏡檢術(shù)檢測(cè)結(jié)合于固定細(xì)胞的抗體。HC-1、HC-3、HC-11和CBH-23結(jié)合于基因型la、 lb、2a、2b、3a、4、5 和 6。圖2 由cDNA列翻譯得到的人單克隆抗體\和Vh結(jié)構(gòu)域⑶R序列。分析揭露，各抗體含有不同的\和Vh CDR序列。圖 3:IgG 亞類分型。HC-I 是 IgG2，而 HC-3、HC-11 和 CBH-23 是 IgGl。圖4:與不同HCV基因型的中和作用。測(cè)試20 μ g/ml各抗體中和不同HCV基因型的能力。各數(shù)字是與無(wú)抗體對(duì)照組相比較的中和百分比。R04是針對(duì)HCMV的同型匹配的人單克隆抗體，并用作陰性對(duì)照。圖5 抗體競(jìng)爭(zhēng)性分析。利用代表性經(jīng)生物素標(biāo)記的結(jié)構(gòu)域A (CBH-4D)、B (CBH-5) 和C (CBH-7) HCV抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)分析。HC-I和HC-11與結(jié)構(gòu)域A和C抗體具有極小競(jìng)爭(zhēng)，而與 CBH-5具有60%到80%的競(jìng)爭(zhēng)，這表明這些新抗體所識(shí)別的表位位于結(jié)構(gòu)域B內(nèi)。CBH-23 與結(jié)構(gòu)域A和B抗體具有極小或無(wú)競(jìng)爭(zhēng)，而與CBH-7具有超過(guò)90%的競(jìng)爭(zhēng)，這表明此表位位于結(jié)構(gòu)域C內(nèi)。HC-3與結(jié)構(gòu)域A、B和C抗體具有極小或無(wú)競(jìng)爭(zhēng)，表明此抗體識(shí)別新的不同結(jié)構(gòu)域。每一對(duì)照抗體(即，CBH-4D、CBH-5和CBH-7)都抑制其自身，并對(duì)其它兩種抗體具有極小抑制作用。圖6 人單克隆抗體抑制E2與⑶81的結(jié)合。將在中表達(dá)的含有1 μ g/ml E2的基因型lb E1E2與10 μ g/ml各測(cè)試抗體一起培育，隨后將抗體_抗原復(fù)合物添加到預(yù)先涂有⑶81的孔中。利用生物素化的CBH-4D測(cè)量E2與⑶81結(jié)合的檢測(cè)結(jié)果。CBH-5用作陽(yáng)性對(duì)照，而R04用作陰性對(duì)照。與R04陰性對(duì)照相比較，將E2糖蛋白與HC-1、HC-IU CBH-23或CBH-5 —起預(yù)培育使E2與⑶81的結(jié)合減少超過(guò)90%。與其它結(jié)構(gòu)域B或C HCV 抗體類似，這些HCV抗體通過(guò)阻斷E2與⑶81的結(jié)合來(lái)中和HCV。相比之下，在HC-3存在下預(yù)培育E2糖蛋白不會(huì)減少E2與CD81的結(jié)合。一式三份，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2次。誤差棒指示與平均值相差一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7 借助丙氨酸置換來(lái)定位HC-I和HC-Il的表位。通過(guò)定點(diǎn)誘變(加州斯特杰公司(Strategene，CA))，將突變引入來(lái)自基因型la H77c株(基因庫(kù)(GenBank)寄存編號(hào) AF009606)的E2中。在細(xì)胞中表達(dá)突變的Ε2蛋白，并利用ELISA進(jìn)行分析。突變的氨基酸描繪于y軸上。每一肽開(kāi)始的數(shù)字對(duì)應(yīng)于參考株H多聚蛋白中的位置。(A)HC-I和 (B)HC-IlHCV抗體與每一突變體的結(jié)合表示為相對(duì)于CBH-17的結(jié)合規(guī)范化并除以HC抗體與野生型的結(jié)合而得到的結(jié)合值百分比，描繪于χ軸上。圖8 借助丙氨酸置換來(lái)定位HC-3的表位。如圖7中所示進(jìn)行丙氨酸置換。圖9 針對(duì)HCVpp感染的抗體介導(dǎo)的中和作用的時(shí)程。為了估計(jì)在進(jìn)入路徑期間 HC-3抑制的步驟，與結(jié)構(gòu)域B和抗CD81抗體相比較，進(jìn)行時(shí)程研究。用抗CD81與結(jié)構(gòu)域B HCV抗體HC-Il阻斷病毒進(jìn)入的進(jìn)行性喪失模式類似。預(yù)期這是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)域BHCV抗體通過(guò)阻斷E2結(jié)合于⑶81來(lái)抑制病毒進(jìn)入。HC-3的作用模式與這兩種抗體類似表明，HC-3在一個(gè)臨時(shí)步驟(temporal step)抑制病毒進(jìn)入，這一步驟接近于病毒與⑶81的相互作用。這包括針對(duì)E2與不同HCV輔助受體(co-rec印tor)(諸如SR-B1)相互作用或緊接在⑶81接合之后的步驟的可能抑制。圖10 :HC-3表位涉及E1-E2 二聚化。與H77c相比較，HCVpp突變體R657A和 D658A(以及在較低程度上，F(xiàn)679A)顯示襯墊顆粒狀(cushion pellet)HCVpp中El明顯減少。這表明，這些殘基涉及El與E2之間雜二聚體的形成。以前未曾將這些殘基鑒別為涉及E1E2 二聚化。利用來(lái)自細(xì)胞溶解產(chǎn)物的E1E2也觀察到類似觀察結(jié)果。E431A突變體用作不會(huì)影響雜二聚體形成的突變的對(duì)照。圖11 :HC-3表位誘變對(duì)HCVpp感染性的影響。測(cè)定具有R657A、D658A和F679A、 L692A、I696A或D698A突變的病毒的感染性。每一突變對(duì)于病毒都是致死性的。對(duì)照突變 E43IA顯示沒(méi)有改變。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供識(shí)別丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(E2)的抗體。在一些實(shí)施例中， HCV E2抗體是單克隆抗體，諸如人單克隆抗體。在一些實(shí)施例中，HCV E2抗體結(jié)合于與一種或一種以上丙型肝炎病毒(HCV)基因型和/或亞型相關(guān)聯(lián)的E2。在一些實(shí)施例中，HCV E2抗體可用于治療、診斷和/或預(yù)防應(yīng)用。本發(fā)明提供包含HCV E2抗體的醫(yī)藥組合物和使用HCV E2抗體治療患者的方法。在一些實(shí)施例中，從來(lái)自受感染患者的血清中鑒別和分離出HCV E2抗體。如實(shí)例中所述，由3個(gè)感染HCV的個(gè)體的外周B細(xì)胞產(chǎn)生一組具有高血清結(jié)合中和滴度的人單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行表征。產(chǎn)生并分離出針對(duì)HCV E2的4種人單克隆抗體HC-l、HC-3、HC-Il和CBH-23。所有4個(gè)抗體都結(jié)合于HCV基因型la、lbda、2b、3a、4、5和6 (圖1)。這些抗體結(jié)合于在各種病毒類型和基因型之間保守的構(gòu)象表位。HC-1、HC-11和CBH-23抑制 E2蛋白與人CD81的相互作用(圖6)。HC-3不抑制E2與CD81的結(jié)合(圖6)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的HCV E2抗體可中和廣譜的HCV基因型和/或亞型。對(duì)于多種HCV基因型和/或亞型的反應(yīng)性廣度以及干擾HCV病毒粒子與易感細(xì)胞的結(jié)合的能力，是在治療上有用的中和抗體所需具備的。本發(fā)明還提供HCV包膜蛋白的肽和非肽結(jié)構(gòu)模擬物的設(shè)計(jì)方法。丙型肝炎病毒(HCV)丙型肝炎病毒(HCV)是一種包膜病毒，其遺傳信息編碼于9. 5kb的正鏈RNA基因組中。在此病毒基因組的5'端具有一個(gè)341bp的高度保守非編碼區(qū)，其后為一個(gè)長(zhǎng)開(kāi)放式閱讀框，負(fù)責(zé)編碼具有約3，010個(gè)氨基酸的多聚蛋白。已經(jīng)鑒別出兩種推定的包膜糖蛋白El(gp3Q和E2(gp72)，分別具有5或6個(gè)和11個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)。高水平的遺傳變異性與這些包膜基因相關(guān)。這一變異性在E2基因的5'端特別明顯，其中的兩個(gè)高變區(qū)已經(jīng)得以描述，稱為HVRl和HVR2。在細(xì)胞培養(yǎng)和黑猩猩保護(hù)研究中，針對(duì)HVRl的抗體似乎介導(dǎo)病毒中和作用(法西(Farci)等人，1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)，93 :15394-15399 ；和清水(Shimizu)等人，1994，病毒學(xué)雜志(J. Virol.)， 68 =1494-1500 ；二者都以引用的方式并入本文中)。盡管已經(jīng)在誘導(dǎo)針對(duì)HVRl相關(guān)序列的廣泛免疫反應(yīng)方面取得了進(jìn)展(普托雷羅(Puntoriero)等人，1998，歐洲分子生物學(xué)研究期刊(EMBO J.)，17 :3521-3533，以引用的方式并入本文中)，但不幸的是，針對(duì)HVRl的抗體傾向于具有分離株特異性，并且會(huì)隨時(shí)間而驅(qū)使現(xiàn)有免疫反應(yīng)不能識(shí)別的新病毒變異體復(fù)制(法西(Farci)等人，1994，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA), 91 :7792-7796 ；維納(Weiner)等人，1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，89 =3468-3472 ；和卡托 (Kato)等人，1993，病毒學(xué)雜志(J. Virol.)，67 =3923-3930 ；都以引用的方式并入本文中)。 