專利名稱：一個新的棉花基因psp231及其啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花基因。具體是一個新的花粉特異表達(dá)的基因PSP231及其啟動子的克隆與功能鑒定。該基因涉及到細(xì)胞分裂的調(diào)控，在棉花花粉發(fā)育過程中起著非常重要 的作用。
背景技術(shù)：
長期以來，棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉花生產(chǎn)不僅與我國農(nóng)民的收入直接相 關(guān)，還關(guān)系到紡織工業(yè)的健康發(fā)展和約2000萬紡織工人的就業(yè)。隨著工業(yè)發(fā)展和人民生活 水平的提高，人們對高質(zhì)量紡織品的需求量逐步增大。因此，紡織及相關(guān)行業(yè)在對棉花的 需求量增加的同時，對棉纖維品質(zhì)也有了更高的要求。目前我國原棉年產(chǎn)量基本能夠滿足 紡織工業(yè)的需要，但紡高檔紗的原棉仍然十分缺乏。另外，在我國，棉花種植過程中農(nóng)藥和 化肥使用量偏高，既增加了生產(chǎn)成本，造成了環(huán)境污染，也給棉花產(chǎn)品的質(zhì)量安全帶來了隱 患。因此，培育高產(chǎn)、抗蟲、優(yōu)質(zhì)的棉花品種對于促進(jìn)農(nóng)業(yè)和紡織工業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù) 性發(fā)展有著重要的作用。雜種優(yōu)勢是生物界的普遍現(xiàn)象，利用雜種互補(bǔ)效應(yīng)實現(xiàn)多種優(yōu)良性狀相互組合， 是改良作物的重要途徑之一。隨著棉花高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗蟲等多目標(biāo)育種的難度增加，利 用雜種互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行雜交育種已經(jīng)成為棉花育種的一個重要發(fā)展方向。因為棉花花期長， 尚未找到在大田制種中比較有效的化學(xué)殺雄劑，所以目前我國生產(chǎn)上大面積推廣的雜交 種，仍然以人工去雄授粉為主。該方法用工多，制種成本高，在很大程度上限制了棉花雜種 優(yōu)勢的利用。因此，通過遺傳工程抑制雄性發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)來培育棉花雄性不育系，則 可以實現(xiàn)高效率、低投入的棉花雜交育種。而此工作的開展則依賴于棉花雄性生殖發(fā)育相 關(guān)基因及其調(diào)控元件的識別與分離。通過克隆棉花花藥發(fā)育的關(guān)鍵功能基因和核心調(diào)控元 件，分析基因的表達(dá)調(diào)控及表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能，闡明花藥發(fā)育的分子機(jī)制，為培育棉花 雄性不育系提供理論依據(jù)和基因元件。在利用遺傳工程創(chuàng)造新的雄性不育系時，特異性啟 動子也是重要的功能元件，它決定著基因表達(dá)的時間、地點和強(qiáng)度。在培育雄性不育系中， 一般選擇花藥特異性啟動子控制目的基因表達(dá)，這樣可以使外源基因在花藥中充分表達(dá)， 同時還可避免目的基因?qū)ζ渌M織生長發(fā)育的干擾。因此，高特異性、高活性的啟動子和功 能基因的克隆與鑒定是棉花分子育種的重要研究內(nèi)容。植物的花粉發(fā)育是一個復(fù)雜而高度程序化的過程，其中受到很多基因的調(diào)控。在 過去的十多年里，發(fā)現(xiàn)了大量的花藥或花粉特異表達(dá)基因，它們通過不同的途徑在花粉發(fā) 育過程中發(fā)揮作用。其中有些基因影響花藥中生殖細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞的分化；有的控制絨粘 層和胼胝體的退化、降解；有的控制花藥的開裂和花絲的伸長；有的調(diào)控花粉母細(xì)胞的減 數(shù)分裂和小孢子的兩次有絲分裂；還有的影響花粉內(nèi)外壁的形成和花粉的成熟。這些資料 證明植物花藥與花粉相關(guān)基因及其調(diào)控元件(即啟動子)在控制花藥與花粉發(fā)育上具有決 定性作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個新的棉花花粉特異的基因PSP231及其啟動子，分析 揭示基因和啟動子表達(dá)活性與功能，探索其對花藥發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)而應(yīng)用該基因 元件創(chuàng)造棉花雄性不育系。在本研究中，申請人從棉花花藥cDNA文庫中分離獲得1個花粉特異性基因 PSP231。PSP231 cDNA包含1656bp的開放閱讀框架，編碼一個551氨基酸的新蛋白。PSP231 蛋白分子量為61.74KD，等電點(pi)為8. 