專利名稱：一種利用具有特異識別功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有生物活性神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，具體地說是一種具 有特異識別功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂工業(yè)化生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
神經(jīng)節(jié)苷脂類化合物(Gangliosides)，具有非常重要的生物功能，它是一種分子 量小的糖脂類復(fù)合物貭，能穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，鑲嵌在受損的神經(jīng)細(xì)胞膜上，修復(fù)受損 的神經(jīng)。它是當(dāng)今國際公認(rèn)的可以直接作用于人腦細(xì)胞，即神經(jīng)系統(tǒng)的營養(yǎng)和生長因子，可 以治療神經(jīng)損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生，對不同時(shí)期、不同原因、不同程度的神經(jīng)損傷、退化、衰老 均有修復(fù)作用。具有四大醫(yī)學(xué)功能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞及大腦組織的正常發(fā)育，防治腦癱等疾 病，修復(fù)損傷神經(jīng)及大腦組織，防治中風(fēng)等疾?。辉鰪?qiáng)大腦的學(xué)習(xí)記憶功能，消除頭昏頭痛 等癥狀；延緩神經(jīng)細(xì)胞的衰老、防治老年癡呆等疾病。研究證明哺育動物腦組織中含量較 多，約有20-50多種，其化學(xué)結(jié)構(gòu)基本相同，幾種主要成分，其差別僅是分子中所含唾液酸 數(shù)目多少不同或糖鏈的組成與連接位置有所不同。它具有廣泛的適應(yīng)癥，與神經(jīng)生長因子 等藥物相比，是目前唯一的能通過血腦屏障進(jìn)入大腦，并有確切療效一種物質(zhì)。
科學(xué)研究的發(fā)展，基因工程方法已取代了干擾素、白介素、胰島素等的制備，但由 于神經(jīng)節(jié)苷這類化合物種類多、含量少，分子組成結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，多變，物理化學(xué)性質(zhì)等因 素十分相近，基因工程和生物模擬合成均難以引用實(shí)現(xiàn)。目前只能依賴生物提取方法獲得。 國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室在提取、分離、純化神經(jīng)節(jié)苷脂方面進(jìn)行了大量探索。1942年，美國科學(xué) 家發(fā)現(xiàn)在哺育動物的神經(jīng)細(xì)胞膜中存在神經(jīng)節(jié)苷脂；60年代日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)哺育動物大 腦中神經(jīng)節(jié)苷脂含量最高；70年代，美、加、意等多國科學(xué)家先后發(fā)明了神經(jīng)節(jié)苷脂的化學(xué) 提取方法，但一直沿用1957年Folch等發(fā)明的分層技術(shù)1976年T. Momoi等[T. Momoi (1976) B. B. A. 441,488-497]首次報(bào)道了使用 DEAE-Seee印hadex A-25 及多空球 latrobeads, 1985 年和2006年天津南開大學(xué)報(bào)道了關(guān)于大孔樹脂分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂技術(shù)。95年我國開始 科研突破，成為世界上第三個(gè)有能力提取節(jié)苷脂的國家。但目前該研究領(lǐng)域中，現(xiàn)有的分離 純化方法一直沿用硅膠、大孔樹脂柱層析法。其一柱層析需要順沖、反沖，有時(shí)因柱堵塞而 需要掏樹脂等，多有操作步驟繁瑣、工藝復(fù)雜、處理周期長，不宜大量制備等缺點(diǎn)，不適合產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)。其二 柱層析致使色譜介質(zhì)與提取液不能充分的混合，且目前所采用的硅膠樹脂 對目標(biāo)分子不具有特異的選擇功能，多有產(chǎn)率低、成本高。到目前為止未發(fā)現(xiàn)簡便、高效、大 批量制備高純度神經(jīng)節(jié)苷脂新的分離純化方法和工藝。目前神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率很高且 往往缺乏有效的治療措施，像神經(jīng)節(jié)苷脂療效確切，副作用小的新藥具有廣泛的市場需求， 急待研究開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工藝。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是 本發(fā)明根據(jù)神經(jīng)節(jié)苷脂的分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)(既溶于水又溶入脂肪溶劑，即具有兩 性性質(zhì)。)和分子印跡理論，及麥飯石可以吸附陽離子，殼聚糖在酸性溶液中帶有正電荷可 以吸附陰離子等特性，研制了對神經(jīng)節(jié)苷脂具有特異識別功能的色譜介質(zhì)。