HCV包膜抗原在表達(dá)為糖基化形式時(shí)，似乎具有高度免疫原性(達(dá)西爾瓦卡多索(da Silva Cardoso)等人，1997，血液學(xué)紀(jì)事(Ann. Hemato 1.),74 135-7 ；以引用的方式并入本文中)。 初步數(shù)據(jù)表明，在E2蛋白內(nèi)存在保守的表位(萊斯尼瓦斯基(Lesniewski)等人，1995，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志(J. Med. Virol. ),45 :415-22 ；以引用的方式并入本文中)。人們已經(jīng)提出，在受感染患者的血清中存在中和抗體。使用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的HCV E1-E2蛋白進(jìn)行的研究顯示，受感染個(gè)體對(duì)HCVE2具有抗體反應(yīng)，這一反應(yīng)實(shí)際上部分歸因于構(gòu)象和線性表位(哈拉達(dá)(Harada) 等人，1994，普通病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol. ),76 :1223-1231 ；以引用的方式并入本文中)。涉及分離針對(duì)HCV E2蛋白的人單克隆抗體或重組抗體的研究顯示，這些抗體中較大部分都識(shí)別構(gòu)象表位(達(dá)西爾瓦卡多索(da Silva Cardoso)等人，1998，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志(J.Med. Virol. )，55 觀-34;以引用的方式并入本文中)。對(duì)于這些結(jié)構(gòu)域的生物功能，由于病毒無(wú)法在體外生長(zhǎng)，故研究人員使用了代用品分析(surrogate assay)來(lái)了解病毒中和作用(霍格頓(Houghton)，“丙型肝炎病毒(Hepatitis C viruses)，”菲茲 (Fields)，柯尼普(Knipe)，郝雷(Howley)(編)病毒學(xué)(Virology)，利平科特-瑞文出版社(Lippincott-Raven)，費(fèi)城(Philadelphia)，1035-1058 ；以引用的方式并入本文中)。 一種代用品分析，即結(jié)合中和(neutralization of binding, NOB)分析，可評(píng)價(jià)指定抗體
14或血清防止HCV E2蛋白與人T細(xì)胞系締合的能力(羅薩(Rosa)等人，1996美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA), USA, 93 :1759-1763 ；以引用的方式并入本文中)。在 NOB分析中發(fā)現(xiàn)，從受到疫苗接種保護(hù)的黑猩猩獲得的血清抗體呈強(qiáng)陽(yáng)性，支持了使用這一分析作為病毒中和活性的量度的適用性(羅薩(Rosa)等人，同上文；和伊什(Ishii)等人， 1998，肝病學(xué)(Hepatology), 28 :1117-1120 ；二者以引用的方式并入本文中)。在NOB分析中，人四次跨膜細(xì)胞表面蛋白CD81(也稱為TAPA-I ；相關(guān)綜述，參見(jiàn)萊維(Levy)等人，1998，免疫學(xué)年評(píng)(Ann. Rev. Immunol.)，16 :89-109 ；以引用的方式并入本文中)是HCV E2結(jié)合的目標(biāo)蛋白(皮爾雷(Pileri)等人，1998，科學(xué)(Science), 282 938-941 ；以引用的方式并入本文中)。此外，人CD81還結(jié)合于游離的病毒粒子，隨后成為 HCV可能的受體(皮爾雷(Pileri)等人，同上文)。然而，有關(guān)不同基因型和/或亞型的 HCV E2蛋白中被先前鑒別的NOB陽(yáng)性抗體所識(shí)別的表位的保守性知之甚少。檢測(cè)和防止HCV的其它方法包括開(kāi)發(fā)肽模擬物。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)通過(guò)產(chǎn)生隨機(jī)生成的合成和噬菌體呈現(xiàn)肽文庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)甲型和丙型肝炎病毒蛋白的肽模擬物，以便用于檢測(cè)分析和疫苗接種療法中(馬提利(Mattioli)等人，1995，病毒學(xué)雜志(J. Virol.)，69 5294-5299 ；和普瑞茲(Prezzi)等人，I"6，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.)，156 :4504-4513 ；二者以引用的方式并入本文中)。然而，這些模擬表位的有效抗體結(jié)合只能與線性確定的病毒表位相比較。已經(jīng)描述了用于診斷分析中的數(shù)種線性確定的免疫顯性HCV表位的連續(xù)重組融合(奇恩(Chein)等人，1999，臨床微生物學(xué)雜志(J. Clin. Microbiol.), 37 :1393-1397 ； 以引用的方式并入本文中)。然而，產(chǎn)生的這一由線性表位設(shè)計(jì)的多表位融合抗原不具有與構(gòu)象模擬物相同的作用能力。設(shè)計(jì)的這一表位不能干擾與目標(biāo)受體的結(jié)合。提供有關(guān)HCV的背景信息的參考文獻(xiàn)包括阿布里尼亞尼(Abrignani)，1997， 施普林格免疫病理學(xué)論文(Springer Semin. Immunopathology)，19 :47-55 ；西蒙斯 (Simmonds)，1995，肝病學(xué) Ofepatology)，21 :570 :583 ；和馬哈雷(Mahaney)等人，1994， 肝病學(xué)，20 :1405-1411，都以引用的方式并入本文中。具有一部分HCV基因組的痘苗病毒或桿狀病毒構(gòu)建體描述于以下文獻(xiàn)中雷爾斯頓(Ralston)等人(1993，病毒學(xué)雜志(J. Virology)，67 :6733-6761 ；以引用的方式并入本文中)和蘭福德(Lanford)等人 (1993，病毒學(xué)(Virology), 197 :225-235 ；以引用的方式并入本文中)。HCV 抗體在各種基因型和亞型之間，HCV包膜糖蛋白基因在某種程度上呈現(xiàn)最高水平的遺傳異質(zhì)性，其中E2呈現(xiàn)的變異性比El高。在E2的N末端發(fā)現(xiàn)的高變區(qū)(HVRl)具有高度免疫原性，并且是分離株特異性中和抗體反應(yīng)的主要決定因素(法西(Farci)等人， 1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. , USA)，93 :15394 ；和清水(Shimizu) 等人，1994，病毒學(xué)雜志(J. Virol. )，68 :1494 ；二者以引用的方式并入本文中)。利用從連續(xù)沈年自特定患者收集的血清樣品得到的連續(xù)HCV分離株進(jìn)行的研究顯示，血清抗體無(wú)法中和在同一時(shí)間點(diǎn)同時(shí)存在的大量E1E2物質(zhì)(范哈恩(von Hahn)等人，2007，胃腸病學(xué)(Gastroenterology)，132 :667 ；以引用的方式并入本文中)。中和逃避(Escape)與 HVRl突變有關(guān)，由此引起對(duì)于從這一患者獲得的極早期分離株產(chǎn)生的針對(duì)HVRl的單克隆抗體的結(jié)合和中和作用減少。從更廣義上看，中和抗體通常針對(duì)E2內(nèi)的構(gòu)象表位(沃蘭德(Allander)等人，2000，普通病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol.), 81 :2451 ；布格力(Bugli)等人，2001，病毒學(xué)雜志(J. Virol. )，75 :9986 ；哈勃斯特澤(Habersetzer)等人，1998，病毒學(xué)(Virology)，249 :32 ；哈德洛克(Hadlock)等人，2000，病毒學(xué)雜志，74 :10407 ；和伊什 (Ishii)等人，1998，肝病學(xué)Ofepatology)，28 :1117 ；都以引用的方式并入本文中)。本發(fā)明者先前已經(jīng)描述了一組針對(duì)來(lái)源于感染基因型lb HCV的個(gè)體的外周B 細(xì)胞的HCV E2上的構(gòu)象表位的中和與非中和人單克隆抗體。利用交叉競(jìng)爭(zhēng)分析，鑒別出由具有不同功能和特性的重疊表位構(gòu)成的3個(gè)免疫原簇(immunogenic cluster)(柯克 (Keck)等人，2005，病毒學(xué)雜志(J.Virol. ),79 :13199 ；和柯克等人，2004，病毒學(xué)雜志，78 92M;二者以引用的方式并入本文中)。所有非中和抗體都屬于一個(gè)簇，稱為結(jié)構(gòu)域A(柯克(Keck)等人，2005，病毒學(xué)雜志(J. Virol. )，79 :13199 ；以引用的方式并入本文中)。中和抗體分屬于兩個(gè)簇，稱為結(jié)構(gòu)域B和C，其中結(jié)構(gòu)域B抗體在阻斷基因型加感染性細(xì)胞培養(yǎng)病毒(HCVcc)感染方面的效力比結(jié)構(gòu)域C抗體強(qiáng)(柯克(Keck)等人，2007，病毒學(xué)雜志 (J. Virol. ),81 1043 ；以引用的方式并入本文中)。經(jīng)證實(shí)，所有結(jié)構(gòu)域B抗體以及結(jié)構(gòu)域 C抗體都抑制E2與⑶81 (對(duì)于HCVpp和HCVcc進(jìn)入宿主細(xì)胞至關(guān)重要的一種HCV受體)的結(jié)合(徐(Hsu)等人，2003，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)，100 :7271 ； 和迪徹尼(Tscherne)等人，2006，病毒學(xué)雜志(J. Virol.)，80 1734 ；二者以引用的方式并入本文中)。