專利名稱：一種黃芪糖蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種黃芪提取物，特別涉及一種黃芪糖蛋白及其制備方法和用途。
背景技術：
糖蛋白(glycoprotein)是一類由糖類與多肽或蛋白質以共價鍵連接而形成的結 合蛋白，廣泛地存在于自然界動物植物和某些微生物中，是生物體內(nèi)重要的一類大分子。20 世紀60年代，生物化學家和化學家們對長期忽視的糖蛋白產(chǎn)生了興趣，開展了多方面的研 究。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白具有顯著的藥用功效和保健功能，能夠增強免疫調節(jié)、抑 制腫瘤、降低血糖、血脂、抗氧化、防衰老等，對于人體極具利用價值。目前已應用于臨床并 具有高效的免疫活性的藥用蛋白制劑大都是糖蛋白。近年來，植物和天然產(chǎn)物來源的糖蛋 白，在生物化學、生物工程學、臨床化學、藥學及食品等領域受到高度重視。特別是存在于植 物中的糖蛋白，在新型特種藥物及功能性食品開發(fā)方面具有廣闊的運用前景。山西道地藥材黃芪是一種常用補氣固表中藥材，能夠增強機體的免疫功能。自20 世紀70年代以來，國內(nèi)外學者對黃芪化學成分及藥理作用進行了大量的研究，從中提取分 離許多黃酮類、皂苷類、多糖等化合物，并對其藥理作用及生物活性進行了研究。但迄今為 止，尚未見到有關黃芪糖蛋白的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于公開一種黃芪糖蛋白，本發(fā)明的目的還在于公開該糖蛋白的制備 方法，本發(fā)明的目的還在于公開該糖蛋白的用途。本發(fā)明目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明黃芪糖蛋白由如下方法制備取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取200-600重量份，加水1200-2000體積份，浸 泡8-16小時，40-60°C以下浸提1-3小時，過濾；殘渣中再加水800-1600體積份，40-60°C以 下浸提1-3小時，過濾，合并兩次濾液，以2000-4000r/min速度離心20-40分鐘，合并上清
液，得粗提液；將粗提液濃縮至200-400體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和， 于2-6°C下靜置12-24小時，以2000-4000r/min速度離心20-40分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置1-3小時，以2000-4000r/min速 度離心20-40分鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋 白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖10-30分鐘，離心，傾出上清 液，除去中間層變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，純水透析24-72小時，得黃芪糖蛋白溶液，經(jīng)冷凍干燥， 得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白(HQGP)。本發(fā)明黃芪糖蛋白優(yōu)選如下方法制備
取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取400重量份，加水1600體積份，浸泡12小 時，55-600C以下浸提2小時，過濾；殘渣中再加水1200體積份，55-60°C以下浸提2小時，過 濾，合并兩次濾液，以3000r/min速度離心30分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至300體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于 4°C下靜置12小時，以3000r/min速度離心30分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置2小時，以3000r/min速度離心 30分鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖20分鐘，離心，傾出上清液， 除去中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，在空氣恒溫振蕩器上用純水透析48小時，得黃芪糖蛋白 溶液，經(jīng)冷凍干燥，得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白(HQGP)。