99，蛋白序列比對分析結(jié)果顯示該蛋白是一類新 的花粉特異性蛋白，含有兩個銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可能屬于抗壞血酸氧化酶家族的同系物。 利用RT-PCR技術(shù)，驗證了該基因的表達(dá)譜，表明該基因在棉花花藥中特異表達(dá)，而在其他 組織中未檢測到該基因的mRNA(見圖1)。進(jìn)一步研究表明，該基因在棉花花藥發(fā)育中期，花 蕾發(fā)育約15天開始表達(dá)，并且隨著花藥發(fā)育成熟，該基因的表達(dá)量逐步升高，在開花當(dāng)天 表達(dá)量達(dá)到最高(見圖2)。RNA組織原位雜交實驗顯示，該基因僅在花藥發(fā)育中后期的雄 配子體細(xì)胞中表達(dá)，在孢子體細(xì)胞中不表達(dá)(見圖3)。為獲取PSP231基因的基因組DNA全長序列，申請人在其開放閱讀框(ORF)兩端設(shè) 計一對引物，以棉花基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該基因的DNA全長序列，與其 cDNA序列比較分析發(fā)現(xiàn)該基因含有兩個內(nèi)含子，長度分別為96和82bp，第一個內(nèi)含子插入 在第83密碼子內(nèi)，第二個內(nèi)含子插入在第452密碼子內(nèi)(見圖4)。為進(jìn)一步研究PSP231基因的組織特異性表達(dá)調(diào)控，申請人用基因組步移法分離 了該基因的啟動子。首先，采用基因組步移試劑盒(Genome Walker Universal Kit, BD BiosciencesClontech, Cat. No. 638904)建立棉花基因組步移文庫，然后按照GhPSP231基 因序列設(shè)計CPl和CP2引物，PCR擴(kuò)增該棉花基因組步移文庫，分離獲得了 PSP231基因 的5’ -上游序列(包括啟動子片段和5’未翻譯區(qū))，該序列長度為1253bp。然后構(gòu)建了 PSP231啟動子與GUS報告基因的融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)將其導(dǎo)入 擬南芥和煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株。組織化學(xué)染色分析表明，PSP231的啟動子驅(qū)動GUS基因 在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株的花粉中特異表達(dá)(圖5)。為更進(jìn)一步分析PSP231啟動子的 花藥特異表達(dá)調(diào)控元件，我們對該啟動子進(jìn)行了缺失分析。以200bp為一個單位，從該啟動 子的5’端開始依次缺失，分別構(gòu)建了 5個不同啟動子片段序列與GUS報告基因的融合表達(dá) 載體，然后將這些含不同啟動子片段的載體轉(zhuǎn)入煙草，對轉(zhuǎn)基因植株的花粉進(jìn)行組織化學(xué) 染色分析。結(jié)果顯示，包含該啟動子400bp片段(基因5’上游-1至-400bp)即具有花粉 特異性表達(dá)活性，而只包含該基因5’上游200bp的啟動子片段不具有啟動子活性(圖6)。 這說明該基因5’上游-200至-400bp之間存在控制花藥特異表達(dá)的啟動子順式元件，可以 作為基因工程培育棉花雄性不育系的基因調(diào)控元件。另外，利用PlantCARE程序(http:// bioinformatics. psb. URent. be/webtools/plantcare/html/)分析這一段啟動子序歹丨J 中 的順式作用元件時發(fā)現(xiàn)，該啟動子含有一個細(xì)胞分裂素KT應(yīng)答因子ARRl的結(jié)合位點。而 且，在經(jīng)過KT處理后，花藥中該基因表達(dá)量顯著上調(diào)。說明該基因可能參與細(xì)胞分裂，并受 ARRl的調(diào)控。為進(jìn)一步檢測該基因是否能夠引起細(xì)胞分裂，申請人利用了單細(xì)胞的裂殖酵母系 統(tǒng)。構(gòu)建了 PSP231的酵母誘導(dǎo)型過量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母，獲得表達(dá)PSP231基因的酵母轉(zhuǎn) 化細(xì)胞系。對其中5個酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞系進(jìn)行檢測分析，統(tǒng)計誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞系中細(xì)胞分裂指數(shù)，以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的酵母細(xì)胞系作為對照。結(jié)果表明，過量表達(dá)PSP231基因的酵母中處于分裂的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。這些結(jié)果說明PSP231蛋白參與細(xì)胞周 期，對細(xì)胞分裂起促進(jìn)作用(見圖7，圖8，表1)。