盡管先前從一位感染HCV的個(gè)體中分離出了 4種針對(duì)結(jié)構(gòu)域B內(nèi)的重疊表位的抗體，但尚不清楚在多大程度上E2上的結(jié)構(gòu)域B表位是免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。實(shí)例1描述了感染基因型la HCV的個(gè)體中兩種新的人單克隆抗體HC-I和HC-Il的分離，這兩種單克隆抗體與較早研究組的結(jié)構(gòu)域B抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)，由此擴(kuò)充了此結(jié)構(gòu)域內(nèi)重疊表位的數(shù)量。這些抗體針對(duì)在所有基因型和/或亞型之間保守的構(gòu)象表位；中和HCVpp和HCVcc，其中一部分抗體的效力比先前提到的針對(duì)此結(jié)構(gòu)域的其它抗體強(qiáng)。利用這些抗體進(jìn)行中和的機(jī)制是抑制E2與⑶81的結(jié)合。此外，在E2上已經(jīng)確定接合⑶81的區(qū)域中進(jìn)行的丙氨酸取代研究(奧瓦斯卡(Owsianka)等人，2006，病毒學(xué)雜志(J. Virol.)，80 :8695 ；以引用的方式并入本文中)顯示，在這些HCV抗體表位內(nèi)的一些接觸殘基與E2結(jié)合于CD81所需的接觸殘基相同。從感染基因型lb HCV的個(gè)體中分離出了第三種人單克隆抗體CBH-23。CBH-23與針對(duì)結(jié)構(gòu)域C的代表性抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)，并通過(guò)抑制E2與CD81的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)中和作用。從感染基因型lb HCV的個(gè)體中分離出了第四種人單克隆抗體HC-3。HC-3不能與來(lái)自較早研究組的代表性結(jié)構(gòu)域A、B和C抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)，由此指示了一個(gè)新的結(jié)構(gòu)域，稱為D。HC-3不能抑制E2與CD81的結(jié)合(圖6)。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，HC-3介導(dǎo)病毒中和作用的機(jī)制發(fā)生的時(shí)間與病毒進(jìn)入期間病毒與CD81相互作用的時(shí)間大致相同。盡管不希望受任一特定理論的束縛，但HC-3可通過(guò)以下方式來(lái)介導(dǎo)病毒中和作用阻斷在E2結(jié)合于⑶81之前發(fā)生的病毒附著；阻斷剛好在E2結(jié)合于CD81之前或之后發(fā)生的病毒與不同輔助受體的相互作用； 和/或阻斷病毒成功進(jìn)入所涉及的一種或一種以上病毒包膜糖蛋白的構(gòu)象改變。鑒于抗體結(jié)合型式的多樣性，可以使用診斷分析來(lái)檢測(cè)多種類型和基因型和/或亞型，以便提供泛抗HCV抗體(pan-anti-HCV antibody) 0在一些實(shí)施例中，抗體可用于被動(dòng)免疫，以作為用于有感染HCV風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的保護(hù)性療法，或作為用于HCV血清反應(yīng)呈陽(yáng)性的人的療法。有關(guān)HCV抗體的應(yīng)用的參考文獻(xiàn)包括赤塚(Akatsuka)等人，1993，肝病學(xué)(Hepatology)，18 :503-510 ；德拉刺(DeLalla)等人，1993，肝病學(xué)雜志(J. Hepatol. )，18 163-167 ；蒙德里(Mondelli)等人，1994.病毒學(xué)雜志(J. Virol.)，68 :4829-4836 ；賽蒙特 (Siemoneit)等人，1994，雜交瘤(Hybridoma)，13 :9_13 ；和莫納德普(Moradpour)等人， 1996，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志(J. Med. Virol. ),48 :234-241 ；都以引用的方式并入本文中。本發(fā)明的HCV抗體具有數(shù)種優(yōu)于現(xiàn)有HCV抗體的益處。由于非同源性初級(jí)氨基酸序列也能確定免疫學(xué)一致的三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以致結(jié)合于結(jié)構(gòu)保守的表位的抗體可識(shí)別多種連續(xù)的相異HCV基因型和/或亞型的天然構(gòu)象，而只識(shí)別線性或變性表位的抗體則不能。 具體點(diǎn)說(shuō)，識(shí)別E2的構(gòu)象依賴性表位的抗體可有效干擾HCV病毒與其細(xì)胞目標(biāo)受體的相互作用。使用識(shí)別構(gòu)象依賴性表位的抗體來(lái)主動(dòng)干擾天然HCV病毒結(jié)合于目標(biāo)細(xì)胞受體(例如CD81)的能力，在降低受感染個(gè)體的病毒載量，和/或預(yù)防未感染個(gè)體的器官發(fā)生感染或再感染方面(例如，通過(guò)(i)識(shí)別不同HCV基因型和/或亞型所編碼的HCV E2蛋白；(ii) 結(jié)合HCV粒子；和/或(iii)防止HCV病毒粒子附著和進(jìn)入其目標(biāo)細(xì)胞)，尤其是對(duì)于近期的接收器官移植者、經(jīng)歷腎透析的個(gè)體、感染HCV的母親生育的嬰兒和/或經(jīng)歷血友病或其它血液凝固障礙的治療的個(gè)體，具有特別的治療作用。在一些實(shí)施例中，其它接收者包括近期暴露于HCV(例如經(jīng)由暴露于含HCV的體液)的個(gè)體。在一些實(shí)施例中，HCV抗體可用于治療帶有HCV病毒株的患者，所述HCV病毒株與導(dǎo)致產(chǎn)生所述抗體的HCV病毒株一致。在一些實(shí)施例中，HCV抗體可用于治療帶有HCV病毒株的患者，所述HCV病毒株不同于導(dǎo)致產(chǎn)生所述抗體的HCV病毒株?？梢允褂脗€(gè)別HCV抗體以及識(shí)別數(shù)種表位的數(shù)種HCV抗體的混合物。在一些實(shí)施例中，HCV抗體可通過(guò)不同于防止與⑶81直接相互作用的機(jī)制干擾E2 相關(guān)性病毒感染。在一些實(shí)施例中，HCV抗體可通過(guò)多種可能的機(jī)制，包括防止E2結(jié)合于輔助受體蛋白、破壞目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合必需的E2蛋白構(gòu)象改變、抑制E2介導(dǎo)的病毒與目標(biāo)蛋白融合，和/或抑制HCV病毒粒子脫殼，來(lái)干擾病毒感染。在一些實(shí)施例中，直接干擾E2與CD81 結(jié)合的HCV抗體可有效補(bǔ)助經(jīng)由其它機(jī)制干擾感染的HCV抗體。識(shí)別病毒表位并干擾病毒/目標(biāo)受體相互作用的本發(fā)明HCV抗體，以及結(jié)合于所述抗體的病毒表位，也可用作合理設(shè)計(jì)所述病毒表位的肽和其它結(jié)構(gòu)模擬物的模板。由這些HCV抗體確定的結(jié)構(gòu)分子模擬物能夠通過(guò)結(jié)合于目標(biāo)受體本身，來(lái)阻斷天然病毒與目標(biāo)受體的結(jié)合。通過(guò)產(chǎn)生人或人源化單克隆抗體，有可能直接分析人體對(duì)于HCV的免疫反應(yīng)。在一些情況下，需要使用人或人源化單克隆抗體。通過(guò)使用人單克隆抗體，可以使針對(duì)作為外來(lái)抗原的抗體本身的免疫反應(yīng)減到最少，而由非人來(lái)源產(chǎn)生的單克隆抗體則會(huì)因被識(shí)別為外來(lái)抗原，常常激發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。與只能夠結(jié)合線性或變性表位的抗體相比較，選擇識(shí)別保守病毒構(gòu)象表位的HCV抗體可使這些試劑在改善或預(yù)防HCV感染方面具有更為廣泛且更為有效的治療應(yīng)用。本文中所述的抗體可識(shí)別構(gòu)象表位，這些構(gòu)象表位是多種不同基因型和/或亞型中高度保守的HCV E2蛋白。因此，本文中所述的抗體的優(yōu)勢(shì)在于，與先前描述的許多中和抗體相比，其可更有效地針對(duì)多種HCV分離株。另一優(yōu)勢(shì)在于，本文中所述抗體所識(shí)別的表位具有高保守性，表明這些抗體可識(shí)別HCV E2蛋白內(nèi)具有功能和/或結(jié)構(gòu)重要性的序列。因此，利用這些抗體分離的肽或小分子很可能是HCV E2內(nèi)的功能區(qū)。HCV抗體的產(chǎn)生和表征
