專利名稱：：聯(lián)苯化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和藥物治療學(xué)領(lǐng)域，具體涉及聯(lián)苯化合物及其制備方法和用途。糖尿病(diabetesmellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水、和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要共同標(biāo)志，久病可引起多個系統(tǒng)損害，病情嚴(yán)重和應(yīng)激時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。在糖尿病人群中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴(yán)重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，MD匿)。糖尿病中90%以上是11型糖尿病。WH0預(yù)計，由于人口老齡化、肥胖、不健康的飲食以及缺乏運(yùn)動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。I型糖尿病病人由于第6對染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學(xué)毒性物質(zhì)剌激的反應(yīng)異常，直接或間接通過自身免疫反應(yīng)引起胰島P細(xì)胞破壞，以致胰島素不足。臨床特點(diǎn)是起病急，多食、多尿、多飲、體重減輕等癥狀較明顯，有發(fā)生酮癥酸中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。II型糖尿病也有很強(qiáng)的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制多樣而復(fù)雜，各病人間存在較大差異。總的來說可概括為胰島素分泌的相對不足和胰島素抵抗。對II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的系列研究證實(shí)，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。在研究脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，設(shè)計開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點(diǎn)，也是其主要方向之一。n型糖尿病的特征是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵抗。雖然其具體機(jī)制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導(dǎo)通路中的減弱甚至阻斷已被證實(shí)是直接因素。胰島素通過與其受體胞外a亞單位結(jié)合激活受體胞內(nèi)13亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，胰島素受體酪氨酸激酶再通過磷酸化其底物將信號傳遞下去。隨著對細(xì)胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認(rèn)識的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物1(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、SHC等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基去磷酸化，從而負(fù)調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。
背景技術(shù)：
：因此，通過尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強(qiáng)和延長胰島素信號，成為越來越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。PTPases家族包括一系列跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達(dá)，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP1、SHPTP2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能作用于胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)，影響正常胰島素功能。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP2和PTP1B。PTP1B是最早被純化和確定生物學(xué)特性的PTPase，全長大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蛛卵母細(xì)胞中，將減少胰島素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達(dá)；用滲透休克的方一法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC7肝細(xì)胞經(jīng)胰島素剌激時DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實(shí)驗(yàn)中也對IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細(xì)胞中PTP1B的高表達(dá)能明顯降低配體誘導(dǎo)的IR磷酸化水平；用腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細(xì)胞L6肌細(xì)胞和Fao細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復(fù)合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導(dǎo)的糖原合成也被抑制(EgawaK.etal.J.Biol.Chem.2001，276(13)，10207-10211)。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞中高表達(dá)PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導(dǎo)的IR、IRS1和PI3激酶的酪氨酸磷酸化，P42和P44MAPK磷酸化水平也明顯降低，而Akt磷酸化水平和活性不受影響(VenableC.L.etal.J.Biol.Chem.2000，275(24)，18318-18326)。PTP1B的高表達(dá)對基本的、中等的及最大量胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)無影響，對轉(zhuǎn)運(yùn)的EC5。胰島素濃度無影響。這些研究證明PTP1B能夠負(fù)調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并主要作用于胰島素受體。更為重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報道，運(yùn)用同源重組的方法產(chǎn)生的PTPIB基因敲除的小鼠生長正常，有生殖力，對胰島素敏感性顯著增強(qiáng)，而且這一增強(qiáng)作用與肝臟和骨骼肌中IR及IRS-1磷酸化水平的增強(qiáng)相關(guān)(ElcheblyM.，etal.science,1999，283(5407)，1544-1548)。令人驚奇的是，PTPIB基因敲除的小鼠對食物誘導(dǎo)的體重增加和胰島素抵抗也有抵抗作用。Klaman等運(yùn)用大致相同的方法產(chǎn)生的PTPlB基因敲除的小鼠也得到同樣的結(jié)果，而且發(fā)現(xiàn)PTPIB基因敲除的小鼠之所以對食物誘導(dǎo)的體重增加有抵抗作用，是由于脂肪細(xì)胞體積的減少，而脂肪細(xì)胞的數(shù)量并不改變。PTP1B基因敲除的小鼠基本代謝水平和總體能量消耗升高(KlamanL.D.，etal.MolecularandCellularBiology,2000，20(15)，5479-5489)。