該色譜介質(zhì)與 提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，采用靜態(tài)吸附與洗脫的方法，建立了分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的一種新的生產(chǎn)工藝，得到了很好的分離效果，分離純化獲得的神經(jīng)節(jié)苷脂，經(jīng)高壓液相色 譜測定結(jié)果表明，與進(jìn)口針劑相比基本一致?！N利用具有特異識別功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工 藝，該工藝包括靜態(tài)吸附、洗脫和濃縮干燥三步驟1)靜態(tài)吸附動物腦組織加提取液，勻漿，離心，分層；分層后的上清液直接加入 具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，攪拌吸附1-2小時(shí)，使具有特異識別功能的色譜介質(zhì)與提 取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，盡量減少提取過程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失。2)洗脫將吸附了神經(jīng)節(jié)苷脂的具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，直接加入到洗脫 液中攪拌洗脫1-2小時(shí)。3)濃縮干燥將洗脫液濃縮，并在-70° --20°的環(huán)境下冷凍干燥，可獲得神經(jīng)節(jié) 昔月旨廣品。上述動物腦組織和提取液的質(zhì)量百分比為1 10-15。上述提取液為氯仿和甲醇按1-5 2-8的比例混合而成。上述洗脫液為氯仿和甲醇按3-5 1-3的比例混合而成。上述動物腦組織為哺乳動物的鮮腦組織，哺乳動物優(yōu)選豬、牛、羊。整個(gè)提取過程的溶液PH值在1. 0-6. 0之間。具有特異識別功能的色譜介質(zhì)的研制包括對麥飯石的預(yù)處理和特異識別功能的 色譜介質(zhì)的制備1)對麥飯石預(yù)處理將粒度為20-60目的麥飯石加入到0. 5-2. 5mol/L鹽酸中，麥 飯石與鹽酸溶液的質(zhì)量比為1 10-15 ；浸泡時(shí)間為20-38小時(shí)；浸泡完畢后用蒸餾水將麥 飯石洗至中性，烘干備用。2)特異識別功能的色譜介質(zhì)的制備先將乙酰度為90% -60%的殼聚糖加入到濃 度為1-8%的醋酸溶液之中，配制成濃度為0. 1%-0.5%的殼聚糖溶液60-180!111 ；再將已經(jīng) 處理好的20-80g的麥飯石加入到殼聚糖溶液中調(diào)成糊狀，最后將此糊狀混合物加熱干燥， 研細(xì)過90-120目篩，即得具有特異識別功能的色譜介質(zhì)。本發(fā)明的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生 產(chǎn)工藝與現(xiàn)有技術(shù)相比，所產(chǎn)生的有益效果是1)該發(fā)明改變了人們在節(jié)苷脂的分離純化過程中一直沿用的柱層析法。省去了柱 層析，需要順沖、反沖，有時(shí)因柱堵塞而需要掏樹脂等繁雜步驟，縮短了分離純化周期，確保 了節(jié)苷脂的純度，提高了產(chǎn)率，本法操作簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。2)該發(fā)明采用靜態(tài)吸附與洗脫的方法，使色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混 合，盡量減少了提取過程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失，與目前沿用的大孔樹脂層析法相比可提高 產(chǎn)率15-20% ；縮短了分離純化時(shí)間10-38倍。

附圖1為常見神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)。附圖2為神經(jīng)節(jié)苷脂的分子結(jié)構(gòu)。附圖3為標(biāo)準(zhǔn)品的神經(jīng)節(jié)苷脂高效液相色譜圖。附圖4為實(shí)施例1的神經(jīng)節(jié)苷脂高效液相色譜圖。附圖5為實(shí)施例2的神經(jīng)節(jié)苷脂高效液相色譜圖。附圖6為實(shí)施例3的神經(jīng)節(jié)苷脂高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面分別以豬、牛、羊三種哺乳動物的的鮮腦組織為例來具體說明本發(fā)明。三個(gè)實(shí) 施例僅 僅是對本發(fā)明的舉例說明，并不限定本發(fā)明，凡是以哺乳動物的鮮腦組織加之本發(fā) 明的提取工藝，都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1 以豬鮮腦組織為例進(jìn)行說明。1)特異識別功能的色譜介質(zhì)的研制麥飯石的預(yù)處理將粒度為20-60目的麥飯石加入到lmol/L鹽酸中，麥飯石與鹽 酸溶液的質(zhì)量比為1 12;浸泡時(shí)間為30小時(shí)；除去有機(jī)物等雜質(zhì)，浸泡完畢后用蒸餾水 將麥飯石洗至中性，烘干備用；特異識別功能的色譜介質(zhì)的制備先將乙酰度為75%的殼聚糖加入到濃度為6% 的醋酸溶液之中，配制成濃度為0. 