為進(jìn)一步研究PSP231基因在棉花花藥發(fā) 育中的功能，申請人應(yīng)用了 RNA干涉(RNAi)技術(shù)。構(gòu)建了 PSP231的RNA干涉載體，并轉(zhuǎn)化 棉花，共獲得6個轉(zhuǎn)基因棉花株系共50余株棉花轉(zhuǎn)基因植株(見圖9)。PCR檢測表明，夕卜 源DNA已導(dǎo)入棉花基因組。對這些轉(zhuǎn)基因植株中基因表達(dá)分析證明PSP231的表達(dá)受到明 顯的抑制。而且，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)花藥不開裂、不散粉的現(xiàn)象。切片觀察結(jié)果顯示，雖然這 些轉(zhuǎn)基因植株的花藥能正常形成小孢子，但在花藥發(fā)育后期，花藥表皮細(xì)胞異常膨脹，花藥 囊細(xì)胞層數(shù)不分明，甚至有多層細(xì)胞的現(xiàn)象。大部分小孢子仍然處于液泡化的時期，只有少 數(shù)小孢子能夠發(fā)育成熟，因而導(dǎo)致花粉敗育(見圖10)。上述結(jié)果表明，PSP231基因在棉花 花藥發(fā)育后期起重要作用。綜合分析實驗結(jié)果，我們推測PSP231蛋白可能參與棉花小孢子 有絲分裂的調(diào)控，影響棉花花粉發(fā)育成熟。表1過量表達(dá)GhPSP231的酵母細(xì)胞分裂統(tǒng)計Ll L2 L3 L4 L5 Cl C2 C3分裂細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分44.6 35.3 40.1 28.8 31.4 5.4 5.2 4.8比(％)L1-L5 5個轉(zhuǎn)基因菌株；C1-C3 3個野生型菌株本發(fā)明的優(yōu)點1、提供了一個新的棉花花粉特異基因PSP231的全長DNA序列及其cDNA序列，該 基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，編碼一個功能未知的含有551個氨基酸的新蛋白。2、提供了一個新的棉花花粉特異性的PSP231啟動子序列，分析了其花藥特異表 達(dá)的順式作用元件，證明該啟動子能夠驅(qū)動GUS基因在擬南芥和煙草花粉中特異表達(dá)，為 通過基因工程技術(shù)培育棉花等農(nóng)作物雄性不育系提供了特異的調(diào)控元件。3、該基因在棉花花藥發(fā)育后期高水平表達(dá)，若抑制該基因表達(dá)，則棉花花粉成熟 受阻，不能形成正常的花粉，導(dǎo)致植株雄性不育。相反，在酵母中過量表達(dá)該基因促進(jìn)細(xì)胞 分裂，細(xì)胞分裂指數(shù)顯著提高。這說明該基因可能通過調(diào)節(jié)雄配子體發(fā)育過程中的細(xì)胞分 裂，從而在棉花花藥發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明通過以下附圖和實施進(jìn)行進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1熒光定量RT-PCR分析PSP231在棉花各組織中的表達(dá)圖2熒光定量RT-PCR分析PSP231在花藥不同發(fā)育階段的表達(dá)圖中15d，15天齡的花藥；20d，20天齡的花藥；25d，25天齡的花藥；30d，30天齡 的花藥。圖3PSP231基因表達(dá)的原位雜交分析圖中小孢子和成熟花粉中能夠檢測到信號，而在花粉母細(xì)胞和花藥囊中檢測不 到信號，表明該基因在花粉中特異表達(dá)。圖4 PSP231基因結(jié)構(gòu)簡中PSP231基因包括3個外顯子和2個內(nèi)含子。外顯子用黑色方框表示，而啟動子、內(nèi)含子和3’末端用線條表示。圖5 PSP231啟動子活性分析 圖中A.擬南芥花藥；B.離體培養(yǎng)的煙草花粉；C.萌發(fā)中的煙草花粉。轉(zhuǎn)基因煙 草和擬南芥花粉和花粉管被染成藍(lán)色，花藥其他組織未被染色，表明在PSP231啟動子的調(diào) 控下，GUS基因在花粉中特異表達(dá)，從而證實該啟動子在棉花中是花粉特異性的。圖6 PSP231啟動子缺失分析圖6表明1200bp-400bp的PSP231啟動子片段能夠驅(qū)動⑶S基因在花粉細(xì)胞中 特異表達(dá)，而在200bp的啟動子控制下，⑶S基因不具有表達(dá)活性，證明PSP231啟動子的花 粉特異性元件可能存在于-200至-400bp的區(qū)段內(nèi)。圖7過量表達(dá)PSP231促進(jìn)酵母細(xì)胞分裂圖8過量表達(dá)PSP231的酵母細(xì)胞分裂的流式細(xì)胞術(shù)分析圖中A.野生型酵母細(xì)胞.；B.轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對照相比，過量表 達(dá)GhPSP231后處于S期和M期的酵母細(xì)胞數(shù)量都增加了。圖9 PSP231 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株圖10 PSP231 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株花藥切片分析圖中A-C.