專利名稱：肽的制造方法
肽的制造方法本發(fā)明涉及用于制造Omiganan肽及其中間產(chǎn)物的方法，并且此外涉及在用于制 造Omiganan的方法中的新穎的中間產(chǎn)物。Omiganan 是對于月太 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-N H2 (SEQ ID NO 1)的常見國際命名(CID)，它主要是以其五鹽酸化物(5HC1)鹽的形式被使 用。Omiganan是一種陽離子的抗微生物的肽。最近的研究還顯示了它可以在炎癥應(yīng)答中 起作用。Omiganan在體外分析中證明了對抗多種微生物的一種快速殺菌活性，這些微生物 移殖于皮膚中而且可以在炎癥病變的致病中起作用。此外，Omiganan五氯化物目前是在 II-III期用于治療嚴重的痤瘡，并且在III期臨床試驗中用于預防中心靜脈導管相關(guān)的血 流感染。Omiganan可以經(jīng)由一種線性肽合成而生產(chǎn)，其中對應(yīng)的氨基酸被順序地添加到一 個增長的肽鏈中。至于所希望的Omiganan肽的產(chǎn)率和純度，這些方法是不令人滿意的。本發(fā)明現(xiàn)在使之可得到一種用于該Omiganan肽的改進的合成。美國專利號5，262，567披露了使用一種化合物(包括一個胍基團以及一種未取代 的四苯基硼酸鹽離子)作為該肽合成中的中間產(chǎn)物。作為一個實例，描述了由精氨酸與四 苯基硼酸鹽(TPB)形成的化合物的合成以及它在合成該肽Boc-Leu-Arg-OH中的用途。WO 99/65506A披露了包含陽離子肽的藥用組合物，這些陽離子肽包括陽離子肽 MBI 11B20CN，它包含Omiganan的氨基酸序列。因此本發(fā)明的目標是提供用于生產(chǎn)該Omiganan肽的方法，該方法以高產(chǎn)率和高 純度給出Omiganan。根據(jù)本發(fā)明的方法出人意料地允許以有限的步驟(特別是純化步驟) 生產(chǎn)所述肽，因此大大減小了制造成本。因此本發(fā)明在第一方面涉及用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp -Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1) Omiganan肽或其一種衍生物的一種方法，該方法 包括在溶液中將一種第一肽與一種第二肽進行偶聯(lián)的至少一個步驟，該第一肽具有一個活 化的羧基以及至少兩個氨基酸單元、或一種選自下組的氨基酸，該組的組成為具有一個活 化羧基的Ile、LeU、Arg、以及Trp、Pr0 ；該第二肽具有一個游離的氨基以及至少兩個氨基酸 單元，其中該第一與第二肽是不同的并且包含選自下組的多個氨基酸，該組的組成為Ile、 Leu>Arg>Trp>Pro> ^(,,S. Lysj^T-Iil Omiganan 中白勺序歹[J 11 e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-P ro-Trp-Arg-Arg-Lys (SEQ ID NO 1)所說明的順序中。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“肽”是指一種聚合物，其中這些單體是通過酰胺鍵共價 地附接在一起的氨基酸。肽是兩個或經(jīng)常是更多個氨基酸單體長。另外，所有的肽序列由 左邊或右邊取向是處于氨基端到羧基端的常規(guī)方向的那些化學式代表。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“氨基酸”旨在表示任何包括至少一個NR1R2基團(優(yōu)選 NH2基團)、以及至少一個羧基的化合物。本發(fā)明的這些氨基酸可以是天然存在的或是合成 的。這些天然氨基酸除甘氨酸之外，包含一種手性碳原子。除非另外確切指明，優(yōu)選的是包 含具有L構(gòu)型的天然氨基酸的這些化合物。貫穿本申請將氨基酸殘基縮寫為如下異亮氨 酸是Ile ；亮氨酸是Leu ；精氨酸是Arg ；色氨酸是Trp ；脯氨酸是Pro并且賴氨酸是LyS。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語肽的“C-端”是由一個游離羧基(-C00H)封端的一種氨基 酸序列的末端。另一方面，術(shù)語肽的“N-端”是指由一種具有游離氨基(-NH2)的氨基酸封 端的一種氨基酸序列的末端。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“偶聯(lián)”是指在一種氨基酸的羧基或一種第一肽的C-端 與另一種氨基酸的氨基或一種第二肽的N-端之間的反應(yīng)。換言之，在偶聯(lián)的過程中，兩個 肽中間產(chǎn)物片段、或一個肽中間產(chǎn)物片段以及一種反應(yīng)性氨基酸被偶聯(lián)，一般是在一種適 當?shù)娜軇┲?、并且通常是在促進該偶聯(lián)反應(yīng)的效率以及質(zhì)量的另外試劑的存在下。這些肽 中間產(chǎn)物片段被反應(yīng)性地安排，因而一個片段的N-端變?yōu)榕悸?lián)至另一個片段的C-端，或反 之亦然。如在此使用的，術(shù)語“肽衍生物”包括一種類似物，其中一個或多個氨基酸殘基已 經(jīng)被對應(yīng)的D異構(gòu)體或被一個非天然的氨基酸殘基、或其一種化學衍生物所取代。一種肽 的化學衍生物包括但不限于含有多個另外的化學部分的一種衍生物，假如該衍生物保持 該肽的抑制活性，則這些另外的化學部分通常不是該肽的一部分。這類衍生物的實例是 (a)該氨基端的或另一個游離氨基的N-?；苌铮渲性擋；鶊F可以是一種烷酰基 基團比如乙?；⒓乎；?、辛?；?；一種芳?；?，如苯甲?；⒒蛏锼鼗?；(b)該羧基端的 或另一個游離羧基或多個羥基的酯類；以及(c)該羧基端的或另一個游離羧基的酰胺，通 過與氨或與一種適當?shù)陌贩磻?yīng)而產(chǎn)生。Omiganan的衍生物及其中間產(chǎn)物還是(例如)該 Omiganan序列的受保護的片段和肽、Omiganan與無機的或有機酸的鹽類(優(yōu)選無機酸、并 且最優(yōu)選鹽酸)的鹽及其中間產(chǎn)物?？赡苁褂玫呐c有機酸的鹽的實例是與乙酸、檸檬酸、草 酸、三氟乙酸、四苯基硼酸以及酒石酸的鹽類。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括將Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 2)或其一種衍生物與Ile-Leu進行偶聯(lián)的步驟，其中Ile的
氨基受一個氨基保護基團所保護。此外優(yōu)選的是本發(fā)明的方法包括將Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 3)或其一種衍生物與Arg-Trp-Pr0進行偶聯(lián)的步驟，其中Arg的氨基受到一個保護基團 保護。該方法優(yōu)選地包括將Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 4)或其一種衍生物與 Trp-Trp-Pro進行偶聯(lián)的步驟，其中Trp N端的氨基受到一個保護基團保護。此外，本發(fā)明根據(jù)一個第二方面是針對一種用于制造H-Arg-Lys (Boc)-NH2的方 法，該方法包括以下步驟(a)將 Z-Arg-OH. Cl 與 H-Lys (Boc) -NH2 進行偶聯(lián)；并且(b)將步驟(a)中所獲得的Z-Arg-Lys (Boc)-NH2氫解，優(yōu)選是在一種Pd催化劑的 存在下。術(shù)語"Lys(Boc) ”旨在表示氨基側(cè)鏈受到一個Boc基團保護的一種賴氨酸。 在第三方面，本發(fā)明是針對新穎的中間產(chǎn)物Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Ar g-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 2)。在第四個方面，本發(fā)明是針該新穎的中間產(chǎn)物Z-Arg-Trp-Pro-OH。在第五個方面，本發(fā)明是針對一種用于制造Z-Arg-Trp-Pro-OH的方法，該方法包 括使H-Trp-Pro-OH與Z-Arg-OH. HCl進行偶聯(lián)的步驟。
