專利名稱：一種1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有生理活性的環(huán)狀氨基酸的合成方法，具體地說是1，4，5， 6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法。
背景技術：
1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(L-ectoine， CAS號96702-03-3)是1985 年在極端嗜鹽外硫紅螺菌屬的光合紫細菌Halochloris中發(fā)現(xiàn)的一種新型環(huán)狀氨基酸，是 耐鹽微生物為維持滲透壓平衡而在細胞內產生的一種相容性溶質。隨著核磁共振和高效液 相等分析技術的應用，越來越多的實驗證明1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸不僅是中 度嗜鹽菌和耐鹽菌主要的相容性溶質，在產生放線菌素的微小鏈霉菌等非嗜鹽菌中也可以 檢測到。 國內外研究表明，1，4，5，6_四氫-2_甲基-4-嘧啶羧酸能夠通過體內合成和體 外轉運兩種途徑在細胞內積累，達到調節(jié)細胞內外滲透壓平衡的作用，在苜蓿中華根瘤菌 等菌株中還可以誘導菌株產生一系列與滲透壓有關基因的表達，使其合成自身的相容性溶 質，如海藻糖、谷氨酸鹽等。 在逆境下，1 ， 4， 5， 6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸對酶、DNA、細胞膜等生物大分子具 有很強的保護作用，對一些性質不穩(wěn)定的酶，如乳酸脫氫酶等保護作用顯著，與常見的相容 性溶質脯氨酸、甜菜堿相比具有顯著的優(yōu)越性。1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸可以 發(fā)揮與分子伴侶相似的作用，能夠識別錯誤折疊的蛋白質，并且抑制蛋白質聚合體的形成。
1，4，5，6_四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的滲透壓調節(jié)作用及穩(wěn)定蛋白質水合層，保 護酶、DNA等生物大分子和細胞膜結構的作用，可以幫助細胞及動植物抵抗冷凍、干旱、高 溫、高鹽、輻射等各種逆境。在農業(yè)、化妝品、食品、醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用前景。專利 文獻W00219978公開了 1，4，5，6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸在口腔護理中的應用，專利文 獻DE102004016129公開了其在皮膚護理及疾病預防中的應用。專利文獻W02006097263公 開了其在治療及預防胃腸道疾病中的應用。 1，4，5，6_四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸廣泛的用途及商業(yè)價值受到了廣泛關注，其 合成方法也得到了不斷的改進。其最初的批量生產技術被稱為"細菌擠奶"技術，在鹽濃度 高的環(huán)境下誘導細菌合成并蓄積1 ， 4， 5， 6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，再在低滲透壓環(huán)境 下使其釋放1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，通過循環(huán)性的升高和降低鹽濃度，獲得 目標產物，產率為3. 3g/L/h。該方法工藝復雜，產品收獲不具備連續(xù)性，較高的鹽濃度則對 反應容器具有腐蝕性，并且菌株合成的產物均在細胞內，其合成受到1 ， 4， 5， 6-四氫-2-甲 基_4-嘧啶羧酸濃度閾值的限制，濃度達到一定值，合成即受到抑制。 針對上述問題，Torsten等發(fā)明一種利用轉基因非嗜鹽菌連續(xù)合成分泌1，4， 5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法，產率達到40mg/L/h(Continuous Synthesis and Excretion of theCompatible Solute Ectoine by a Transgenic, Nonhalophilic Bacterium. A卯l EnvironMicrobiol. 2007 ;73 (10) :3343-7)。專利文獻CN101314785公開了一種利用鹽單胞菌屬菌株發(fā)酵合成1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法。產物 大部分分泌至培養(yǎng)基中，可以實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)，并將鹽濃度降低了 1/2至2/3。
然而，迄今為止，1，4，5，6_四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的合成方法仍是發(fā)酵法，尚 無關于1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法。這種利用微生物發(fā)酵合成 1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法具有的共同缺陷是細胞生長緩慢、制備工藝 復雜，產率較低，很難滿足需求。急需一種可大規(guī)模進行生產的人工合成方法。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種1，4，5，6_四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人 工合成方法，其工藝簡單且產率高，可大規(guī)模生產，滿足社會的需求。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的 —種1，4，5，6_四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，包括以下步驟
(l)N-乙酰化二氨基丁酸的合成反應 取4-硝基苯酚醋酸酯、無機堿，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中進 行反應，邊反應邊攪拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混 合物，其中，L-2，4-二氨基丁酸、無機堿與4-硝基苯酚醋酸酯的摩爾比為1 : (2.0 5.0) : (1.0 3. 0)，反應溫度為20。C 70。C，攪拌速度為50 100rpm，反應時間為8 20小時; 反應完成后，用CH^l2進行萃取，得萃取液，然后干燥，減壓蒸餾，3(TC 7(rC下真 空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；
(2)1，4，5，6-四氫-2_甲基_4_嘧啶羧酸的合成反應 將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于極性有 機溶劑，然后加入三乙胺，三乙胺與L-2，4-二氨基丁酸的摩爾比為2 : 1，加熱回流36 60小時，減壓蒸去有機溶劑，然后用柱層析進行純化，即得到1 ， 4， 5， 6-四氫-2-甲基-4-嘧
啶羧酸。合成反應式如下
<formula>formula see original document page 4</formula>四氫嘧啶(L) 所述步驟(1)中，無機堿選自NaOH、 KOH、 Ca (OH) 2中的任一種。
所述步驟(1)中，反應溫度為25°C 35t:，反應時間為10 16小時。
