表達西尼羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫LaSota疫苗株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供一種表達西巧羅熱病毒（West Nile virus, WNV)PrM/E蛋白的重組新 城疫病毒LaSota疫苗株及其應用。具體而言，本發(fā)明提供表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的 重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E (其保藏號為CGMCC No. 10199)及其在制備 用于預防西巧羅熱的疫苗中的應用。
【背景技術】
[0002] 西巧羅病毒（West Nile Virus，WNV)是一種由庫蚊傳播的蟲媒病毒。WNV屬于黃 病毒科黃病毒屬，廣泛分布于非洲，歐洲西南部，俄羅斯，中東，印度W及澳大利亞。該病毒 于1999年傳入北美[1，2]。西巧羅病毒在血清學上屬于日本腦炎血清群，同群的病毒還有 圣路易斯腦炎病毒，墨累山谷腦炎病毒，日本腦炎病毒和昆津病毒。1998年W色列從發(fā)病的 鶴上分離到1系WNV病毒，其引起的臨床癥狀為腦炎和擁痕。1999年，紐約市發(fā)生WNV疫 情，分離得到的NY99株1系WNV病毒巧]。美國第一次WNV嚴重爆發(fā)發(fā)生在2003年，9000 人感染，死亡265人。第二次嚴重爆發(fā)發(fā)生在2012年，5387人感染，243人死亡。與2003 年爆發(fā)相比，2012年感染人群中呈現神經癥狀的病例比例大幅上升。2012年西巧羅熱在意 大利，W色列，俄羅斯，塞爾維亞，突巧斯和希臘均有發(fā)生，總計167例[4]。
[0003] 西巧羅熱病毒宿主范圍較廣，能夠感染人，馬，狗，綿羊，羊駝等[5,6]，大部分動 物呈隱形感染，極少數呈現臨床癥狀。大部分人感染西巧羅熱病毒只引起溫和癥狀或不典 型臨床癥狀，表現為高熱，皮疹，頭痛，肌肉酸疼等；少部分人發(fā)展成為嚴重的致死性神經癥 狀，如腦炎，腦脊髓炎W及相關的并發(fā)癥，該病的潛伏期一般為3-12天[7,8]。鳥類，尤其是 烏鴉是WNV的重要儲存宿主，遷徙鳥類在病毒散播過程中起重要作用巧]。吸血節(jié)肢動物如 蚊蟲、沙蛹、朦、壁風等是西巧羅病毒的傳播媒介，庫蚊、伊蚊、按蚊等蚊蟲是該病的主要傳 播媒介，其中美洲大陸的尖音庫蚊是美洲主要的傳播媒介?，F已證實WNV在蚊蟲與鳥類中 循環(huán)。人類主要通過帶病毒的蚊蟲叮咬而感染西巧羅病毒巧]。
[0004] WNV基因組表達的多聚蛋白，被蛋白酶切割產生S個結構蛋白C，PrM和E蛋白W 及7個非結構蛋白。C蛋白是是病毒核衣殼的主要成分。PrM是病毒細胞膜錯定蛋白化及 病毒相關的M蛋白的前體蛋白。PrM蛋白駿基端含有一段跨膜區(qū)域，該區(qū)域可W協(xié)助PrM蛋 白與細胞膜結合，同時也可W作為E蛋白的信號膚，同時研究證實PrM蛋白與E蛋白的正確 折疊密切相關[10-12]。此外，PrM可W與E蛋白結合形成異源二聚體蛋白進而組裝成未成 熟的病毒粒子[13]。當病毒從細胞內釋放時，位于高爾基復合體的furin蛋白酶W及其它 蛋白酶會將其切割成為成熟的M蛋白，從而形成成熟的病毒粒子[14]。WNV的E蛋白是其 最重要的結構蛋白，其在病毒復制周期的多個環(huán)節(jié)起關鍵的作用，其功能包括受體結合、膜 融合、病毒組裝W及出芽釋放等。E蛋白是誘導機體產生中和抗體的最主要結構蛋白[15， 16]。E蛋白也能夠誘導具有免疫保護效力的CTL殺傷性T細胞免疫反應[17]。
[0005] 西巧羅熱是一種重要的人獸共患病，我國目前尚未發(fā)現西巧羅病毒腦炎病例，沒 有分離到西巧羅病毒。近年來，隨著國際人員和物資流動加快，感染者、帶毒畜禽和媒介蚊 蟲傳入我國的可能性日益增加。加之西巧羅病毒主要分布在北紳23.50° -南紳66. 50° 的溫帶地區(qū)，而我國大部分領±處在該一地區(qū)，并有適宜的鳥類宿主、易感動物和媒介蚊蟲 分布，因此面臨著西巧羅病毒輸入和流行的威脅。由此，亟需開發(fā)出一種具有前瞻性和儲備 性、安全高效的西巧羅熱防控候選疫苗。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是開發(fā)一種具有前瞻性和儲備性、安全高效的西巧羅熱防控候選疫 苗。
[0007] 為實現上述目的，本發(fā)明人利用重組新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，構建了表達 西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒，實驗表明該重組病毒在小鼠中安全有效，能 夠誘導高水平的中和抗體和E蛋白特異性CD4+和CD8+T細胞免疫反應。研究結果表明該 重組病毒是優(yōu)秀的西巧羅熱儲備疫苗，對我國應對該病的威脅具有重要戰(zhàn)略意義。
[0008] 因此，本發(fā)明提供一種表達西巧羅熱病毒（West Nile virus, WNV)PrM/E蛋白的 重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發(fā)明提供表達西巧羅 熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E (其保藏號為CGMCC No. 10199)及其在制備用于預防西巧羅熱的疫苗中的應用。
