專利名稱：新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新城疫病毒NDV-Italien株的唾液酸-神經(jīng) 氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN蛋白)禾口融合蛋白(fusion protein,F蛋白) 及其在基因治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)是副粘病毒科副粘病毒屬的單股 負(fù)鏈RNA病毒，通常感染禽類導(dǎo)致新城疫。由于該病毒對(duì)人類無致病源性，因此，近年來用 于腫瘤治療。NDV的RNA基因組全長約15kb，包含6個(gè)基因，編碼六種結(jié)構(gòu)蛋白，其中的血 凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase, HN)能夠識(shí)別宿主細(xì)胞膜上的含 唾液酸的糖蛋白受體，并和病毒的融合蛋白(fusion protein, F)相互作用，促使病毒進(jìn)入 宿主細(xì)胞。同時(shí)更重要的是，感染了病毒的細(xì)胞其表達(dá)的HN和F蛋白促使腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞 之間發(fā)生融合，進(jìn)而形成多核細(xì)胞，最終細(xì)胞走向死亡。以往的研究多從病毒分子生物學(xué)角 度，探討HN蛋白和F蛋白的相互作用介導(dǎo)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的入侵，或從畜牧業(yè)領(lǐng)域研究HN 作為病毒的保護(hù)性抗原，從而制備針對(duì)NDV的疫苗預(yù)防新城疫的感染。對(duì)F蛋白的研究也 主要集中于HN和F蛋白作用后，引起F蛋白空間構(gòu)象的改變，進(jìn)而引發(fā)病毒包膜和細(xì)胞膜 的融合。我們研究表明，體外表達(dá)HN蛋白和F蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞之間形成多核巨細(xì) 胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的功能，基于此發(fā)現(xiàn)，將HN和F基因共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞是一種潛在的基因治療 策略。 基因治療是指將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛞肽[瘤細(xì)胞或體細(xì)胞以糾正突 變或有缺陷的基因或表達(dá)相應(yīng)的效應(yīng)分子，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前，基因治療的主 要方法包括基因沉默療法、自殺基因療法、免疫基因療法、基因替代療法、反義基因療法、 多藥耐藥相關(guān)基因治療、抗腫瘤新生血管治療、抗端粒酶治療和凋亡誘導(dǎo)療法等。常見報(bào)道 的治療基因有TRAIL、caspase-3、凋亡素、抑癌基因和細(xì)胞因子基因等。如凋亡素是雞貧血 病毒的vp3基因編碼的蛋白質(zhì)，體外合成或基因工程表達(dá)的凋亡素能特異地引起多種人源 性惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常二倍體體細(xì)胞無作用。但目前治療基因的種類仍有限，發(fā)現(xiàn)新 的、有效的治療基因仍是基因治療面臨解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供新城疫病毒NDV-Italien株的HN和F基因及其在組織或
細(xì)胞中進(jìn)行同時(shí)表達(dá)，以作為一種疾病治療的有效成分，用于基因治療。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下 —種新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，所述的F基因的cDNA是序列 表〈400>1的序列，F(xiàn)蛋白的氨基酸序列是序列表〈400>3的序列，HN基因的cDNA是序列表 〈400>2的序列，HN蛋白的氨基酸序列是序列表〈400>4的序列。
新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病 的藥物中的應(yīng)用。 —種重組病毒載體，將包含HN或F基因完整開放讀碼框序列的片段分別連入病毒 載體中，可以在真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因，然后通 過體外轉(zhuǎn)染或感染的方法，導(dǎo)入培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型中并且同時(shí) 表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。 重組病毒載體，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的應(yīng)用。 —種真核表達(dá)質(zhì)粒，將包含HN或F基因完整開放讀碼框序列的片段分別連入真核
表達(dá)質(zhì)粒，可以在真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因，然后