野生型植株；D-I.轉(zhuǎn)基因植株。在野生型植株中，小孢子自四分體中 釋放出來后，會產(chǎn)生外壁并發(fā)生液泡化，此時絨粘層尚未降解，花藥囊的四層細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍能 清晰分辨，如圖A所示；隨著花粉的發(fā)育成熟，絨粘層降解，花藥囊內(nèi)壁膨脹，如圖B、C所示 (其中B圖是C圖的放大)。從圖D-I可以看到，這些轉(zhuǎn)基因植株的花藥都處于花藥發(fā)育晚 期，與圖B、C中所顯示的花藥處于同一個發(fā)育時期。但從圖中可以明顯觀察到轉(zhuǎn)基因植株 的花粉發(fā)育滯后，同時花藥囊的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生不同程度的異常現(xiàn)象。
具體實施例方式—個新的棉花基因PSP231及其啟動子分離鑒定及功能分析1.棉花 GhPSP231 cDNA 克隆鑒定從棉花花藥cDNA文庫中分離了 4，000多個棉花cDNA克隆，通過序列分析和表達(dá) 譜分析，從中篩選到一些花藥特異或高水平表達(dá)的基因，其中包括PSP231。2.熒光定量RT-PCR分析PSP231基因的表達(dá)(1)組織總 RNA 的提取(按 Li XB，Cai L, Cheng NH, Liu Jff, 2002. Molecular characterizationof the cotton GhTUBl gene that preferentially expressed in fiber.Plant Physiology 130 666-674 進(jìn) 亍)。(2)總 RNA 的純化。首先用 1U/1 μ 1 RQl DNase (Promega, Madison, USA)消化殘 留的 DNA。然后，用 Qiagen RNeasy mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒純化 RNA。(3)實時熒光定量RT-PCR研究基因的表達(dá)(按照Li XB, Fan XP, Wang XL, Cai L， Yang WC,2005. The Cotton A CTINl gene is functionally expressed in fibers and participates in fiberelongation. Plant Cell 17 :859_875 進(jìn)行)。首先，將棉花不同 組織(根、下胚軸、子葉、葉、花瓣、花藥、胚珠、纖維、15天齡的花藥、20天齡的花藥、25天齡 的花藥、30 天齡的花藥)的總 RNA (2 μ g/樣)用 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, USA)反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；然后，以cDNA為模板，用基因特異的引物(PPSP231RTP1和PSP231RTP2)和 Real-time PCRMaster Mix (TOYOBO，Japan)進(jìn)行定量 PCR 反應(yīng)。以棉花 polyubiquitin基因(GhUBIl)作為RT-PCR反應(yīng)的內(nèi)參，每個基因的表達(dá)水平相對值按公式 Y = 10Δ"/3·57Χ100%計算(其中 ACt = CtGhUBIl-CtPSP231,3. 57 是利用 GhUBIl 制備的 標(biāo)準(zhǔn)曲線y = -0. 28x+9. 87中斜率的倒數(shù)，表示基因表達(dá)相差10倍的PCR循環(huán)數(shù))。重復(fù) 3次，統(tǒng)計分析實驗結(jié)果。3. RNA組織原位雜交分析PSP231的表達(dá)(1)花藥材料的制片將新鮮花藥置于冰冷的FAA中，真空抽氣IOmin后，固定16h后用50%酒精清洗 3次，在50%、60%、70%、85%，95%、100%的酒精中逐級脫水30min，接著依次轉(zhuǎn)入體積比 為1 3、1 1、3 1的二甲苯乙醇溶液和體積比為9 1的二甲苯氯仿溶液中透明。 待樣品透明完全后，將其包埋在石蠟中進(jìn)行切片，切片厚度為7 μ m。選擇包含不同發(fā)育時期 的花藥切片的蠟帶，在38°C的展片臺上展片過夜。(2)按照 DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7) (Roche, Cat. No. 11175025910)的方法 制備RNA探針將PSP231的特異性片段構(gòu)建到載體pSPT19中，用T7或SP6RNA聚合酶進(jìn)行 體外轉(zhuǎn)錄。其中用T7RNA聚合酶合成的為雜交探針，SP6RNA聚合酶合成的為對照探針。(3)原位雜交分析PSP231的表達(dá)按照 Wang XL and Li XB, 2009. The GhACSl gene encodes an acyl-CoA synthetase which isessential for normal microsporogenesis in early anther development of cotton. Plant Journal 57(3) :473_86 介紹的方法進(jìn)行。