這些實(shí)驗(yàn)更加有力地證明了PTP1B在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療二型糖尿病和肥胖癥的一個潛在藥物作用靶點(diǎn)。PTPIB選擇性抑制劑的研究已取得了一定的進(jìn)展，但大多局限于一些肽類或類肽化合物。雖然這些肽類抑制劑具有較強(qiáng)的抑制活性及較高的選擇性，但它們是肽類磷酸化合物的事實(shí)使其很難成為藥物候選化合物。近年來，人們始終試圖尋找分子量較小、結(jié)構(gòu)簡單、選擇性高的非肽類小分子PTPIB抑制劑。一系列非肽類非磷酸化合物類PTP1B抑制劑被報道，但現(xiàn)有化合物存在選擇性及生物利用度問題，迄今還無一以PTPIB為藥物靶點(diǎn)的藥物上市，尋找新的非肽類高效、高選擇性PTPIB小分子抑制劑仍然是近年來生物學(xué)及創(chuàng)新藥物研究的熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一系列對蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B有抑制作用的聯(lián)苯化合物。本發(fā)明的另一目的是提供所述化合物的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供所述化合物作為蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制劑的用途，即其在制備用于治療糖尿病或肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的聯(lián)苯化合物具有如下結(jié)構(gòu)通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中&為H、CrC4直鏈或支鏈烷基、羥基、甲氧基、甲硫基、三氟甲基、苯基或鹵素；R2為H、羥基、甲氧基、乙氧基、Q-Q直鏈或支鏈烷基、硝基或鹵素；R3為H、CrC4直鏈或支鏈烷基、三氟甲基或鹵素；a:A與對溴苯甲醛反應(yīng)得B，反應(yīng)溫度為5(TC，溶劑為甲醇；b:B在醋酸鈀為催化劑，碳酸鉀、碳酸銫或磷酸鉀為堿，封管條件下與芳基硼酸反應(yīng)得C，反應(yīng)溫度為709(TC，溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或二甲亞砜；c:C在醋酸鈉或醋酸鉀為堿的條件下與2，4-噻唑二酮、2-硫代-4-噻唑酮、2，4，三酮或2-硫代-4，6-噻唑二酮在11013(TC反應(yīng)得D，溶劑為醋酸。o6-嘧啶在本發(fā)明一優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述的結(jié)構(gòu)通式中X為具體而言，上述化合物可以通過如下路線1合成路線1:PEG—NH213PEG—NPEG—NR1'v1d如路線1所示，所用的原料la可參考文獻(xiàn)方法(Janda，K.D.Org.Lett.2000，2，477-480)制得。a:la與對溴苯甲醛反應(yīng)得lb，反應(yīng)溫度為5(TC，溶劑為甲醇；b:lb在醋酸鈀為催化劑，碳酸鉀、碳酸銫或磷酸鉀為堿，封管條件下與芳基硼酸反應(yīng)得lc，反應(yīng)溫度為709(TC，溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或二甲亞砜；c:lc在醋酸鈉或醋酸鉀為堿的條件下與2，4-噻唑二酮反應(yīng)得ld，反應(yīng)溫度為110130。C，溶劑為醋酸。o力A在本發(fā)明的又一優(yōu)選實(shí)施方案中，上述的結(jié)構(gòu)通式中X為、上述化合物可以通過如下路線2合成路線2:2d如路線2所示，所用的原料2a可參考文獻(xiàn)方法(Janda，K.D.Org.Lett.2000，2，477-480)制得。a:2a與對溴苯甲醛反應(yīng)得2b，反應(yīng)溫度為5(TC，溶劑為甲醇；b:2b在醋酸鈀為催化劑，碳酸鉀、碳酸銫或磷酸鉀為堿，封管條件下與芳基硼酸反應(yīng)得2c，反應(yīng)溫度為709(TC，溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或二甲亞砜；c:2c在醋酸鈉或醋酸鉀為堿的條件下與2-硫代-4-噻唑酮(羅丹寧)反應(yīng)得2d，反應(yīng)溫度為11013(TC，溶劑為醋酸。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實(shí)施方案中，上述的結(jié)構(gòu)通式中X為o上述化合物可以通過如下路線3合成路線3:3d如路線3所示，所用的原料3a可參考文獻(xiàn)方法(Janda，K.D.Org.Lett.2000，2，477-480)制得。a:3a與對溴苯甲醛反應(yīng)得3b，反應(yīng)溫度為5(TC，溶劑為甲醇；b:3b在醋酸鈀為催化劑，碳酸鉀、碳酸銫或磷酸鉀為堿，封管條件下與芳基硼酸反應(yīng)得3c，反應(yīng)溫度為709(TC，溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或二甲亞砜；8c:3c在醋酸鈉或醋酸鉀為堿的條件下與2，4，6-嘧啶三酮反應(yīng)得3d，反應(yīng)溫度為110130。C，溶劑為醋酸。在本發(fā)明的再一優(yōu)選實(shí)施方案中，上述的結(jié)構(gòu)通式中X為o上述化合物可以通過如下路線4合成路線4:如路線4所示，所用的原料4a可參考文獻(xiàn)方法(Janda，K.D.Org.Lett.2000，2，477-480)制得。a:4a與對溴苯甲醛反應(yīng)得4b，反應(yīng)溫度為5(TC，溶劑為甲醇；b:4b在醋酸鈀為催化劑，碳酸鉀、碳酸銫或磷酸鉀為堿，封管條件下與芳基硼酸反應(yīng)得4c，反應(yīng)溫度為709(TC，溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或二甲亞砜；c:4c在醋酸鈉或醋酸鉀為堿的條件下與2-硫代-4，6_嘧啶二酮反應(yīng)得4d，反應(yīng)溫度為11013(TC，溶劑為醋酸。有益效果本發(fā)明針對PTP1B設(shè)計了一類結(jié)構(gòu)新穎的靶向化合物庫；并以PEG為載體，苯胺為無痕連接分子應(yīng)用于可溶性樹脂PEG為載體的組合化學(xué)方法對該化合物庫進(jìn)行了合成。其中，部分化合物對PTP1B具有明顯的抑制活性，IC5。小于10—6M。具體實(shí)施例方式制備實(shí)施例實(shí)施例1:5-(4-苯基苯亞甲基)-2，4_噻唑二酮(化合物1)p向溶解在100ml二氯甲烷中的10克(2.5mmol)PEG4000滴加1.3ml(15mmol)甲磺酰氯。反應(yīng)液在室溫下攪拌過夜，然后蒸干溶劑用少量二氯甲烷重新溶解粗產(chǎn)品并且在劇烈攪拌下滴入乙醚溶劑中。過濾收集析出的沉淀，用乙醚洗滌，得到白色粉末狀固體，收率100%。'HNMR(300MHz,CDC13):S4.38(m，2H)，3.40—3.87(bm，PEG)，3.08(s，3H)將得到的白色粉末，1.04g(7.5mmol)K2C03及1.04g(7.5mmol)4-硝基苯酚溶解在100ml丙酮中，加熱回流12小時。濾除不溶物，將濾液中的溶劑蒸干，粗產(chǎn)品用少量二氯甲烷重新溶解并在劇烈攪拌下滴入乙醚溶劑中。過濾收集析出的沉淀，用乙醚，異丙醇洗滌，得到亮黃色粉末狀固體，99%。丄HNMR(300MHz，CDC13):S8.00(d，J=9.5Hz，2H)，6.61(d，J=9.5Hz，2H)，4.20(m，2H)，3.37-3.85(bm，PEG)FT-IR(KBr):1510cm—1將上述得到的亮黃色粉末狀固體溶于100ml甲醇中，在氬氣保護(hù)下加入lg10wt%Pd/C。對反應(yīng)容器進(jìn)行抽換氣后接上一個氫氣球。反應(yīng)容器再次抽空并充入氫氣。反應(yīng)液在室溫下反應(yīng)5小時，濾除不溶物并蒸干濾液中的溶劑，粗產(chǎn)品用少量二氯甲烷重新溶解并在劇烈攪拌下滴入乙醚溶劑中。過濾收集析出的沉淀，用乙醚洗滌，得到棕色粉末狀固體，收率96%。丄HNMR(300MHz，CDC13):S6.58(d，J=8.6Hz，2H)，6.48(d，J=8.6Hz，2H)，4.06(m，2H)，3.38—3.81(bm，PEG)FT-IR(KBr):3420，3280cm—1將8.4g(2mmo1)上述棕色粉末和1.1lg(6mmo1)4_溴苯甲醛溶解至30ml甲醇中，反應(yīng)液在5(TC加熱6小時，然后把溶劑蒸干。