通過轉(zhuǎn)染的方法，導(dǎo)入培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型中同時(shí)表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。 真核表達(dá)質(zhì)粒，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的應(yīng)用。 —種真核表達(dá)質(zhì)粒，將包含HN和F基因完整開放讀碼框序列的片段連入含有內(nèi)核
糖體進(jìn)入序列(internal ribosome entry site, IRES)的真核表達(dá)質(zhì)粒中，可以在真核細(xì)
胞中串聯(lián)表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通過轉(zhuǎn)染的方法，導(dǎo)入培
養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型中同時(shí)表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。 真核表達(dá)質(zhì)粒，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的應(yīng)用。 —種重組病毒載體，將包含HN和F基因完整開放讀碼框序列的片段通過內(nèi)核糖體
進(jìn)入序列(internal ribosome entry site, IRES)連接后，連入病毒載體中，構(gòu)建重組病毒
載體，可以在真核細(xì)胞中串聯(lián)表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通過
體外轉(zhuǎn)染或感染的方法，導(dǎo)入培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型中同時(shí)表達(dá)兩
種編碼產(chǎn)物。 重組病毒載體，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的應(yīng)用。
我們研究表明，將HN和F基因克隆、同時(shí)在體外轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，可以 引起轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間相互融合，形成多核巨細(xì)胞，最終誘導(dǎo)多核巨細(xì)胞死亡。因此，HN基因和 F基因可以作為一種治療人體腫瘤和其他疾病的潛在的治療基因。本發(fā)明是基于新城疫病 毒HN和F蛋白具有促膜融合功能、進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用而設(shè)計(jì)的。HN蛋白和F蛋白均 位于病毒包膜或者呈現(xiàn)在感染細(xì)胞膜表面，HN蛋白和F蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)編碼氨基酸殘基分 別有571和553個(gè)，是病毒毒力的主要決定蛋白。正常情況下，HN蛋白以二聚體的形式與 F蛋白形成復(fù)合物，但是當(dāng)HN蛋白與細(xì)胞膜表面的唾液酸受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致蛋白變構(gòu)，引 起復(fù)合物解體，使F蛋白的活性位點(diǎn)暴露，而與鄰近細(xì)胞膜相互作用最終導(dǎo)致相鄰兩個(gè)細(xì) 胞膜的融合而形成多核細(xì)胞，這種形成的融合多核巨細(xì)胞最終均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡崩解。同 時(shí)由于腫瘤細(xì)胞死亡后釋放的大量腫瘤相關(guān)抗原被提呈到相關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞，可以同時(shí)增強(qiáng) 人體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用。 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明得到了可以單獨(dú)或串聯(lián)表達(dá)NDVItalien株HN和F 基因的真核表達(dá)質(zhì)?；蛑亟M病毒顆粒，使這兩種基因能夠在真核細(xì)胞，包括人體的腫瘤細(xì) 胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或異常細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)其編碼產(chǎn)物HN蛋白和F蛋白，并且這兩種蛋白可以導(dǎo) 致感染細(xì)胞與細(xì)胞之間融合形成多核巨細(xì)胞，最終產(chǎn)生細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒效應(yīng)。


圖1為免疫熒光法檢測HN和F的促膜融合效應(yīng)的結(jié)果。
圖2為素木精_伊紅染色顯示HN和F的促膜融合效應(yīng)的結(jié)果。
圖3為HN和F促膜融合導(dǎo)致的細(xì)胞死亡效應(yīng)的結(jié)果。 圖4為HN和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒圖譜以及HN和F基因的真核串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒 pIRES-HN/F圖譜。 圖5為HN禾P F基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-HN和pShuttle-CMV-F圖譜以及HN 和F基因真核串聯(lián)表達(dá)的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-HN/F圖譜。