所述步驟(2)中，極性有機溶劑選自正丁醇、乙醇、甲醇中的任一種。
所述步驟(2)中，加熱回流的溫度為80°C 120°C。 所述步驟(2)中，柱層析的流動相為正丁醇/乙酸/水，體積比為12 :3:5。
所述步驟(2)中，柱層析的吸附劑為200 300目硅膠。 本發(fā)明的基本原理是首先利用4-硝基苯酚醋酸酯與L_2，4- 二氨基丁酸反應生 成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸，然后通過2-乙酰胺基-4-氨基 丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸反應生成1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸。
本發(fā)明的合成工藝步驟簡單，環(huán)境污染小，收率可達50% 70 % ，適于工業(yè)化生產。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明 實施例1人工合成制備1，4，5，6_四氫_2-甲基_4_嘧啶羧酸，步驟如下
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(3.62g，20翻l)與NaOH(l. 68g，40mmo1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 25。C下80rpm攪拌14小時，反應完成后， 以CH2C12進行萃取，萃取液以無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，5(TC下真空干燥4小時，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁 酸混合物。 (2)將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 80ml正丁醇，加入2g三乙胺，8(TC加熱回流48小時，減壓蒸去有機溶劑，以正丁醇/乙酸/ 水(體積比為12 : 3 : 5)進行柱層析(200-300目硅膠)，得到產物。
采用核磁共振及質譜對產物進行定性鑒別，確定為1，4，5，6_四氫_2-甲基-4-嘧 啶羧酸，數(shù)據(jù)如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， gi2-CH_N，丄JCH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色譜對1， 4， 5， 6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量進行測定，色譜柱為 TSK-GEL，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液(p朋.0)，流速為1. Oml/min，吸收波長為210nm， 測得產率為54%，純度為95%。 實施例2人工合成制備1，4，5，6_四氫-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步驟如下
(1) 4-硝基苯酚醋酸酯(5. 43g， 30mmo1)與K0H(2. 25g， 40,1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 25。C下80rpm攪拌12小時，反應完成后， 以CH2C12進行萃取，萃取液以無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，5(TC下真空干燥4小時，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁 酸混合物。
(2)將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 100ml乙醇，加入2g三乙胺，12(TC加熱回流48小時，減壓蒸去有機溶劑，以正丁醇/乙酸/ 水(體積比為12 : 3 : 5)進行柱層析(200-300目硅膠)，得到產物。
采用核磁共振及質譜對產物進行定性鑒別，確定為1，4，5，6_四氫_2-甲基-4_嘧 啶羧酸，數(shù)據(jù)如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， ￡H2-CH_N， ^CH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm(d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm(s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0);ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色譜對1， 4， 5， 6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量進行測定，色譜柱為 TSK-GEL，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液(p朋.0)，流速為1. Oml/min，吸收波長為210nm， 測得產率為62 % ，純度為87 % 。 實施例3人工合成制備1，4，5，6_四氫-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步驟如下
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5. 43g，30mmo1)與NaOH(l. 68g，40mmo1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 30。C下80rpm攪拌14小時，反應完成后， 以CH2C12進行萃取，萃取液以無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，5(TC下真空干燥4小時，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁 酸混合物。 (2)將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 80ml正丁醇，加入2g三乙胺，120。C加熱回流36小時，減壓蒸去有機溶劑，以正丁醇/乙酸 /水(體積比為12 : 3 : 5)進行柱層析(200-300目硅膠)，得到產物。
采用核磁共振及質譜對產物進行定性鑒別，確定為1，4，5，6_四氫_2-甲基-4_嘧 啶羧酸，數(shù)據(jù)如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， gi2-CH_N，丄JCH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色譜對1， 4， 5， 6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量進行測定，色譜柱為 TSK-GEL，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液(p朋.0)，流速為1. Oml/min，吸收波長為210nm， 測得產率為67 % ，純度為99 % 。 實施例4人工合成制備1，4，5，6_四氫-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步驟如下
