專利名稱：：蜂王漿中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蜂王漿中藥物殘留的檢測方法，特別是一種蜂王漿中萘夫西林、氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盤尼西林G、雙氯青霉素和苯唑西林九種e-內(nèi)酰胺類藥物殘留總量的快速提取和酶聯(lián)免疫測定方法。
背景技術(shù)：
：e-內(nèi)酰胺(Beta-Lactams)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有P-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素與頭孢菌素，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)P-內(nèi)酰胺類等其他非典型P-內(nèi)酰胺類抗生素。e-內(nèi)酰胺類的抗菌作用機(jī)理均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白從而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解，從而達(dá)到抑制細(xì)菌的生長。在蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)中該類藥物被用來防治歐洲幼蟲腐臭病、中蜂囊狀幼蟲病、美洲幼蟲病等。食用了含有3-內(nèi)酰胺類抗生素的食品對人體會造成潛在危害(1)過敏反應(yīng)；(2)赫氏反應(yīng)；(3)胃腸反應(yīng)。最重要的是，這類藥物很容易造成細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。目前世界各個國家都對動物使用P-內(nèi)酰胺和食品中殘留進(jìn)行了嚴(yán)格的控制。在我國，動物源性食品中阿莫西林和氨芐西林的MRL為5(Vg/kg，奶及奶制品中MRL為10昭/kg;日本規(guī)定在蜂蜜中阿莫西林殘留量不得超過8^tg/kg，奈夫西林殘留量不得超過5pg/kg，氨芐青霉素殘留量不得超過9pg/kg，芐青霉素殘留量不得超過4ng/kg，蜂王漿中殘留量則參照一律標(biāo)準(zhǔn)(l(Wkg)。長期以來3-內(nèi)酰胺殘留的檢測手段主要有大型分析儀器測試。對于肉類、水產(chǎn)品中3-內(nèi)酰胺的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等。另外，微生物法也是該類藥物殘留主要測定方法。近年來酶聯(lián)免疫法(ELISA)和放射免疫法(CharmII)等生物學(xué)篩選方法得到應(yīng)用，我國已制定了利用放射免疫法(CharmII)檢測動物源性食品中e-內(nèi)酰胺殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法，但我國迄今為止還沒關(guān)于動物源性食品中3-內(nèi)酰胺殘留ELISA檢測的方法，更是沒有關(guān)于蜂王漿樣品中e-內(nèi)酰胺殘留量的篩選方法。這是因為一方面是蜂王漿所含活性成分多樣，組成復(fù)雜，有大量干擾物質(zhì)，在具體操作時更增加了難度和不穩(wěn)定性；另一方面是由于3-內(nèi)酰胺類藥物在溶液中極易降解，制備相應(yīng)的抗體非常困難。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蜂王漿中P-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，其實現(xiàn)對P-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的快速提取為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為蜂王漿中P-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，其步驟如下1)蜂王漿樣品中加入體積比為48%_52%的甲醇水溶液，充分混勻；2)在15土2"下進(jìn)行高速離心，直至清亮；3)取上清液加入稀釋洗滌緩沖液；4)用堿或酸將pH值調(diào)節(jié)到6.57.5;5)用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行檢測；上述的稀釋洗漆緩沖液為檢測試劑盒自帶或磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0。上述的蜂王漿中e-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，甲醇水溶液的體積比優(yōu)選50%。上述的蜂王漿中3-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，所述的P-內(nèi)酰胺類藥物為萘夫西林、氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盤尼西林G、雙氯青霉素和苯唑西林。