保藏證明 請求保藏的培養(yǎng)物名稱新城疫病毒NDV-Italien 保藏編號(hào)CCTCC-V200908 收到日期2009年4月30日 保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
具體實(shí)施例方式1材料 1. 1病毒和細(xì)胞株 強(qiáng)毒株NDV Italien由Volker Schirrmacher教授(德國癌癥研究中心)饋贈(zèng)。
人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株FHCC98
非洲綠猴腎細(xì)胞株C0S-7
1. 2菌種與質(zhì)粒 E.coli JM109購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒購自 Invitrogen公司，pIRES質(zhì)粒購自Clontech公司。
1. 3主要試劑 Trizol LS Reagent禾口 Lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司；氨節(jié)青霉 素購自Genview公司；ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄酶購自Toyobo公司；限制性核酸內(nèi)切酶，Prime STAR DNA聚合酶，T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒(Plasmid Minipr印s kit)和DNA凝膠純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)購自Stratagene 公司。 2方法 2. 1引物的設(shè)計(jì):根據(jù)我們向GenBank提交的NDV Italien全長序列(登錄號(hào): EU293914)，以其中的HN和F基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物并合成。合成系列兩對(duì)引物并且在 引物的5'端分別加上EcoR V和Xba I的酶切位點(diǎn)，同時(shí)在基因開放讀碼框的起始位點(diǎn)添 加Kozak序列。序列如下HN sense :5' AATTGATATCAATAGCAGACTTCGGTCATGG 3'
Anti-sense :5' ATTATCTAGACTGACTGGCAGCGTAGGATTC 3'
Fsense :5' TAAGATATCATCATGCGCTCCAGATCTTCT 3'
Anti-sense :5' ATTATCTAGAATACCTCCGCCTCTCGTCT 3' 2. 2病毒的擴(kuò)增和收集將病毒接種9日齡無特殊病原體(specific-pathogenfree，SPF)雞胚尿囊腔，72h后收獲尿囊液，所獲得的尿囊液以20%蔗糖溶液為介質(zhì)經(jīng)差速 離心法收集病毒沉淀，病毒沉淀用TNE(Tris+NaCl+EDTA)緩沖液重懸后保存于_70°C 。
2. 3病毒基因組cDNA的分段擴(kuò)增采用Trizol LS提取病毒基因組RNA，并且通過 分段RT-PCR擴(kuò)增的方法獲得cDNA亞片段，分別是HN-cDNA和F-cDNA，再通過PrimeSTAR高 保真DNA聚合酶對(duì)分別以HN-cDNA和F-cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到HN和F基因完整開放讀 碼框的片段，連入T載體后測序無誤，分別通過EcoRV/Xba I連入pcDNA3. 1 (+)中，得到質(zhì) 粒pcDNA3. l-HN和pcDNA3. l-F。所得產(chǎn)物測序確認(rèn)正確。 2. 4將HN和F的真核表達(dá)質(zhì)粒通過脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞，免疫熒光法檢測 確認(rèn)上述表達(dá)質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中有效表達(dá)編碼產(chǎn)物HN蛋白和F蛋白。
2. 5將HN和F真核表達(dá)質(zhì)粒通過脂質(zhì)體或電穿孔同時(shí)轉(zhuǎn)染FHCC98和C0S-7細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染48h觀察，免疫熒光法觀察到共轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒的細(xì)胞與周圍細(xì)胞出現(xiàn)了融合產(chǎn)生多核 巨細(xì)胞(圖1)，隨時(shí)間推移所產(chǎn)生的多核巨細(xì)胞最終死亡并從培養(yǎng)瓶上脫落(圖2)。碘化 丙錠(PI)染色顯示多核細(xì)胞呈陽性著色(圖3)。 2.6同時(shí)設(shè)計(jì)另外兩對(duì)引物，用于擴(kuò)增HN和F的開放讀碼框完整片段，但分別包含
有Xho I/Mlu I酶切位點(diǎn)(F基因)和Xba I/Not I的酶切位點(diǎn)(HN基因)，同時(shí)在基因開