在第六個方面，本發(fā)明是針對新穎的中間產(chǎn)物Z-Trp-Trp-Pro-OH。在第七個方面，本發(fā)明是針對一種用于制造Z-Trp-Trp-Pro-OH的方法，該方法包 括使H-Trp-Pro-OH與Z-Trp-Osu進行偶聯(lián)的步驟。在第八個方面，本發(fā)明是針對一種用于制造中間產(chǎn)物Boc-IIe-Leu-OH的方法，該 方法包括使Boc-Ile-NCA與H-Leu-OH進行偶聯(lián)的步驟。在第九個方面，本發(fā)明是針對新穎的中間產(chǎn)物Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 4)。在第十個方面，本發(fā)明是針對新穎的中間產(chǎn)物Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys ( Boc) -NH2 (SEQ ID NO 3)。在本發(fā)明的方法中，保護基團一般用于在所涉及的氨基酸或肽中間產(chǎn)物中的一個 或多個氨基。保護基團的用途沒有具體進行限制。以說明的方式，在本發(fā)明的這些化合物中可以采用以下保護基團?；捅Ｗo基團，特別是甲?；?、三氟乙酰基、鄰苯二甲?；?、4_甲苯磺?；⒈交??；约?-硝基苯基次磺酸基；芳香族的尿烷型保護基團，例如尤其是取代的或未取代的芐氧基羰基、對_溴代 芐氧基羰基、對-甲氧基芐氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、2-(4_聯(lián)苯基)丙基(2)氧基羰 基、2-(3，5_ 二甲基氧苯基)、丙基(2)氧基羰基、以及三苯基膦?；一趸驶?；脂肪族的尿烷型保護基團，特別是叔丁氧羰基、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、 乙氧羰基、烯丙氧羰基、9-芴甲氧羰基、2-甲基磺?；已豸驶约?，2，3-三氯乙基氧基 羰基；環(huán)烷基尿烷型保護基團，例如尤其是環(huán)戊氧羰基、金剛烷氧基羰基、環(huán)己氧基羰 基、叔戊氧基羰基以及異冰片基氧基羰基；硫尿烷型保護基團，特別是苯基硫代羰基、烷基型保護基團，例如尤其是三苯基甲基(三苯甲基)以及芐基；三烷基硅烷基團，如三烷基硅烷。上述的保護基團特別適合作為氨基保護基團。在本發(fā)明的一種或多種方法中，優(yōu)選的是在與一個保護基團進行偶聯(lián)的步驟過程 中一種氨基酸基團中的至少一個氨基受到保護，該保護基團選自一種芳香族的尿烷型保護 基團以及脂肪族的尿烷型保護基團。更優(yōu)選地，所述保護基團是選自一種叔丁氧羰基(Boc) 基團與一種芐氧基羰基(Z)基團。在本發(fā)明的一種或多種方法的一個優(yōu)選實施方案中，該芐氧基羰基(Z)基團被用 作一個氨基酸單元中一個端氨基的保護基團，其中該氨基酸單元是Arg或Trp。在本發(fā)明的一種或多種方法的另一個優(yōu)選實施方案中，該叔丁氧羰基(Boc)基團 被用作Lys中的側(cè)鏈氨基的和/或Ile中的N-端氨基的保護基團。特別適合用于保護該羧基的其他保護基團包括烷氧基，特別是甲酯、乙酯、叔丁酯 以及芐基酯。在一個優(yōu)選實施方案中，Lys的羧基是作為酰胺、特別是作為CONH2基團被保 護的。在本發(fā)明的一種或多種方法中，該第一肽具有一個活化的羧基以及一般至少兩個 氨基酸單元。在本發(fā)明的方法中可以使用不同的活化基團，它們減少了副反應(yīng)和/或增大 了反應(yīng)效率，優(yōu)先選自碳二亞胺類、羰基二咪唑類、酰鹵類、磷鐺鹽類、以及脲鐺或胍鐺鹽類。例如，磷鐺和脲鐺鹽類在一種叔堿(例如二異丙基乙胺(DIPEA)以及三乙胺(TEA))的 存在下可以將被保護的氨基酸轉(zhuǎn)化成活化的種類(例如BOP、PyBOP, HBTU、以及TBTU全部 產(chǎn)生了 HOBt酯)。幫助防止外消旋作用的其他試劑包括碳二亞胺類(例如N，N-二環(huán)己 基碳二亞胺(DCC)、N-(3- 二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)或水溶性碳二亞 胺(WS⑶I))與一種添加的輔助親核體(例如1-羥基-苯并三唑(HOBt)、3，4 二氫-3-羥 基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBT)、1_羥基-氮雜苯并三唑(HOAt)、或HOSu)或其衍 生物?？梢允褂玫牧硪环N試劑是TBTU。例如用N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-(3- 二 甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(EDC)、新戊酰氯(PivCl)、異丁基氯甲酸酯(IBCF)、 HBTU (0-(苯并三唑-1-基)-N, N，N，，N，-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽)、HATU (0- (7-氮雜苯并 三唑-1-基)-N，N, N，，N，-四甲基銨脲鐺六氟磷酸鹽)、以及EEDQ (2-乙氧基-1-乙氧碳 酰基-1，2-二氫喹啉)獲得了好的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的活化基團是DCC、EDC以及HBTU。當使用這類羧酸活化劑時，該偶聯(lián)反應(yīng)經(jīng)常是在一種堿作為額外試劑的存在下進 行的。在本發(fā)明的另一個具體的方面，該偶聯(lián)反應(yīng)因此是在一種堿的存在下進行的。該堿 是優(yōu)先選自叔胺類以及雜芳香族胺類，如N-甲基嗎啉(NMM)、吡啶、三乙胺(TEA)、二異丙基 乙胺(DIPEA)或它們的混合物。更優(yōu)選地，它是選自N-甲基嗎啉以及二異丙基乙胺。除這些活化基團之外，有時候有利地使用添加劑。優(yōu)選的添加劑是N-羥基丁二酰 亞胺(Suc-OH)、N-羥基苯并三唑(HOBt)、或3，4-二氫_3_羥基-4-氧代-1，2，3苯并三嗪 (HOOBt)以及它們的衍生物。通常這些添加劑是基于待活化的羧基的量值按1到2當量的 量值使用。在本發(fā)明的另一個具體的方面，如以上說明的肽的偶聯(lián)是在至少一種極性有機溶 劑的存在下進行的。在一個具體的優(yōu)選實施方案中，該極性有機溶劑允許對所形成的肽鍵 的外消旋作用、該肽和/或肽片段的溶解度、以及偶聯(lián)反應(yīng)速率進行特別有效的控制。該 極性有機溶劑優(yōu)先選自N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡 咯烷酮(NMP)、二甲亞砜(DMSO)、乙酸乙酯(AcOEt)、異丙基乙酸酯、二氯甲烷(DCM)、亞甲 基氯、吡啶、氯仿、乙腈、二甲氧基乙烷、二噁烷、四氫呋喃(THF)或它們的混合物。更優(yōu)選 地，它是選自N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)、以及N， N 二甲基甲酰胺(DMF)或它們的混合物。最優(yōu)選地，該極性有機溶劑是N，N-二甲基乙酰胺 (DMA)。一種優(yōu)選的混合物包含20%到80% (體積)的DMA以及80%到20% (體積)的 二氯甲烷(CH2Cl2)、更優(yōu)選50%到70% (體積)的DMA以及50%到30% (體積)的二氯 甲烷(CH2Cl2)。如在此使用的術(shù)語“偶聯(lián)”或“偶聯(lián)步驟”具體是指將不同的肽或氨基酸進行偶聯(lián) 的步驟。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括使Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其一種衍生物與受保護的Ile-Leu或其一種衍生物進行 偶聯(lián)的步驟。在這個步驟中，優(yōu)選將HOOBt用作一種添加劑。此外，這個偶聯(lián)步驟優(yōu)選是在 DMA/二氯甲烷(CH2Cl2)的一種混合物中進行，該混合物優(yōu)選包含50%到75% (體積)的 DMA以及25%到50% (體積)的二氯甲烷(CH2Cl2)。此外該偶聯(lián)步驟優(yōu)選在EDC的存在下 進行。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個特別優(yōu)選的實施方案中，該第二肽具有選自以下的化 學式NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4) ,NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (X) -R (SEQ ID NO 5), NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 6), NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Ar g-Lys (X)_R(SEQ ID N07), NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8), N H2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9), NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-T rp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10), NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (X)-R(SEQ ID NO 11)，其中X是用于該Lys-側(cè)鏈氨基的一個保護基團、優(yōu)選 是一種Boc基團，并且R是用于Lys的羧基的一個羧基保護基團、優(yōu)選是一種酰胺基團。事實上本發(fā)明允許貫穿該合成對于在該Ominagan肽的10位置包含Arg的D-對 映異構(gòu)體的多種產(chǎn)物的存進行控制并且將其最小化。在這個實施方案中，該第二肽總體上包括從0. 1襯％到、有利地從 0. 2wt % -0. 9wt %、并且經(jīng)常從 0. 2wt % 到 0. 