3%的殼聚糖溶液60ml ；再將已經(jīng)處理好的20g的麥飯石 加入到殼聚糖溶液中調(diào)成糊狀，使之充分浸潤，將此糊狀置于微波爐中，加熱干燥，研細(xì)過 100目篩，即得具有特異識別功能的色譜介質(zhì)。豬的鮮腦組織加提取液(氯仿和甲醇按3 6的比例混合)，按質(zhì)量比1 10的 比例勻漿，離心，分層；分層后的上清液直接加入具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，攪拌吸附 1. 5小時(shí)，使具有特異識別功能的色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，盡量減少提取 過程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失。將吸附了神經(jīng)節(jié)苷脂的具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，直接加入到洗脫液(氯仿 和甲醇按4 2)的比例混合中攪拌洗脫1.5小時(shí)。合并洗脫液，并在-45°的環(huán)境下冷凍干燥，可獲得神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)品。整個(gè)提取過程調(diào)PHl. 0-6.0。獲得的產(chǎn)品，純度與進(jìn)口針劑純度相當(dāng)。每千克豬鮮腦組織可提取單一成分神經(jīng)節(jié)苷脂1. 2-1. 5克，從色譜圖可以看出純 度與標(biāo)準(zhǔn)品相同，與進(jìn)口針劑純度相同。實(shí)施例2 以牛鮮腦組織為例進(jìn)行說明。1)特異識別功能的色譜介質(zhì)的研制麥飯石的預(yù)處理將粒度為20-60目的麥飯石加入到2. 5mol/L鹽酸中，麥飯石與 鹽酸溶液的質(zhì)量比為1 15;浸泡時(shí)間為38小時(shí)；除去有機(jī)物等雜質(zhì)，浸泡完畢后用蒸餾 水將麥飯石洗至中性，烘干備用；特異識別功能的色譜介質(zhì)的制備先將乙酰度為90%的殼聚糖加入到濃度為8%的醋酸溶液之中，配制成濃度為0. 5%的殼聚糖溶液120ml ；再將已經(jīng)處理好的50g的麥飯 石加入到殼聚糖溶液中調(diào)成糊狀，之充分浸潤，將此糊狀置于微波爐中，加熱干燥，研細(xì)過 120目篩，即得具有特異識別功能的色譜介質(zhì)。牛的鮮腦組織加提取液(氯仿和甲醇按5 8的比例混合)，按質(zhì)量比1 13的 比例勻漿，離心，分層；分層后的上清液直接加入具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，攪拌吸附 2小時(shí)，使具有特異識別功能的色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，盡量減少提取過 程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失。將吸附了神經(jīng)節(jié)苷脂的具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，直接加入到洗脫液(氯仿 和甲醇按5 3)的比例混合中攪拌洗脫2小時(shí)。合并洗脫液，并在-70°的環(huán)境下冷凍干燥，可獲得神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)品。整個(gè)提取過程調(diào)PHl. 0-6.0。 獲得的產(chǎn)品，純度與進(jìn)口針劑純度相當(dāng)。每千克牛腦組織可提取神經(jīng)節(jié)苷脂單一成分1. 4-1. 8克.純度與標(biāo)準(zhǔn)品相同.與 進(jìn)口針劑純度相同。實(shí)施例3 以羊鮮腦組織為例進(jìn)行說明。1)特異識別功能的色譜介質(zhì)的研制麥飯石的預(yù)處理將粒度為20-60目的麥飯石加入到0. 5mol/L鹽酸中，麥飯石與 鹽酸溶液的質(zhì)量比為1 10;浸泡時(shí)間為20小時(shí)；除去有機(jī)物等雜質(zhì)，浸泡完畢后用蒸餾 水將麥飯石洗至中性，烘干備用；特異識別功能的色譜介質(zhì)的制備先將乙酰度為60%的殼聚糖加入到濃度為 的醋酸溶液之中，配制成濃度為0. 的殼聚糖溶液180ml ；再將已經(jīng)處理好的80g的麥飯 石加入到殼聚糖溶液中調(diào)成糊狀，之充分浸潤，將此糊狀置于微波爐中，加熱干燥，研細(xì)過 90目篩，即得具有特異識別功能的色譜介質(zhì)。羊的鮮腦組織加提取液(氯仿和甲醇按1 2的比例混合)，按質(zhì)量比1 15的 比例勻漿，離心，分層；分層后的上清液直接加入具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，攪拌吸附 1小時(shí)，使具有特異識別功能的色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，盡量減少提取過 程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失。將吸附了神經(jīng)節(jié)苷脂的具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，直接加入到洗脫液(氯仿 和甲醇按3 1)的比例混合中攪拌洗脫1小時(shí)。合并洗脫液，并在-20°的環(huán)境下冷凍干燥，可獲得神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)品。整個(gè)提取過程調(diào)PHl. 0-6.0。獲得的產(chǎn)品，純度與進(jìn)口針劑純度相當(dāng)。每千克羊腦組織可提取神經(jīng)節(jié)苷脂單一成分1. 0-1. 2克.純度與標(biāo)準(zhǔn)品相同.與 進(jìn)口針劑純度相同。