本發(fā)明黃芪糖蛋白優(yōu)選如下方法制備取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取300重量份，加水1900體積份，浸泡9小時， 500C以下浸提3小時，過濾；殘渣中再加水1500體積份，500C以下浸提1小時，過濾，合并兩 次濾液，以3500r/min速度離心35分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至250體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于 3°C下靜置24小時，以3500r/min速度離心35分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置1小時，以2500r/min速度離心 35分鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖25分鐘，離心，傾出上清液， 除去中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，在空氣恒溫振蕩器上用純水透析24小時，得黃芪糖蛋白 溶液，經(jīng)冷凍干燥，得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白(HQGP)。本發(fā)明黃芪糖蛋白優(yōu)選如下方法制備取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取500重量份，加水1300體積份，浸泡15小 時，45°C以下浸提1小時，過濾；殘渣中再加水900體積份，45°C以下浸提3小時，過濾，合并 兩次濾液，以2500r/min速度離心25分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至350體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于 5°C下靜置18小時，以2500r/min速度離心25分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置3小時，以3500r/min速度離心 25分鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖15分鐘，離心，傾出上清液， 除去中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，在空氣恒溫振蕩器上用純水透析72小時，得黃芪糖蛋白 溶液，經(jīng)冷凍干燥，得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白(HQGP)。其中，所述的重量份與體積份是g/ml的關系。本發(fā)明所述黃芪蛋白呈乳白色粉狀，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯 仿等有機溶劑；濃度為0. 096mg/ml的黃芪糖蛋白水溶液于23 °C下測定pH值為5.8 ；濃 度為0.08g/100ml的黃芪糖蛋白水溶液的比旋光度為-56. 38° ；紫外光譜圖的特征吸收峰為 485nm 和 280nm ；紅外光譜圖顯示于 3399. 2cm_1,2962. 6cm_1,1643. 2cm1,1546. 2cm1, 1403. 0，1246. ScnT1處有明顯吸收峰；黃芪糖蛋白中糖肽的結合方式為N-糖苷鍵；黃芪糖蛋 白的分子量為50-55kD，優(yōu)選53. 26kD。


圖1 黃芪提取物紫外光譜2 黃芪提取物紅外光譜3 提取物在DEAE-CelIulose 32層析柱上的洗脫曲線圖4 黃芪提取物經(jīng)過堿處理前后紫外光譜5:標準曲線圖6 單糖組成分析圖，圖6. 1 =HQGP樣品GC圖，圖6. 2 木糖(局部)，圖6. 3 阿 拉伯糖(局部)，圖6. 4 甘露糖(局部)，圖6. 5 半乳糖(局部)，圖6. 6 葡萄糖(局部)圖7 =SDS-PAGE電泳圖譜，1、2為HQGP樣品；3為標準蛋白。本發(fā)明所述黃芪糖蛋白(HQGP)是采用硫酸銨鹽析，Sevage法除游離蛋白質，再經(jīng) 透析和DEAE-C32陰離子交換樹脂柱層析，從黃芪水提液中分離得到的一類新的活性組分。 經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析，得其分子量約為53. 26kD。經(jīng)過實驗進一步得到該新 活性組分的理化性質，并通過小鼠脾淋巴細胞體外轉化實驗證明，本發(fā)明方法制得的具有 本發(fā)明所述理化性質的黃芪糖蛋白(HQGP)對體外培養(yǎng)正常小鼠脾淋巴細胞及免疫低下的 小鼠脾淋巴細胞的增殖均呈抑制作用，不同劑量HQGP組與空白對照組進行統(tǒng)計學比較，均 有極顯著差異，并且抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性；同時本發(fā)明黃芪糖蛋白對活化狀態(tài)下小 鼠脾細胞體外增殖具有顯著的抑制活性。由此證明，本發(fā)明黃芪糖蛋白具有顯著的免疫調節(jié)活性。下述實驗例和實施例進一步說明但不限于本發(fā)明實驗例1本發(fā)明黃芪糖蛋白的理化性質研究實驗1、實驗材料(1)原料黃芪，購自山西渾源。(2)試劑丙烯酰胺(Acrylamide)、雙丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)、三羥甲基氨基 甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250、溴酚蘭(BBI進口原 裝)；低分子量蛋白標準(LMW-SDS markerkit) (Amersham公司)；甘氨酸(Gly)、三羥甲基 甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate, AP)(均 為Amresco公司進口分裝)；DEAE-Cellulose 32 (國藥集團化學試劑有限公司)；氯化鈉、 氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銨、冰醋酸、甲醇、乙醇、正丁醇、甘油、氯仿(均為國產(chǎn)分析純)；二次 蒸餾水；透析袋(美國)。