7wt % 的一種肽，該肽選自=NH2-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4), NH2-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 5)、 NH2-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys (X)-R (SEQ ID NO 6)、NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 7)、 NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、NH2-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D)Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10)、NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp- (D) Arg-Arg-Lys (X) -R (SEQ ID NO 11) > NH2- (D) Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (X) -R(SEQ ID NO 11)，其中 X 和 R 是如上所說明的。本發(fā) 明還涉及所述第二肽。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，該第二肽是NH2-Arg-Lys(X)-R,其中X是用 于該Lys-側(cè)鏈氨基的一個任選的保護基團、優(yōu)選是一種Boc基團，并且R是用于Lys的 羧基的一個羧基保護基團，優(yōu)選是一個酰胺基團，并且該第一肽是選自下組Y-Trp-Arg、 Y-Pro-Trp-Arg> Y-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 12)> Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13) > Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 14) > Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15) > Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 16) > Y-Leu-Arg-Trp-Pro-T rp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、Y-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SE Q ID NO 18)，并且Y是用于該N-端氨基的一個氨基保護基團、特別是如上所說明的、優(yōu)選 是一個Z基團。在這個具體的實施方案中，該偶聯(lián)有利地在一種芳基環(huán)化的氧代-三嗪活化劑、 優(yōu)選HOOBt的存在下進行。在這個實施方案中，該偶聯(lián)總體上是在從-10°C到+10°C的溫度下進行的。在這個實施方案中，該偶聯(lián)經(jīng)常是在一種鹵化的與非鹵化的溶劑的一個混合物 中、優(yōu)選一種氯化的溶劑與一種酰胺型溶劑的一個混合物進行的。適當?shù)穆然娜軇┌?例如氯仿、1，2_ 二氯乙烷以及優(yōu)選地二氯甲烷。適當?shù)孽０沸腿軇┌ɡ鏝-甲基吡咯 烷酮、N，N-二甲基甲酰胺以及優(yōu)選地N，N-二甲基乙酰胺。亞甲基氯與N，N-二甲基乙酰胺 的一種混合物已經(jīng)給出了良好的結(jié)果。特別有利的是使Z-Trp-Arg-OH 與 HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 偶聯(lián)。在本實施方案的最優(yōu)選的方面，使Z-Trp-Arg-OH與HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2偶聯(lián)，該活化劑是HOOBt，該溶劑是DMA與亞甲基氯的一種混合物，并且該偶聯(lián)在第一時間段 中在-5°C 士5°C的溫度下進行了 3到5小時、并且在第二時間段中在+5°C 士5°C的溫度下 進行了 6到10小時。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的方法是依照

圖1的方案。在該方案中X與Y可以是相同的 或不同的。它們優(yōu)選地是不同的。當X是一種叔丁氧羰基(Boc)基團并且Y是一種芐氧基 羰基(Z)基團時，獲得了良好的結(jié)果。本發(fā)明還涉及用于制造具有序列H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg -Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)的Omiganan肽的一種脫保護方法，該方法包括在基本上無水 的條件下使具有化學式 Yl-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Y2) -NH 2(SEQ ID NO 1)的一種前體肽與一種酸進行反應(yīng)，其中Yl與Y2指代相同或不同的氨基保 護基團或H，并且Yl或Y2的至少一個是一種對酸敏感的氨基保護基團。保護基團Yl和Y2可以是例如包括在以上概括說明中的氨基保護基團。優(yōu)選的是 Yl與Y2 二者都是氨基保護基團。更優(yōu)選地，Yl與Y2 二者都是Boc。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護方法中，該酸經(jīng)常是選自HCl、HF、HBr、HI、三氟乙酸、以及 三氟甲磺酸。更優(yōu)選地，該酸是HC1。特別是在此情況下，對每摩爾肽使優(yōu)選用6到32摩 爾、更優(yōu)選12到24摩爾的酸。根據(jù)本發(fā)明的脫保護方法的反應(yīng)總體上是在一種有機溶劑中進行，優(yōu)選是在一種 脂肪族的醇、特別是一種仲醇中，更優(yōu)選是在異丙醇中。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護方法中，基本上無水的條件是例如通過在包含從10mg/kg 到1. 5wt%、優(yōu)選從50mg/kg到1襯％的水的一種液體反應(yīng)介質(zhì)中進行該反應(yīng)而實現(xiàn)的。更 優(yōu)選地，該反應(yīng)介質(zhì)的含水量是從100mg/kg到0. 5wt%。尤其在Yl與Y2中的至少一個是Boc時，該反應(yīng)有利地在對于碳陽離子、特別是該 叔丁基陽離子的一種清除劑(例如苯甲硫醚、以及優(yōu)選地4-(甲硫基)苯酚)的存在下進 行。根據(jù)本發(fā)明的脫保護方法的反應(yīng)總體上是在從0°C到80°C、優(yōu)選從25°C到45°C的 溫度下進行的。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護方法中，該Omiganan肽有利地是以其五鹽酸化物鹽的形 式被回收。在根據(jù)本發(fā)明的脫保護方法中，該前體肽優(yōu)選地是通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得 的。在該脫保護方法的一個特別優(yōu)選的實施方案中，使Boc-IIe-Leu-Arg-Trp-Pr0-Tr p-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 1)脫保護從而產(chǎn)生 5HC1. H-Ile-Leu-A rg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)是在 HCl 與一種仲醇的一 個混合物中、優(yōu)選在用于叔丁基碳陽離子的一種清除劑(例如4-(甲硫基)苯酚)的存在 下進行的。最優(yōu)選地是使用HCl與異丙醇的一種混合物。以這種方式所獲得的脫保護的產(chǎn)物 可以按一種特別經(jīng)濟有效的方式進行純化，并且比其他可能的脫保護方法(除其他之外包 括用乙酸、三氟乙酸、甲烷磺酸、HF、以及HBr進行分裂)更有效。本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如與 用三氟乙酸(TFA)(對于富含色氨酸的肽像Omiganan而言是更多副產(chǎn)物的來源)進行的一個程序相比，一種HCl/異丙醇混合物優(yōu)選在一種用于叔丁基碳陽離子的清除劑的存在下 給出了更好的結(jié)果。而且，在此具體情況下，脫保護優(yōu)選是在一種如上所說明的基本上不含 水的反應(yīng)介質(zhì)中進行。而且，在此具體情況下，所述脫保護反應(yīng)有利地是在從20°C到80°C、 優(yōu)選從25°C到45°C、并且更優(yōu)選從30°C到40°C的溫度下進行。在本發(fā)明的多個實施方案中，在一種催化劑的存在下進行一種氫解作用。優(yōu)選地， 使用一種可以結(jié)合不同載體(例如碳、SiO2, Si-Al化合物等等)采用的Pd催化劑。在一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括形成一種含Arg的肽的四苯基硼 酸鹽。典型地，所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽是通過使一種偶聯(lián)步驟反應(yīng)介質(zhì)與四苯基 硼酸鹽陰離子的一種來源相接觸而形成的，該介質(zhì)包含經(jīng)常通過根據(jù)本發(fā)明的方法的一個 偶聯(lián)步驟所獲得的一種含Arg的肽。四苯基硼酸鹽類適合作為四苯基硼酸鹽陰離子的來 源。因此，優(yōu)選的是在一種四苯基硼酸鹽(TPB)的存在下進行至少一個步驟，該鹽優(yōu) 選地是在至少一個偶聯(lián)步驟完成以后加入。在該四苯基硼酸鹽(TPB)的鹽中的陽離子可以是有機的或無機的。有機離子的實 例是四乙基銨、二異丙基乙基銨、N-乙基哌啶鐺、N-甲基嗎啉鐺、N-乙基嗎啉鐺。適當?shù)臒o 機離子是例如鈉(Na+)或鋰(Li+)。最優(yōu)選地，使用一種能夠形成水溶液的四苯基硼酸鹽。 優(yōu)選的是LiTPB與NaTPB。最優(yōu)選使用的四苯基硼酸鹽是NaTPB。該TPB陰離子可以在其苯環(huán)上被取代或者它可以無任何取代而被使用。優(yōu)選地， 該TPB陰離子沒有被取代。適當?shù)娜〈腡PB陰離子的實例包括例如四(3，5_雙三氟甲
