專利名稱：煙梗所含的木脂素類化合物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于煙草化學領域，更具體地說，本發(fā)明涉及煙梗中一種新的木脂素類化合物制備方法及其活性。
背景技術：
木脂素(lignan)又稱木脂體，是一類由二分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物。多以二聚體的形式存在，少數(shù)為三聚體和四聚體，它們存在于許多種植物中，所在部位各異，甚至在植物的分泌物、人類和動物的尿液中也有發(fā)現(xiàn)。木脂素大多呈游離狀態(tài)，也有的與糖結合成甙存在于植物中。富含木脂素類化合物的植物在民間有著相當長的醫(yī)用歷史，如小檗科鬼臼等多種值物中所含的鬼臼毒素(podophy 1 lotoxin)及其書t生物具抗腫瘤的活性，五味子素(schizandrin)能降低谷丙轉氨酶(GPT)而用于治療肝炎，厚樸酚(maganolol)具肌肉松弛作用，牛蒡子甙(arctiin)對風熱感冒有效等。由于植物木脂素成分結構類型多，立體化學復雜，具有多種生物活性，國內(nèi)外對該領域的研究十分活躍。
煙梗是煙葉之粗梗葉脈，約占葉重的25% - 30%。煙梗是煙草工業(yè)的副產(chǎn)物，目前多作棄置處理。研究表明，煙梗中含有多種有用的化學成分，其特殊天然植物素，如煙堿、果膠、煙酸及茄呢醇等，在精細化工、日化、食品、輕工、醫(yī)藥等行業(yè)都有著廣泛的應用。我國是煙草大國，每年有數(shù)十萬噸煙梗資源被廢棄，既造成環(huán)境污染，同時也是對自然資源的浪費。目前，已有從煙草廢棄物中提取煙堿、茄尼醇、植物蛋白等，這些研究成果為煙草廢棄物綜合利用開辟了一條新途徑。但是，至今還沒有煙梗中木脂素類化合物的報道，本發(fā)明從煙梗中分離得到了一種具有生物活性的新木脂素化合物，為煙梗的綜合利用提供了新途徑
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的木脂素類化合物。
本發(fā)明的另 一個目的是提供一種從煙梗中提取所述化合物的方法。本發(fā)明進一步的目的是提供所述化合物在抗氧化和抗HIV-1中的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)。
除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。
A.本發(fā)明從煙梗中分離出一種新的木脂素類化合物，該化合物具有顯著的
抗氧化和抗HIV-1活性。
本發(fā)明的新的木脂素類化合物具有下述結構式
6' 5'
5 6
該化合物的命名為煙草木脂素A(Toblignan A)。
B. 本發(fā)明提供了 一種所述化合物的制備方法，該方法采用以下步驟l.煙梗樣品粉碎后以7M的乙醇分3次用超聲提取；2.合并提取液，減壓
濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物，并將提取液濃縮成浸膏；3.浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用高效液相半制備色譜進一步分離，即得到所需的該新化合物。
C. 本發(fā)明對所述的新化合物進行了抗氧化和抗HIV-1活性檢測，化合物顯示出良好的抗氧化活性和抗HIV-1效果，可為醫(yī)藥工業(yè)提供有藥用價值的新化合物或先導化合物。


圖1為化合物的高分辨質(zhì)譜(HRESIMS);圖2為化合物的核i茲共振氫譜('H麗R);圖3為化合物的核,茲共振炭譜("C麗R);
圖4本發(fā)明的化合物和kobusinol A結構對比，圖中，a為本發(fā)明化合物的結構式；b為kobusinol A的結構式；圖5為化合物的HSQC相關譜；圖6為化合物HBMC相關i普；圖7為化合物C0SY相關譜；圖8為化合物ROESY相關謙。
具體實施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實 施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅 僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1
一一化會物的制備
煙梗樣品采于云南玉溪。將煙梗樣品取樣3. 0 kg粉碎到30目，以70%的 乙醇用超聲4是取3次，提取液合并，過濾，減壓濃縮提取液至小體積，靜置后 濾除沉淀物，然后濃縮成遂膏，得浸膏63. 8 g。浸膏用適量氯仿溶解后用80 g粗硅膠(80 -100目)拌樣，1. 5 kg硅膠(160 - 200目)裝柱進行硅膠柱 層析，氯仿丙酮(1: 0 — 0: l)梯度洗脫，TLC監(jiān)測合并相同的部分，得 到8個部分(純氯仿、氯仿-丙酮20:1、氯仿-丙酮9:1、氯仿-丙酮8:2、氯 仿-丙酮3:2、氯仿-丙酮1:1、氯仿-丙酮1:2、純丙酮)，其中氯仿-丙酮 (8:2)洗脫部分4.26 g用安捷侖1100半制備高效液相色譜分離，以60%的曱 醇為流動相，Zorbax SB-C18 (9.4 x 250 mm, 5 ,)半制備柱為固定相，紫 外檢測器檢測波長為300 nm,每次進樣50 jiL,收集15. 8 min的色譜峰，多 次累加后蒸干，再次用純曱醇溶解，再以曱醇為流動相，用Sephadex LH-20 凝膠柱層析分離，可得該新化合物。