粗產(chǎn)品用少量二氯甲烷重新溶解并在劇烈攪拌下滴入乙醚溶劑中，過濾收集析出的沉淀，用乙醚洗滌，得到黃色粉末化合物。力畫R(300MHz，CDC13):S8.41(s，1H)，7.69-7.75(m，2H)，7.52-7.57(m，2H)，7.12-7.23(m，2H)，6.84—6.94(m，2H)，4.13(m，2H)，3.36—3.85(bm，PEG)FT-IR(KBr):1635，1005cm—1將10ml甲醇加至4.88g(lmmo1)得到的黃色粉末中，293mg苯硼酸(2.4,1)，414mg(3mmo1)碳酸鉀以及5mg(lmol%)醋酸鈀中。把反應(yīng)管密封并在8(TC下加熱8小時。冷卻至室溫，并用甲醇稀釋，然后濾除不溶物，將濾液中的溶劑蒸干，粗產(chǎn)品用少量二氯甲烷重新溶解并在劇烈攪拌下滴入乙醚溶劑中。過濾收集析出的沉淀，用乙醚和異丙醇洗滌，得到灰色粉末化合物。力畫R(300MHz，CDC13):S8.51(s，1H)，7.92-7.96(m，2H)，7.63-7.70(m，4H)，7.37-7.48(m，3H)，7.16-7.24(m，2H)，6.87-6.96(m，2H)，4.15(m，2H)，3.39-3.86(bm，PEG)IR(KBr):1630cm—1稱取244mg(0.05mmol)上述得到的灰色粉末狀化合物，12mg(0.15mmol)乙酸鈉和18mg(0.15mmol)2，4-噻唑二酮，然后加入1.5ml乙酸使其溶解。將反應(yīng)管密封并在120°C下加熱12小時。反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入8ml水中，過濾收集析出的沉淀，用少量水和甲醇洗滌，得到褐色粉末狀固體，收率86%力NMR(300MHz，d6-DMS0):S7.83(m，3H)，7.72(d，J=8.5Hz，2H)，7.66(m，2H)，7.46-7.51(m，2H)，7.38-7.42(m，1H)13CNMR(100MHz，d6_DMS0):S167.91，167.33，141.95，138.94，132.16，131.59，130.89，129.28，128.42，127.56，126.95，123.34EI-MS:m/z281(M)，210，165;HRMS:calcdforC16H11NS02,281.0510;found，281.0510;HPLCPurity(retentiontime):100%(3.66min)實(shí)施例2:5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]_2，4_噻唑二酮(化合物2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>操作過程如同實(shí)施例l，不同處在于用對氟苯硼酸代替苯硼酸得到土黃色固體，收率84%。4NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.72-7.79(m，5H)，7.62(d，J=8.1Hz，2H)，7.31-7.25(m，2H)EI-MS:m/z299(M)，228，114;HPLCPurity(retentiontime):96%(3.68min)實(shí)施例3:5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]_2，4_噻唑二酮(化合物3)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-亞甲二氧基苯硼酸代替苯硼酸得到黃色固體，收率90%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.80(s，1H)，7.77(d，J=8.2Hz，2H)，7.62(d，J=8.2Hz，2H)，7.23-7.32(m，2H)，7.01(d，J=8.0Hz，1H)，6.06(s，2H)13CNMR(100MHz，d6_DMS0):S168.03，167.42，148.32，147.71，141.71，133.17，131.68，130.87，127.25，123.05，120.94，109.02，107.22，101.51EI-MS:m/z325(M)，254，242，226，149;HRMS:calcdforC17HuNS04，325.0408;found，325.0416;HPLCPurity(retentiontime):98%(3.51min)實(shí)施例4:5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]_2，4_噻唑二酮(化合物4)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二甲氧基苯硼酸代替苯硼酸得到橙色固體，收率85%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.82(d，J=8.2Hz，2H)，7.80(s，1H)，7.63(d，J=8.2Hz，2H)，7.27-7.29(m，2H)，7.05(d，J=8.9Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.78(s，3H)13C畫R(100MHz，d6-DMSO):S168.23，167.62，149.44，149.38，142.07，131.89，131.64，131.54，130.96，127.24，122.97，119.53，112.44，110.48,55.84EI-MS:m/z341(M)，270，255;HRMS:calcdforC18H15NS04，341.0722;found，341.0728;HPLCPurity(retentiontime):100%(3.30min)WOO]實(shí)施例5:5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮(化合物5)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，5_二(三氟甲基)苯硼酸代替苯硼酸得到乳白色固體，收率85%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.37(s，2H)，8.11(s，1H)，8.02(d，J=8.7Hz，2H)，7.84(s，lH)，7.71(d，J=8.7Hz，2H)EI-MS:m/z417(M)，346，173;HPLCPurity(retentiontime):100%(4.19min)實(shí)施例6:5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]_2，4_噻唑二酮(化合物6)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3-氯-4-氟苯硼酸代替苯硼酸得到淺黃色固體，收率91%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.94—7.97(m，1H)，7.86(s，1H)，7.83(d，J=8.3Hz，2H)，7.73-7.78(m，1H)，7.67(d，J=8.3Hz，2H)，7.51(m，1H)13CNMR(100MHz，d6_DMS0):S167.75，167.29，139.23，136.65，132.57，131.19，130.66，128.81，127.53，127.48，123.71，120.33，120.21，117.44EI-MS:m/z335/333(1:3，M)，264/262(1:3);HRMS:calcdforC16H9NFSC102，325.0027;found，333.0026;HPLCPurity(retentiontime):98%(3.94min)實(shí)施例7:5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮(化合物7)操作同實(shí)施例1，不同處在于用4-乙基苯硼酸代替苯硼酸得到白色固體，收率82%。