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用于開(kāi)發(fā)主題HCV抗體的總體策略描述于實(shí)例1中。簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)，⑴鑒別有證據(jù)顯示暴露于HCV的個(gè)體；⑵在體外擴(kuò)增和活化來(lái)自其外周血液的抗原特異性B細(xì)胞；(3) 通過(guò)與適合的小鼠-人異源骨髓瘤電融合來(lái)使這些細(xì)胞永生化；(4)鑒別分泌人抗體的相關(guān)雜交瘤；和( 通過(guò)克隆使相關(guān)雜交瘤穩(wěn)定。這一策略使得鑒別出對(duì)HCV E2蛋白具特異性且結(jié)合于HCV基因型la、lb、2a、2b、3a、4、5和6的E2的構(gòu)象表位的HCV抗體(圖1)。如實(shí)例1中所述，使用來(lái)自感染HCV Ia或Ib且具有高血清抗體中和活性的個(gè)體的外周B細(xì)胞，來(lái)產(chǎn)生和表征一組人單克隆抗體。最初的篩選利用了基因型lb E2蛋白來(lái)篩選來(lái)源于感染Ia的供體的抗體，或者利用la E2蛋白來(lái)篩選來(lái)源于感染Ib的供體的抗體。由于供體感染基因型Ia或Ib分離株，故這一步驟偏向于使用篩選方法來(lái)選擇針對(duì)基因型Ia與Ib之間保守的表位的抗體。利用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)發(fā)現(xiàn)，由這一篩選方法鑒別的抗體(即HC-1、HC-3、HC-11和CBH_2;3)不識(shí)別E2蛋白，而利用免疫沉淀法則顯示，其識(shí)別E2蛋白。這些結(jié)果表明，這些HCV抗體識(shí)別構(gòu)象表位。HCV 抗體 HC-1、HC-3、HC-11 和 CBH-23 都能夠結(jié)合于 HCV 基因型 la、lb、2a、2b、3a、 4、5 和 6 的 E1E2(圖 1)。HC-1 和 HC-Il 中和 HCV 基因型 la、lb、2a、2b、3a、4、5 和 6HCVpp Ia(圖4)和Ib感染以及HCVcc Ia和加感染(圖4)中的大部分。HC-3能夠中和HCVpp Ia 和 HCVcc 2a。HC-3 中和 la HCVpp 和 2a HCVcc (圖 4)，而 CBH-23 中和基因型 la、lb、2a HCVpp和加HCVcc (圖4)。這些數(shù)據(jù)顯示，全部四種HCV抗體都能夠識(shí)別和中和多種HCV基因型。⑶81捕捉分析顯示，這四種抗體中有三種(即HC-1、HC-Il和CBH-23)能夠阻斷E2 與⑶81的相互作用(圖6)。本發(fā)明顯示，與HCV E2內(nèi)的⑶81結(jié)合位點(diǎn)部分或完全重疊的表位實(shí)際上具有構(gòu)象性，而且是高度保守的。CD 81結(jié)合位點(diǎn)中高度的序列保守性符合HCV E2與CD 81之間的相互作用具有生物學(xué)相關(guān)性的提議。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到，由于HC-3中和HCV Ia和加，但不抑制E2與CD81的結(jié)合，故HC-3可能利用另外的病毒中和機(jī)制。人們?cè)褂酶?jìng)爭(zhēng)分析來(lái)確定具有HCV E2中類似結(jié)合位點(diǎn)的抗體。將先前鑒別的識(shí)別HCV E2結(jié)構(gòu)域A、B或C中一者的HCV抗體生物素化，并測(cè)定在遞增量的競(jìng)爭(zhēng)性HCV抗體(SP，HC-l、HC-3、HC-ll*CBH-23)存在下，生物素化的抗體與HCV E2的結(jié)合。HCV抗體 HC-I和HC-Il有效地與識(shí)別結(jié)構(gòu)域B的抗體競(jìng)爭(zhēng)，但不與識(shí)別結(jié)構(gòu)域A或C的抗體競(jìng)爭(zhēng)。 CBH-23有效地與識(shí)別結(jié)構(gòu)域C的抗體競(jìng)爭(zhēng)，而不與識(shí)別結(jié)構(gòu)域A或B的抗體競(jìng)爭(zhēng)。HC-3不與任何結(jié)構(gòu)域A、B或C抗體競(jìng)爭(zhēng)。這些結(jié)果表明，在相異的HCV基因型和/或亞型之間，HCV E2糖蛋白內(nèi)的構(gòu)象表位高度保守。識(shí)別這些表位的抗體可用作更好地確定HCV E2結(jié)構(gòu)的試劑。此外，經(jīng)證實(shí)， 抑制HCV病毒粒子與人CD81的結(jié)合的抗體可介導(dǎo)HCVpp和HCVcc模型(此項(xiàng)技術(shù)中公認(rèn)的HCV模型)的病毒中和作用。事實(shí)上，所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，成功中和HCVpp 和/或HCVcc預(yù)示著體內(nèi)治療活性(例如參見(jiàn)拉文(Lavie)等人，2007，現(xiàn)代分子生物學(xué)專題(Curr. Issues Mol. Biol.)，9 :71-86 ；博托奇(Bartosch)等人，2003，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 (J. Exp. Med.)，197 :633-642 ；和勞爾(Law)等人，2008，自然-醫(yī)學(xué)(Nat. Med.)，14 :25-27 ； 都以引用的方式并入本文中)。因此，本發(fā)明提供HCV E2抗體HC-1、HC-3、HC_11和/或CBH-23。本發(fā)明提供識(shí)別與HC-1、HC-3、HC-11和/或CBH-23相同或相似表位的抗體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供與HC-l、HC-3、HC-Il和/或CBH-23競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于E2蛋白的抗體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供使HC-I、HC-3、HC-Il和/或CBH-23與E2蛋白的結(jié)合減少約30%、約40%、約50%、 約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約95 %或超過(guò)約95 %的抗體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供與HC-1、HC-3、HC-Il和/或CBH-23競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于E2 蛋白的試劑(例如小分子、肽、核酸、脂質(zhì)、納米粒子等)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供使 HC-1、HC-3、HC-11和/或CBH-23與E2蛋白的結(jié)合減少約30%、約40%、約50%、約60%、 約70%、約80%、約90%、約95%或超過(guò)約95%的試劑(例如小分子、肽、核酸、脂質(zhì)、納米粒子等)。HCVpp (HCV假型粒子)模型包含用未修飾的HCV El和E2蛋白假型化的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子(例如參見(jiàn)博托奇(Bartosch)等人，2003，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J. Exp. Med.), 197 633-642 ；杜默(Drummer)等人，2003 ；歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊(FEBS Lett. ),546 :385-390 ； 奧普德貝克(Op De Beeck)等人，2004，病毒學(xué)雜志(J. Virol. ),78 =2994-3002 ；和徐(Hsu) 等人，2003，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)，100 :7271-7276 ；都以引用的方式并入本文中)。HCVpp優(yōu)先感染人肝細(xì)胞，可用抗E2抗體中和、用感染HCV的患者的血清中和，并模擬HCV感染的早期階段，包括病毒進(jìn)入(博托奇(Bartosch)等人，2003， 同上文；和拉文(Lavie)等人，2007，現(xiàn)代分子生物學(xué)專題(Curr · Issues Mol. Biol. ),9 71-86 ；二者以引用的方式并入本文中)?；贖CVpp的分析可用于觀察病毒進(jìn)入并與體內(nèi)的生理?xiàng)l件相關(guān)聯(lián)，并且適用于開(kāi)發(fā)新的抗病毒療法(博托奇(Bartosch)等人，2003，同上文)。HCVcc (細(xì)胞培養(yǎng)的HCV病毒粒子)模型提供了一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其能夠產(chǎn)生感染性、完全復(fù)制型HCV病毒粒子(林德貝奇(Lindenbach)等人，2005，科學(xué)(Science)，309 623-626 ；脅田(Wakita)等人，2005，自然-醫(yī)學(xué)(Nat. Med.)，11 :791-796 ；和鐘(Zhong)等人，2005，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)，102 =9294-9299 ；都以引用的方式并入本文中)。HCVcc系統(tǒng)是基于用從患有暴發(fā)型肝炎的個(gè)體克隆的基因型^iJFHl病毒株的基因組HCV RNA轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh-7。為了能進(jìn)行不同HCV病毒株之間的比較研究，也已經(jīng)制造出編碼不同基因型的結(jié)構(gòu)蛋白和JFHl分離株的非結(jié)構(gòu)蛋白的嵌合基因組(派特斯曼(Pietschmarm)等人，2006)。HCVcc模型能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行體外復(fù)制，以及在黑猩猩中進(jìn)行體內(nèi)復(fù)制(脅田(Wakita)等人，2005，同上文)。HCVcc系統(tǒng)能夠研究完整的病毒生活史，并確認(rèn)利用HCVpp系統(tǒng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。已公認(rèn)，幾乎所有使用HCVcc病毒粒子進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都與使用HCVpp病毒粒子進(jìn)行的類似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。參見(jiàn)林德貝奇(Lindenbach)等人，2005，科學(xué)(Science)， 309 :623-626 ；拉文(Lavie)等人，2007，現(xiàn)代分子生物學(xué)專題(Curr· Issues Mol. Biol.)， 9 :71-86;查培爾(Chapel)等人，2007，普通病毒學(xué)雜志(J. Gen. Virol.) ,88 :1133-1143 ； 雷格嘉德(Regeard)等人，2007，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊(FEBS J.)