專利名稱：液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用液-固萃取體系從血液中分離純化血清白蛋白的方法，更具體地說(shuō)是涉及用液-固萃取體系從人血漿或牛血漿中純化血清白蛋白的方法。更具體地說(shuō)， 是通過(guò)分子識(shí)別機(jī)理，用聚乙二醇(PEG) 二元脂肪酸修飾物混合聚合物-鹽-水液-固親 和萃取法從血液中提取血清白蛋白。
背景技術(shù)：
血清白蛋白是一種水溶性很強(qiáng)的蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能結(jié)合多種小分子，在醫(yī)學(xué)臨床 及生物領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)的分離純化原理主要基于溶解度差異、電荷差異、分子 大小、疏水作用、生物親和差異來(lái)達(dá)到分離的。作為生物分子，蛋白質(zhì)的分離純化與其它化 學(xué)產(chǎn)品的分離有很大的差異通常完成一次產(chǎn)品的純化需要好幾種方法結(jié)合使用，一般分 為前處理、粗分離、細(xì)分離和結(jié)晶四個(gè)步驟。隨著人類對(duì)蛋白質(zhì)認(rèn)識(shí)的深入，分離純化方法 也一直在改進(jìn)，當(dāng)今純化研究的重點(diǎn)在提高純度、回收率，降低成本、減少繁冗的操作時(shí)間 和步驟。目前，血清白蛋白的分離純化方法有很多種，各自都具有一定的特點(diǎn)，歸納起來(lái)主 要有以下方法1、利用溶解度差異分離純化血清白蛋白沉淀法是一種初級(jí)分離技術(shù)，但是，多步操作也可以獲得高純度的目標(biāo)產(chǎn)品。(1)鹽沉淀法蛋白質(zhì)在不同濃度的中性鹽溶液中溶解度有不同程度的降低，采用添加中性鹽的 方法使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來(lái)的方法，叫鹽析法，比如硫酸銨、利凡諾、辛酸鹽沉淀 法。但是鹽析法可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚合體或蛋白質(zhì)變性，影響藥用效果，自動(dòng)化程度低、生產(chǎn) 周期長(zhǎng)、成本高、純化倍數(shù)低。因此，在目前的實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。(2)有機(jī)溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入乙醇等水溶性溶劑之后，水的活度降低，利用有機(jī)溶劑較低 的介電常數(shù)來(lái)沉淀白蛋白。最常用的是冷乙醇沉淀法，即著名的Cohn法。雖然廣泛應(yīng)用于 工業(yè)生產(chǎn)，但乙醇沉淀法也有一些不足乙醇是一種非特異性沉淀劑，盡管對(duì)人血清白蛋白 HSA生產(chǎn)效果顯著，但產(chǎn)品純度不是很高；作為有機(jī)溶劑的乙醇還可能使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集 變性或者二級(jí)構(gòu)象改變；生產(chǎn)不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，生產(chǎn)周期長(zhǎng)；在非封閉式的環(huán)境中有機(jī)溶 劑對(duì)工作人員危害也較大，同時(shí)也有可能由于環(huán)境不潔造成產(chǎn)品污染。(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法PEG沉淀的條件溫和，可以避免蛋白質(zhì)聚集或變性，而且沉淀完全，但大量PEG價(jià) 格較貴，從白蛋白溶液中除去在工業(yè)生產(chǎn)上需較大成本。Μ. I. Jimenez等人將聚乙二醇和乙 醇結(jié)合來(lái)純化血清白蛋白，分離迅速，并達(dá)到了實(shí)驗(yàn)室中等分離規(guī)模。但又用到了有機(jī)溶劑乙醇。2、利用電荷差異分離純化血清白蛋白
(1)離子交換色譜這是迄今利用較廣泛的色譜技術(shù)，在純化中占了 75%。因?yàn)樗哂蟹直媛矢?，交換 容量大以及明確的作用機(jī)理等特點(diǎn)。在白蛋白的分離純化上有很重要的作用。但色譜柱的 再生、保存、使用步驟煩瑣，以及容易出現(xiàn)柱阻塞等問(wèn)題，限制了它的進(jìn)一步使用。(2)電泳法電泳分離的原理和操作形式多樣，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，成為分離純化，特別是鑒定 蛋白質(zhì)的有力工具，現(xiàn)在正向綜合方向發(fā)展。尹開(kāi)吉等利用壓力驅(qū)動(dòng)的毛細(xì)管等電聚焦分 離牛血清白蛋白和血紅蛋白，得到了理想的分離結(jié)果，且操作簡(jiǎn)單。K. A. Denton等用中性涂 布的高效毛細(xì)管分離臨床用HSA，得到了八種組分峰。