放讀碼框的起始位點(diǎn)添加Kozak序列。引物序列如下HN+ sense :5' AATTTCTAGAAATAGCAGACTTCGGTCATGG 3' Anti-sense :5' ATTAGCGGCCGCCTGACTGGCAGCGTAGGATTC 3'F+ sense :5' TAACTCGAGATCATGCGCTCCAGATCTTCT 3' Anti-sense :5'ATTAACGCGTATACCTCCGCCTCTCGTCT 3' 2. 7采用HN+和F+兩對(duì)引物，通過PrimeSTAR高保真DNA聚合酶對(duì)病毒基因組 cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到HN和F基因完整開放讀碼框的片段，連入T載體后測序無誤，分別通過 Xho I/Mlu I(F基因)和Xba 1/Notl(HN基因)依次先后連入pIRES載體中相應(yīng)位置。所 的產(chǎn)物測序確認(rèn)正確(圖4)。 2.8將所得到串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pIRES-HN/F轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞，采用分別針對(duì)NDV HN蛋 白和F蛋白的單克隆抗體檢測兩種蛋白的表達(dá)情況，隨后將該串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒在體外通過脂 質(zhì)體的方式轉(zhuǎn)染FHCC98和C0S-7細(xì)胞，兩種基因串聯(lián)表達(dá)的產(chǎn)物對(duì)兩種不同細(xì)胞系均具有 促膜融合及誘導(dǎo)融合多核巨細(xì)胞死亡的功能。 2. 9根據(jù)NDV Italien株基因組序列合成另外兩對(duì)引物，分別用于構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)
HN和F蛋白的重組腺病毒和串聯(lián)表達(dá)HN和F蛋白的重組腺病毒。在HN1和F1引物對(duì)的上
下游分別添加Sal I和Xho I酶切位點(diǎn)。序列如下HN1 sense :5' AATTGTCGACAATAGCAGACTTCGGTCATGG 3' Anti-sense :5' ATTACTCGAGCTGACTGGCAGCGTAGGATTC 3'Fl sense :5' TAAGTCGACATCATGCGCTCCAGATCTTCT 3' Anti-sense :5' ATTACTCGAGATACCTCCGCCTCTCGTCT 3' 2. 10采用HN1引物，以HN-cDNA為模板擴(kuò)增HN1片段，該片段的兩端分別帶有 Sal I和Xho I的酶切序列。采用Fl引物，以F-cDNA為模版擴(kuò)增Fl片段，該片段的兩側(cè) 分別帶有Sal I和Xho I酶切序列。以HN1的上游引物和F1引物對(duì)的下游引物，以構(gòu)建的 pIRES-HN/F質(zhì)粒為模版，擴(kuò)增HN-IRES-F片段，該片段兩端分別帶有Sal I和Xho I酶切位點(diǎn)。將所得的三個(gè)片段連入T載體，測序無誤后，將其通過Sal I和Xho I雙酶切后連入 AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)中的pShuttle-CMV質(zhì)粒中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，所得的質(zhì)粒分別 命名為pShuttle-CMV-HN， pShuttle-CMV-F和pShuttle-CMV-HN/F (圖5)。
2. 11將所得的三種穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-HN， pShuttle-CMV-F和 pShuttle-CMV-HN/F分別與腺病毒骨架結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pAdEasy-1按照說明書所述步驟最終得到 包含HN、 F完整開放讀碼框序列以及這兩段序列的串聯(lián)表達(dá)片段的重組腺病毒，分別命名 為Ad-HN， Ad_F禾口 Ad_HN/F。 2. 12將所得的重組病毒體外分別感染FHCC98和C0S-7細(xì)胞，觀察重組病毒Ad-HN 和Ad-F在單獨(dú)感染、聯(lián)合感染以及Ad-HN/F感染導(dǎo)致基因串聯(lián)表達(dá)時(shí)對(duì)細(xì)胞生長的影響。 結(jié)果表明，Ad-HN與Ad-F聯(lián)合感染以及Ad-HN/F感染均具有促膜融合及誘導(dǎo)融合多核巨細(xì) 胞死亡的功能。
序列表 〈110〉中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) 〈120〉新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治療藥物中 的應(yīng)用 〈160>4 〈210>1 〈211>1791 〈212>cDNA 