，274 :4705-4718 ；海特斯曼(Pietschmann)等人，2006，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)，103 7408-7413;脅田(Wakita)等人，2005，自然-醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)，11 :791-796 ；易 (Yi)等人，2006，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)，103 :2310-2315 ；鐘 (Zhong)等人，2005，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. ki.，USA)，102 :9294-9299 ； 都以引用的方式并入本文中。已經(jīng)確立的另一研究HCV的模型是“HCV-三聚體(HCV-Trimera) ”小鼠模型(艾蘭(Ilan)等人，2002，感染性疾病雜志(J. Infect. Dis.), 185 =153-61 ；以引用的方式并入本文中)。HCV-三聚體小鼠模型是使用致死性照射的小鼠，用嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷Severe Combined Immunodeficiency, SCID)小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行重構(gòu)，并且其中已經(jīng)移植有離體感染了 HCV的人肝片段而產(chǎn)生。HCV三聚體小鼠可用于評(píng)估潛在HCV治療劑和/或診斷劑在體內(nèi)的治療功效(艾蘭(Ilan)等人，2002，感染性疾病雜志(J. Infect. Dis.), 185 153-61 ；厄侖(Eren)等人，2006，病毒學(xué)雜志(J. Virol.)，80 :26544664 ；以引用的方式并入本文中)。已公認(rèn)，在培養(yǎng)系統(tǒng)中使用HCVcc或HCVpp病毒粒子進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與使用人肝-小鼠嵌合模型進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致(厄侖(Eren)等人，2006，病毒學(xué)雜志 (J. Virol.)，80 J654-2664 ；和勞爾(Law)等人，2008，自然-醫(yī)學(xué)(Nat. Med.)，14 :25-27 ； 二者以引用的方式并入本文中)。此外，也已經(jīng)確立，在體外分析中和擴(kuò)展的體內(nèi)小動(dòng)物人小鼠嵌合模型(例如三聚體小鼠模型)中，HCV復(fù)制的抑制與在體內(nèi)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中HCV 的抑制相關(guān)聯(lián)。舉例來(lái)說(shuō)，在部分集中于所選多克隆人IgG制劑預(yù)防黑猩猩感染的能力的研究中，利用HCVpp分析確定的具有高中和滴度的制劑具有保護(hù)性，而具有低中和滴度的制劑則沒(méi)有。參見(jiàn)余(Yu)等人·，2004，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA)， 101 :7705-7710 ；以引用的方式并入本文中。已知這些模型系統(tǒng)的預(yù)測(cè)值，那么所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員將易于認(rèn)識(shí)到，可在體內(nèi)成功地使用 HC-1、HC-3、HC-11 和 / 或 CBH-23 (或識(shí)別與 HC-1、HC-3、HC_11 和 / 或 CBH-23 相同的表位的抗體)中和HCV。與在肝移植中利用乙型肝炎免疫球蛋白取得的成功類似(迪克森(Dickson)，1998，肝移植外科學(xué)(Liver Transpl. Surg.)，4 (5 增刊 1) :S73_S78 ；馬克維茲(Markowitz)等人，1998，肝病學(xué)Ofepatology)觀=585-589 ；二者以引用的方式并入本文中)，一個(gè)可能的應(yīng)用是利用廣譜反應(yīng)性中和人單克隆抗體抑制肝移植接受者感染HCV。盡管提供了人單克隆抗體，但來(lái)自其它來(lái)源的其它抗體也可以識(shí)別與本文中所述的人類抗體所識(shí)別相同的表位，并且也可以使用。一般說(shuō)來(lái)，可以利用來(lái)自鼠類來(lái)源(例如小鼠、大鼠、兔形目等)和家畜(例如兔、豚鼠、山羊、綿羊、豬、雞、馬、倉(cāng)鼠等)的抗體。可以使用遺傳工程改造并置換本文中提供的HCV抗體的恒定區(qū)來(lái)產(chǎn)生具有哺乳動(dòng)物來(lái)源的保守區(qū)的抗體，或者可以使用下文所述的蛋白質(zhì)作為免疫原使動(dòng)物免疫，隨后使所得B細(xì)胞永生化，并如下文所述篩選可產(chǎn)生具有類似的廣泛結(jié)合特異性的單克隆抗體的永生化細(xì)胞，從而產(chǎn)生抗體。通過(guò)在競(jìng)爭(zhēng)性分析中利用主題HCV抗體進(jìn)行篩選，可以確定非人類抗體是否結(jié)合于相同的表位。除使用雜交瘤作為抗體來(lái)源外，也可分離出編碼HCV抗體或其部分的基因，并將其引入適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞G^i^nCH0、CH0-KlJ93T、Huh7、Huh7. 5、HeLa、CVl等)中， 以此作為抗體來(lái)源。適合的表達(dá)質(zhì)粒包括pcDNA3. lko、pIND (SPl)、pREP8(都購(gòu)自英杰公司anvitrogen)，位于加州卡爾斯巴德(Carlskid，CA))(參見(jiàn)實(shí)例1)等。可經(jīng)由病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)抗體基因，所述載體例如可為基于MLV的載體、基于痘苗病毒的載體等。類似地，也可使用pCOMB系列載體，在M13噬菌體的表面上將抗體基因表達(dá)為兩條獨(dú)立的鏈，可使其復(fù)性來(lái)形成完整的抗體?；蛘撸梢詫⒖贵w表達(dá)為至少包括可變區(qū)的單一鏈。 基因在基因療法中的應(yīng)用可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)將基因引入適合的細(xì)胞中，諸如淋巴細(xì)胞、 肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，在這些細(xì)胞中可組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)和分泌抗體，從而基于宿主細(xì)胞的壽命，在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)連續(xù)或間歇地提供抗體來(lái)源。可將基因與標(biāo)記基因(例如抗生素抗性、熒光標(biāo)記、養(yǎng)分選擇等)相結(jié)合引入從個(gè)體獲取的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中，借助于標(biāo)記物選擇經(jīng)修飾的細(xì)胞，并將作標(biāo)記的細(xì)胞回輸?shù)剿拗髦?。舉例來(lái)說(shuō)，可使用各種質(zhì)粒DNA、 裸DNA、DNA病毒構(gòu)建體(例如腺病毒、腺相關(guān)病毒或痘苗病毒)和/或RNA病毒(例如水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus)、辛德畢斯病毒(sindbis virus)和西門利克森林病毒(semiliki forestvirus))將DNA引入細(xì)胞中。在一些實(shí)施例中，DNA構(gòu)建體具有啟動(dòng)子，由此轉(zhuǎn)錄因子可存在于個(gè)體細(xì)胞中或者可經(jīng)誘導(dǎo)或引入，并且基因處于這一啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。也可能存在其它調(diào)控序列，諸如分泌前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、RNA穩(wěn)定序列等。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgG類別。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgGl或IgG2 類別(圖3)。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgG1類別。在某些實(shí)施例中，抗體是屬于IgGlK 類別。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgGlY、IgGlS或化61；^類別。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgG2、IgQ或IgQ類別。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgA、IgD、IgE或IgM類別。在一些實(shí)施例中，抗體是屬于IgA1或IgA2類別?？贵w可以其天然形式使用，或者可截短而提供Fab或F(ab' )2片段?？梢杂枚喾N不同的方式分離和修飾編碼重鏈和輕鏈的基因。宜使用RT-PCR，獲得呈適宜構(gòu)造的基因的 cDNA以供進(jìn)一步操作?？煞蛛x重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，并直接或間接或者經(jīng)由3η 核苷酸鏈進(jìn)行連接，由此在兩個(gè)可變區(qū)之間提供氨基酸連接子，其中η至少為1，且不超過(guò)約60，通常不超過(guò)約40。鏈的長(zhǎng)度可憑經(jīng)驗(yàn)確定，以提供最佳的親和力和其它特性，例如經(jīng)由巰基、羧基或氨鍵聯(lián)以便與表面或其它分子螯合、鍵合等?？