無論在酸性還是堿性條件下用其它有機(jī)溶劑(如乙腈)來萃取蜂王漿中的3-內(nèi)酰胺類抗生素，樣品本底干擾大，回收率低，這是因為P-內(nèi)酰胺類藥物較不穩(wěn)定，在pH值小于5和pH值大于9時都會發(fā)生一定程度的降解；相關(guān)文獻(xiàn)表明，在使用SPE凈化的方法中，要使e-內(nèi)酰胺類藥物的損失最小，必須考慮SPE柱的碳含量，C-18柱填料的含碳量至少為17%;另外用一庚垸磺酸鈉緩沖液(pH為2.0)提取王漿中該類藥物時，e-內(nèi)酰胺發(fā)生的較多的降解，因此回收效果不佳；而用磷酸鹽緩沖液沉淀蛋白效果較差，蜂王漿中的蛋白質(zhì)易與P-內(nèi)酰胺類藥物形成共價鍵，凈化效果不理想。通常，樣品要與脫蛋白溶劑一起勻質(zhì)，可以增加溶劑與試樣的接觸面積，與提取劑一起通過振蕩脫蛋白，達(dá)到沉淀蛋白和提取e-內(nèi)酰胺的效果。本發(fā)明的研究結(jié)果表明以50%甲醇(酸性)作為蜂王漿樣品的脫蛋白沉淀劑和其中P-內(nèi)酰胺藥物的提取效果最理想，處理后的樣品溶液可以直接進(jìn)行ELISA檢測。本發(fā)明以直接以50%甲醇來沉淀蜂王漿中的蛋白質(zhì)和提取殘留的3-內(nèi)酰胺，處理后樣品中殘留的P-內(nèi)酰胺與酶標(biāo)記氨芐西林共同競爭結(jié)合至包被有抗體的微孔板上氨芐西林抗體，通過洗滌除去未結(jié)合的3-內(nèi)酰胺和酶標(biāo)記氨芐西林，然后加入底物顯色劑，用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出試樣中3-內(nèi)酰胺的含量。本發(fā)明對設(shè)備要求簡單，操作容易，便于企業(yè)自檢，自我控制原料質(zhì)量；也可以為大型分析儀器LC-MS/MS使用前先行篩選樣品，降低儀器分析成本；本發(fā)明的測定低限可以達(dá)至UlOng/kg，滿足了國內(nèi)外對蜂王漿產(chǎn)品中0-內(nèi)酰胺殘留限量的測定要求。具體實施例方式實施例(以英國RANDOX公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對提取物進(jìn)行ELISA測定)1)交叉反應(yīng)測試在檢測試劑盒所帶的稀釋緩沖液中添加不同濃度的P-內(nèi)酰胺類藥物，進(jìn)行選擇性試驗(結(jié)果見表l)，不同物質(zhì)的交叉反應(yīng)率以下公式進(jìn)行計算交叉反應(yīng)率(％)=I5o(氨芐西林)/I5Q(待測物)XiooIso為反應(yīng)中產(chǎn)生50%最大抑制率的e-內(nèi)酰胺類藥物或待測物濃度。不同P-內(nèi)酰胺藥物的交叉性數(shù)據(jù)如下表1:_抗生素_交叉性％~萘夫西林(Naficillin)iii~氨節(jié)西林(Ampicillin)100阿莫西林(Amoxicillin)94哌拉西林(Pioeracillin)92阿洛西林(Azlodllin)89氯唑西林(Cloxacillin)69盤尼西林G(PenicillinG)56雙氯青霉素(dicloxillin)52苯唑西林(Oxacillin)51美坦西林(Metampicillin)30盤尼西林V(PenicillinV)22羧節(jié)西林(Carbenicillin)8替卡西林(Ticarcillin)6先鋒霉素類eCephalosporins)_O.01從交叉反應(yīng)結(jié)果可見，該試劑盒對萘夫西林、氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盤尼西林G、雙氯青霉素和苯唑西林具有良好的交叉性，對美坦西林和盤尼西林V的交叉性為20309()，但對其他氟喹諾酮類交叉反應(yīng)都小于10%，說明該試劑盒可以用于蜂王漿中萘夫西林、氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盤尼西林G、雙氯青霉素和苯唑西林殘留量的檢測。2)本發(fā)明的具體測定步驟如下稱取5g蜂王漿樣品，精確到0.1g，置于50mL具塞試管中，加入10mL50。/。甲醇，充分混勻；15。C下6000rpm離心10min直至清亮，取0.5mL上清液加入lmL稀釋洗滌緩沖液(檢測試劑盒自帶)；用30%NaOH/lmol/LHC1溶液將pH調(diào)節(jié)到6.57.5，用7檢測試劑盒檢測。在不同的空白樣品中分別添加三個濃度的氨芐西林，每個添加濃度測定5個平行樣，并進(jìn)行3批實驗(不同檢測日期，不同標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同批次試劑盒)。測定數(shù)據(jù)見表2。在三個添加濃度對蜂王漿樣品的平均回收率在83%93%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.3%7.3%。以上結(jié)果表明本發(fā)明的方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密性。