〈213>新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus)〈220〉〈221〉CDS〈222〉(47). (1708)〈223〉F〈400〉1g^tttggatcccggttggcacattc^ggtgca卿tgggctccagatc60ttctaccaggatcccggtacctctaatgctgatcatccgaattgcgctgacactgagctg120tatccgtctgacaagctctcttg3tggC3ggcctcttgcagctgc鄉(xiāng)gatcgtggtaac1803ggagate^gcagtc^catetacacctcatcccagacatagtcaagtt240actcccaaat3tgCCC33gg3C^3g3ggCgtgtgc^^gccccattag300C3gg3C3Ctgactactttgctcaccccccttggcaattct3tCCgC3gg3360tgtgactecttCCgg3gg33gg卿c卿gacgctttataggtgccattatcggcagtgt420agctcttggggttgc皿cagctgcacagat■cagcagcctcggccctga480ccagaatgctgccaacatcctccggcttaagg卿gcattgctgcaaccaatg皿gctgt540gcacgaggtctetcacaact3gC3gtggC3gteggga卿tgcagcagtt600tgttaatgaccagttteatattacacagca660ggtcggtgtagaactcaacttgtacctaactgaattgactacagtettcgggCC3C3^t720cacttcccctgccttaactccgctgactatccaggcgctttacaatttagctggtggt皿780tatggattacttgctgactaagtteggtgt3ggg皿C33Ccaactcagctcatteattgg840
tegcggcttgatcaccggcaaccctattct gtacgactca cagactcaga tcttgggtat■ttgccttcagteggg皿cct ■ateatetg cgtgccacct acttggagac960cttetctgte3gC3C皿CC3ctcagcacttgtccc皿皿g1020ggtcggttccgtgateg皿gaacttgacacctcatectgt3tgg3g3CCgacttggatct1080atectgteca3g皿tegtgacattccctetgtctcctggtatttettcctgtctgagcgg1140teatecatcggcttgcatgttg皿ggcgcacttectecgccatetetggc1200tctcaaaggctcagttetcgccaattgcaatgt卿tgtgC3g3CCCCCC1260gggtetcatetcgcaaaattatggag皿gctgtgtcctteategateggcactcatgcaa1320tgtcttetcctt卿cgggateactctgaggctcagtgggg皿tttgatgcaacctetca1380tcaatectegattctcaagttetegtgacaggcaatctcg1440tgagcttgggactc皿teagteatgccctg皿teagtteg1500atgtcaaactg3CC3gC3C3tctgctctcattecctecat1560cgtttteactgtcatetctcttgtttttggtgtecttegcctggttctegcatgctecct1620gatgtec皿gC皿皿ggC3C皿c皿皿gaccttettetggcttggg皿teatecccttga1680tcagatgagagccactecaagC3g3Cg3g3ggcgg郷tetccccaateg1740caatttgcgtgteaattctggcaacctgtt1791〈210〉2〈211〉2002〈212〉cDNA〈213〉新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus)
〈220〉 〈221〉CDS〈222〉 (92)(1807)〈223〉HN〈400〉23cgggteg皿cggtcgg卿agccacccctc皿tcggg皿tcaggcctcacaacgtcctt60tcteccgcatcaccaategcagacttcggtcatggaccgtgagttgcgct120g皿3gag皿gcg皿g皿tecatggcgctttgtettccggatcgcaatctt180tctttteategteateaccttegccatctctgcagccgccctggtetetegratgg郷c240tegcacgtctggcgaccttgttggcateccaactgtgatctctegggrag300tecatctgcactcagttcteatc^gatgtagt卿teggateteteagcaggtggccct360tgagtctccgttggcgttgcte皿c3ctgaatctgteattteacgtctct420ctcttetcaaatc^tggagctgc3皿teategcgggtgtggggcacctgttcatgaccc■agattetetcgggggg咖gtettgtegatgacgctegtgatgtcacatc540attctecccctctgcgttccgaattttetcccggcacctectecaggatc600aggttgcactcggateccctcattcgacataagtgctecccactectgtt660tgtgatettetctggttgcagagatcactcacactcacatcagtecttegcacttggtgt720gcttcggacatctgcaacaggg郷gtettcttttctectctgcgttccatcaatttgga780tgac皿cc皿皿tcgg皿gtcttgcagtgtgagtgc皿ctccccteggttgtgatetgct840
8
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Cys Leu Val lie Thr lie His Lys Glu Asn Thr Leu Gly Gly Gin Thr Ser Glu Tyr Ser
Ala Leu Thr lie Ala Leu Glu Met Leu Leu Ser Ala Asn Asn lie Tyr Ala Glu Cys Cys
Lys Thr Thr Gly Ala Arg Val Gin Asp Tyr Pro Gly Asn Pro Thr Leu Leu Leu Thr Leu