蓪?biāo)記或標(biāo)簽與編碼抗體的基因連接，以提供針對(duì)所表達(dá)抗體的特定親和分離方法、與表面、標(biāo)記或標(biāo)簽連接以供鑒別等。標(biāo)記或標(biāo)簽可在其它方面改進(jìn)所分離抗體基因的效用。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記或標(biāo)簽經(jīng)由連接子(諸如可裂解臂、蛋白酶位點(diǎn)等)與抗體締合。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記或標(biāo)簽直接締合于(例如共價(jià)或非共價(jià))抗體、編碼抗體的基因或其片段。標(biāo)記可包括酶、螯合基團(tuán)、供結(jié)合于配體結(jié)合蛋白的配體(例如生物素/抗生蛋白鏈菌素、毛地黃毒苷/抗毛地黃毒苷等)、綠色熒光蛋白等。大腸桿菌生物素羧基載體蛋白 (biotin carboxylase carrier protein, BCCP)的生物素化序歹[J可用于在體內(nèi)使大腸桿菌中表達(dá)或以大腸桿菌溶解產(chǎn)物形式引入的蛋白質(zhì)生物素化?？梢允褂?個(gè)組氨酸的序列或交替組氨酸與天冬氨酸序列，這些序列適于使抗體結(jié)合于含有固定的二價(jià)陽(yáng)離子的柱。可以使用編碼高親和力表位的序列，諸如FLAG表位DYKDDDDK(SEQ ID NO :1)、T7標(biāo)簽序列 MASMTGGQMG (SEQ ID NO : 、S 標(biāo)簽序列 KETAAAKFERQHMDS (SEQID NO :3)，或賦予與相關(guān)結(jié)合成員或蛋白質(zhì)試劑的高親和力結(jié)合的任何其它序列。除上文所述者外，融合蛋白還包括谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶、肝細(xì)胞上所見(jiàn)的細(xì)胞表面受體的配體、T細(xì)胞或其它所需的細(xì)胞目標(biāo)等。這些融合物通常是經(jīng)由具有3到50個(gè)氨基酸的連接序列連接，由此促進(jìn)了蛋白質(zhì)的雙功能性。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記包括熒光、放射性、發(fā)光和/或酶可檢測(cè)部分。或者，抗體可連接于螯合的有毒重金屬或放射性同位素(例如锝、放射性碘等)。抗體可以化學(xué)方式連接于熒光團(tuán)或化學(xué)發(fā)光分子。化學(xué)偶聯(lián)可涉及使用活化的羧酸基團(tuán)或生物素-Cll-羥基琥珀
21酰亞胺酯(將與半胱氨酸反應(yīng))的生物素化；通過(guò)使用CNBr活化各種珠粒(瓊脂糖凝膠、 瓊脂糖、磁性珠粒、聚苯乙烯等)或表面進(jìn)行偶聯(lián)以連接抗體等；一般涉及將抗體與有用化學(xué)部分橋接的許多其它方法，其通常通過(guò)修飾賴氨酸或其它堿性殘基或者使用游離硫氫基特異性試劑實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記可使半胱氨酸與馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)形成硫醚、聚組氨酸/半胱氨酸或聚組氨酸/天冬氨酸螯合金屬、聚賴氨酸與醛發(fā)生還原胺化反應(yīng)等。在一些實(shí)施例中，標(biāo)記可以是毒素，諸如白喉毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖體失活蛋白、細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、成孔蛋白(例如穿孔素(perforin))等?？筛鶕?jù)已知的方式，使抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(尤其可變區(qū)的高變區(qū))基因突變，以增強(qiáng)抗體的結(jié)合親和力或擴(kuò)大反應(yīng)性。人們可以使用體外選擇，通過(guò)使用噬菌體呈現(xiàn)方法、隨機(jī)或定向序列誘變或其它類似的方法，來(lái)鑒別最佳抗體結(jié)合?；蛘?，可以使用丙氨酸或甘氨酸步行(alanine or glycine walk)通過(guò)高變區(qū)，以鑒別基本氨基酸，隨后改變這些或其它位點(diǎn)的氨基酸以鑒別表位結(jié)合的改良。此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它技術(shù)也可用于提供誘變的抗體。例如參見(jiàn)格拉姆(Gram)等人，1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. , USA)，89 :；3576_80 ；格里夫斯(Griffiths)等人，1993，歐洲分子生物學(xué)研究期刊(EMBO J.)，12 :725-34 ；德科魯夫(de Kruif)等人，1995，分子生物學(xué)雜志 (J. Mol. Biol. ),248 :97-105 ；勞爾(Low)等人，1996，分子生物學(xué)雜志，260 :359-368 ；海恩斯(Hanes)等人，2000，自然-生物技術(shù)(Nat. Biotechnol.)，18 :1287-1292 ；博德(Boder) 等人，2000，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA),97 :10701-10705 ；蓋夫 (Graff)等人，2004，蛋白質(zhì)工程、設(shè)計(jì)和選擇(Protein Eng. Des. Sel.)，17 :293-304 ；庫(kù)姆博思(Cumbers)等人，2002，自然-生物技術(shù)，20 :11四_1134 ；查德哈瑞(Chowdhury)和帕斯坦(Pastan), 1999,自然-生物技術(shù)，17 :568-572 ；紐博格(Neuberger)和米爾斯坦 (Milstein)，1995，現(xiàn)代免疫學(xué)觀點(diǎn)(Curr. Opin. Immunol.)，7 :248-254 ；喬利(Jolly)等人，1996，免疫學(xué)論文集(Semin. Immunol.), 8 :159-168 ；紐博格(Neuberger)等人，1998，免疫學(xué)研究(Immunol. Rev), 162 :107-116 ；紐博格，2002，生物化學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)(Biochem. Soc. Trans.)，30 :341-350 ；比爾斯(Beers)等人，2000，臨床癌癥研究(Clin. Cancer Res. ),6 2835-2843 ；和薩爾瓦托(Salvatore)等人，2002，臨床癌癥研究，8 =995-1002 ；都以引用的方式并入本文中。有關(guān)人類抗體的制造的參考文獻(xiàn)包括弗奧格(Rnmg)等人，1990，免疫學(xué)方法 (J. Immunol. Methods), 70 :83-90 ；和澤姆曼(Zimmermann)等人，1990，免疫學(xué)方法，134 43-50 ；二者以引用的方式并入本文中。有關(guān)使用組合文庫(kù)產(chǎn)生經(jīng)修飾抗體的參考文獻(xiàn)， 參見(jiàn)伯頓(Burton)和巴貝斯(Bartas)，蒂克頓FJ (Dixon, FJ)(編)免疫學(xué)研究進(jìn)展 (Advances in Immunology)，第 57 卷，Vi+391 頁(yè)，學(xué)術(shù)出版公司(Academic Press, Inc.), 加州圣地亞哥(San Diego,CA), 191-280,1994 ；帕雷斯特(Plaisant)等人，1997，病毒學(xué)研究(Res. Virol. )，148-169 ；以及巴貝斯和伯頓，來(lái)自組合文庫(kù)的單克隆抗體(Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries.)冷泉港實(shí)驗(yàn)過(guò)禾呈指南(Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual)，紐約冷泉港(Cold Spring Harbor，NY)，1994 ；都以引用的方式并入本文中。可通過(guò)誘變，隨后針對(duì)所需特性，諸如與目標(biāo)抗原的親和力增加或者較寬或較窄的特異性進(jìn)行體外選擇，來(lái)產(chǎn)生經(jīng)修飾抗體。也可以用毒素或其它生物活性分子修飾抗體。有關(guān)抗體結(jié)合于HCV E2的分析描述于羅薩(Rosa)等人(1996，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊 (Proc. Natl. Acad. Sci. , USA),93 :1759-1763 ；以引用的方式并入本文中)中。構(gòu)象表位表位的表征可以使用抗體來(lái)鑒別E2蛋白上其所結(jié)合的結(jié)構(gòu)表位。可以采用兩種基本方法， 使用單克隆抗體來(lái)鑒別構(gòu)象表位。在第一種方法中，可使用HCV分離株的天然變異體或突變分析來(lái)鑒別各區(qū)域，并最終鑒別出由單克隆抗體識(shí)別的表位中所涉及的個(gè)別氨基酸(斯奇沃茲(Schwartz)等人，1999，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.), 287 :983-999 ；以引用的方式并入本文中)。篩選針對(duì)多種不同HCV E2分離株的抗體，鑒別不與個(gè)別抗體選擇性反應(yīng)的分離株。隨后構(gòu)建“嵌合”E2包膜蛋白，其中嵌合體的多個(gè)部分是來(lái)源于一種HCV基因型的E2蛋白，而其它部分來(lái)源于另一 HCV基因型的E2蛋白。通過(guò)PCR擴(kuò)增重疊片段，和 /或利用兩種E2蛋白共有的限制性位點(diǎn)，來(lái)構(gòu)建嵌合E2蛋白。