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5. 43g，30mmo1)與NaOH(l. 68g，40mmo1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 30。C下80rpm攪拌20小時，反應完成后， 以CH2C12進行萃取，萃取液以無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，6(TC下真空干燥4小時，得到2-乙酰胺基_4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。 (2)將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 80ml正丁醇，加入2g三乙胺，8(TC加熱回流60小時，減壓蒸去有機溶劑，以正丁醇/乙酸/ 水(體積比為12 : 3 : 5)進行柱層析(200-300目硅膠)，得到產物。
采用核磁共振及質譜對產物進行定性鑒別，確定為1，4，5，6_四氫_2-甲基-4_嘧 啶羧酸，數(shù)據(jù)如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， ￡H2-CH_N，丄JCH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH-C仏VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色譜對1， 4， 5， 6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量進行測定，色譜柱為 TSK-GEL，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液(p朋.0)，流速為1. Oml/min，吸收波長為210nm， 測得產率為67 % ，純度為97 % 。 實施例5人工合成制備1，4，5，6_四氫-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步驟如下 (1)4-硝基苯酚醋酸酉旨(3.62g，20翻l)與NaOH(l. 68g，40,1)混合，加入到
200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 30。C下80rpm攪拌14小時，反應完成后，
以CH2C12進行萃取，萃取液以無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去除CH^l2，6(TC下真空干燥4小
時，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。 (2)將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于
100ml甲醇，加入2g三乙胺，ll(TC加熱回流60小時，減壓蒸去有機溶劑，以正丁醇/乙酸/
水(體積比為12 : 3 : 5)進行柱層析(200-300目硅膠)，得到產物。 采用核磁共振及質譜對產物進行定性鑒別，確定為1，4，5，6_四氫_2-甲基-4_嘧
啶羧酸，數(shù)據(jù)如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， gi2-CH_N， ^CH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色譜對1， 4， 5， 6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量進行測定，色譜柱為 TSK-GEL，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖液(p朋.0)，流速為1. Oml/min，吸收波長為210nm， 測得產率為59%，純度為94%。
權利要求
一種1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，其特征在于，包括以下步驟(1)N-乙?；被∷岬暮铣煞磻?-硝基苯酚醋酸酯、無機堿，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中進行反應，邊反應邊攪拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物，其中，L-2，4-二氨基丁酸、無機堿與4-硝基苯酚醋酸酯的摩爾比為1∶(2.0～5.0)∶(1.0～3.0)，反應溫度為20℃～70℃，攪拌速度為50～100rpm，反應時間為8～20小時；反應完成后，用CH2Cl2進行萃取，得萃取液，然后干燥，減壓蒸餾，30℃～70℃下真空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；(2)1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的合成反應將上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于極性有機溶劑，然后加入三乙胺，三乙胺與L-2，4-二氨基丁酸的摩爾比為2∶1，加熱回流36～60小時，減壓蒸去有機溶劑，然后用柱層析進行純化，即得到1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸；合成反應式如下F2009102294668C0000011.tif
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步驟(1)中，無機堿選自NaOH、KOH、Ca(OH)2中的任一種。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步驟(1)中，反應溫度為25°C 35t:，反應時間為10 16小時。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步驟(2)中，極性有機溶劑選自正丁醇、乙醇、甲醇中的任一種。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步驟(2)中，加熱回流的溫度為80°C 120°C。
6. 根據(jù)權利要求l所述的一種1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步驟(2)中，柱層析的流動相為正丁醇/乙酸/水，體積比為12 :3:5
7. 根據(jù)權利要求1所述的一種1，4，5，6-四氫_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步驟(2)中，柱層析的吸附劑為200 300目硅膠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，包括以下步驟(1)取4-硝基苯酚醋酸酯、無機堿，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中進行反應，邊反應邊攪拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物，然后用CH2Cl2進行萃取，得萃取液，然后干燥，減壓蒸餾，真空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；(2)將上述反應混合物溶于極性有機溶劑，然后加入三乙胺，加熱回流，減壓蒸去有機溶劑，然后用柱層析進行純化，即得。本發(fā)明的合成工藝步驟簡單，環(huán)境污染小，收率可達50％～70％，適于工業(yè)化生產。
文檔編號C07D239/06GK101698662SQ20091022946
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權日2009年10月26日
發(fā)明者厲保秋 申請人:山東大學