(3)儀器=AKTA Purif ier_10型生物活性分子系統(tǒng)，美國PharmaciaBiotech公司； TE612-L型電子天平，德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；VarianCary50紫外可見分光光度 計；LR4001型旋轉蒸發(fā)儀，德國HE100LPH公司；98-1-B型電子恒溫電熱套，Heto FD8真空 冷凍干燥箱(丹麥)；天津市泰斯特儀器有限公LD5-10B型低速離心機，北京醫(yī)用離心機 廠；CA-Illl型冷水循環(huán)裝置，上海愛朗儀器有限公司；SHB-88型循環(huán)水式真空泵，鄭州長 城科貿(mào)有限公司；THE-D臺式恒溫振蕩器(空氣浴)，太倉市實驗設備廠。
2、實驗方法(1)按本發(fā)明實施例1所述方法經(jīng)過分離、純化制得本發(fā)明黃芪提取物。(2)物態(tài)⑴所得黃芪提取物呈乳白色粉狀。(3)溶解性測定取(1)所得黃芪提取物少量，分別以水，甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、 氯仿等有機溶劑試驗其溶解性，結果表明該提取物呈乳白色粉狀，易溶于水，不溶于甲醇、 乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有機溶劑。(4)PH值測定將(1)所得黃芪提取物配制成濃度為0.096mg/ml的水溶液，于 23. °C測定 PH 值=5.8。(5)比旋光度測定將(1)所得黃芪提取物配置成濃度為0. 08g/100ml的水溶 液，以二次蒸餾水做空白，1.002g/100ml的葡萄糖溶液做校正測量得HQGP的比旋光度 為-56.38° 。(6)紫外、紅外光譜分析將⑴所得黃芪提取物配置成濃度為0.5mg/ml的水溶液，以水為空白，在 200nm-320nm波長范圍內(nèi)掃描得紫外光譜圖，如附圖1所示，紫外光譜圖顯示特征吸收峰為 485nm 禾口 280nmo取上述水溶液少量，采用KBr壓片法，在^ΟΟοπ^-δΟΟοπΓ1范圍內(nèi)掃描，得紅外圖 譜，如附圖2所示，吸收峰位于SSOOcn^lSOOcnT1之間，表明本發(fā)明提取物為糖類化合物， 3399. 2,2962. 6，1643. 2，1546. 2，1403. 0，1246. 5cm_l 處有明顯吸收峰，進一步證明該樣品 為糖蛋白。其中3399. 2cm-1左右為多糖羥基伸縮振動吸收峰，2962. ecnT1左右為糖C-H伸 縮振動吸收峰，1403cm"1為多糖C-O振動吸收峰，1246. ScnT1為吡喃糖環(huán)醚鍵C-O-C的吸收 峰，1643. 2CHT1和1546. 2cm"1處為酰胺基的N-H振動吸收峰。(7)生物活性分子系統(tǒng)分析取(1)所得的黃芪提取物，經(jīng)DEAE-CelIulose 32柱層析，分別用0. 05mol/lLNaCl 和0. Imol/LNaCI為洗脫液依次洗脫，在糖蛋白特征吸收峰485nm和280nm處測定其吸光 度，以吸光度為縱坐標，得出HQGP吸光度與流出時間曲線圖。如附圖3所示，485nm處多糖 吸光峰和280nm處蛋白吸光峰出現(xiàn)的時間一致，說明該提取物具有糖蛋白的特征。(8)糖肽鍵類型的測定取(1)所得的黃芪提取物配成0. 5mg/ml的水溶液和0. 5mg/ml的NaoH(0. 2mol/L) 溶液，于45°C水浴處理2h，分別以水和0. 2mol/L的NaoH溶液為空白，在200nm-400nm范圍 內(nèi)掃描得紫外光譜圖，如附圖4所示，水溶液和堿處理樣品的紫外光譜圖在230nm-240nm間 均未出現(xiàn)吸收，及未出現(xiàn)羥基不飽和氨基酸的特征吸收，由此確定該黃芪提取物中糖肽的 結合方式為N-糖肽鍵。(9)總糖含量測定用硫酸-苯酚法顯色，以0. 02mg/ml、0. 04mg/ml、0. 06mg/ml、0. 08mg/ml、0. IOmg/ ml的葡萄糖溶液做標準在475nm處測定，得標準曲線為Abs = 5. 22884*C+0. 23032 ；r = 0. 98042 ；將(1)所得黃芪提取物配制成0. 5mg/ml水溶液，在同等條件下測定吸光度，計算 得總糖含量為6.0%，見附圖5。(10)單糖組成分析取木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸各4. 6mg于6支安瓿瓶中，各加2moL/L的F3CC00H2mL后封管，120°C水解3h，濾去水解液中的殘渣，蒸干后用ImL水洗 一次，蒸干水分，各加入0. 13mL無水吡啶和4mg鹽酸羥胺，于90°C水浴30min，冷卻后各加 0. 2mL無水乙酸酐，于90°C乙?；?0min，濃縮，進行GC分析。取糖混合樣4. 6mg (含上述六 種糖各約0. 8mg)和4. 6mg的該黃芪提取物樣品同上法制得供試品。GC 分析條件19091J-433HP-5 毛細管柱(30m*0. 25mm*0. 25um)；升溫程序為 80°C始以8. 0°C /min升至160°C并保持2min，以5. 