實施例2
一一化合物的鑒定
本發(fā)明化合物為白色無定形粉末；紫外光譜(溶劑為曱醇)， (log s):
280 (4.18), 206 (5.36) mn;紅外光譜(溴化鉀壓片)3462， 2958, 2874,
1687, 1652, 1621， 1528， 1485， 1462， 1398， 1354， 1245， 1208， 1121,
1098, 1055 ctrf1;旋光(溶劑為甲醇)[a〗〗5'3+3.6 (c 0. 26)。
HRESIMS (附圖-l)顯示本發(fā)明化合物準分子離子峰m/z 367.1523+ (計算值為367.1521 ),結合卞和13C麗R譜(圖-2和圖-3,數(shù)據(jù)歸屬
見表-l)給出其分子式C2。H24 0 5,不飽和度為9。 ^和3C畫R譜信號表明化合
物中有2個苯環(huán)(包括6'個雙鍵次曱基碳(5e 110.9、 116.3、 120.1、
113.2、 116.6、 121.8), 1個甲基(5C 15.0), 2個次甲基(5C 49.5、
49.2), 1個氧化的次級甲基(5c 89. 2), 1個亞甲基(5 c 38. 5, 1個氧化的亞甲基(5c 73. 4)， 2個甲氧基(5C 55.9、 56.0)。本發(fā)明化合物的13C-麗R數(shù) 據(jù)與已知化合物kobusinol A(圖-4)比較表明兩者非常相似，不同之處僅為該 化合物中苯環(huán)上少了 1個甲氧基信號而苯環(huán)上雙鍵次曱基碳信號相同，說明1 個曱氧基被羥基取代，經(jīng)HMBC相關譜(圖-6)證實本發(fā)明化合物中C-3、 C-3'位為曱氧基，C-4, C-4，位為羥基；并近一步經(jīng)過R0ESY相關譜(圖-8) 證實了本發(fā)明化合物的立體結構。至此，化合物的結構式最終被確定，命名為 煙草木脂素A(Toblignan A)。
表-l化合物的和13C NMR數(shù)據(jù) iJ & (mult, /, Hz) ii^ <S (mult, /' Hz)
(mult.) (mult.)
1132. 1s2，113.2 d6.97, s
2110. 9d7.31， s3，150. 1 s
3150. 4s4,146.6 s
4147. 2s5,116.6 d7.23-7.28, overlap
5116. 3d7.18-7.23， overlap6，121.8 d7. 23-7. 28, overlap
6120. 1d7.18-7.23, overlap7，89.2 d4.23， d, /=9. 0
738. 5t4. 24, d, /=6. 88，49.2 d4. 04—4. 11, m
849. 5d2. 73-2. 80, m9，15. 0 q1.23, d, 7=6.8
973. 4t1. 22， d, /=6. 8OMe-355. 9 q3.68, s
1，133. 8sOMe-3，56. 0 q3.65, s
實施例3
——化合物抗氧化活性;險測
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50 |ng/mL為初篩濃
度，測定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一塊costar 96孔板，加入新鮮
配制的DPPH乙醇溶液(6.5 xlO 5 mol/L) 190 jaL/孔，加入待測樣品10 jliL/
孔，空白孔加10 )iiL生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板后室溫下避光靜置
30分鐘，于UV2401分光光度計上測定儀上測定各孔吸光度值，測定波長為
517 nm;樣品對脂性自由基DPPH清除率按下式計算 DPPH清除率(W = (A空白一A樣品)/ A空白xl00%
A空白空白對照組吸光度值；A樣品加樣品組吸光度值。
樣品平行5次檢測，計算半數(shù)清除濃度I"0測定結果為6. 87 |ag/L,表 明化合物具有良好的抗氧化活性。 實施例4——對本發(fā)明化合物的抗HIV活性檢測
1. HIV-1感染性滴定
按Johnson & Byington所述方法改良進行滴定；按Reed&Muench方法 計算病毒的TCID5。 (50% Tissue Culture Infection Dose)。
2. 樣品對C8166宿主細胞的細胞毒性檢測