權(quán)利要求
一種利用具有特異識別功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于該工藝包括靜態(tài)吸附、洗脫和濃縮干燥三步驟1)靜態(tài)吸附動物腦組織加提取液，勻漿，離心，分層；分層后的上清液直接加入具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，攪拌吸附1-2小時(shí)，使具有特異識別功能的色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，盡量減少提取過程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失；2)洗脫將吸附了神經(jīng)節(jié)苷脂的具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，直接加入到洗脫液中攪拌洗脫1-2小時(shí)；3)濃縮干燥將洗脫液濃縮，并在-70°--20°的環(huán)境下冷凍干燥，可獲得神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用具有特異識別功能色譜介質(zhì)快速分離純化神 經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，上述動物腦組織和提取液的質(zhì)量百分比為 1 10-15。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，上述提取液為氯仿和甲醇按1-5 2-8的比例混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，上述洗脫液為氯仿和甲醇按3-5 1-3的比例混合而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，動物腦組織為哺乳動物的鮮腦組織。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，哺乳動物為豬、牛、羊。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，整個(gè)提取過程的溶液PH值在1. 0-6. 0之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用具有特異功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂 的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，具有特異識別功能的色譜介質(zhì)的研制包括對麥飯石的預(yù) 處理和特異識別功能的色譜介質(zhì)的制備1)對麥飯石預(yù)處理將粒度為20-60目的麥飯石加入到0.5-2. 5mol/L鹽酸中，麥飯石 與鹽酸溶液的質(zhì)量比為1 10-15 ；浸泡時(shí)間為20-38小時(shí)；浸泡完畢后用蒸餾水將麥飯石 洗至中性，烘干備用；2)特異識別功能的色譜介質(zhì)的制備先將乙酰度為90%-60%的殼聚糖加入到濃度為 1-8%的醋酸溶液之中，配制成濃度為0. 1%-0. 5%的殼聚糖溶液60-180ml ；再將已經(jīng)處理 好的20-80g的麥飯石加入到殼聚糖溶液中調(diào)成糊狀，最后將此糊狀混合物加熱干燥，研細(xì) 過90-120目篩，即得具有特異識別功能的色譜介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用具有特異識別功能色譜介質(zhì)快速分離純化神經(jīng)節(jié)苷脂的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，該工藝包括靜態(tài)吸附、洗脫和濃縮干燥三步驟。靜態(tài)吸附動物腦組織加提取液，勻漿，離心，分層；分層后的上清液直接加入具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，攪拌吸附1-2小時(shí)，使具有特異識別功能的色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合；洗脫將吸附了神經(jīng)節(jié)苷脂的具有特異識別功能的色譜介質(zhì)，直接加入到洗脫液中攪拌洗脫1-2小時(shí)；濃縮干燥將洗脫液濃縮，并在-70°-20°的環(huán)境下冷凍干燥，可獲得神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)品。該發(fā)明采用靜態(tài)吸附與洗脫的方法，使色譜介質(zhì)與提取液進(jìn)行充分的攪拌與混合，盡量減少了提取過程中神經(jīng)節(jié)苷脂的丟失，與目前沿用的大孔樹脂層析法相比可提高產(chǎn)率15-20％；縮短了分離純化時(shí)間10-38倍，該法操作簡單，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07H1/08GK101838295SQ20101014656
公開日2010年9月22日 申請日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者萬春燕, 李傳勝, 李宗霖, 李桂鳳 申請人:李桂鳳