0°C /min升至200°C并保持3min，再 以2. 0° c/min升至230°C并保持2. Omin ；FID檢測器，N2為載氣，流速為0. 6mL/s，分流為 10mL/mino如圖6所示，該提取物單糖組成主要含有葡萄糖和阿拉伯糖等。(11)分子量測定取(1)所得黃芪提取物進行SDS-PAGE電泳，分離膠質量分數(shù)為15%，電極緩沖液 為pH = 8. 3的1. 5mol/L Tris-Gly-SDS溶液，采用考馬斯亮藍R-250染色，脫色液為7% 的冰乙酸，上樣量25yg。同時，采用LMW-SDS markerkit作為對照，溴酚藍為指示劑，得 SDS-PAGE電泳圖譜，如附圖7所示，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用考馬斯亮藍R-250染色，得 一條均一的染色帶區(qū)，表明該提取物達到電泳純。根據(jù)樣品的相對遷移率，測得其分子量約 為 53. 26kD。(12)氨基酸組成分析取(1)所得的黃芪提取物，采用氨基酸自動分析儀檢測，該 提取物的氨基酸組成如表1所示表1.黃芪提取物中氨基酸組成及含量
序號項 目g/100g序號項目g/100g1天門冬氨酸(Asp)4. 5010異亮氨酸(Ile)2. 312蘇氨酸(Thr)3. 2011亮氨酸(Leu)2. 343絲氨酸(Ser).2.3312酪氨酸(Tyr)4. 394谷氨酸(Glu)6. 4913苯丙氨酸(Phe)1. 935甘氨酸(Gly)3.8314賴氨酸(Lys)6. 506丙氨酸(Ala)1.6815組氨酸(His)2. 007胱氨酸1.4216精氨酸(Arg)1. 448纈氨酸(Val)5.9917脯氨酸(Pro)5.919蛋氨酸(Met)0. 92氨基酸總量57. 18
磷酰胺
實驗例2本發(fā)明黃芪糖蛋白的小鼠脾淋巴細胞體外轉化實驗 1、實驗材料
(1)動物8 12周齡雄性Balb/c小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所
(2)試劑本發(fā)明實施例1所得的黃芪提取物(HQGP)山西中醫(yī)學院提供；
黃芪多糖粉針劑(Astragalus polysaccharides, APS-P)美國泛華醫(yī)藥公司；環(huán) (CTX)山西普德藥業(yè)有限公司； 刀豆蛋白A、脂多糖(LPS)、四噻唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品； RPMI1640培養(yǎng)基Hyclone改良型，賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司； 小牛血清杭州四季青生物材料有限公司
(3)儀器C02培養(yǎng)箱(德國BINDER)；酶標儀(瑞士Tecan Safire2)；低溫離心機
8(日本 Sanyo)2、實驗方法(1)動物處理將10只小鼠隨機分為兩組，腹腔注射給藥。第一組為正常對照組， 注射生理鹽水，0. lml/10g體重，第二組為模型組，注射環(huán)磷酰胺，40ml/10g體重。給藥2天。(2)小鼠脾細胞制備第三天頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇浸泡3分鐘，無菌取出 脾臟，通過200目細胞篩，1500r/min離心10分鐘，棄上清，加入6ml 8. 3ml/L Tris-NH4CL, 室溫放置10分鐘裂解紅細胞后1500r/min離心10分鐘，棄上清，加入無血清RPMI1640培 養(yǎng)基洗滌2次，每次1500r/min離心10分鐘，棄上清，加入1 2ml RPMI1640培養(yǎng)基，調節(jié) 細胞懸液密度為3 X 106/ml，并用臺盼藍染色檢測細胞活力> 95 %。(3)脾淋巴細胞體外轉化的測定將制備的正常對照組脾細胞懸液加入96孔細胞 培養(yǎng)板中，每孔100μ 1，分為4組①空白對照，加入RPMI 1640培養(yǎng)基ΙΟΟμ 1 ；②刀豆蛋白 A 8 μ 1終濃度為4 μ g/ml ；③脂多糖30 μ 1終濃度為15 μ g/m ；④不同濃度的本發(fā)明實施例 1 所得的黃芪提取物(0. 5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml、10 μ g/ml、30 μ g/ml、90 μ g/ ml)?？傮w積為200 μ 1。每組設3個復孔。將制備的模型組脾細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ 1。分組及給藥劑 量同正常對照組脾細胞。每組設3個復孔。然后將細胞板放入37°C C02培養(yǎng)箱68小時，吸棄100 μ 1上清，每孔加入5mg/ml MTT 10 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，每孔加入100μ 1含0. OlN鹽酸的10% SDS，充分溶解細胞。在 Tecan Safire2全波長酶標儀上測0D570吸光值，以表示淋巴細胞轉化增殖的大小。3、統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)資料用 ±s表示，應用SPSS13. 0進行統(tǒng)計學處理，各組均數(shù)之間比較進行 one-way ANOVA 檢驗。4、實驗結果MTT結果見表2、表3。黃芪提取物對體外培養(yǎng)正常小鼠脾淋巴細胞及免疫低下的 小鼠脾淋巴細胞的增殖均呈抑制作用，不同劑量HQGP組與空白對照組進行統(tǒng)計學比較，均 有極顯著差異，并且抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性，該黃芪提取物具有顯著的免疫調節(jié)活性。表2黃芪提取物對正常小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響(n = 3，5 士s)