丄HNMR(300MHz，d6_DMS0):S7.80—7.83(m，3H)，7.63—7.67(m，4H)，7.32(d，J=7.9Hz，2H)，2.63(q，J=7.6Hz，2H)，1.19(t，J=7.6Hz，3H)EI-MS:m/z309(M)，238，223;HRMS:calcdforC18H15NS02，309.0823;found，309.0826;HPLCPurity(retentiontime):99%(4.13min)實(shí)施例8:5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮(化合物8)操作同實(shí)施例l，不同處在于用2-甲基-4-甲氧基苯硼酸代替苯硼酸得到淺褐色固體，收率83%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.82(s，1H)，7.63(d，J=8.5Hz，2H)，7.47(d，J=8.5Hz，2H)，7.16(d，J=8.4Hz，1H)，6.87(d，J=8.4Hz，1H)，6.82(s，1H)，3.76(s，3H)，2.23(s，3H)EI-MS:m/z325(M)，254，242，226;HPLCPurity(retentiontime):98%(3.72min)實(shí)施例9:5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮(化合物9)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3-羥基苯硼酸代替苯硼酸得到粉紅色粉末，收率79%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S9.65(s，1H)，7.82(s，1H)，7.77(d，J=8.5Hz，2H)，7.66(d，J=8.5Hz，2H)，7.25-7.31(m，1H)，7.14(d，J=7.9Hz，1H)，7.08(s，1H)，6.80(d，J=8.0Hz，1H)13CNMR(100MHz，d6_DMS0):S167.90，167.38，157.88，142.00，140.31，132.08，131.46，130.75，130.22，127.41，123.29，117.67115.25，113.51;HRMS:calcdforC16HUNS03，297.0459;found，297.0462EI-MS:m/z297(M)，226，113;HPLCPurity(retentiontime):98%(3.03min)實(shí)施例10:5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮(化合物10)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二氟苯硼酸代替苯硼酸得到淺褐色固體，收率81%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.86(m，1H)，7.83(d，J=8.6Hz，2H)，7.80(s，1H)，7.64(d，J=8.6Hz，2H)，7.56-7.59(m，1H)，7.47-7.53(m，1H)EI-MS:m/z317(M)，246，201，123;HRMS:calcdforC16H9NS02F2，317.0322;found,317.0317;HPLCPurity(retentiontime):100%(3.74min)實(shí)施例11:5-(4-苯基苯亞甲基)-2-硫代-4-噻唑酮(化合物11)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到褐色固體，收率93%。NMR(300MHz，d6_DMS0):S75(d，J=8.2Hz，2H)，7.74(d，J=8.2Hz，2H)，7.66-7.69(m，3H)，7.46-7.51(m，2H)，7.40(t，J=7.2Hz，1H)13CNMR(100MHz，d6_DMS0):S195.48，169.35，142.24，138.84，132.09，131.46，131.38，129.29，128.52，127.69，126.98，125.29EI-MS:m/z297(M)，210，165;HPLCPurity(retentiontime):100%(4.04min)實(shí)施例12:5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮(化合物12)操作同實(shí)施例l，不同處在于用對氟苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到褐色固體，收率83%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.77—7.85(m，4H)，7.67(m，3H)，7.32(m，2H);EI-MS:m/z315(M)，228;HPLCPurity(retentiontime):99%(4.00min)實(shí)施例13:5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]_2_硫代_4_噻唑酮(化合物13)操作同實(shí)施例1，不同處在于用3，4-亞甲二氧基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到褐色固體，收率84%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.77(d，J=8.5Hz，2H)，7.64(s，1H)，7.60(d，J=8.5Hz，2H)，7.22-7.32(m，2H)，7.OO(d，J=8.3Hz，1H)，6.07(s，2H)EI-MS:m/z341(M)，254;HRMS:calcdforC17H11NS203，341.0181;found，341.0170;HPLCPurity(retentiontime):96%(3.89min)實(shí)施例14:5-[4-(3，4_二甲氧基苯基)苯亞甲基]_2_硫代_4_噻唑酮(化合物14)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二甲氧基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到橙色固體，收率83%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.83(d，J=8.5Hz，2H)，7.66(s，1H)，7.62(d，J=8.5Hz，2H)，7.29(m，2H)，7.04(d，J=9.1Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.79(s，3H)EI-MS:m/z357(M)，270，255;HPLCPurity(retentiontime):97%(3.64min)實(shí)施例15:5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮(化合物15)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，5-二(三氟甲基)苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到黃色固體，收率81%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.40(s，2H)，8.13(s，1H)，8.05(d，J=8.7Hz，2H)，7.73(m，3H)EI-MS:m/z433(M)，346;HPLCPurity(retentiontime):99%(4.48min)實(shí)施例16:5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮(化合物16)15操作同實(shí)施例1，不同處在于用3-氯-4-氟苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到黃色固體，收率87%。4腿(300MHz，d6_DMS0):S7.96-7.99(m，1H)，7.87(d，J=8.3Hz，2H)，7.74-7.79(m，1H)，7.67(m，3H)，7.52(m，1H)EI-MS:m/z351/349(1:3，M)，264/262(1:3);HRMS:calcdforC16H9NFClS20，348.9798;found，348.9788;HPLCPurity(retentiontime):91%(4.29min)實(shí)施例17:5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮(化合物17)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>操作同實(shí)施例1，不同處在于用4-乙基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到黃色固體，收率80%。NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.80(d，J=8.6Hz，2H)，7.62-7.66(m，5H)，7.30(d，J=7.9Hz，2H)，2.63(q，J=7.7Hz，2H)，1.19(t，J=7.7Hz，3H)EI-MS:m/z325(M)，238，223;HRMS:calcdforC18H15NS20,325.0595;found，325.0579;HPLCPurity(retentiontime):95%(4.48min)實(shí)施例18:5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮(化合物18)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用2-甲基-4_甲氧基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到金黃色固體，收率88%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.70(s，1H)，7.65(d，J=8.6Hz，2H)，7.50(d，J=8.6Hz，2H)，7.18(d，J=8.6Hz，1H)，6.88(d，J=8.6Hz，1H)，6.83(s，1H)，3.77(s，3H)，2.25(s，3H)EI-MS:m/z341(M)，254;HPLCPurity(retentiontime):97%(4.05min)實(shí)施例19:5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮(化合物19)操作同實(shí)施例1，不同處在于用3-羥基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到褐色固體，收率84%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S9.63(s，1H)，7.78(d，J=8.4Hz，2H)，7.67(m，3H)，7.28(m，1H)，7.15(d，J=7.9Hz，1H)，7.08(s，1H)，6.82(m，1H)EI-MS:m/z313(M)，226;HRMS:calcdforC16H11NS202,313.0231;found，313.0238;HPLCPurity(retentiontime):93%(3.30min)實(shí)施例20:5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]_2_硫代_4_噻唑酮(化合物20)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二氟苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4-噻唑酮代替2，4-噻唑二酮得到褐色固體，收率84%。4NMR(300MHz，d6_DMS0):S7.91(m，1H)，7.87(m，2H)，7.66-7.68(m，3H)，7.61-7.59(m，1H)，7.50-7.56(m，1H)EI-MS:m/z333(M)，246，201;HPLCPurity(retentiontime):98%(4.05min)實(shí)施例21:5-(4-苯基苯亞甲基)-2，4，6-嘧啶三酮(化合物21)操作同實(shí)施例l，不同處在于用2，4，6-嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到淺綠色固體，收率92%。NMR(300MHz，d6-DMS0):S8.31(s，1H)，8.24(d，J=8.7Hz，2H)，7.77-7.82(m，4H)，7.48-7.53(m，2H)，7.42(t，J=7.3Hz，1H)13CNMR(100MHz，d6-DMS0):S163.45，161.70，154.44，150.09，143.86，138.92，134.39，131.75，129.23，128.58，127.00，126.27，118.73EI-MS:m/z292(M)，248，215;HRMS:calcdforC17H12N203，292.0848;found，292.0840;HPLCPurity(retentiontime):100%(3.Olmin)實(shí)施例22:5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮(化合物22)17操作同實(shí)施例1，不同處在于用對氟苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6_嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到乳白色固體，收率89%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.31(s，1H)，8.23(d，J=8.lHz，2H)，7.77-7.86(m，4H)，7.33(m，2H)EI-MS:m/z310(M)，266，215;HPLCPurity(retentiontime):100%(3.Olmin)實(shí)施例23:5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮(化合物23)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-亞甲二氧基苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6-嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到黃色固體，收率85%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.29(s，1H)，8.22(d，J=8.4Hz，2H)，7.75(d，J=8.4Hz，2H)，7.39(s，1H)，7.31(d，J=8.1Hz，1H)，7.03(d，J=8.1Hz，1H)，6.08(s，2H)EI-MS:m/z336(M)，292，215;HPLCPurity(retentiontime):100%(2.90min)實(shí)施例24:5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]_2，4，6_嘧啶三酮(化合物24)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二甲氧基苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6_嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到橙色固體，收率86%。力NMR(300MHz，d6-DMS0):S8.30(s，1H)，8.26(d，J=8.5Hz，2H)，7.80(d，J=8.5Hz，2H)，7.34-7.36(m，2H)，7.06(d，J=8.8Hz，1H)，3.86(s，3H)，3.80(s，3H)EI-MS:m/z352(M)，309,255;HPLCPurity(retentiontime):97%(2.72min)實(shí)施例25:5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]_2，4，6-嘧啶三酮(化合物25)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，5-二(三氟甲基)苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6-嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到乳白色固體，收率88%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.45(s，2H)，8.33(s，1H)，8.22(m，3H)，8.00(d，J=8.6Hz，2H)EI-MS:m/z428(M)，384，215;HPLCPurity(retentiontime):96%(3.56min)實(shí)施例26:5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]-2，4，6_嘧啶三酮(化合物26)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3-氯-4-氟苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