4.PSP231 基因分離在其PSP231cDNA開放閱讀框(ORF)兩端設(shè)計一對引物，以棉花基因組DNA為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該基因的DNA全長序列。5. PSP231啟動子分離按照 Genome Walker Universal Kit (BD Biosciences Clontech, Cat. No. 638904) 的方法，用CPl和CP2引物從棉花基因組步移文庫中分離了 PSP231基因5’上游1253bp片段。5.啟動子PSP231p表達(dá)活性分析構(gòu)建PSP231p:⑶S融合表達(dá)載體，電擊法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404，然 后分別通過浸花法和浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草。GUS活性的組織化學(xué)染色分析按照Li XB, Cai L，Cheng NHiLiu JW,2002. Molecular characterization of the cotton GhTUBl gene that preferentiallyexpressed in fiber. Plant Physiology 130 :666_674 介紹的方法 進(jìn)行。6. PSP231啟動子缺失分析(1)以構(gòu)建好的PSP231P:⑶S載體質(zhì)粒為模板，在該啟動子5’端下游241bp、 446bp、650bp、863bp、1067bp 處分別設(shè)計引物 PSP231Pdl、PSP231Pd2、PSP231Pd3、PSP231Pd4和PSP231Pd5，將其分別與PSP231Pp2配對，擴(kuò)增出包含不同長度的啟動子片段。(2)構(gòu)建PSP231不同長度的啟動子片段與GUS融合表達(dá)載體，按照上述方法轉(zhuǎn)化 煙草，分析花粉中⑶S活性變化。其載體名稱分別為PSP231PD1，PSP231PD2 PSP231PD3， PSP231PD4, PSP231PD5。
7. PSP231基因功能分析構(gòu)建了 PSP231的RNA干涉載體，并轉(zhuǎn)化棉花，共獲得6個株系50余株棉花轉(zhuǎn)基因 植株。用PCR檢測證明外源DNA已導(dǎo)入棉花基因組后，將檢測的陽性植株移栽到大田，生長 發(fā)育至開花。用RT-PCR對這些轉(zhuǎn)基因植株中PSP231基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，選擇PSP231 的表達(dá)受到抑制的植株進(jìn)行花藥切片觀察。構(gòu)建PSP231的誘導(dǎo)型過量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化裂殖酵母，隨機(jī)挑選5個陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞 系進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，觀察細(xì)胞分裂并統(tǒng)計分裂指數(shù)。同時，用細(xì)胞核專一性染料DAPI對所選 擇的細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察細(xì)胞核分裂情況。然后，用流式細(xì)胞術(shù)對實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析 驗證。
權(quán)利要求
一個棉花基因PSP231，該基因包括開放閱讀框和3’端未翻譯區(qū)的cDNA序列如下1ATGGCTCGAT TAACATTAGT ATCGGTGCTA TTTCTCTGGG CAGGATCAAT GCTTATGGTC61 CAGGGCGGAG ATCCCACCCT TTTTTTCGAA TGGAACGTCA CCTATGGCAC CATTGCTCCC121 TTGGGAGTGC CAGTAAAGGG TATTCTTATT AACGGGCAAT TCCCGGGACC AAATATTAAC181 TCTACCACCA ACAACAATAT TGTGGTCAAT GTGTTCAATA ACCTTGATGA GCCATTCCTT241 GTAACATGGA ACGGCGTGCA GCATAGGAAG AACTCTTGGC AAGATGGTGT TCTGGGAACC301 AACTGTCCTA TCCCCCCTGG GAAGAATTAC ACCTATAAAT TCCAGGTGAA GGATCAGATT361 GGCAGCTACA TCTACTATCC GGTGACGGCT ATGCATAAGG CGGTTGGTGG TTTCGGTGGC421 CTCCGTGTTA ATAGCCGTCT ACTCATCCCT