但是電泳法分離純化蛋白質(zhì)的量很 少，不屬制備范疇，無(wú)法滿足制備需求，且電泳過(guò)程中產(chǎn)生的熱量可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，并 且成本也很高。3、利用分子大小差異(1)凝膠層析法這是20世紀(jì)60年代初發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)單有效的技術(shù)。利用凝膠分子篩對(duì)大 小、形狀不同的蛋白進(jìn)行分離。分子大小相差25%的樣品，通過(guò)單一的凝膠就可以完全分 開(kāi)。應(yīng)用于提純蛋白質(zhì)、激素、核酸等。同時(shí)還可以進(jìn)行脫鹽、濃縮、脫色、去熱原。具有分 離效果好、操作簡(jiǎn)單方便、分離廣泛及不影響生物活性的特點(diǎn)。但是分辨率不高，分離操作 較慢，對(duì)于質(zhì)量差異不大的樣品難以達(dá)到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品黏度不宜太 高。凝膠顆粒有時(shí)還有非特異性的吸附現(xiàn)象。(2)離心法離心法具有可以迅速將沉淀和上清液分開(kāi)、應(yīng)用范圍廣，成本低等特點(diǎn)，但無(wú)法獲 得純度很高的產(chǎn)品。并且受樣品濃度影響，離心力過(guò)大常會(huì)導(dǎo)致樣品顆粒變性、聚集而失 活。4、利用特殊選擇性分離純化血清白蛋白楊利等用IDA型固定化鎳離子金屬螯合親和膜色譜對(duì)HSA分離純化，產(chǎn)品經(jīng)毛細(xì) 管電泳分析，純度與Sigma公司的電泳純HSA相當(dāng)，回收率可達(dá)85%以上。Sinan Akgol等用苯乙二醇二聚異丁烯酸和二羥乙基異丁烯在水分散介質(zhì)里通過(guò) 基團(tuán)懸浮聚合得聚合物珠，從人血漿中吸附HSA量，為95. 7mg. g_l，純度為88%，珠可重復(fù) 使用未見(jiàn)吸附容量顯著減少。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，納米技術(shù)，膜技術(shù)等現(xiàn)代化的材料與蛋白質(zhì)生物親和性結(jié) 合，正在成為未來(lái)分離純化發(fā)展的一個(gè)新興方向。5、萃取法利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方 法稱為萃取。用于血清白蛋白萃取的方法主要有反膠團(tuán)萃取法、雙水相萃取法等。(1)反膠團(tuán)萃取法比如Tianxi Zhang等用游離的Cibacron Blue 3GA組成的反膠團(tuán)萃取BSA。 Gordon C. Kresheck等加熱含有乙酸二甲次膦酸氧化物和蛋白質(zhì)的水溶液形成雙水相并分 離BSA。李詳村等用CATB (十六烷基三甲基溴化銨)/異辛烷/正戊醇反膠團(tuán)萃取法純化 BSA等，但此法始終處于基礎(chǔ)研究階段，工業(yè)運(yùn)用還有很多問(wèn)題，無(wú)制備級(jí)研究報(bào)道。
(2)雙水相萃取法從1955年Albertson發(fā)明雙水相體系到1979年德國(guó)人kula等人將雙水相萃取 技術(shù)應(yīng)用于生物產(chǎn)品分離，目前已經(jīng)成功的應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、病毒等生物產(chǎn)品的分離純 化，雙水相體系也成功的應(yīng)用到生物轉(zhuǎn)化以及生物分析中。近年來(lái)，雙水相萃取技術(shù)的分離 對(duì)象進(jìn)一步擴(kuò)大到抗生素、多肽、氨基酸、重金屬和植物有效成分中的小分子物質(zhì)。雙水相 技術(shù)應(yīng)用于血清白蛋白分離純化的報(bào)道較多，比如鄧凡政等用四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪 唑([Bmim]BF4)和KH2PO4形成的離子液體雙水相體系萃取分離BSA。在最佳條件下離子液體 雙水相體系對(duì)BSA有較高的正向萃取率。童愛(ài)軍等利用陰陽(yáng)離子型表面活性劑雙水相萃取 色氨酸衍生物和牛血清白蛋白。Graham Ε. McCreath等人在乳劑親和血清白蛋白分離上也 取得了一定的成果。雙水相萃取成為新興生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究的熱點(diǎn)，主要是該技術(shù)對(duì)于生 物物質(zhì)的分離和純化表現(xiàn)出特有的優(yōu)點(diǎn)和獨(dú)有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)雙水相萃取體系萃取蛋白也存 在明顯的不足，選擇性不高，只能作為蛋白質(zhì)的粗分離和蛋白質(zhì)的濃縮，成相鹽(如聚乙二 醇或葡聚糖)價(jià)格昂貴，成本較高，工業(yè)化困難。