6-嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到淺黃色固體，收率90%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.31(s，1H)，8.21(d，J=8.5Hz，2H)，8.03(m，1H)，7.81-7.85(m，3H)，7.54(m，1H)EI-MS:m/z346/344(1:3，M)，302/300(1:3)，215;HPLCPurity(retentiontime):97%(3.22min)實(shí)施例27:5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮(化合物27)操作同實(shí)施例l，不同處在于用4-乙基苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6_嘧啶三酮代替2，4_噻唑二酮得到白色固體，收率85%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.30(s，1H)，8.24(d，J=8.5Hz，2H)，7.78(d，J=8.5Hz，2H)，7.70(d，J=8.2Hz，2H)，7.34(d，J=8.2Hz，2H)，2.65(q，J=7.5Hz，2H)，1.21(t，J=7.5Hz，3H)EI-MS:m/z320(M)，276，215;HPLCPurity(retentiontime):100%(3.37min)實(shí)施例28:5-[4-(2-甲基_4_甲氧苯基)苯亞甲基]_2，4，6_嘧啶三酮(化合物28)操作同實(shí)施例l，不同處在于用2-甲基-4_甲氧基苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6-嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到白色固體，收率87%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.31(s，1H)，8.21(d，J=8.5Hz，2H)，7.43(d，J=8.5Hz，2H)，7.20(d，J=8.1Hz，1H)，6.89(d，J=8.1Hz，1H)，6.85(s，1H)，3.78(s，3H)，2.27(s，3H)EI-MS:m/z336(M)，292，215;HPLCPurity(retentiontime):97%(3.04min)實(shí)施例29:5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮(化合物29)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3-羥基苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6-嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到金黃色固體，收率80%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S9.63(s，1H)，8.30(s，1H)，8.22(d，J=8.5Hz，2H)，7.72(d，J=8.5Hz，2H)，7.29(m，1H)，7.18(d，J=7.7Hz，lH)，7.11(s，1H)，6.83(d，J=8.4Hz，1H)EI-MS:m/z308(M)，264，215;HPLCPurity(retentiontime):96%(2.52min)實(shí)施例30:5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮(化合物30)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二氟苯硼酸代替苯硼酸，2，4，6_嘧啶三酮代替2，4-噻唑二酮得到黃色固體，收率91%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.30(s，1H)，8.21(d，J=8.6Hz，2H)，7.89-7.96(m，1H)，7.82(d，J=8.6Hz，2H)，7.54-7.60(m，1H)，7.47-7.51(m，1H)EI-MS:m/z328(M)，284，215;HPLCPurity(retentiontime):92%(3.07min)實(shí)施例31:5-(4-苯基苯亞甲基)-2-硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物31)操作同實(shí)施例1，不同處在于用2-硫代-4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到橙色固體，收率90%。力NMR(300MHz，d6-DMS0):S8.32(s，1H)，8.28(d，J=8.OHz，2H)，7.75—7.83(m，4H)，7.45-7.53(m，2H)，7.39-7.43(m，1H)13CNMR(100MHz，d6—DMS0):S178.31，161.77，159.56，155.38，144.36，138.84，134.78，131.76，129.26，128.72，127.06，126.36，118.76EI-MS:m/z308(M)，248，231;HPLCPurity(retentiontime):91%(3.27min)實(shí)施例32:5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物32)操作同實(shí)施例1，不同處在于用對氟苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到橙色固體，收率86%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.32(s，1H)，8.26(d，J=8.2Hz，2H)，7.78-7.86(m，4H)，7.34(m，2H)EI-MS:m/z326(M)，266，231;HPLCPurity(retentiontime):92%(3.27min)實(shí)施例33:5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]_2_硫代_4，6_嘧啶二酮(化合物33)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-亞甲二氧基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6_嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到深紅色固體，收率87%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.30(s，1H)，8.25(d，J=8.5Hz，2H)，7.74(d，J=8.5Hz，2H)，7.32-7.41(m，2H)，7.04(d，J=8.1Hz，1H)，6.09(s，2H)EI-MS:m/z352(M)，292，231;HPLCPurity(retentiontime):96%(3.18min)實(shí)施例34:5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物34)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二甲氧基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6_嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到淺黃色固體，收率86%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.31(s，1H)，8.28(d，J=8.5Hz，2H)，7.81(d，J=8.5Hz，2H)，7.35-7.38(m，2H)，7.06(d，J=8.7Hz，1H)，3.88(s，3H)，3.81(s，3H)EI-MS:m/z368(M)，308;HPLCPurity(retentiontime):91%(3.OOmin)實(shí)施例35:5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物35)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，5-二(三氟甲基)苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