GTTCCCTACG CTGATCCGGC TGATGACTAT481 ACTCTCTTAG TGGGAGACTT TTTCAACAAG GGACACACCA GCCTCAAGAA GATTCTTGAT541 AGTGGTCGCA ACCTTGGGAG ATGTGACGGT GTTCACCTTA ATGGGAAAGT TGCAAAAGGT601 GATAGGAAGG ATGAACCTCT GTTTACGATG GAGGCAGGCA AAACGTACAA GTACAGGATT661 TGCAATACGG GTATCAAGAC ATCTCTGAAC GTCAGGTTCC AAGGCCACAC CATGAAATTG721 GTTGAGATGG AGGGTTCCCA CACAATGCAG AATGACTATG ACTCCCTTGA TGTGCATGTT781 GGACAGTGCT TCAGTGTGCT TGTTACTGCC AACCAGGAAC CAAGGGATTA CTATGTGGTG841 GCCTCTACCC GTTTTACCAG ACGTGAGGTT ACAGCAACTG GCATCATCCG TTACAAGAAT901 GGTAAGGGAG CTGCCTCATC CGAGTTGCCA CCACCACCTG TTGGTTGGGC TTGGTCACTC961 AATCAATTCC GTACCTTCCG TTGGAACTTG ACTTCTAACG CTGCTAGGCC TAACCCTCAG1021 GGCTCCTACA AATATGGTTC CATTAACATT ACCCGCACCA TCAAGCTTGC CAACACTGCA1081 CAAAAAGTAG ATGGCAAGCT CCGATATGCT CTTAATGGAG TCTCCTATGT CGAACCAACC1141 ACTCCACTAA AACTTGCAGA ATACTACGGC GTAGCCGACA AGGTTTTCAA GTATGATACC1201 ATTCCCGATG AGCCACAAAG TGACAACACT AAGGTAACTT TGGCACCTAT TGTGCTGAAC1261 ATGACACACA GAAACTTTGT GGAAATAATC TTCGAGAATC ACGAGAGCGC CATTCAGTCT1321 TACCACTTGT CTGGCTACTC ATTCTTTGCT GTGGGCATGG ACGTTGGGAA ATGGAGCCCC1381 GAGAAGAGGA TGAACTACAA TCTTCTTGAC GCCGTGAGCA GACACACCAT ACAGGTATTC1441 CCCAACTCCT GGTCAGCAAT CCTATTGACA TTCGACAACT GCGGGATGTG GAACCTGAGG1501 TCGGAGATAT GGGACAGGCA TTACCTTGGG CAACAGCTTT ATGCTAGTGT TATTTCCCCT1561 AACCGATCCC TCAAGGATGA GTACAACTTG CCGGAAGGTG TATTGACTTG CGGCATCGTG1621 CAAGGCATGC CAAGGCCTCC ACCTTTCAGC AGTTAATTTA ATTAAGCTTA TAAATCTGTA1681 TCCAATTATG GTATATGAGG AGAGAGAGGG TGAGAAAAGC TTGAGTTCCA AATGTATTTA1741 ATGAAATAAA ATGTTTTGGA CCATATGTTT ATACTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1795基因的編碼區(qū)從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA為1656bp。
2.如權(quán)利要求1所述的一個棉花基因PSP231，其特征在于，PSP231基因包括3個外顯 子和2個內(nèi)含子的DNA全序列為，1 ATGGCTCGAT TAACATTAGT ATCGGTGCTA TTTCTCTGGG CAGGATCAAT GCTTATGGTC 61 CAGGGCGGAG ATCCCACCCT TTTTTTCGAA TGGAACGTCA CCTATGGCAC CATTGCTCCC 121 TTGGGAGTGC CAGTAAAGGG TATTCTTATT AACGGGCAAT TCCCGGGACC AAATATTAAC 181 TCTACCACCA ACAACAATAT TGTGGTCAAT GTGTTCAATA ACCTTGATGA GCCATTCCTT 241 GTAACATGGT AAGCGACTAC CAAGAGTATT TTCTTTTTTA CATTAATATG ATTATGCTAG[301 TGAAGAGTTG AGCTAATTAT ATGTGGAAAT GGGATTTGTT GCAGGAACGG CGTGCAGCAT 361 AGGAAGAACT CTTGGCAAGA TGGTGTTCTG GGAACCAACT GTCCTATCCC CCCTGGGAAG 421 AATTACACCT ATAAATTCCA GGTGAAGGAT CAGATTGGCA GCTACATCTA