苯基)硼酸鹽。所采用的四苯基硼酸鹽的量值可以在寬的界限中變化。優(yōu)選地，在該含Arg的肽 中對每個Arg單元采用從1到10當量、優(yōu)選1到1. 5當量的四苯基硼酸鹽。該四苯基硼酸鹽在本發(fā)明的方法中優(yōu)選是在完成至少一個偶聯(lián)步驟之后的處理 (work-up)過程中、在一種溶劑或多種溶劑的混合物的存在下采用。適當?shù)娜軇┯绕涫羌?醇、甲氧乙醇、二氯甲烷、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、以及叔丁醇。使用甲氧乙醇獲得了良好的 結(jié)果。在這個實施方案中，可以有利地使所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽不經(jīng)分離而經(jīng) 受至少一個另外的合成步驟。經(jīng)常地，使所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽經(jīng)受至少一個脫 保護步驟接著經(jīng)受一個偶聯(lián)步驟。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明是針對一種用于制造Omiganan肽的方法，該 方法包括以下步驟(a)至(d)(a)使Arg-Lys-NH2或其一種衍生物、特別是使Arg-Lys (Boc) -NH2與N-保護的 Trp-Arg-OH或其一種衍生物、特別是與Z-Trp-Arg-OH進行偶聯(lián)。(b)使 Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 4)或其一種衍生物、特別是使 Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 4)與 N-保護的 Trp-Trp-Pro 或其一種衍生物、特 別是與Z-Trp-Trp-Pro-OH進行偶聯(lián)。(c) Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 3)或其一種衍生物、特別 是使 Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2 (SEQ ID NO 3)與 N-保護的 Arg-Trp-Pro 或 其一種衍生物、特別是與Z-Arg-Trp-Pro-ΟΗ進行偶聯(lián)。
(d)使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 2)或其一種 衍生物、特別是使 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2 (SEQ ID NO 2) 與N-保護的Ile-Leu或其一種衍生物、特別是與Boc-Ile-Leu-OH進行偶聯(lián)。圖1的方案展示了該包括步驟(a)、(b)、(c)、以及(d)的方法的最優(yōu)選的實施方案。在根據(jù)本發(fā)明的這些方法中所采用的這些操作條件總體上對于本發(fā)明不是關(guān)鍵 的。因此，進行該方法的壓力總體上是為了將該反應(yīng)介質(zhì)維持在一種液態(tài)，有利的是在0. 1 與10巴之間。在大氣壓下已經(jīng)獲得了良好的結(jié)果。進行該方法的該溫度通常是在-50°C 與100°C之間、并且可以依賴于一個具體步驟中的這些反應(yīng)物以及旨在最終制備的化合物 的性質(zhì)而改變。優(yōu)選地，該溫度是大于或等于_45°C，更優(yōu)選地它是大于或等于_25°C。另 一方面，該溫度優(yōu)選是低于或等于60°C，更優(yōu)選地它是大于或等于50°C。在特殊的偶聯(lián)步驟中，可以應(yīng)用優(yōu)選的更受限制的溫度范圍。例如在將Arg-T rp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其一種衍生物與受保護的 Ile-Leu或其一種衍生物進行偶聯(lián)的步驟中，優(yōu)選的將該偶聯(lián)反應(yīng)在一個第一時間段中在 O0C 士5°C的溫度范圍內(nèi)進行優(yōu)選大約3到5小時、并且在一個第二時間段中在20°C 士5°C 的溫度范圍內(nèi)優(yōu)選進行大約6到10小時。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方案中，使用了中間產(chǎn)物Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Bo c) -NH2. 2TPB (SEQ ID NO 4)。優(yōu)選地，通過將 Z-Trp-Arg-OH 與 HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 進 行偶聯(lián)而獲得Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2. 2TPB (SEQ ID NO 4)。優(yōu)選地，該偶聯(lián)步驟是 在HOOBt的存在下進行的。在這個偶聯(lián)步驟中，優(yōu)選將溫度在一個第一時間段中在_5°C 士5°C的范圍內(nèi)維持 大約2到5小時、并且在一個第二時間段中在5°C 士 5°C的溫度范圍內(nèi)維持大約6到10小 時。將Z-Trp-Arg-OH與HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2進行偶聯(lián)之后優(yōu)選跟隨一個步驟 (還將被稱作處理步驟)，該步驟包括向該偶聯(lián)步驟的反應(yīng)介質(zhì)中加入一種NaTPB鹽，優(yōu)選 是在水溶液中，更優(yōu)選是在Na2CO3的存在下。在本發(fā)明的一個或多個偶聯(lián)步驟中，一種肽優(yōu)選地是按0. 8到1. 2摩爾的肽/每 摩爾其他肽、更優(yōu)選0. 9到1. 1、并且最優(yōu)選0. 95到1. 05摩爾的肽/每摩爾其他肽的量值使用。例如，具有一個活化的羧基以及一般至少兩個氨基酸單元的第一肽優(yōu)選地是與具 有一個游離氨基以及至少兩個氨基酸單元的第二肽進行偶聯(lián)，使用0. 8到1. 2、更優(yōu)選0. 9 到1. 1摩爾第一肽/每摩爾第二肽的一個量值。本發(fā)明的該第一方面的方法具有眾多的優(yōu)點_它是一種具有較少反應(yīng)步驟的非常收斂的路徑。在使用四苯基硼酸鹽(TPB)鹽 類的多個實施方案中，在用TPB鹽類進行選擇性提取之后有可能使那些鹽沉淀或者不經(jīng)分 離而繼續(xù)進行合成。這提供了合成過程中的增大的靈活性。沒有必要用在側(cè)鏈上受保護的 Arg進行操作。-在色氨酸單元的吲哚環(huán)上進行合成的過程中不需要保護。已知色氨酸對強酸性 介質(zhì)是非常敏感的(這些吲哚核的烷化、有色副產(chǎn)物的形成)?？紤]到事實上這種保護是昂貴的并且之后是難以消除的，這是一個重要的優(yōu)點。因此，在一種具體的優(yōu)選實施方案中， 在此前所披露的這些方法以及片段中，至少一個色氨基酸單元并且優(yōu)選全部色氨基酸單元 是未被保護的。-本發(fā)明的方法還允許減少Arg10以及Leu 2上的外消旋作用的量，這允許了更 容易的最終純化。_最后，本發(fā)明的方法允許相當平穩(wěn)的條件用于最終的脫保護，特別是(若適當 時)Boc基團的消除。-本發(fā)明的方法此外還允許(特別是在使用具有一種C-端Pro的第一肽的某些優(yōu) 選實施方案中)進一步減小外消旋作用的風險，從而允許了一種更加容易的最終純化。具體地說，本發(fā)明的該第一方面的方法允許獲得Omiganan而伴隨有顯著 減小的量的這三種主要副產(chǎn)物，即H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-(D) Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1) > H-Ile-(D)Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg -Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)(是通過在偶聯(lián)步驟過程中對該外消旋作用的更好控制)以及H-I Ie-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-OH (SEQ ID NO 1)(是通過避免在一 種強酸性水介質(zhì)中工作)。一個將根據(jù)本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的Omiganan在一個另外的純化步驟、特別是一 個單一純化步驟中進行純化。