對(duì)于雙水相萃取體系由于兩相密度相近， 相系粘度很大，導(dǎo)致相分離困難，需借助離心操作，另外，由于高聚物的性質(zhì)，生物大分子在 兩相界面存在較強(qiáng)的吸附及乳化作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的兩相滯留。人血清白蛋白(Human serum albumin HSA)是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，血漿中 血清白蛋白含量約占總血漿蛋白質(zhì)含量的60%，血清白蛋白在人體內(nèi)具有重要的作用，是 迄今為止用量最大的蛋白質(zhì)藥物，HSA的純化非常關(guān)鍵。目前市場(chǎng)上銷售的HAS或牛血清 白蛋白(BSA)商品均由血漿純化而得。由于生物分子的特殊柔性、安全要求以及對(duì)分離條 件要求很高，使適用于化工領(lǐng)域的技術(shù)無(wú)法應(yīng)用于血清白蛋白分離純化。同時(shí)，由于生物制 品的分離純化成本大約占其總成本的60-90%，因此需要選擇可靠、安全、低成本的人血清 白蛋白分離純化方法。近年許多實(shí)驗(yàn)室和公司已陸續(xù)嘗試通過(guò)遺傳工程方法獲取HSA，但是 也遇到了同樣的分離純化難題。作為藥物制品的HSA，不論怎樣制備，它自身的特點(diǎn)和用途 都決定了純化的復(fù)雜性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，用該方法 純化可得到高純度、結(jié)構(gòu)未變、未聚合的血清白蛋白，并將通常需進(jìn)行的血漿前處理、粗分 離、細(xì)分離一步完成。本發(fā)明的技術(shù)方案為液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，按以下步驟進(jìn)行(1)、液-固萃取體 系形成將長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物、無(wú)機(jī)鹽形成液-固萃取體 系，并且液_固萃取體系中無(wú)機(jī)鹽的濃度為0. 5-3. 5mol ·廠1，聚合物吐溫80的質(zhì)量濃度為 3 20%，長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物的濃度為0. 2 3. Omg ^mr1，調(diào)節(jié)pH 3. 5-9. 5 ； (2)、在上述液-固萃取體系中加入血樣，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩2-10分鐘，優(yōu)選4-6 分鐘，取下倒置10-20分鐘，優(yōu)選12-16分鐘，體系分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白 被萃入固相；(3)、將第(2)步的固相加蒸餾水溶解后，使體系酸度在pH 3-9范圍內(nèi)，并加入 無(wú)機(jī)鹽使體系的無(wú)機(jī)鹽濃度達(dá)到0. 5-3. 5mol · L—1，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩2_10分鐘， 優(yōu)選4-6分鐘，取下倒置10-20分鐘，優(yōu)選12-16分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被反萃入液相；(4)、將第(3)步的萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行 透析，將留在透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉。所述的長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物為碳十二長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇、碳 十四長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇或碳十六長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇。所述的無(wú)機(jī)鹽為磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸銨或檸檬酸鈉。本發(fā)明利用長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物_無(wú)機(jī)鹽_水 液-固萃取體系直接對(duì)牛血漿、人血漿中血清白蛋白進(jìn)行選擇性萃取，經(jīng)過(guò)一次正萃，一次 反萃和透析、凍干后即可得到純度大于98%的血清白蛋白干粉。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，采用該體系 能夠獲得理想的固相收得率和反萃取率，而且操作簡(jiǎn)單，全血漿樣品經(jīng)過(guò)一次正萃，一次反 萃，透析后即可獲得較為滿意的純度，為血清白蛋白SA的分離純化提供了一種簡(jiǎn)易、快速、 成本低廉的方法。