專利名稱：雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種雷莫拉寧發(fā)酵液的預(yù)處理的方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素在抗感染治療上的大量應(yīng)用，臨床耐藥問題日益突出。雷莫拉寧 (RAM0PLANIN)作為一類新型廣譜抗革蘭氏陽(yáng)性菌抗生素，目前主要是作為外用和治療胃腸 道粘膜表面感染性疾病藥物進(jìn)行研究開發(fā)。雷莫拉寧由一種游動(dòng)放線菌屬菌種(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)保存，代碼ATCC33076)制得。 其傳統(tǒng)的預(yù)處理方法是將ATCC33076發(fā)酵菌株發(fā)酵出來的發(fā)酵液先調(diào)pH到3. 5，離心得 到菌絲體和發(fā)酵液，其中菌絲體用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，提取后真空濃縮，再用正丁醇萃取多 次，合并萃取液后再反復(fù)用石油醚對(duì)其進(jìn)行沉淀并分離出來，真空干燥得到粗品，而發(fā)酵液 用正丁醇萃取，同樣方法制得粗品。USP4328316中報(bào)道的雷莫拉寧的預(yù)處理方法是通過高速離心，使發(fā)酵液和菌絲體 分開，再分別處理發(fā)酵液和菌絲體。此法的缺點(diǎn)是必須使用價(jià)格昂貴的大型離心設(shè)備，且由 于雷莫拉寧發(fā)酵液的黏度很大，固液分離的效果不好，另外，由于必須對(duì)發(fā)酵液和菌絲體分 別處理，操作步驟繁瑣，溶劑使用量大，非常不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種步驟簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短，并同時(shí)保持高收 率的預(yù)處理雷莫拉寧發(fā)酵液的方法。本發(fā)明基于將絮凝作用應(yīng)用到雷莫拉寧發(fā)酵液的預(yù)處理中，通過篩選各種絮凝 齊U、摸索其加入發(fā)酵液的比例而完成。絮凝作用的原理是在絮凝劑存在的條件下，在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使發(fā) 酵液中的膠粒物質(zhì)形成粗大的絮凝團(tuán)，從而使得發(fā)酵液易于過濾。對(duì)于雷莫拉寧發(fā)酵液，由 于其菌絲形態(tài)的特異性，粘度非常大，無論是抽濾還是離心都難以取得很好的效果，加入本 發(fā)明的絮凝劑后，由于產(chǎn)生的架橋作用，使得發(fā)酵液中粘度較大的蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)聚集成 塊，因而能夠大大增加了過濾的速度。本發(fā)明通過篩選各種絮凝劑，找到兩種絮凝效果非常好的絮凝劑，并優(yōu)選出最佳 的添加量。加入本發(fā)明絮凝劑后，原來非常粘稠的發(fā)酵液變得非常的容易過濾，直接通過布 氏漏斗即可快速的將固液分離開，從而避免了大型離心機(jī)處理過程煩瑣，離心時(shí)間長(zhǎng)的問題。另外，本發(fā)明通過對(duì)發(fā)酵液pH的考察，發(fā)現(xiàn)將發(fā)酵液的pH調(diào)到8 10后，再加入絮凝劑，過濾后雷莫拉寧將完全在菌絲體中，濾液中幾乎沒有單位。對(duì)于菌絲體可以用有機(jī) 溶劑將雷莫拉寧提取出來。和已有專利相比，此工藝免去了從菌絲體和濾液分別提取雷莫 拉寧，只需對(duì)菌絲體進(jìn)行處理，從而簡(jiǎn)化了工藝。因此，本發(fā)明提供一種雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法，該方法包括如下步驟
a)將雷莫拉寧發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到8-10 ；b)向發(fā)酵液中加入絮凝劑；C)過濾；
d)提取濾餅中的雷莫拉寧。其中，a)步驟中雷莫拉寧發(fā)酵液的pH可用NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)；b)步驟中所述的 絮凝劑優(yōu)選為亞鐵氰化鉀和硫酸鋅，所述亞鐵氰化鉀和硫酸鋅加入的量?jī)?yōu)選為所述雷莫拉 寧發(fā)酵液體積的0. 2 1%，這里絮凝劑的加入量最少要0. 2%，但并不限定最大用量，選擇
為上限是出于成本的考慮，已經(jīng)完全能夠很好的過濾雷莫拉寧發(fā)酵液；c)步驟中的 過濾方式優(yōu)選為抽濾；d)步驟中濾餅中的雷莫拉寧可用一定體積的有機(jī)溶劑例如甲醇、乙 醇或丙酮等提取。本發(fā)明的雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法具體根據(jù)如下步驟進(jìn)行操作1)將雷莫拉寧的發(fā)酵液放罐后用NaOH溶液調(diào)其pH到8-10，攪拌后靜置Ih左右；2)向發(fā)酵液中加入絮凝劑(優(yōu)選亞鐵氰化鉀和硫酸鋅)，加入的量可以為0. 2 1% (體積百分比)，攪拌后靜置0. 5h ；3)用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間視發(fā)酵液的體積而定，對(duì)于幾升的發(fā)酵液來說， 二十分鐘內(nèi)完全能夠抽濾好；4)抽濾完后棄去濾出液，將濾餅用一定體積的有機(jī)溶劑(優(yōu)選甲醇、乙醇、丙酮 等)將其提取出來。本發(fā)明的雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法具有步驟簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短以及收率高的 優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的雷莫拉寧發(fā)酵液由以下方法制得將保藏號(hào)為ATCC33076的發(fā)酵菌 株進(jìn)行發(fā)酵，其中斜面培養(yǎng)條件斜面及平板培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0，酪蛋白10.0，可溶淀粉 24. 0，葡萄糖1.0，瓊脂22.0，滅菌前pH 7. 0，121°C滅菌30min。菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于 30°C培養(yǎng)5-9天。種子培養(yǎng)條件二級(jí)發(fā)酵種子培養(yǎng)條件為牛肉膏3. 0，酪蛋白5. 0，酵母粉5. 0，燕 麥粉30.0，碳酸鈣4.0，自來水配制，用2mol/L的NaOH(或者HCl)調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌 30min。種子培養(yǎng)基裝量為100ml/750ml，于28°C，250rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)條件為淀粉50.0，葡萄糖20.0，黃豆粉30.0，碳酸鈣10.0，L-Leu5.0，自 來水配制，用2mol/L的NaOH(或者HCl)調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌30min。接種量6%，裝量 100ml/750ml，于25°C，旋轉(zhuǎn)式搖床250rpm培養(yǎng)5天。本發(fā)明所用絮凝劑1亞鐵氰化鉀國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純2硫酸鋅(七水合硫酸鋅)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純實(shí)施例1 3考察加入絮凝劑的比例對(duì)本發(fā)明方法的影響
實(shí)施例1雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為1062ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到
8.5，攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 2%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽率時(shí)間約為18min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中沒有 單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為882ug/ml。
實(shí)施例2雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為967ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到8. 5， 攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各1%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用布 氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為12min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中沒有單位， 棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為891ug/ml。實(shí)施例31雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為1096ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到