Ala Pro Ser Ser Ser Leu Thr Gin Cys Leu Ala Gly Gin lie Leu Glu Val Asp Arg Ser
Pro 80 Leu 95 Gly 110 Val 125 Ala 140 Lys 155 Asp 170 Phe 185 lie 200 Thr 215 Leu 230 Asn 245 Leu 260 Leu 275 Pro 290 Thr 305 Pro 320 Thr 335 lie 350 Gly
Leu Gly Gly Ala Leu Glu Gly Val Lys Glu Thr Met Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Val Asn
Glu Asn Arg Leu lie Ser Leu Asn lie Leu Pro Asp Ser Asp Val Ser Val Tyr Thr Thr
Ala Ser Arg Gly Gin lie Ser Asp Thr Thr Leu Tyr Leu Ser Gly Val Val Cys Phe Ser
Tyr lie Gin Val Ala Ala Gin Gin Gin Thr Thr Leu lie Gin Asn Ser Thr Met Pro Ala
Asn 85 Arg 100 Arg 115 Ala 130 Asn 145 Ala 160 Leu 175 Phe 190 Gin 205 Val 220 lie 235 Leu 250 Gly 265 Thr 280 Leu 295 Thr 310 Gin 325 Glu 340 Met 355 Cys
Arg Arg Arg Thr Gin Thr Ala Asn Val Phe Gin Thr Ser Gin Asn Thr Val Thr Ser Met
Thr lie Phe Ala Asn Asn Val Asn Gly Gly Ala Lys Gly lie Asn Lys Gly Asp Pro Tyr
Leu Gin lie Ala Ala Glu Ala Thr Val Pro Leu Leu Leu Leu Met Gly Ser Leu Gly Ser
Thr Glu Gly Gin Ala Ala Val Ala Glu Gin Tyr Gly lie Gly Arg Phe Val Asp lie Lys
Thr 90 Ser 105 Ala 120 lie 135 Asn 150 Val 165 Gly 180 Gin 195 Leu 210 lie 225 Asn 240 Val 255 Thr 270 lie 285 Ala 300 Ala 315 lie 330 Leu 345 Tyr 360 Thr
10Glu lie Gly Arg Leu Leu Glu Leu Thr Ser Met Asn
Gly Ala Ala Asn lie lie His Ser Ser Gly Asp Ser Leu Gly Glu Glu Ser Thr Leu Val Tyr Lys Asn Thr
Leu Cys Ser Cys Glu Gin Asn Ser Ser Phe Gin Leu
365 Thr 380 Lys 395 Gin 410 Asn 425 Phe 440 Val 455 Val 470 Asn 485 Ala 500 Gly 515 Lys 530 Asp 545
Thr Pro Met Thr Asn Tyr Val Asp lie
Tyr Thr Gly
Met Cys Glu
Leu Ser Leu
Ala Val
Thr Thr
Asn Asn Ser
Ser Leu Val Ala Gin
Lys lie
Leu
Thr
Tyr Gly lie Asp Tyr
Leu Ser Leu
Gin Gin
Met Arg
Lys Ala
370 Ala 385 Arg 400 Ala 415 Asp 430 Gin 445 Asn 460 Ser 475 Lys 490 lie 505 Val 520 Thr 535 Thr 550
Leu Cys Val Gly Lys Leu Asn Val Val
Lys Ala
Ser
Pro
Gly Asp Ser Leu lie lie Thr lie lie
Asn
Asp Ala Asn Leu
Leu Ala
Leu Leu
Thr Lys
Leu
Ser
Ser
Leu Asn
Val
Thr
Cys
Trp
lie 553
Lys Val Tyr Leu
〈210>4 〈211>571 〈212>Amino Acid
〈213〉新城疫病毒Italien株(Newcastle disease virus) 〈220〉
〈221>Amino Acid 〈222〉 (1) (571)
〈223>hemagglutinin_neuraminidase 〈400>4
Met Asp Arg Ala Val Gly Arg Val Ala Leu Glu Asn Glu
1 5 10
Glu Ala Lys Asn Thr Trp Arg Phe Val Phe Arg lie Ala
20 25 Leu Leu lie Val lie Thr Leu Ala lie Ser Ala Ala Ala
375 Val 390 Pro 405 Asp 420 Arg 435 lie 450 Thr 465 Lys ■ Leu 495 lie 510 Leu 525 Gly 540
Glu lie Leu
Arg 15 Phe 30 Val






































Tyr Ser Met Glu Thr
Val lie Ser Asn Gin
Ser lie Phe Pro Ser Cys Leu Ser Ser Glu Val Leu Gly Val
lie Gly Gly Tyr Thr Ala Arg Arg lie Ala Thr His Asp Val Tyr