5pg/kg10pg/kg50|ag/kg測定值l4.68測定值24.37測定值34.64測定值44.41測定值54.76測定值64.7測定值74.9測定值84.4測定值94.1測定值IO4.13測定值ll4.29測定值124.6測定值133.85測定值144.56測定值154.57平均回收率(％)89.3相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)6.39.138.668.138.749.818.488.939.98.348.788.679.610,159.29.2390.56.648.244.141.740.450.749,451.140.242.343.844.746.448.551.147.892.18.43)方法的假陽性率和假陰性對于100陰性樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示有4個陽性樣品(濃度分別為8.6|ug/kg、10.5pg/kg、12.4iLig/kg和13.8iLig/kg)。以LC-MS/MS對這4個樣品進(jìn)行確證，結(jié)果顯示為陰性。假陽性率=1-測定陰性/(測定陽性+測定陰性)=4%對20個測定結(jié)果為陽性的王漿樣品和24個添加氨芐西林和阿莫西林的王漿樣品以ELISA進(jìn)行測定，見表3-4，結(jié)果均為陽性，表明建立的ELISA方法的假陰性率為0。表3陽性蜂王漿樣品的ELISA和LC-MS/MS結(jié)果比對<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4添加樣品中的ELISA結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4)驗證實驗選擇了5家實驗室進(jìn)行本方法的驗證實驗，結(jié)果表明在各種空白樣品中分別添加三個濃度的氨芐西林、阿莫西林、萘夫西林和哌拉西林均良好的回收率，見表5，說明建立的測定方法在實驗室間也有著良好的重現(xiàn)性。符合GB/T6379《測試方法的精密度通過實驗室間試驗確定標(biāo)準(zhǔn)測試方法的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性》的要求。表5蜂王漿樣品的實驗室間添加回收率(％)和精密度(CV%)氨芐西林阿莫西林萘夫西林哌拉西林5嗎/kg106.8%109.8%/1,292.2%103.6%/5.184.4%99.0%/5.885.8%95.0%/4.599.0%104%/2.097.3%103%/2.384.5%93.4%/3.685.8%95.7%/4.750pg/kg98.8%108.8%/3.788.4%99.2%/4.483.6%95.8%/5.685.4%97.6%/4.9權(quán)利要求1、蜂王漿中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，其步驟如下1)蜂王漿樣品中加入體積比為48％-52％的甲醇水溶液，充分混勻；2)在15±2℃下進(jìn)行高速離心，直至清亮；3)取上清液加入稀釋洗滌緩沖液；4)用堿或酸將pH值調(diào)節(jié)到6.5～7.5；5)用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行檢測；上述的稀釋洗滌緩沖液為檢測試劑盒自帶或磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜂王漿中P-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于甲醇水溶液的體積比選用50%。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蜂王漿中內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法，其特征在于所述的P-內(nèi)酰胺類藥物為萘夫西林、氨芐西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盤尼西林G、雙氯青霉素和苯唑西林。全文摘要本發(fā)明涉及一種蜂王漿中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫測定方法。目前沒有關(guān)于蜂王漿樣品中β-內(nèi)酰胺殘留量的篩選方法。本發(fā)明采用的步驟如下1)蜂王漿樣品中加入體積比為48％-52％的甲醇水溶液，充分混勻；2)在15±2℃下進(jìn)行高速離心，直至清亮；3)取上清液加入稀釋洗滌緩沖液；4)用堿或酸將pH值調(diào)節(jié)到6.5～7.5；5)用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行檢測；上述的稀釋洗滌緩沖液為檢測試劑盒自帶或磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0。本發(fā)明實現(xiàn)了對β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量的快速提取和測量，測定低限可以達(dá)到10μg/kg，滿足了國內(nèi)外對蜂王漿產(chǎn)品中β-內(nèi)酰胺殘留限量的測定要求。文檔編號C07D499/76GK101587119SQ200910099399公開日2009年11月25日申請日期2009年6月11日優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日發(fā)明者張曉峰,施偉良,朱振江,陳笑梅申請人:浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心