9.0，攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中幾乎 沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為877ug/ml。實(shí)施例4 6考察pH值范圍對(duì)本發(fā)明方法的影響實(shí)施例4雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為957ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到8. 0， 攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用 布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中有少量的 雷莫拉寧，單位為12ug/ml，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位 為 882ug/ml。實(shí)施例5雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為855ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到
10.0，攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜 置后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中幾 乎沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為796ug/ml。實(shí)施例6雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到9. 0， 攪拌后靜lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用布 氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中幾乎沒有單 位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為844ug/ml。實(shí)施例7 8考察不同溶劑對(duì)本發(fā)明方法的影響實(shí)施例71雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為1120ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到 9. 0，攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中幾乎 沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的乙醇將其提取出來，測(cè)其單位為921ug/ml。實(shí)施例8
雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為1120ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到 9. 0，攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置 后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中幾乎 沒有單位，棄去濾出液，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為1033ug/ml。對(duì)比例1雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為1096ug/ml，放罐后，用鹽酸溶液調(diào)其pH到3. 5， 攪拌后靜置lh，用BECKMAN離心機(jī)高速離心，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心0. 5h后，將上清液 用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，其單位為233ug/ml，將固體收集好用1500ml甲醇提取出來，測(cè)其單位為 564ug/ml。由對(duì)比例1可以看出，雷莫拉寧在上清液和沉淀中都有單位，必須分別進(jìn)行進(jìn)一 步的處理，因此增加了分離的步驟。
對(duì)比例2雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為896ug/ml，放罐后，用鹽酸溶液調(diào)其pH到4. 0， 攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀和硫酸鋅各0. 5%，攪拌后靜置0. 5h，靜置后用 布氏漏斗進(jìn)行抽濾，抽濾時(shí)間約為15min，抽濾完后用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)濾液中雷莫拉寧 單位為426ug/ml，將濾餅用1500ml的甲醇將其提取出來，測(cè)其單位為451ug/ml。由對(duì)比例2可以看出，濾液和菌絲體中都含有雷莫拉寧，必須分別進(jìn)行進(jìn)一步的 處理，因此增加了分離的步驟。對(duì)比例3雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到9. 0， 攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入亞鐵氰化鉀1%，攪拌后靜置0. 5h，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液仍然呈膠 狀，用布氏漏斗過濾時(shí)難以過濾，2h后濾液收集約400ml。對(duì)比例4雷莫拉寧的發(fā)酵液3000ml，單位為952ug/ml，放罐后，用NaOH溶液調(diào)其pH到9. 0， 攪拌后靜置lh，向發(fā)酵液中加入硫酸鋅1%，攪拌后靜置0. 5h，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液呈膠狀，用布氏 漏斗過濾時(shí)難以過濾，2h后濾液收集約350ml。由對(duì)比例3和4可以看出，只加一種絮凝劑獲得的分離效果不佳。
權(quán)利要求
雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法，其特征在于，包括如下步驟a)將雷莫拉寧發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到8-10；b)向發(fā)酵液中加入絮凝劑；c)過濾；d)提取濾餅中的雷莫拉寧。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用NaOH溶液調(diào)節(jié)雷莫拉寧發(fā)酵液的pH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，b)步驟中所述的絮凝劑為亞鐵氰化鉀和 硫酸鋅。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述亞鐵氰化鉀和硫酸鋅加入的量為所 述雷莫拉寧發(fā)酵液體積的0. 2 1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，c)步驟中所述的過濾為抽濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用有機(jī)溶劑提取濾餅中的雷莫拉寧。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇或丙酮。
全文摘要
本發(fā)明提供一種雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法，其特征在于，包括如下步驟a)將雷莫拉寧發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)到8-10；b)向發(fā)酵液中加入絮凝劑；c)過濾；d)提取濾餅中的雷莫拉寧。本發(fā)明的雷莫拉寧發(fā)酵液預(yù)處理的方法具有步驟簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短以及收率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K9/00GK101838316SQ20091004772
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者盧亮, 尹培軍, 張宏宇, 李繼安 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院