通過(guò)中科院查新檢索查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，未見(jiàn)報(bào)道。在此體系中，經(jīng)過(guò)優(yōu)化萃取條件，牛血清白蛋白、人血清白蛋白混合分配系數(shù)K (K =固相中血清白蛋白濃度液相中血清白蛋白濃度)均可達(dá)到1000 ；—次正相萃取固相收 得率R(R=萃取分相后固相血清白蛋白的量加入體系的血清白蛋白的總量)可達(dá)100%， 一次反萃取率也可達(dá)到100%。經(jīng)高效液相色譜、SDS-PAGE凝膠電泳法驗(yàn)證純度不低于美 國(guó)sigma公司所購(gòu)試劑(98% )，并用熒光法檢驗(yàn)蛋白構(gòu)象與sigma公司產(chǎn)品一致，未發(fā)生 變化。本發(fā)明利用聚合物-鹽-水液_固萃取體系克服了雙水相技術(shù)和反膠團(tuán)技術(shù)萃取 蛋白的缺陷，相系清晰，界面無(wú)乳化。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑液_液萃取體系比較，該體系不僅能 萃取電中性物質(zhì)，還能萃取帶電荷的化合物，該體系不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑，無(wú)毒性，安全， 成相容易，分相操作不需特殊技術(shù)處理，成相后直接傾倒出液相即可，無(wú)需雙水相萃取中的 離心等操作，成相聚合物及鹽對(duì)生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定和保護(hù)作用，且不存在似雙水相萃取 中被萃物質(zhì)滯留于相界面的問(wèn)題，現(xiàn)用分子識(shí)別機(jī)理萃取分離選擇性好、消耗低，是易于規(guī) 模放大的分離新技術(shù)。


圖1標(biāo)準(zhǔn)HSA的XRD譜圖。圖2提取蛋白的XRD譜圖。圖 3SDS-PAGE 電泳圖。圖4為標(biāo)準(zhǔn)HSA和萃取HSA的熒光發(fā)射光譜圖。1_標(biāo)準(zhǔn)HSA，2_人血漿。圖5為SDS-PAGE凝膠電泳圖。圖6為粗血漿、標(biāo)準(zhǔn)品、萃取蛋白的SDS-PAGE圖。圖7為2mg. mL"1標(biāo)準(zhǔn)品蛋白HPCE圖。圖 8 為 2mg. ml/1 粗蛋白 HPCE 圖。圖9為2mg. ml/1萃取蛋白HPCE圖。圖10為標(biāo)準(zhǔn)白蛋白的HPLC圖。圖11為萃取白蛋白的HPLC圖。圖12為粗血漿的HPLC圖。圖13為10%全牛血清經(jīng)萃取分離后透析袋中溶液(254nm)的HPLC圖。
圖14為萃取分離前的血樣10%的全牛血清(254nm)的HPLC圖。圖15為4mg/mL標(biāo)準(zhǔn)血清白蛋白(sigma分裝)(280nm)的HPLC圖。圖16為10%全牛血清經(jīng)萃取分離后透析袋中溶液(280nm)的HPLC圖。圖17為C12PEG、C14PEG, C16PEG修飾物萃取率對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一碳十六長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇(C16PEG)修飾物混合吐溫80-磷酸 鉀_水液_固萃取體系分離純化HSA1.萃取方法依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 4克C16PEG修飾物、0. 8毫升吐溫80儲(chǔ)備液，6. 3克 磷酸鉀溶液于比色管中，PH在6. 5-9. 5范圍內(nèi)，加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩5 分鐘，混合均勻，靜置后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH 3-6范圍內(nèi)，并加入6. O克磷酸鉀，置于電 動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩5分鐘，取下倒置20分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清 白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋 中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉38毫克。2.純度檢測(cè)1)XRD初步探究通過(guò)XRD將上述制得的血清白蛋白凍干粉末進(jìn)行初步探究，從圖1，圖2可以看出， 提取得到的蛋白粉末與標(biāo)準(zhǔn)品的衍射峰個(gè)數(shù)一致，均為二個(gè)衍射峰，標(biāo)準(zhǔn)品[瓊脂糖凝膠 電泳法，98-99% (agarose gelelectrophoresis), lyophilized powder (Sigma)]。