_ Μ_劑量(μ g/ml)_0D570nm_
空白組 一 0. 1358±0.0026 刀豆蛋白 A 組 4 0.9678±0.0397* 脂多糖組 15 0. 5898±0. 0248* _黃芪提取物 1_05_0. 1193±0. 0079*_
權利要求
一種黃芪糖蛋白(HQGP)，其特征在于該糖蛋白的分子量為50 55kD。
2.如權利要求1所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白的分子量為53.26kD。
3.如權利要求1或2所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白呈乳白色粉狀，易溶 于水，不溶于有機溶劑甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿；濃度為0. 096mg/ml的黃芪糖蛋白水 溶液于23°C下測定pH值為5. 8 ；濃度為0. 08g/100ml的黃芪糖蛋白水溶液的比旋光度 為-56. 38°。
4.如權利要求1或2所述的黃芪糖蛋白，其特征在于將該黃芪糖蛋白配置成濃度為 0. 5mg/ml的水溶液，以水為空白，在200nm-320nm波長范圍內(nèi)掃描得紫外光譜圖，顯示特征 吸收峰為485nm和280nm。
5.如權利要求1或2所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該黃芪糖蛋白配置成濃度為 0. 5mg/ml的水溶液，采用KBr壓片法，在^ΟΟαι^-δΟΟαιΓ1范圍內(nèi)掃描，得紅外圖譜，吸收 峰位于 3500cm_1-2800cm_1 之間，3399. 2,2962. 6，1643. 2，1546. 2，1403. 0，1246. 5cm_l 處 有明顯吸收峰；其中3399. 2cm-1為多糖羥基伸縮振動吸收峰，2962. θ^1糖C-H伸縮振動 吸收峰，1403cm"1為多糖C-O振動吸收峰，1246. 5cm"1為吡喃糖環(huán)醚鍵C-O-C的吸收峰， 1643. 2cm"1和1546. 2cm"1處為酰胺基的N-H振動吸收峰。
6.如權利要求1或2所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白的糖肽的結合方式為 N-糖肽鍵。
7.如權利要求1或2所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白中氨基酸組成及含量為 每IOOg糖蛋白含氨基酸總量57. 18g，其中天門冬氨酸4. 50g,蘇氨酸3. 20g,絲氨酸2. 33g， 谷氨酸6. 49g，甘氨酸3. 83g，丙氨酸1. 68g，胱氨酸1. 42g，纈氨酸5. 99g，蛋氨酸0. 92g，異 亮氨酸2. 31g，亮氨酸2. 34g，酪氨酸4. 39g，苯丙氨酸1. 93g，賴氨酸6. 50g,組氨酸2. OOg, 精氨酸1.448，脯氨酸5.918。
8.如權利要求1至7任一所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白由如下方法制備而成取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取200-600重量份，加水1200-2000體積份，浸泡 8-16小時，40-60°C以下浸提1-3小時，過濾；殘渣中再加水800-1600體積份，40_60°C以下 浸提1-3小時，過濾，合并兩次濾液，以2000-4000r/min速度離心20-40分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至200-400體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于 2-6°C下靜置12-24小時，以2000-4000r/min速度離心20-40分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置1-3小時，以2000-4000r/min速度離 心20-40分鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白； 把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖10-30分鐘，離心，傾出上清液， 除去中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，純水透析24-72小時，得黃芪糖蛋白溶液，經(jīng)冷凍干燥，得乳 白色粉狀物黃芪糖蛋白。