Cys Lys
Ser
Asp
Glu Ser Pro Leu Ala
Thr Ser
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Thr Thr Asp Thr
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His
His
Ser
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Thr Glu Gly Val Gly Gly
Pro Glu Arg lie Gly Gly
35 Ala
50 Arg
65 Val
80 Ala
95 Leu 110 Ala 125 Leu 140 Ala 155 Ser 170 Tyr 185 Ser 200 Ala 215 Asp 230 Leu 245 Glu 260 Leu 275 Thr 290 Gly 305 Leu 320
Ser
Ala
Thr Glu
Ser
Glu
Ser Pro lie Phe Gly Cys
Tyr Val Val Gin Cys Tyr
Asp Gly Asp Gly Leu Ser
Asn
Cys Tyr Phe Phe Phe
Asp Lys lie
Gly Lys
Val Asp Arg lie
Leu Leu Asn Thr
Gin lie
His Asp Glu Thr Thr
Asp Asp His Arg His
His Ser His Gin
Thr Gly Arg Gin Asp
Val
Asn
Met
Ser Ser
Gly Asp Asp
Lys Pro Asn Ser
40 Asp
55 lie
70 Tyr
85 Glu 100 Asn 115 Pro 130 Ala 145 Leu 160 lie 175 Asn 190 Tyr 205 Phe 220 Arg 235 Leu 250 Val 265 Gin 280 Trp 295 Asn 310 Pro 325
Leu Val Gly lie
Thr Ser Ala Leu
Lys Ser Gly Asp Ser Asn
Gin Val Ala Val lie Met Ala Ala Asn Tyr lie Gly Asp Val Thr Phe lie Pro
Pro Ser Phe Asp
Val
Leu
lie Leu Ser Ala Leu Gly
Ser
Ser
Cys Lys
Asn
Ser
lie
Phe Ser Thr Leu Lys Cys
Thr Pro Thr Ser Tyr His Glu Val Arg
Lys Tyr
Ala Val Trp Phe
Ser Asp Thr Ala
45 Pro
60 Ser
75 Leu
90 Asn 105 Asn 120 Gly 135 Ser 150 Ala 165 lie 180 Gly 195 Val 210 Arg 225 Val 240 Thr 255 Met 270 Asp 285 Pro 300 Pro 315 Gin 330
12Glu
Asp
Pro
lie
Pro
Thr
Phe
Ala
Gly
Val
Asn
Gin
Arg
Tyr
Tyr
Phe
Val 571
Gly Glu Gly Lys Pro Val Ser Thr Ser Thr His Ala Ser Thr Cys Arg
Arg Gin Arg Val Asn Gly Pro Leu Val Gly Thr Arg Arg Thr Leu lie
Tyr Asp Phe Ser Thr Thr Ala His Pro Val Leu Leu lie Ser Ser Val
Val 335 Tyr 350 Gly 365 Thr 380 Val 395 Ser 410 Leu 425 Ser 440 Cys 455 Tyr 470 Arg 485 Asn 500 Thr 515 Thr 530 lie 545 Pro 560
lie Gin Gly Ser Thr His Leu Pro Gin Thr Gly Pro Arg Cys Ala Leu
Tyr Lys lie Arg Lys Arg Leu Gly Leu Met Phe Leu Tyr Pro Tyr Thr Ala Ser Asp Pro Val Phe Val Ser Val Ser Phe Lys Glu lie Leu Val
Arg Met Val Glu Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Gly Ala Ser Val Ser Glu
Tyr 340 Ala 355 Gin 370 Asp 385 Ala 400 Gin 415 Thr 430 Asn 445 Arg 460 Pro 475 Thr 490 Val 505 Ser 520 Val 535 Asn 550 lie 565
Asn Lys Gin Pro Glu Arg Val Ala Cys Leu Met Phe Ser Lys Thr Leu
Asp Ser Ala Val Gly Gly Asn Phe Pro Val Leu Asp Thr Thr Leu Lys
Thr Ser lie Leu Arg Ser Asn Thr Asn Phe Asp Asn Lys Asn Phe Glu
Cys Tyr Leu Thr Val Ser Lys Arg Ser His Asp lie Ala Lys Gly Asp
Pro 345 Lys 360 Ser 375 Val 390 Leu 405 Tyr 420 Thr 435 Pro 450 Cys 465 Arg ■ Lys 495 Ser 510 Ala 525 Thr 540 Glu 555 Gly 570
權(quán)利要求