本發(fā)明還涉及用于純化該Omiganan肽的一種方法，該方法包括使一種不純的 Omiganan肽經(jīng)受一種液相色譜法、特別是HPLC色譜法，其中流動性包括水以及一種有機溶 劑。在HPLC色譜法技術(shù)之中，反相以及離子交換相色譜法是優(yōu)選的。使用反相獲得了優(yōu)異 的結(jié)果?？梢允褂貌煌姆聪嘀?，特別是基于C4、C8、C18硅石的反相柱。在這個方法中，該流動相優(yōu)選地包括乙腈。在這個方法中，該流動相有利地包括一 種緩沖劑。使用一種乙酸鹽緩沖劑獲得了良好的結(jié)果。包括乙腈與一種乙酸鹽緩沖劑、PH 5的一種體系作為流動相是特別優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的純化方法經(jīng)常進一步包括一個反離子交換步驟。例如，可以將純化 過的肽進行洗滌，優(yōu)選是在一種色譜柱上用一種氯化物鹽水溶液(特別是NaCl水溶液)與 一種有機溶劑(特別是乙腈)的一個混合物。若適當時，在離子交換之后可以用乙腈與水 的一種混合物將該純化過的肽從該柱中洗脫，由此可以獲得純化的omiganan的一種濃縮 溶液。根據(jù)本發(fā)明的純化方法還可以包括一個結(jié)晶步驟。根據(jù)本發(fā)明的純化方法因此可以進一步包括一個濃縮步驟以及任選地一個冷凍 干燥步驟。實例以下實例說明了本發(fā)明的方法，但不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明進行限制。若沒有另外 指明，則該化合物的純度是大于按重量計98 %并且指出的比率是指體積比。1. Z-Arg-Lys (Boc) NH2. TPB 的合成將1. 02 當量的 Z-Arg-OH. HCl (Mw = 344. 8)在室溫下加入 DMA 與 CH2Cl2 (6/4)的 一種混合物中。此后，加入1. 03當量的HOBt (N-羥基苯并三唑，Mw = 135. 12)以及1. 00 當量的H-Lys (Boc)-NH2 (Mw = 245. 3 ；純度99% )。在將該溶液冷卻到O士5°C之后，加入1. 03 當量的 EDC. HCl (Mwl91. 7)。在0士5°C下繼續(xù)攪拌另外30分鐘，然后在室溫下攪拌至少2小時。在通過HPLC 檢驗該反應(yīng)的完成以后，將用一種CH2Cl2/異-BuOH(6/4)混合物稀釋該反應(yīng)混合物并且用 0.5當量的HCl溶液進行萃取。用CH2Cl2/異-BuOH(6/4)的一種混合物第二次萃取該酸 性水相。首先用含有1. 05當量的四苯基硼酸鈉(TPBNa) (Mw = 342g)的一種Na2CO3的5% (重量)水溶液洗滌組合的有機相，然后用一種5% (重量)NaCl水溶液洗滌4次。在已經(jīng)將該有機相在真空中濃縮以后，將甲氧乙醇以若干個部分加入該濃縮物中 以除去痕量的異丁醇接著將它進一步蒸發(fā)。然后將該濃縮物最后用甲氧乙醇稀釋并且將其 緩慢地加入一種冷的(0到5°C)5% (重量)NaCl水溶液之中。該肽沉淀出并且將其在低 溫下保持至少30分鐘然后過濾。用冷(0士5°C )脫礦質(zhì)水將該固體洗滌3次。其后，使該固體再溶解于MeOH中并 且進行攪拌直到獲得一種輕微混濁的溶液為止。將該溶液部分地濃縮并然后將該甲醇溶液 緩慢地加入到一種冷卻的水性NaCl 5% (重量)溶液中。在將該沉淀物在被過濾掉之前 在低溫下保存至少30分鐘。最后用冷的脫礦質(zhì)水(0士5°C )將該固體洗滌3次并且在真 空(45°C)下進行干燥。最終獲得一種灰白色的固體?；趯窟M行的NMR測量，產(chǎn)率是 89%。2. HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 的合成使1. 00 當量的 TPB. Z-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 535. 6 ；純度=62. 0% )的一種甲 醇溶液若干次穿過一個柱，該柱含有一種甲醇洗滌過的樹脂IRA 958 (Mw = 1000 ；3. 00當 量)。在通過HPLC檢驗這種交換以后，將該樹脂過濾并且用甲醇洗滌三次。使這些組合的 有機相在真空中部分濃縮。將濃縮的溶液用水稀釋。加入Pd催化劑(Mw= 106.4;2%重量)并且然后將該懸浮液在35°C 士5°C下氫 化至少5小時。將該催化劑過濾掉、用一種甲醇/水混合物洗滌兩次。將該濾液在真空中 蒸發(fā)，該殘余物懸浮在DMA中并且使之在真空中部分蒸發(fā)以清除痕量的水。在檢驗水的含 量以后，用HCl (0. 1N)滴定最終溶液并且不經(jīng)任何純化而進一步使用。產(chǎn)率(基于滴定)90%。3. Z-Trp-Arg-OH 的合成將2. 00當量的水和1當量的Arg(Mw = 174. 2)與DMF混合并且在室溫下進行攪 拌直到獲得一種溶液為止。將1. 03當量的Z-Trp-OSu (Mw = 435. 45 ；純度=98% )溶解在 DMF中并且傾倒在該精氨酸溶液中。然后在室溫下繼續(xù)攪拌至少5小時。在通過HPLC檢驗 該反應(yīng)的終止以后，通過緩慢地加入冷的乙腈(0士5°C )而使該反應(yīng)混合物沉淀并且在過 濾之前在此溫度下保持至少30分鐘。用CH3CN/IPE(異丙醚)(1/1)的一種混合物將該沉 淀物洗滌3次然后用IPE洗滌2次。然后在真空中在45°C下將該固體干燥。最終獲得一種 白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)86%。4. Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2. 2TPB (SEQ ID NO 4)的合成將1.00 當量Z-Trp-Arg-OH(Mw = 494. 5 ；純度=85. 0%)以及 1. 10 當量HOOBt (Mw =163. 13)加入 1. 15 當量 HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 437. 5 ；純度=20. 0% )的 DMA 溶液中，該溶液之前已經(jīng)用012(12稀釋了。將該溶液冷卻到_5°C 士5°C后，緩慢倒入1.00當量HCl/二噁烷4N并然后加入1.10當量EDC (Mw= 191.7)。將該反應(yīng)混合物在_5 士 5°C 下攪拌至少3小時并然后在5°C 士5°C下攪拌至少8小時。在通過HPLC檢驗該反應(yīng)的完成 以后，用一種CH2Cl2/仲丁醇混合物(6/4)將該反應(yīng)混合物稀釋，首先用含有HCl (0. 5當量) 的NaCl的5% (重量)水溶液洗滌該反應(yīng)混合物、然后用1900ml的含有2. 2當量NaTPB (Mw =342)的一種5% (重量)Na2CO3水溶液洗滌，并且最終用5% (重量)的NaCl水溶液洗 滌5次。在該有機層濃縮以后，將殘余物溶解在甲醇中然后在真空中濃縮以便清除大部分 的剩余CH2Cl2。通過NMR滴定最終溶液并且不經(jīng)任何純化而進一步使用。產(chǎn)率(基于滴定含量)83 %。5. 2HC1. H-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 4)的合成使1. 00 當量 2TPB. Z-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 878. 11)的甲醇溶液若干 次穿過一個柱，該柱含有6. 00當量的一種甲醇洗滌過的樹脂IRA 958 (Mw = 1000)。在通過 HPLC檢驗這種交換以后，將該樹脂過濾并且用甲醇洗滌三次。使這些組合的有機相在真空 中部分地濃縮。用水將該濃縮溶液稀釋并且加入Pd催化劑。然后在35°C 士5°C下將該懸 浮液氫化至少3小時。將該催化劑過濾掉并且用甲醇洗滌兩次。將該濾液在真空中蒸發(fā)， 該殘余物溶解在DMA中并且將其進一步濃縮以消除剩余的水。在檢驗水的含量以后，將沉 淀物溶解在DMA中并且在真空中部分地蒸發(fā)以便適配該溶液的重量。用0. INHCl滴定最終 溶液并且不經(jīng)任何純化而進一步使用。產(chǎn)率(基于該滴定)95%。6. Z-Trp-Trp-Pro-OH 的合成將DMA、1. 05 當量的 DIPEA(Mw = 129. 2)以及 1. 05 當量的 H-Trp-Pro-OH(Mw = 301. 3;純度=91.0%)在室溫下混合至少30分鐘直到形成一種溶液為止。然后用乙酸 乙酯稀釋該反應(yīng)混合物并且將其冷卻到5°C 士5°C。一旦達到這個溫度，就加入1.00當量 的Z-Trp-Osu(Mw = 435. 45 ；純度=98.0% ),并且在將該溶液留置來再次升溫到室溫之 前繼續(xù)攪拌至少30分鐘。在通過HPLC證實該反應(yīng)的完成以后，加入0.2當量的DMAPA(N， N’ -二甲基氨基丙胺，Mw = 102. 2g/mol)。將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋并且用含有2 當量KHSO4的5% (重量)的NaCl水溶液進行洗滌。進一步地首先用一種5% (重量)的 NaCl水溶液洗滌該有機相并且最后用水。將該有機相在真空中部分地濃縮，該殘余物被懸 浮在乙酸乙酯中并將其進一步濃縮以便消除剩余的水。將濃縮的肽溶液以多個小部分加入 MTBE/石油醚(45-55) (1/1)的一種冷的(0士5°C )混合物中，并且將沉淀物在過濾之前在 0士5°C保持至少30分鐘。過濾后，然后將其用石油醚(45-55)洗滌并且在真空中在45°C下 進行干燥。最終獲得一種白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=82%。