[0009] 具體地，本發(fā)明成功構建了表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白（SEQ ID No. 2)的重組 新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E，該疫苗株已于2014年12月12日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC，中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，100101)，保藏號為CGMCC No. 10199,并在小鼠模型中系統(tǒng)評 價了所述重組病毒產生的體液和細胞免疫反應。
[0010] 本發(fā)明人采用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)構建了表達WNV PrM/E蛋白的重組病 毒新城疫病毒rLa-WNV-PrM/E。RT-PCR和間接免疫巧光實驗檢測重組蛋白的表達；重組病 毒免疫小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗巧LISA)和WNV瞻斑減少試驗檢測重組病毒的體液免疫 水平；用流式細胞術評價重組病毒產生的特異性細胞免疫水平。結果顯示，該疫苗株能夠正 確表達PrM/E蛋白。將重組病毒兩次免疫巧7BL/6小鼠，ELISA結果表明免疫小鼠可產生 高水平的PrM/E蛋白特異性IgG ;中和試驗結果顯示免疫小鼠可W產生高水平的WNV中和 抗體；流式細胞術表明免疫小鼠能夠產生WNV E蛋白表位特異性CD4+和CD8+T細胞免疫反 應。
[0011] 本發(fā)明中所用的西巧羅熱病毒PrM/E基因通過對WNV NY99株的PrM/E基因 (Genbank登記號為DQ211652. 1)進行哺乳動物密碼子優(yōu)化后合成而得到的，優(yōu)化后的序列 為SEQ ID No. 1，其編碼的PrM/E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0012] 本發(fā)明還提供表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/E在制備用于預防由西巧羅熱病毒引起的疾病的疫苗中的應用。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于預防由西巧羅熱病毒引起的疾病的疫苗，其包含 有效量的本發(fā)明所述的表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/E。可W施用該疫苗進行預防作用的受試者主要為哺乳動物，例如，但不限于， 人、馬、狗、綿羊、羊駝、小鼠、大鼠等。
[0014] 由西巧羅熱病毒引起的疾病例如，但不限于，高熱，皮疹，頭痛，肌肉酸疼，嚴重者 如腦炎，腦脊髓炎w及相關的并發(fā)癥等。
[0015] 本發(fā)明還提供用于預防哺乳動物中由西巧羅熱病毒引起的疾病的方法，所述方法 包括給所述哺乳動物施用有效量的包含本發(fā)明的表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新 城疫病毒LaSota疫苗株rLa-WNV-PrM/E的疫苗。
[0016] 本發(fā)明所述的表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/E還可W與其他疫苗株進行聯(lián)合免疫。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明提供下述實施方案：
[001引 1. 一種表達西巧羅熱病毒（West Nile virus)PrM/E蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株，其中所述PrM/E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0019] 2.根據第1項所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名為rLa-WNV-PrM/E， 保藏號為 CGMCC No. 10199。
[0020] 3. -種用于預防哺乳動物中由西巧羅熱病毒引起的疾病的疫苗，其包含有效量 的第1項或第2項所述的表達西巧羅熱病毒PrM/E蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株 rLa-WNV-PrM/Eo
[002U 4.根據第3項所述的疫化其中所述哺乳動物選白人、馬、狗、綿羊、羊駝、小鼠或 大鼠。
[0022] 5.根據第4項所述的疫苗，其中所述哺乳動物為人。
[0023] 6.根據第3項所述的疫苗，其中由所述西巧羅熱病毒引起的疾病選自由西巧羅熱 病毒引起的高熱、皮疹、頭痛、肌肉酸疼、腦炎、腦脊髓炎或相關的并發(fā)癥。
[0024] 7.第1項或第2項所述的表達