一種新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，其特征在于所述的F蛋白cDNA是序列表<400>1的序列，F(xiàn)蛋白的氨基酸序列是序列表<400>3的序列，HN蛋白cDNA是序列表<400>2的序列，HN蛋白的氨基酸序列是序列表<400>4的序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，作為制備治療人 體腫瘤或其他疾病的藥物中的應(yīng)用。
3. —種重組病毒載體，將包含權(quán)利要求1所述的HN或F基因完整開放讀碼框序列 的片段分別連入病毒載體中，該重組病毒載體可以在真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒 NDV-Italien株HN基因或F基因；通過體外轉(zhuǎn)染或感染的方法，可以將該重組病毒載體導(dǎo) 入體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型中并且同時(shí)表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。
4. 如權(quán)利要求3所述的重組病毒載體，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的 應(yīng)用。
5. —種真核表達(dá)質(zhì)粒，將包含權(quán)利要求l所述的HN或F基因完整開放讀碼框序列的片 段分別連入真核表達(dá)質(zhì)粒，可以在真核細(xì)胞中分別表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因 或F基因；通過轉(zhuǎn)染的方法，同時(shí)將兩種真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或 細(xì)胞疾病模型中同時(shí)表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。
6. 如權(quán)利要求5所述的真核表達(dá)質(zhì)粒，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的 應(yīng)用。
7. —種真核表達(dá)質(zhì)粒，將包含權(quán)利要求l所述的HN和F基因完整開放讀碼框序列的片 段連入含有內(nèi)核糖體進(jìn)入序列(internalribosome entry site, IRES)的真核表達(dá)質(zhì)粒中， 可以在真核細(xì)胞中串聯(lián)表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通過轉(zhuǎn)染的 方法，導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型中同時(shí)表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。
8. 如權(quán)利要求7所述的真核表達(dá)質(zhì)粒，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中的 應(yīng)用。
9. 一種重組病毒載體，將包含權(quán)利要求1所述的HN和F基因完整開放讀碼框序列的 片段通過內(nèi)核糖體進(jìn)入序列(internalribosome entry site, IRES)連接后，連入病毒載體 中，構(gòu)建重組病毒載體，可以在真核細(xì)胞中串聯(lián)表達(dá)新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F 基因，然后通過體外轉(zhuǎn)染或感染的方法，導(dǎo)入培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞疾病模型 中同時(shí)表達(dá)兩種編碼產(chǎn)物。
10. 如權(quán)利要求9所述的重組病毒載體，作為制備治療人體腫瘤或其他疾病的藥物中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新城疫病毒Italien株HN蛋白和F蛋白及其在基因治療藥物中的應(yīng)用，包括NDV Italien株的HN基因和F基因的cDNA以及NDV Italien株的HN蛋白和F蛋白氨基酸序列。本發(fā)明的有益效果是得到了可以單獨(dú)或串聯(lián)表達(dá)NDV Italien株HN和F基因的真核表達(dá)質(zhì)粒或重組病毒顆粒，使這兩種基因能夠在真核細(xì)胞，包括人體的腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或異常細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)其編碼產(chǎn)物HN蛋白和F蛋白，并且這兩種蛋白可以導(dǎo)致感染細(xì)胞與細(xì)胞之間融合形成多核巨細(xì)胞，最終產(chǎn)生細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒效應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K14/125GK101768211SQ20091002245
公開日2010年7月7日 申請日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者馮浩, 尉丁, 邊惠潔, 陳志南 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)