7. Z-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2. 2TPB (SEQ ID NO 3)的合成將1. 00 當量的 Z-Trp-Trp-Pro-OH(Mw = 621. 7 ；純度=94. 0 % )加入之前用 CH2Cl2 稀釋過的 1. 05 當量 2HC1. HTrp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 816. 9 ；純度=15. 0% ) 的DMA溶液之中。然后，加入1.20當量N，N’ - 二異丙基乙胺(DIPEA) (Mw = 129.2)以 及1.05當量的2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟磷酸酯)(HBTU) (Mw = 379. 24)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌至少1小時。在通過HPLC檢驗該反應(yīng)的完成以后， 用一種CH2Cl2/異丁醇混合物(8/2)將該反應(yīng)混合物稀釋、首先用NaCl與HCl (1. 5當量)的一種5% (重量)水溶液進行洗滌、然后用Na2CO3與2. 2當量NaTPB (Mw = 342g/摩爾)的 一種5% (重量)水溶液洗滌、并且最終用5% (重量)的NaCl水溶液洗滌三次。在該有 機層濃縮以后，將殘留的油在甲氧乙醇中溶解若干次、然后在真空中濃縮以便消除大部分 的剩余異丁醇。在GC控制之后，將該濃縮物通過緩慢倒入冷的(0士5°C)5% (重量)NaCl 水溶液而使它沉淀。在攪拌至少1小時以后，將該懸浮液過濾并且用冷水洗滌兩次。將該 沉淀物在真空中在45°C下進行干燥。最終獲得一種白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=98%。8. 2HC1. H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 3)的合成使 1. 00 當量 2TPB. Z-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 1347. 5 ；純 度=64.0% )的一種甲醇溶液若干次穿過一個柱，該柱含有一種甲醇洗滌過的樹脂IRA 958(或Amberjet Cl 1000 ;6. 00當量)。在通過HPLC檢驗這種交換以后，將該樹脂過濾、洗 滌三次。使這些組合的有機相在真空中部分地濃縮、并然后用水稀釋。最后，加入2% (重 量)的Pd催化劑，并且將該懸浮液在40°C下氫化至少3小時。將該催化劑過濾掉、用甲醇 /水的一種混合物洗滌三次。將組合的濾液在真空中蒸發(fā)、殘余物懸浮在DMA中并且將其進 一步濃縮以消除剩余的水。在檢驗水的含量以后，用HCl (0. IN)、AgNO3 (0. 1N)、或NMR滴定 該溶液并且不經(jīng)任何純化而進一步使用。產(chǎn)率(基于滴定)=82 %。9. Z-Arg-Trp-Pro-OH 的合成將DMA、1. 00 當量的 DIPEA 以及 1. 00 當量的 H-Trp-Pro-OH (Mw = 301. 3 ；純 度=94. 0% )在室溫下混合至少30分鐘直到獲得一種溶液為止，然后將該溶液冷卻到 10士5° (1號溶液)。將1. 00當量的Z-Arg-OH. HCl (Mw = 344. 8)在室溫下加入DMA中直 到獲得一種澄清溶液為止(2號溶液)。在將2號溶液冷卻到_15°C 士5°C期間，加入1. 05 當量吡啶(Mw = 79. 1 ；純度=99. 0% )以及1. 00當量的DIPEA。一旦達到這個溫度，就將 1. 00當量的新戊酰氯(PivCl) (Mw = 120. 58)倒入該反應(yīng)混合物(2號溶液)中，將其進一 步活化大約5分鐘。最后，將1號溶液加入活化的2號溶液中，并且將該反應(yīng)混合物進一步 攪拌至少1小時同時停止冷卻，并且允許該反應(yīng)混合物升溫至室溫。在已經(jīng)通過HPLC證實該反應(yīng)的完成以后，將該肽溶液在真空中進行濃縮。用乙腈 和水稀釋殘余物并且用2N K2COJfpH調(diào)節(jié)到8.0士0.2。然后將該溶液在真空中部分地濃 縮并且將殘余物冷卻到5°C 士5°C以進行沉淀。在過濾之前維持攪拌至少30分鐘、并且然 后用水洗滌沉淀物。最終獲得一種白色固體。產(chǎn)率(基于NMR含量):90 %。10. Z-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc)-NH2. 3TPB (SEQ ID NO 2)的合成將1. 00 當量的 Z-Arg-Trp-Pro-OH(Mw = 591. 65 ；純度=96. 0 % )、1. 00 當量的 HCl/二噁燒(4N)以及 1. 05 當量HOBt (Mw = 135. 12 ；純度=98. 0% )加入 1. 00 當量 2HC1. H-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (Mw = 1213. 4 ；純度=85. 0% )在用 CH2Cl2 稀 釋過的DMA中的溶液中。在已經(jīng)將該溶液冷卻到10°C 士5°C以后，加入1. 02當量EDC(Mw = 191. 7)。將該反應(yīng)混合物在10°C 士5°C攪拌30分鐘、并且然后在室溫下攪拌至少4小時。 在通過HPLC證實該反應(yīng)的完成以后，用一種CH2Cl2/異丁醇混合物(8/3)將該反應(yīng)混合物稀釋、首先用具有HCl (0.5當量)的一種5% (重量)NaCl水溶液進行洗滌、然后用含有3 當量NaTPB(Mw = 342)的一種5% (重量)Na2CO3水溶液洗滌、并且最終用5% (重量)的 NaCl水溶液洗滌兩次。在該有機層濃縮以后，將殘余的油在甲氧乙醇中溶解若干次、然后在 真空中進行濃縮以便消除大部分的異丁醇。在GC控制之后，將該濃縮物通過緩慢地倒入冷 的5% (重量)NaCl水溶液中而使它沉淀。在攪拌至少1小時以后，將該懸浮液過濾并且用 冷水洗滌兩次。在將該沉淀物40°C 士5°C下進行干燥。最終獲得一種灰白色的固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=87%。11. 3HC1. H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2 (SEQ ID NO 2)的合成使 1. 00 當量 3TPB. Z-Arg-Trp-Pro-TrpTrp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2 (Mw =1787. 1 ；純度=57.0% )的一種甲醇溶液若干次穿過一個柱，該柱含有一種甲醇洗滌過 的樹脂IRA 958 (Mw = 1000,9. 00當量)。在已經(jīng)通過HPLC檢驗這種交換以后，將該樹脂過 濾并且用甲醇洗滌三次。使這些組合的有機相在真空中部分地濃縮。然后用水將該濃縮的 溶液稀釋并且加入Pd催化劑。然后將該懸浮液在35°C 士5°C下氫化至少6小時。將該催 化劑過濾掉、用一種甲醇/水混合物洗滌三次。將該組合的濾液在真空中蒸發(fā)，殘余物懸浮 在DMA中并且將其進一步濃縮以消除剩余的水。在檢驗該水的含量以后，用HCl (0.1N)或 NMR滴定該溶液并且不經(jīng)任何純化而進一步使用。產(chǎn)率(基于NMR含量測量)93%。12. Boc-Ile-Leu-OH 的合成根據(jù)兩個路徑進行Boc-I Ie-Leu-OH 二肽的合成-經(jīng)由Boc-Ile-OH的活化的酯OSu(路徑A)-通過使用Boc-Ile-OH的UNCA(尿烷N-保護的羧酸酐)(路徑B)路徑A =Boc-Ile-OSu的合成(對比)在攪拌下，將1.00 當量的 Boc-Ile-OH. l/2H20(Mw = 240. 3)以及 1.05 當量的 Suc-OH(Mw = 115)加入乙酸乙酯中。將該溶液冷卻到O士5°C并且然后將稀釋在乙酸乙酯 中的1. 10當量DCC(Mw = 206. 3)倒入該溶液中。將該懸浮液在0°C下攪拌至少30分鐘、 并且在室溫下攪拌至少5小時。在已經(jīng)通過加入2. 42g乙酸(0. 20當量)使該反應(yīng)混合物 猝滅以后，將D⑶過濾并且用乙酸乙酯洗滌兩次。用以下物質(zhì)洗滌這些有機層含0. 5當量 KHSO4的5% (重量)NaCl水溶液、5% (重量)NaCl水溶液；含0. 5當量Na2CO3的5% (重 量)NaCl水溶液、并且最后是5% (重量)NaCl水溶液。將該溶劑在真空下進行濃縮。在乙 酸乙酯中吸收該濃縮溶液兩次、并且進一步在真空中蒸發(fā)以便消除剩余的水。用環(huán)己烷或 庚烷稀釋該濃縮的有機層。將該沉淀的懸浮液在室溫下攪拌至少30分鐘、過濾并最終在真 空下(45°C)干燥。干燥過的沉淀物產(chǎn)出了 89% (基于NMR含量)的Boc-Ile-Osu，為白色 固體。路徑A =Boc-Ile-Leu-OH 的合成將1. 01 當量的 H-Leu-OH(Mw = 131. 2)在大約 50°C下首先用 2. 10 當量 TMA (Mw = 145.12)甲硅烷基化直到獲得一種澄清溶液為止。將該溶液冷卻到室溫，并且用乙酸異丙 酯進行稀釋。然后將1. 00當量的Boc-Ile-OSu固體(Mw = 328. 26 ； 100. 0% )加入甲硅烷 基化的H-Leu-OH溶液中。將該反應(yīng)混合物在室溫下進一步攪拌至少8小時。