代_4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到褐色固體，收率81%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.47(s，2H)，8.36(s，1H)，8.23(m，3H)，8.01(d，J=8.6Hz，2H)EI-MS:m/z444(M)，384，215;HPLCPurity(retentiontime):93%(3.81min)實(shí)施例36:5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]-2_硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物36)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用3-氯-4-氟苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到金黃色固體，收率88%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.32(s，1H)，8.23(d，J=8.5Hz，2H)，8.04(m，1H)，7.82-7.85(m，3H)，7.54(m，1H)EI-MS:m/z362/360(1:3，M)，302/300(1:3)，231;HPLCPurity(retentiontime):93%(3.52min)實(shí)施例37:5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物37)操作同實(shí)施例l，不同處在于用4-乙基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到金黃色固體，收率83%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.32(s，1H)，8.27(d，J=8.5Hz，2H)，7.78(d，J=8.5Hz，2H)，7.71(d，J=8.3Hz，2H)，7.35(d，J=8.3Hz，2H)，2.67(q，J=7.5Hz，2H)，1.24(t，J=7.5Hz，3H)EI-MS:m/z336(M)，276，231;HPLCPurity(retentiontime):95%(3.65min)實(shí)施例38:5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]_2_硫代_4，6_嘧啶二酮(化合物38)操作同實(shí)施例l，不同處在于用2-甲基-4_甲氧基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6_嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到金黃色固體，收率80%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.33(s，1H)，8.24(d，J=8.5Hz，2H)，7.45(d，J=8.5Hz，2H)，7.21(d，J=8.2Hz，1H)，6.90(d，J=8.2Hz，1H)，6.85(s，1H)，3.79(s，3H)，2.28(s，3H)EI-MS:m/z352(M)，292，231;HPLCPurity(retentiontime):92%(3.33min)實(shí)施例39:5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]_2_硫代_4，6_嘧啶二酮(化合物39)操作同實(shí)施例l，不同處在于用3-羥基苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代-4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到深紅色固體，收率82%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S9.62(s，1H)，8.31(s，1H)，8.23(d，J=8.5Hz，2H)，7.73(d，J=8.5Hz，2H)，7.18-7.31(m，2H)，7.12(s，lH)，6.84(m，lH)EI-MS:m/z324(M)，264，231;HPLCPurity(retentiontime):94%(2.76min)實(shí)施例40:5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮(化合物40)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>操作同實(shí)施例l，不同處在于用3，4-二氟苯硼酸代替苯硼酸，2-硫代_4，6-嘧啶二酮代替2，4-噻唑二酮得到金黃色固體，收率89%。力NMR(300MHz，d6_DMS0):S8.32(s，1H)，8.24(d，J=8.5Hz，2H)，7.91—7.98(m，1H)，7.83(d，J=8.5Hz，2H)，7.55-7.61(m，1H)，7.48-7.51(m，1H)EI-MS:m/z344(M)，284，231;HPLCPurity(retentiontime):90%(3.34min)蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB(PTPIB)的獲得及活性測定方法發(fā)明人通過同源重組的方法，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到了大量高活性的人源PTPIB活性片段，進(jìn)一步研究了PTPIB的酶學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)其酶學(xué)性質(zhì)確定PTPIB篩選體系為30nMGST-PTPlB，2mMpNPP，50mMMopspH6.5，2mMDTT，ImMEDTA。以PTP的PTPs通用抑制劑Na3V04作為陽性抑制劑，檢測了Na3V04在PTP1B上的抑制活性，從而證實(shí)抑制劑篩選體系的可行性。1.目的蛋白PTP1B的表達(dá)及菌的收獲與裂解將構(gòu)建好的PTP1B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)型大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑單克隆菌落于含有終濃度100iig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C，280rpm培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)0D6。。值為0.40.6，加入ImMIPTG誘導(dǎo)，37t:，280rpm表達(dá)4小時。8000rpm離心3分鐘收獲表達(dá)細(xì)菌，用含有2mMDTT禾PlmMEDTA的PBS(140mMNaC1、2.7mMKCl、10mMNa2HP04、1.8mMKH2P04)洗滌后，加入含有1%TritonX-100的破胞液重懸菌體，冰浴條件下使用超聲波破菌。將上述含有GST融合目的蛋白的裂解液于4t:12000rpm15分鐘離心兩次，收集上清，待分離純化。2.融合蛋白GST-PTP1B的親和純化預(yù)先用含有2mMDTT和ImMEDTA的PBS，以510ml/min的流速平衡5ml的GSTrapFF層析柱，以便使目的蛋白在上樣過程中始終保持相同的溶液條件；將含有目的融合蛋白的上清液以12ml/min的流速緩慢上樣，使目的蛋白充分地結(jié)合到親合樹脂上，通過PBS將結(jié)合于親和樹脂的雜質(zhì)蛋白充分洗凈，以Bradford法檢測蛋白濃度；最后用含有2mMDTT和ImMEDTA的洗脫液(10mM還原型谷胱甘肽和50mMTris-HClpH8.0)，以12ml/min的流速將融合蛋白GST-PTP1B從親和樹脂上洗脫，取較濃蛋白混合，以備下一步脫^!.o3.GST-PTP1B重組蛋白分子篩脫鹽及鑒定上述親和層析是采用底物濃度競爭方法，以高濃度的谷胱甘肽溶液將GST融合蛋白洗脫，所以獲得的重組蛋白溶液中含有10mM還原型谷胱甘肽。分子篩純化的原理是利用大小不同的分子所經(jīng)的路徑不同，導(dǎo)致流出的時間不同，從而使得大小不同的分子得到分離，大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。