替代性方法是麥克基恩生物技術(shù)公司(MaxyGen)首先采用的DNA改組法(評(píng)述于以下文獻(xiàn)中克汗(Cohen)，2001， 科學(xué)(Science )，293 :237 ；羅徹爾(Locher)等人，2005，DNA 與細(xì)胞生物學(xué)(DNA Cell Biol. )，24 :256-263 ；羅徹爾等人，2004，生物療法專家評(píng)論(Expert Opin. Biol. Ther.)， 4 =589-597 ；羅徹爾等人，2004，分子治療學(xué)新見(jiàn)(Curr· Opin. Mol. Ther.)，6 34-39 ；庫(kù)茲曼 (Kurtzman)等人，2001，現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)(Curr. Opin. Biotech.), 12 :361-370 ；以及米恩肖爾(Minshull)和斯特姆(Stemmer)，1999，現(xiàn)代化學(xué)與生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr. Opin. Chem. Biol. ),3:284-290 ；都以引用的方式并入本文中)。通過(guò)調(diào)查觀察到的不同嵌合E2蛋白與不同單克隆抗體的結(jié)合反應(yīng)性，可以鑒別出E2蛋白中涉及形成構(gòu)象表位的氨基酸區(qū)域。一旦鑒別出相關(guān)區(qū)域，就能使不同基因型間不同的個(gè)別氨基酸突變以構(gòu)成反應(yīng)性E2序列。使用修復(fù)全部反應(yīng)性的突變體鑒別形成表位所涉及的氨基酸。第二種確定構(gòu)象表位的基本方法是，合成一系列長(zhǎng)度為10到15個(gè)殘基的重疊肽，這些肽編碼所需的HCV E2序列(例如參見(jiàn)佩特(Petit)等人，2003，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.)，278 :44385_44392 ；莫斯卡倫科(Moskalenko)等人，2000，病毒學(xué)雜志(J. Virol. )，74 :1761-1766 ；皮特森(Pettersson)，1992，分子生物學(xué)報(bào)告(Mol. Biol. Rep.), 16 :149-53 ；基爾洛夫-尼杰蘭德(Gerlofs-Nijland)等人，2003，腎元實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟學(xué) (Nephron Exp. Nephrol. ),94 :e25_34 ；都以引用的方式并入本文中)。隨后使用高濃度抗體(通常100yg/ml或更高)，針對(duì)抗體篩選肽。包含完整構(gòu)象表位的個(gè)別區(qū)域通常保留可檢測(cè)的與抗體的殘留結(jié)合活性。一旦鑒別出這些區(qū)域，就可以在肽的情況下或通過(guò)取代入構(gòu)象完整的HCV E2蛋白中，使用涉及所述肽的10到15個(gè)殘基的突變研究來(lái)確認(rèn)所述區(qū)域。 這一方法的變型描述于雷尼克(Reineke)等人(1999，自然-生物技術(shù)(Nat. Biotech.)， 17 :271-275 ；以引用的方式并入本文中)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供HCV E2蛋白中構(gòu)象表位的確定方法，并且進(jìn)一步提供含有所述表位的組合物和化合物。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供包含HCV E2蛋白的構(gòu)象表位的模擬劑(例如蛋白質(zhì)、肽、小分子、碳水化合物、脂質(zhì)、納米粒子、核酸、模擬表位、有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、無(wú)機(jī)化合物等)。肽試劑可含有一個(gè)或一個(gè)以上由本發(fā)明抗體識(shí)別的表位。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是多聯(lián)體肽鏈，其中至少一者含有HCV E2的構(gòu)象表位。肽鏈中的肽可含有HCV的不同構(gòu)象表位，或者這些肽可含有相同表位。肽鏈中的肽優(yōu)選應(yīng)適
23與其在自然界所呈現(xiàn)的實(shí)質(zhì)上相同的構(gòu)象表位。這些蛋白質(zhì)和肽可用于調(diào)配疫苗或用于診斷測(cè)試中。本發(fā)明提供根據(jù)針對(duì)HCV的免疫反應(yīng)對(duì)患者分級(jí)的方法，以及鑒別可能對(duì)HCV免疫療法良好反應(yīng)的那些患者的方法。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用患者的血清來(lái)測(cè)試針對(duì)HCV E2的特定表位的抗體的存在。如果患者不具有針對(duì)所述表位的適宜抗體水平，那么可對(duì)患者投予針對(duì)所述表位的人單克隆抗體。在調(diào)配針對(duì)HCV的疫苗時(shí)，可以使用模擬HCV E2蛋白的至少一個(gè)構(gòu)象表位的任何試劑。在一些實(shí)施例中，以疫苗形式提供的表位包括在不同病毒基因型間或不同病毒株間保守的表位。在一些實(shí)施例中，使用含有HCV E2的構(gòu)象確定的表位的肽或蛋白質(zhì)，來(lái)調(diào)配疫苗以預(yù)防HCV感染或治療HCV感染。在一些實(shí)施例中，肽或蛋白質(zhì)模擬物的長(zhǎng)度可小于 500個(gè)、小于200個(gè)、小于100個(gè)、小于50個(gè)、小于40個(gè)、小于30個(gè)或小于20個(gè)的氨基酸。 在一些實(shí)施例中，用于調(diào)配疫苗的肽是HCV E2蛋白的肽片段。在一些實(shí)施例中，肽折疊的方式類似于其在天然E2蛋白中的折疊方式，由此保留了構(gòu)象表位的三維結(jié)構(gòu)。疫苗也可含有蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是具有抗體所需的構(gòu)象表位的多聯(lián)體肽?？梢允褂脭?shù)種不同的肽構(gòu)成多聚體，以致每一肽含有不同的表位，或者可以在多聚體中使用相同肽超過(guò)一次?？梢允褂么隧?xiàng)技術(shù)中已知的任何方法，包括馬氏固相化學(xué)(Merrifield solid phasechemistry)，來(lái)合成肽。這些肽也可通過(guò)裂解El或E2蛋白并純化而得到?？稍诖竽c桿菌、酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae)),昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中，使用此項(xiàng)技術(shù)中任何可用的技術(shù)重組制備和產(chǎn)生肽(薩姆布魯克 (Sambrook)等人；米勒(Miller)和卡洛斯(Calos)編，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體 (Gene Transfer vectors for Mammalian Cells)，1987 ；奧斯貝爾(Ausubel)等人編，現(xiàn)代分子生物學(xué)方案(Current Protocols in Molecular Biology)，1987 ；各以引用的方式并入本文中)。肽可經(jīng)修飾以增加其免疫原性、于水溶液中的水溶性或增加其正確折疊傾向。 舉例來(lái)說(shuō)，可將肽糖基化、法呢基化(farnesylated)、羥基化、還原、氧化等。在一些實(shí)施例中，肽包含HCV E2蛋白的氨基酸657-698。在一些實(shí)施例中，肽包含HCV E2蛋白中氨基酸D658、F679、L692、1696或D698中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸。如所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員所理解的，可以使用任一 HCV基因型E2蛋白的類似氨基酸序列。類似序列可通過(guò)比對(duì)來(lái)自不同HCV病毒株或基因型的E2蛋白的多個(gè)序列確定。保留所需表位的同源序列也可用于調(diào)配疫苗。在一些實(shí)施例中，序列與來(lái)自HCV E2蛋白的天然序列至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少 98%或更高百分比同源。在一些實(shí)施例中，本文中所述的全長(zhǎng)HCV E2蛋白可具有來(lái)源于野生型HCV多聚蛋白的序列。在一些實(shí)施例中，本文中所述的全長(zhǎng)HCV E2蛋白可具有來(lái)源于非野生型HCV多聚蛋白的序列。此項(xiàng)技術(shù)中已知多種不同HCV多聚蛋白(例如來(lái)自不同基因型、亞型、分離株等)的氨基酸序列，并且這些序列都可從諸如基因庫(kù)等公用數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。下表1中提供了多種HCV基因型、亞型和/或分離株的例示性HCV多聚蛋白序列。表1 例示性HCV多聚蛋白序列
2權(quán)利要求
1.一種抗體，其針對(duì)在丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白2(E》的氨基酸523到MO內(nèi)的構(gòu)象表位。
2.一種抗體，其中所述抗體是單克隆抗體HC-I。
3.一種抗體，其中所述抗體是單克隆抗體HC-3。
4.一種抗體，其中所述抗體是單克隆抗體HC-11。
5.一種抗體，其中所述抗體是單克隆抗體CBH-23。
6.一種抗體，其針對(duì)HC-I所識(shí)別的表位。
7.一種抗體，其針對(duì)HC-3所識(shí)別的表位。
8.一種抗體，其針對(duì)HC-Il所識(shí)別的表位。
9.一種抗體，其針對(duì)CBH-23所識(shí)別的表位。
10.一種抗體，其中所述抗體與HC-I競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