在通過HPLC證實該反應(yīng)的完成以后，通過加入DMAPA和水使該溶液猝滅、用以下物質(zhì)進行洗滌500ml 5% (重量)NaCl水溶液中的KHSO4(1.00當量)；500ml 5% (重量)NaCl水溶液、以及水。 在將該乙酸異丙酯在真空中蒸發(fā)以后，通過用乙酸異丙酯進行共沸蒸餾而去除過量的水。 在濃縮過程中該肽沉淀出。然后將該濃縮的懸浮液稀釋在環(huán)己烷中。將沉淀物在室溫下攪 拌至少10分鐘、過濾并最終在真空中在45°C下進行干燥。干燥過的沉淀物產(chǎn)出了(基于 NMR含量)80%的Boc-I le-Leu-OH，為白色固體。路徑B =Boc-Ile-Leu-OH 的合成將1. 00 當量的 Boc-IIe-NCA (Mw = 257. 3)加入 1. 10 當量 H-Leu-OH (Mw = 131. 2) 在DMSO中的懸浮液中。然后將該懸浮液在60°C 士5°C下加熱至少2小時。在通過HPLC檢 驗轉(zhuǎn)化率以后，用乙酸異丙酯稀釋該反應(yīng)混合物、用以下物質(zhì)進行洗滌在5% (重量)NaCl 水溶液中的KHSO4 (Mw= 136 ； 1.00當量)、5% (重量)NaCl水溶液、以及水。在將乙酸異丙酯 在真空中蒸發(fā)以后，通過用乙酸異丙酯進行共沸蒸餾而消除過量的水。在濃縮過程中該肽 沉淀出。然后將該濃縮的懸浮液在環(huán)己烷中稀釋。將該沉淀物在室溫下攪拌至少10分鐘、 過濾并最終在真空中在45 °C下進行干燥。干燥的沉淀物產(chǎn)出了 89%的Boc-Ile-Leu-OH，為 白色固體(基于NMR含量)。13. 3HC1. Boc-11e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(Boc)-NH2 ( SEQ ID NO 1)的合成將1· 05 當量的 Boc-Ile-Leu-OH (Mw = 344. 4)以及 1. 10 當量的 HOOBt (Mw = 163. 13)加入 1. 00 當量 3HC1. H-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (M W= 1652. 9 ；純度=89. 0%)在DMA與CH2Cl2中的一種冷的(O 士 5°C)溶液中。然后將1.20 當量的EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺；Mw= 191. 7 ；純度=100.0% )加 入該反應(yīng)混合物，將它在O士5°C下進一步攪拌大約4小時、然后在室溫下攪拌至少8小時。 在已經(jīng)通過HPLC檢驗該反應(yīng)的完成以后，用一種CH2Cl2/異丁醇混合物(8/2)將該反應(yīng)混 合物稀釋、并且用一種5% (重量)NaCl的水溶液+HCl (0. 3當量)進行洗滌。在該有機層 濃縮以后，將殘余的油通過緩慢地倒入冷的(O士5°C)乙腈中而使它沉淀。在O士5°C下攪拌 至少30分鐘以后，將該懸浮液過濾并且用冷的MTBE洗滌兩次。將該沉淀物在40°C 士5°C 下進行干燥。最終獲得一種灰白色的固體。產(chǎn)率(基于NMR含量)=88%。14. 5HC1. H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)的合成將 1. 00 當量的 Boc-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Boc) -NH2 (SEQ ID NO 1) (Mw = 1980 ；純度=89. 0% )緩慢地加入相對于該肽含有24當量HCl 以及6當量4-(甲硫基)苯酚(Mw =124. 2)的異丙醇中。在完成加入以后，用異丙醇稀釋 該反應(yīng)混合物。將該反應(yīng)混合物在35°C 士5°C下攪拌至少2小時。在通過HPLC檢驗該反 應(yīng)的完成以后，將該反應(yīng)混合物緩慢倒入冷的異丙醚中。將該沉淀物在O士5°C下攪拌至少 15分鐘、然后過濾、用異丙醚洗滌三次、并且最后在真空下干燥從而獲得5HC1. H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-LyS-NH2 (SEQ ID NO 1)。15. 5HC1. H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 1)的純化
將實例14中所獲得的產(chǎn)物溶解在一種乙酸鹽緩沖劑中并且在0. 5 μ m膜上過濾。 使用以下參數(shù)通過HPLC將生成的溶液進行純化-柱2·0*25cm(ID*L)-固定相C18硅石；ΙΟμπι-ΙΟΟΑ-流動相=A=乙酸鹽緩沖劑，ρΗ 5. 0 (0. 15Μ)B=乙月青-流速19mL/min-波長254nm-梯度(min； % B) (0 ；10) (5 ； 10) (6 ； 18) (36 ；33) (36. 1 ；60) (43 ；60) (43. 1 ； 10) (52 ； 10)所獲得的Omiganan肽(SEQ ID NO 1)具有超過98%的純度。將所生成的高純度部分用水稀釋并且使用以下流動相將同一個柱用來將乙酸根 離子轉(zhuǎn)化為Cl—離子-水/乙腈95/5v/v，用于該柱的平衡-0. 5M NaCl/MeCN 95/5v/v，用于離子交換-水/MeCN60/40v/v，用于洗脫然后將生成的產(chǎn)物進行濃縮并且冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一禾中用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 1)的Omiganan肽或其衍生物的方法，該方法包括在溶液中將第一肽與第二 肽偶聯(lián)的至少一個步驟，該第一肽具有活化的羧基以及至少兩個氨基酸單元、或選自以下 的氨基酸具有活化羧基的lie、Leu、Arg以及Trp、Pro ；該第二肽具有游離氨基以及至少 兩個氨基酸單元，其中該第一肽與第二肽不同，并且它們包含選自以下的氨基酸Ile、Leu、 Arg>Trp>Pro 以及 Lys,其順序如 Omiganan 中序列 11 e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Tr p-Arg-Arg-Lys (SEQ ID NO 1)所指定的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法，包括將 Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 2)或其衍生物與Ile-Leu偶聯(lián)的步驟，其中Ile的氨基受到氨基保護基團 的保護。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括將Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 3)或其衍生物與Arg-Trp-Pr0偶聯(lián)的步驟，其中Arg的氨基受到保護基團的保護。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，包括將Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO4)或其衍生物與Trp-Trp-Pro偶聯(lián)的步驟，其中該N端Trp的氨基受到保護基團的保護。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的方法，其中該保護基團選自叔丁氧羰基(Boc) 基團以及芐氧基羰基( 基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中Arg或Trp的氨基受到芐氧基羰基(Z)基團的保護。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中Lys中的側(cè)鏈氨基和/或Ile中的N端氨基受到 叔丁氧羰基(Boc)的保護。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其包括形成含Arg的肽的四苯基硼酸鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽是通過使偶聯(lián)步 驟反應(yīng)介質(zhì)與四苯基硼酸鹽陰離子的來源相接觸而形成的，該反應(yīng)介質(zhì)包含由權(quán)利要求1 至7中任一項所述的偶聯(lián)步驟所獲得的含Arg的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述四苯基硼酸鹽陰離子的來源包括四苯基硼 酸鈉。