CTATCCGGTG 481 ACGGCTATGC ATAAGGCGGT TGGTGGTTTC GGTGGCCTCC GTGTTAATAG CCGTCTACTC 541 ATCCCTGTTC CCTACGCTGA TCCGGCTGAT GACTATACTC TCTTAGTGGG AGACTTTTTC 601 AACAAGGGAC ACACCAGCCT CAAGAAGATT CTTGATAGTG GTCGCAACCT TGGGAGATGT 661 GACGGTGTTC ACCTTAATGG GAAAGTTGCA AAAGGTGATA GGAAGGATGA ACCTCTGTTT 721 ACGATGGAGG CAGGCAAAAC GTACAAGTAC AGGATTTGCA ATACGGGTAT CAAGACATCT 781 CTGAACGTCA GGTTCCAAGG CCACACCATG AAATTGGTTG AGATGGAGGG TTCCCACACA 841 ATGCAGAATG ACTATGACTC CCTTGATGTG CATGTTGGAC AGTGCTTCAG TGTGCTTGTT 901 ACTGCCAACC AGGAACCAAG GGATTACTAT GTGGTGGCCT CTACCCGTTT TACCAGACGT 961 GAGGTTACAG CAACTGGCAT CATCCGTTAC AAGAATGGTA AGGGAGCTGC CTCATCCGAG 1021 TTGCCACCAC CACCTGTTGG TTGGGCTTGG TCACTCAATC AATTCCGTAC CTTCCGTTGG 1081 AACTTGACTT CTAACGCTGC TAGGCCTAAC CCTCAGGGCT CCTACAAATA TGGTTCCATT 1141 AACATTACCC GCACCATCAA GCTTGCCAAC ACTGCACAAA AAGTAGATGG CAAGCTCCGA 1201 TATGCTCTTA ATGGAGTCTC CTATGTCGAA CCAACCACTC CACTAAAACT TGCAGAATAC 1261 TACGGCGTAG CCGACAAGGT TTTCAAGTAT GATACCATTC CCGATGAGCC ACAAAGTGAC 1321 AACACTAAGG TAACTTTGGC ACCTATTGTG CTGAACATGA CACACAGAAA CTTTGTGGAA 1381 ATAATCTTCG AGAATCACGA GAGCGCCATT CAGTCTTACC ACTTGTCTGG CTACTCATTC 1441 TTTGCTGTGG GGTAAGTATA GCTTCTAACA TAGCCAATAC ATGTGGTGAT TTGCTTGAGT 1501 TGAAGTAATA AGTTGTATAA TGATTTGTCG CAGCATGGAC GTTGGGAAAT GGAGCCCCGA 1561 GAAGAGGATG AACTACAATC TTCTTGACGC CGTGAGCAGA CACACCATAC AGGTATTCCC 1621 CAACTCCTGG TCAGCAATCC TATTGACATT CGACAACTGC GGGATGTGGA ACCTGAGGTC 1681 GGAGATATGG GACAGGCATT ACCTTGGGCA ACAGCTTTAT GCTAGTGTTA TTTCCCCTAA 1741 CCGATCCCTC AAGGATGAGT ACAACTTGCC GGAAGGTGTA TTGACTTGCG GCATCGTGCA 1801 AGGCATGCCA AGGCCTCCAC CTTTCAGCAG TTAA 1834 PSP231基因的內(nèi)含子用斜體和下劃線表示。
3.如權(quán)利要求1所述的一個棉花基因PSP231，其特征在于，PSP231基因編碼區(qū)翻譯的 蛋白質(zhì)序列如下 [1 MARLTLVSVL FLffAGSMLMV QGGDPTLFFE WNVTYGTIAP LGVPVKGILI NGQFPGPNIN 61 STTNNNIVVN VFNNLDEPFL VTffNGVQHRK NSffQDGVLGT NCPIPPGKNY TYKFQVKDQI 121 GSYIYYPVTA MHKAVGGFGG LRVNSRLLIP VPYADPADDY TLLV⑶FFNK GHTSLKKILD 181 SGRNLGRCDG VHLNGKVAKG DRKDEPLFTM EAGKTYKYRI CNTGIKTSLN VRFQGHTMKL 241 VEMEGSHTMQ NDYDSLDVHV GQCFSVLVTA NQEPRDYYVV ASTRFTRREV TATGIIRYKN 301 GKGAASSELP PPPVGffAffSL NQFRTFRffNL TSNAARPNPQ GSYKYGSINI TRTIKLANTA 361 QKVDGKLRYA LNGVSYVEPT TPLKLAEYYG VADKVFKYDT IPDEPQSDNT KVTLAPIVLN 421 MTHRNFVEII FENHESAIQS YHLSGYSFFA VGMDVGKffSP EKRMNYNLLD AVSRHTIQVF 481 PNSffSAILLT FDNCGMWNLR SEIffDRHYLG QQLYASVISP NRSLKDEYNL PEGVLTCGIV 541 QGMPRPPPFS S 551