4 x 107ml C8166細胞懸液100 ul與待測化合物溶液混合，設三個重復 孔。同時設置不含化合物的對照孔，溫度37°C， 5% C02培養(yǎng)三天，采用MTT 比色法檢測細胞毒性。ELx800 ELISA儀測定0D值，測定波長為595nm,參考 波長為630 nm。計算得到CC5。值(50% Cytotoxic Concentration),即對 50%的正常T淋巴細胞系C8166產(chǎn)生毒性時的化合物濃度。 3.樣品對HIV-ln!B誘導C8166細胞病變(CPE)的抑制試驗 將8 x 107mL C8166細胞50 jiL/孔接種到含有100 ju L/孔倍比稀釋化合物 的96孔細胞培養(yǎng)板上，然后加入50 nL的HIV-l，稀釋上清(M.O. I. 0.0016)。設三個重復孔。同時設置不含化合物的正常細胞對照孔。37°C， 5% C02培養(yǎng)三天，倒置顯微鏡下(100x)計數(shù)合胞體的形成。EC5。(50% Effective Concentration)為抑制合胞體形成50 %時的化合物濃度。 4.樣品對HIV感染細胞的保護作用試驗
將8xl0Vml ML細胞50ul/孔接種到含有100 ]a 1/孔倍比稀釋化合物的 96孔細胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板的一半孔加入50 u 1的HIV-1，稀釋 (M. 0. I. 0. 006),另一半孔加入50pl培養(yǎng)基。每個濃度梯度2個重復孔，同時 設置不含化合物的對照孔和空白對照孔，37°C、 5% C02培養(yǎng)，第三天每孔補加 100 pl新鮮培養(yǎng)基，第五天或第六天采用MTT比色法檢測細胞存活率。 ELx800 ELISA儀測定0D值，測定波長為595nm，參考波長為630 nm。用公式 計算出化合物對正常細胞的毒性和對HIV-1麗感染細胞的保護作用。 5.計算公式
根據(jù)實驗結果繪制劑量反應曲線，按Reed&Muench法計算出化合物抑制 病毒的50%有效濃度(EC5。) ， 50%抑制細胞生長濃度(CC5。)及抗HIV-1活 性的治療指數(shù)TI值(Therapeutic index)為TI = CC5。/EC5。。
細胞生長存活率(°/ )=實驗孔OD值/對照孔OD值x 100
細胞生長抑制率(W = (1-實驗孔0D值/對照孔0D值)xlOO
HIV-1致細胞病變的抑制率(W = (1-實驗孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))x 100
感染細胞的保護率(y )=
7(實驗孔0D值-陽性對照孔0D值)/ (陰性對照孔0D值-陽性對照孔0D值)xlOO 6.實驗結果
實驗結果清楚地表明，該化合物顯示出一定的抗HIV-1活性，其治療指數(shù) 為112.8，揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗愛滋病的藥物中有良好的應用前 景。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā) 明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種具有下述結構式的化合物
2.權利要求1所述化合物的制備方法，該方法采用以下步驟(1) 煙梗樣品粉碎后以70%的乙醇分3次用超聲提取，合并提取液5(2) 減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物并濃縮成浸膏。(3) 浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用高效液相半制備色譜進一步分離，即得到所需的化合物。
3. 權利要求1所述的化合物作為抗氧化劑的應用。
4. 權利要求1所述的化合物在制備抗HIV-1藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的煙梗所含的木脂素類化合物(I)及其制備方法和應用。系將煙梗樣品粉碎后以70％的乙醇分3次用超聲提取，合并提取液，過濾，減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物并濃縮成浸膏，浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用高效液相半制備色譜進一步分離，即得到所需新化合物。對該化合物進行了抗抗氧化活性和抗HIV-1活性篩選，實驗結果顯示化合物顯示出較強的抗氧化和抗HIV-1活性。
文檔編號C07D307/12GK101648929SQ20091009491
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月1日 優(yōu)先權日2009年9月1日
發(fā)明者徐祎然, 忠 李, 李干鵬, 楊光宇, 陳永寬 申請人:云南煙草科學研究院