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項所述的方法，其中使所述含Arg的肽的四苯基硼酸 鹽不經(jīng)分離而經(jīng)歷至少一個另外的合成步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中使所述含Arg的肽的四苯基硼酸鹽至少經(jīng)歷脫 保護步驟然后是偶聯(lián)步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中該第二肽具有選自以下的式 NH2-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 4), NH2-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO5)>NH2-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R (SEQ ID NO 6)> NH2-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-L ys (X)-R(SEQ ID NO 7), NH2-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 8)、NH2 -Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 9)、NH2-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp -Pro-Trp-Arg-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 10) >NH2-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Ar g-Arg-Lys(X)-R(SEQ ID NO 11)，其中X是用于該Lys側(cè)鏈氨基的任選的保護基團，并且R 是用于Lys的羧基的羧基保護基團，優(yōu)選是酰胺基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該第二肽包含0.至的其⑶Arg-Arg-Lys (X) -R 類似物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該第二肽包含0.2wt%至0.9wt%的⑶ Arg-Arg-Lys (X) -R 類似物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項所述的方法，其中該第二肽是NH2-Arg-Lys⑴-R，其 中X是用于該Lys側(cè)鏈氨基的任選的保護基團，并且R是用于Lys的羧基的羧基保護基團， 優(yōu)選是酰胺基團，并且該第一肽選自Y-Trp-Arg、Y-Pro-Trp-Arg, Y-Trp-Pro-Trp-Arg (SEQ ID NO 12)^Y-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 13)>Y-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID N014) > Y-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 15) > Y-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-T rp-Arg(SEQ ID NO 16) > Y-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO 17)、Y-Il e-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg(SEQ ID NO ⑶，其中 Y 是氨基保護基團，優(yōu)選 Z基團。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該偶聯(lián)是在芳基環(huán)化的氧代三嗪活化劑、優(yōu)選 HOOBt的存在下進行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中該偶聯(lián)在-10°C到+10°C的溫度下進行。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項所述的方法，其中該偶聯(lián)在鹵化溶劑與非鹵化溶劑 的混合物、優(yōu)選氯化溶劑與酰胺型溶劑的混合物中進行。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項所述的方法，其中使Z-Trp-Arg-OH與HCl. H-Arg-Lys (Boc) -NH2偶聯(lián)，該活化劑是HOOBt，該溶劑是DMA與亞甲基氯的混合物，并且該 偶聯(lián)在第一個時間段中在_5°C 士5°C的溫度下進行3到5小時，并且在第二時間段中在 +50C 士5°C的溫度下進行6到10小時。
21.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的方法，其中該第二肽是通過權(quán)利要求16至 20中任一項所述的方法獲得的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項所述的方法，該方法依照圖1的方案。
23.一種用于制造具有序列 H-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys -NH2 (SEQ ID NO 1)的Omiganan肽的脫保護方法，該方法包括在基本上無水的條件下使式 Y I-Ile-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys (Y2) -NH2 (SEQ ID NO 1)的前體 肽與酸進行反應(yīng)，其中Yl與Y2指相同或不同的氨基保護基團或H，并且Yl或Y2中的至少 一個是對酸敏感的氨基保護基團。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中Yl和Y2是Boc。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中該酸選自HC1、HF、三氟乙酸、以及三氟甲磺酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中該酸是HC1，并且其中針對每摩爾的肽優(yōu)選使用 6到32摩爾、更優(yōu)選12到M摩爾的HCl。
27.根據(jù)權(quán)利要求23至沈中任一項所述的方法，其中該反應(yīng)在有機溶劑中、優(yōu)選在脂 肪醇中、更優(yōu)選在異丙醇中進行。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項所述的方法，其中基本上無水的條件是通過在含有 10mg/kg到1. 5wt%、優(yōu)選50mg/kg到Iwt%的水的液體反應(yīng)介質(zhì)中進行該反應(yīng)而實現(xiàn)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至觀中任一項所述的方法，其中該反應(yīng)是在碳陽離子清除劑、特 別是叔丁基陽離子清除劑的存在下進行的。
30.根據(jù)權(quán)利要求23至四中任一項所述的方法，其中該反應(yīng)是在0°C到80°C、優(yōu)選 30°C到45°C的溫度下進行的。
31.根據(jù)權(quán)利要求23至30中任一項所述的方法，其中該Omiganan肽是以其五鹽酸鹽 的形式被回收的。
32.根據(jù)權(quán)利要求23至31中任一項所述的方法，其中該前體肽是由權(quán)利要求1至22 中任一項所述的方法獲得的。
33.一種用于純化Omiganan肽的方法，其包括使不純的Omiganan肽經(jīng)歷反向液相色譜 法，其中流動相包含水以及有機溶劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該流動相包含乙腈。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中該流動相包含乙酸鹽緩沖劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項所述的方法，還包括反離子交換步驟。
37.根據(jù)權(quán)利要求33至36中任一項所述的方法，還包括濃縮和冷凍干燥步驟。
38.根據(jù)權(quán)利要求33至37中任一項所述的方法，其中該omiganan肽是由權(quán)利要求1 至32中任一項所述的方法獲得的。
39.Trp-Trp-Pro-OH0
40.Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 2)。
41.Arg-Trp-Pro-OH0
42.Trp-Arg-Arg-Lys-NH2 (SEQ ID NO 4)。
43.Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lys-NH2(SEQ ID NO 6)。
44.根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項所述的化合物，其中該N端氨基受到保護基團、優(yōu) 選Z基團的保護。
45.根據(jù)權(quán)利要求40以及42至44中任一項所述的化合物，其中Lys的側(cè)鏈氨基受到 保護基團、優(yōu)選Boc基團的保護。
46.根據(jù)權(quán)利要求40至44中任一項所述的化合物的四苯基硼酸鹽。
47.包括在圖1中的含Arg的肽中的任何一種的四苯基硼酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在溶液相中制造Omiganan肽的一種方法。本發(fā)明還涉及在用于制造Omiganan的方法中新穎的中間產(chǎn)物并且涉及用于制造這些中間產(chǎn)物的方法。
文檔編號C07K7/08GK102124021SQ200880130757
公開日2011年7月13日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者喬治斯·布隆迪爾, 洛朗·讓尼, 羅蘭·卡倫斯 申請人:索爾維公司