9.如權利要求8所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白由如下方法制備而成 取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取400重量份，加水1600體積份，浸泡12小時，55-600C以下浸提2小時，過濾；殘渣中再加水1200體積份，55_60°C以下浸提2小時，過濾，合并兩次濾液，以3000r/min速度離心30分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至300體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于4°C下 靜置12小時，以3000r/min速度離心30分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置2小時，以3000r/min速度離心30分 鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖20分鐘，離心，傾出上清液，除去 中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，在空氣恒溫振蕩器上用純水透析48小時，得黃芪糖蛋白溶 液，經(jīng)冷凍干燥，得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白。
10.如權利要求8所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白由如下方法制備而成 取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取300重量份，加水1900體積份，浸泡9小時，50°C以下浸提3小時，過濾；殘渣中再加水1500體積份，500C以下浸提1小時，過濾，合并兩次濾 液，以3500r/min速度離心35分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至250體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于;TC下 靜置24小時，以3500r/min速度離心35分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置1小時，以2500r/min速度離心35分 鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖25分鐘，離心，傾出上清液，除去 中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，在空氣恒溫振蕩器上用純水透析24小時，得黃芪糖蛋白溶 液，經(jīng)冷凍干燥，得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白。
11.如權利要求8所述的黃芪糖蛋白，其特征在于該糖蛋白由如下方法制備而成 取黃芪藥材，將其粉碎成粉末狀，稱取500重量份，加水1300體積份，浸泡15小時，450C以下浸提1小時，過濾；殘渣中再加水900體積份，450C以下浸提3小時，過濾，合并兩 次濾液，以2500r/min速度離心25分鐘，合并上清液，得粗提液；將粗提液濃縮至350體積份，加入研磨成粉狀的硫酸銨，邊加邊攪拌至飽和，于5°C下 靜置18小時，以2500r/min速度離心25分鐘，棄去上清液，得沉淀；沉淀加入少量水溶解，再加入硫酸銨至飽和，靜置3小時，以3500r/min速度離心25分 鐘，棄去上清液，沉淀再用少量水溶解，重復上述步驟，得到沉淀，為粗糖蛋白；把粗糖蛋白加少量水溶解，加入sevag試劑，劇烈振搖15分鐘，離心，傾出上清液，除去 中間層黃色膠狀變性蛋白和下層氯仿，重復該步驟至中間層幾乎無變性蛋白；將上清液置于透析袋中，在空氣恒溫振蕩器上用純水透析72小時，得黃芪糖蛋白溶 液，經(jīng)冷凍干燥，得乳白色粉狀物黃芪糖蛋白。
12.如權利要求1至7任一所述的黃芪糖蛋白在制備免疫抑制藥物中的應用。
13.如權利要求12所述的應用，其特征在于其中所述的免疫抑制是指對體外培養(yǎng)正常 脾淋巴細胞及免疫低下的脾淋巴細胞的增殖均呈抑制作用。
14.如權利要求12所述的應用，其特征在于其中所述的免疫抑制是指抑制T細胞和B 細胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明公開一種黃芪糖蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明所述黃芪糖蛋白是從黃芪水提液中經(jīng)硫酸銨鹽析，Sevage法除游離蛋白質，再經(jīng)透析和DEAE-C32陰離子交換樹脂柱層析，分離純化得到的一類新的活性組分。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析，得其分子量約為53.26kD。經(jīng)過實驗進一步測定了該新活性組分的理化性質，并通過藥效實驗證明，本發(fā)明黃芪糖蛋白具有顯著的免疫抑制作用，臨床上可以作為一種經(jīng)濟有效的免疫抑制劑使用，具有廣闊的市場前景。
文檔編號C07K1/30GK101962402SQ200910089580
公開日2011年2月2日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權日2009年7月23日
發(fā)明者馮前進, 劉亞明, 宋強, 張立偉, 楊向竹, 牛欣, 王永輝, 薛慧清, 趙俊云 申請人:山西中醫(yī)學院