11.一種抗體，其中所述抗體與HC-3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
12.—種抗體，其中所述抗體與HC-Il競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
13.一種抗體，其中所述抗體與CBH-23競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體是哺乳動(dòng)物抗體。
17.一種抗體片段，所述抗體選自由HC-I、HC-3、HC-Il和CBH-23組成的群組，其中所述片段保留所述完整抗體的抗原結(jié)合活性。
18.一種細(xì)胞系，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一權(quán)利要求所述的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系為B細(xì)胞系。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系為人細(xì)胞系。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系為真核細(xì)胞系。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系為雜交瘤。
24.一種醫(yī)藥組合物，其包含抗體，選自由HC-I、HC-3、HC-Il和CBH-23組成的群組；和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
25.—種醫(yī)藥組合物，其包含抗體，其識(shí)別選自由HC-1、HC-3、HC-11和CBH-23組成的群組的抗體所識(shí)別的表位；和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
26.—種醫(yī)藥組合物，其包含抗體片段，所述抗體選自由HC-l、HC-3、HC-Il和CBH-23組成的群組，其中所述片段保留所述完整抗體的抗原結(jié)合活性；和醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求對(duì)至沈中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其進(jìn)一步包含至少一種其它抗病毒劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的醫(yī)藥組合物，其中所述至少一種其它抗病毒劑選自由以下組成的群組干擾素、抗HCV單克隆抗體、抗HCV多克隆抗體、RNA聚合酶抑制劑、利巴韋林(ribavirin)、蛋白酶抑制劑、IRES抑制劑、解螺旋酶抑制劑、反義化合物、短干擾RNAjSS 夾RNA、微RNA、RNA適體和核糖酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的醫(yī)藥組合物，其中所述至少一種其它抗病毒劑是干擾素。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的醫(yī)藥組合物，其中所述至少一種其它抗病毒劑是利巴韋林。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的醫(yī)藥組合物，其中所述至少一種其它抗病毒劑是干擾素與利巴韋林的組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的醫(yī)藥組合物，其中所述至少一種其它抗病毒劑是抗HCV單克隆抗體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的醫(yī)藥組合物，其中所述抗HCV單克隆抗體識(shí)別包膜糖蛋白 2(E2)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的醫(yī)藥組合物，其中所述抗體是針對(duì)相同HCV基因型的蛋白質(zhì)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的醫(yī)藥組合物，其中所述抗體是針對(duì)兩種或兩種以上HCV基因型的蛋白質(zhì)。
36.一種治療感染HCV的患者的方法，其包含以下步驟 提供感染HCV或易感染HCV的患者；和投予所述患者根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一權(quán)利要求所述的抗體或醫(yī)藥組合物。
37.一種治療暴露于HCV的患者的方法，其包含以下步驟 提供感染HCV或易感染HCV的患者；和投予所述患者根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一權(quán)利要求所述的抗體或醫(yī)藥組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中治療有效量是足以治療所述個(gè)體的HCV感染的量。
39.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中治療有效量是足以減少所述個(gè)體的HCV感染復(fù)發(fā)的量。
40.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中治療有效量是足以預(yù)防所述個(gè)體感染HCV 或延緩其發(fā)作的量。
41.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述個(gè)體是感染HCV的母親生育的嬰兒。
42.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述個(gè)體是肝移植接受者。
43.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述個(gè)體是易感染HCV的個(gè)體。
44.根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述個(gè)體是罹患HCV感染的個(gè)體。
45.一種方法，其包含對(duì)有需要的患者投予有效量的醫(yī)藥組合物，其中所述醫(yī)藥組合物包含醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑，和選自由以下組成的群組的人單克隆抗體(a)單克隆抗體HC-1，其是由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9416保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；(b)單克隆抗體HC-3，其是由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9417保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；(c)單克隆抗體HC-11，其是由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9418保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；(d)單克隆抗體CBH-23，其是由ATCC以寄存編號(hào)PTA-9419保藏的雜交瘤細(xì)胞系分泌；和(e)所述(a)到(d)的抗體的片段，其保留所述完整抗體的抗原結(jié)合特征。
46.一種試劑盒，其包含至少一種HCV抗體，其選自由HC-1、HC-3、HC-Il和CBH-23組成的群組； 注射器、針或施藥器，用于對(duì)個(gè)體投予所述至少一種HCV抗體；和使用說(shuō)明。
47.一種試劑盒，其包含包含至少一種HCV抗體的凍干粉，所述HCV抗體選自由HC-1、HC-3、HC-11和CBH-幻組成的群組；稀釋劑，其中所述稀釋劑用于復(fù)原所述粉末。
48.一種小分子，其中所述小分子與HC-I結(jié)合于相同的表位。
49.一種小分子，其中所述小分子與HC-3結(jié)合于相同的表位。
50.一種小分子，其中所述小分子與HC-Il結(jié)合于相同的表位。
51.一種小分子，其中所述小分子與CBH-23結(jié)合于相同的表位。
52.一種小分子，其中所述小分子與HC-I競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
53.一種小分子，其中所述小分子與HC-3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
54.一種小分子，其中所述小分子與HC-Il競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
55.一種小分子，其中所述小分子與CBH-23競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于其表位。
全文摘要
本發(fā)明提供丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2構(gòu)象表位的鑒別和表征方法。本發(fā)明提供一組識(shí)別E2的構(gòu)象表位的人單克隆抗體。這些抗體來(lái)源于感染HCV的患者。本發(fā)明提供利用HCV抗體作為治療劑、診斷劑和/或預(yù)防劑的方法。本發(fā)明提供具有完整構(gòu)象表位的模擬表位和模擬表位的使用方法。本發(fā)明提供根據(jù)針對(duì)HCV的反應(yīng)來(lái)對(duì)患者分級(jí)的方法。本發(fā)明提供用于預(yù)防和治療HCV的醫(yī)藥組合物，其包含一種或一種以上HCV抗體。
文檔編號(hào)C07K16/10GK102197050SQ200880131397
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2008年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月5日
發(fā)明者凱克·振勇, 史蒂文·豐 申請(qǐng)人:小利蘭斯坦福大學(xué)理事會(huì)