采用55mlHiPr印16/10脫鹽層析柱一次可上樣9ml蛋白。GST融合蛋白上樣后，用脫鹽緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0)洗脫，以獲得去除谷胱甘肽的目的蛋白。以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。在96孔酶標(biāo)板中加入100ii1反應(yīng)體系80ii1測活緩沖液，10ill—定濃度的底物pNPP和10ill酶。放入96孔板紫外/可見分光光度計SpectraMAX340中，在3(TC，動態(tài)檢測3分鐘之內(nèi)405nm的光吸收值變化。反應(yīng)開始階段呈線性的酶動力學(xué)曲線的斜率即為酶反應(yīng)初速度(mOD/min)。4.PTP1B抑制活性測定上述純化并鑒定后的hPTPlB重組蛋白能水解底物pNPP的磷脂鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收，因此可以通過直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標(biāo)準(zhǔn)的測活體系如下10mMTris.Cl，m=7.6，10mMpNPP，2%DMSO，lOOnMhPTPlB。觀察指標(biāo)動態(tài)測定波長為410nm處的光吸收，時間為3分鐘，其動力學(xué)曲線一級反應(yīng)的斜率作為酶的活性指標(biāo)。篩選結(jié)果是當(dāng)化合物的濃度為5yg/ml時對酶活性的百分抑制率，抑制活性高于50%時，按常規(guī)篩選得出IC5。，陽性對照Na3V04的IC5。為2M。所得化合物活性如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>35<20-36一29一3730—38、。,<20-39<20-40<20-"-"表示未測ICso如表1所示，該化合物庫中的部分化合物對PTP1B具有明顯的抑制活性，對化合物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行考察，可以看出2-硫代-4-噻唑酮和2，4_噻唑二酮片段對生物活性有利，而2，4，6-嘧啶三酮與2-硫代-4，6-嘧啶二酮片段則對生物活性不利；當(dāng)苯環(huán)片段有取代基時能夠在一定程度上提高對PTP1B的抑制活性，部分化合物的IQ。小于10—6M。29權(quán)利要求具有如下結(jié)構(gòu)通式的聯(lián)苯化合物其中R1為H、C1-C4直鏈或支鏈烷基、羥基、甲氧基、甲硫基、三氟甲基、苯基或鹵素；R2為H、羥基、硝基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、甲氧基、乙氧基或鹵素；R3為H、C1-C4直鏈或支鏈烷基、三氟甲基或鹵素；R1-R2為X為F2009100448750C0000011.tif,F2009100448750C0000012.tif,F2009100448750C0000013.tif2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的聯(lián)苯化合物，其特征在于:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)苯化合物，其特征在于，X為4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)苯化合物，其特征在于，X為5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)苯化合物，其特征在于，X為為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)苯化合物，其特征在于，所述化合物為5-(4-苯基苯亞甲基)-2，4-噻唑二酮；5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(3，4_亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]-2，4-噻唑二酮；5-(4-苯基苯亞甲基)-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4-噻唑酮；5-(4-苯基苯亞甲基)-2，4，6-嘧啶三酮；5_[4-(4_氟苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮；5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]_2，4，6-嘧啶三酮；5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮；5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮；5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]_2，4，6_嘧啶三酮；5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮；5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮;5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮；5-[4-(3，4-二氟苯基)苯亞甲基]-2，4，6-嘧啶三酮；5-(4-苯基苯亞甲基)-2-硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-(4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-(3，4-亞甲二氧基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-(3，4-二甲氧基苯基)苯亞甲基]_2_硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-[3，5-二(三氟甲基)苯基]苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-(3-氯-4-氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代_4，6_嘧啶二酮；5-[4-(4-乙基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-(2-甲基-4-甲氧苯基)苯亞甲基]_2_硫代-4，6-嘧啶二酮；5-[4-(3-羥基苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮；或5_[4-(3，4_二氟苯基)苯亞甲基]-2-硫代-4，6-嘧啶二酮。7.—種制備權(quán)利要求1所述的聯(lián)苯化合物的方法，其特征在于包括以下步驟PEG柳:ABCa:A與對溴苯甲醛反應(yīng)得B，反應(yīng)溫度為5(TC，溶劑為甲醇；b:B在醋酸鈀為催化劑，碳酸鉀、碳酸銫或磷酸鉀為堿，封管條件下與芳基硼酸反應(yīng)得C，反應(yīng)溫度為709(TC，溶劑為甲醇、乙醇、乙腈或二甲亞砜；c:C在醋酸鈉或醋酸鉀為堿的條件下與2，4-噻唑二酮、2-硫代-4-噻唑酮、2，4，6-嘧啶三酮或2-硫代-4，6-嘧啶二酮在11013(TC反應(yīng)得D，溶劑為醋酸。8.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)苯化合物在制備治療糖尿病或肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)式如下的聯(lián)苯化合物及其制備方法和用途。通過生物活性測試證明，該化合物能夠明顯地抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B的活性。因此，本發(fā)明的聯(lián)苯化合物可用作蛋白酪氨酸磷酸酯酶的抑制劑而用于預(yù)防或?qū)ΠY治療糖尿病或肥胖癥。文檔編號C07D239/60GK101768132SQ20091004487公開日2010年7月7日申請日期2009年1月5日優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日發(fā)明者劉章,張薇,李佳,李靜雅,沈競康,馬蘭萍申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所