4.如權(quán)利要求1所述的一個棉花基因PSP231，其特征在于，PSP231基因上游序列包括 5’端未翻譯區(qū)和啟動子片段下`1 ACTATAGGGC ACGCGTGGTC GACGGCCCGG GCTGGTCCTT ATTTTTTTAT CCAAGCCCAT 61 TTTTCGAGCC TATATTTTTG CTCAAACCCT CTCACATTTC AGACGGGTCT TCGAGCTTGG 121 CTGAGTGGCC CGACCCATGA ACAAGTCTAA ACAGTACTTA GGTTCTTGGC ATAATTACCA 181 CTGGCAAATT TGTTTAATTC TTAAATCAAT TCTCTTTATT TTATTCACCT TACAATTTAG 241 TCTTTGATCA ATAATTACTA TTCTTTCAAT CTAGTCCTTG TACTTAATAA TTTATCTAAT 301 TTAATCACTT AATAATTCTA ATTTCTAATT TCATGTTCAT CTTGTAAATG TCTCGATTTA 361 ATATTTTTGG ACTAGTTCGG CTTCGAGAAT TTAGCCTCAA AATCAAATCT TTTGACCCTA 421 ATGAAAATCA GAATGTTATA TGCAAAATGC TCGACATCCT GCAAGGTCTC CATAATAGAT 481 TTCTTCATAT TTGTGTCATT GTTGCTCATG TCTGATCCAC CTCTAGTATT CACTTCAACC 541 GTAACAATGG TCATATTTGT TGCCATGAGT GATGTGGAAA TTTTTTTAAA AATGTCATTA 601 AGTAATTTGA AATAGACCAT GAATAATGTG GTGGAAAGAG TTAATAAAAT AATTTCTCCA 661 CATTTTGGGT GATCAATATT TAATTTATTA TAAAATTTCT CGTAGATGAT GTCACAAATG 721 GATTTGTTAT GTATGCGTAA ACTCTTGAAA AAAAAACTAT AATAAAATTT CTCGTAGATG 781 ATGTCACATA ATTTGTCATA ATTTAAGCTT TCATATAAGA AGGTTAGTTT CACATTAATA 841 CAATTTCTAT TTTTAAAAAT TACAATAGTT TATCTATATG TATAATAAAA GAATAAATAA 901 AAAGGTTAAA AAAAAGCACT AAAGTATTTT TCATAGAAGC AACTACTTTC CTAAAGAAAA 961 GGTTAGCCAT CCATATAGTG AATATTCAAA TCCTTGTGAT AACAGAAAAG AATGATTCAA 1021 CATTGTAAAA CTAAAAATGG TTAGTGCTAA AAGGAAGGAA ATAAATGAAT GGATGAGCTT 1081 ATTCTAAGGG ATTAAGATGG AAGAATGGAA GAGGGGGTTG TGTGGTATAA AAGGAGAGGT 1141 ATGCATGCAA TTCAAAATCA ACTCAAGCTA ATCATCTCCC TCTTCCTCTA GAGGGGATAA 1201 ACAGTATAAT AAATTATATT GGAGGCGTGG TCGGCAAAAA AAAGGGTTAA GAG 125全文摘要
從棉花中分離鑒定了一個新的花粉特異表達(dá)的基因PSP231，其cDNA包含1656bp的開放閱讀框架，編碼一個新的含有551氨基酸的功能未知蛋白。PSP231基因只在棉花雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)，在營養(yǎng)細(xì)胞中不表達(dá)。GUS活性分析也證明PSP231啟動子具有花粉特異性表達(dá)活性。該基因啟動子在其起始密碼子前236位處含有一個細(xì)胞分裂素KT應(yīng)答因子ARR1結(jié)合位點，且KT處理后基因表達(dá)量顯著上升，表明PSP231可能受到ARR1的調(diào)控，并在細(xì)胞分裂過程中起著一定的作用。利用RNAi干擾技術(shù)，抑制該基因表達(dá)會導(dǎo)致花粉敗育。相反，在酵母中過量表達(dá)PSP231基因能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂，顯著增加細(xì)胞分裂指數(shù)。上述資料表明PSP231可能在棉花小孢子進(jìn)行有絲分裂，形成成熟花粉的過程中起著非常重要的作用。
文檔編號C07K14/415GK101838655SQ20101014608
公開日2010年9月22日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者姜佳, 李學(xué)寶, 李揚, 李瓅, 王秀蘭 申請人:華中師范大學(xué)