2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳檢測(cè)10%分離膠二次水 2mL，l. 5M ρΗ8· 8Tris_HCl 1. 25mL，30%雙丙烯酰胺 1. 65mL， 10% SDS(十二烷基硫酸鈉)50yL，10%過(guò)硫酸銨40yL，TEMED (四甲基二乙胺)5yL 5 % 濃縮膠(二次水 1. 37mL，0. 5ΜρΗ6· 8Tris-HCll. 12mL，30 % 雙丙烯酰胺 0. 5mL, 10 % SDS30 μ L, 10%過(guò)硫酸銨 20 μ L, TEMED2 μ L)。步驟1 將玻璃板、樣品梳、電泳槽用洗滌劑洗凈，用二次水沖洗數(shù)次，再用乙醇 擦拭晾干2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，裝好玻璃板3 按上述比例配制10%分 離膠5mL，混勻；向玻璃板間灌制分離膠，立即加入二次水覆蓋，大約20min后膠可聚合(視 溫度而定)4 按上述比例配制5%濃縮膠，混勻；5 將覆蓋水用濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入 樣品梳；6 待濃縮膠成膠后，拔掉梳子，點(diǎn)樣；7 裝好電泳系統(tǒng)，先將梳孔用電泳緩沖液加 滿，然后加入電泳緩沖液開(kāi)始電泳。8 先從穩(wěn)流開(kāi)始，電流每五分鐘調(diào)大5毫安，直到溴酚 藍(lán)前沿跑到分離膠與濃縮膠交界處，然后打到穩(wěn)壓100KV。溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時(shí)，停止電 泳，約需2-3小時(shí)左右；9.卸下膠板，剝離膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色10小時(shí)左 右；加入脫色液脫色，每20min更換一次脫色液(冰乙酸乙醇蒸餾水為1 4. 5 4. 5) 至完全脫凈，得到圖3。從左到右依次為人血漿樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、萃取HSA。人血漿樣品濃度為 2mg. ι ΙΛ 標(biāo)準(zhǔn)品(sigma) lmg. mL—1，萃取蛋白 1. 5mg. πι Λ 點(diǎn)樣量均為 10 μ L。由圖3可知萃取蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品蛋白電泳帶一致，與血漿比電泳條帶明顯減少，說(shuō) 明經(jīng)過(guò)此方法能選擇性地從人血漿中直接分離純化HSA。
3)熒光法檢測(cè)HSA蛋白活性在激發(fā)波長(zhǎng)222nm下，得到發(fā)射波長(zhǎng)在260-420nm范圍的標(biāo)準(zhǔn)HSA和本實(shí)施例一 萃取HSA熒光光譜圖4，白蛋白中色氨酸的殘基是三個(gè)能自然發(fā)出熒光的芳香氨基酸之一。 從圖4可以看出，萃取HSA和標(biāo)準(zhǔn)HSA的最大熒光強(qiáng)度波長(zhǎng)一致，沒(méi)有明顯的峰值移動(dòng)，說(shuō) 明結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道如果結(jié)構(gòu)改變，最大吸收波長(zhǎng)會(huì)紅移或者藍(lán)移。實(shí)施例二 C16PEG修飾物混合吐溫80-檸檬酸鈉-水液-固萃取體系分離純化HSA1.萃取方法依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 6克C16PEG修飾物、0. 75毫升吐溫80儲(chǔ)備液，2. 8克 檸檬酸鈉溶液于比色管中，PH在4. 1-6. 2范圍內(nèi)，加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩 10分鐘，混合均勻，靜置10分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用 蒸餾水將聚合物固相定容至10. OmL，使體系酸度在PH 3. 0-5. 2范圍內(nèi)，并加入2. 4克檸檬 酸鈉，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩10分鐘，取下倒置10分鐘，體系重新分成聚合物固相和 鹽水液相，血清白蛋白被反萃入；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在 透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉6. 1毫克。2.純度檢測(cè)電泳實(shí)驗(yàn)條件同磷酸鹽體系，從左到有分別為粗蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品，萃取蛋白。由圖5 可知萃取蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品蛋白電泳帶一致，與血漿比電泳條帶明顯減少，說(shuō)明經(jīng)過(guò)此體系同 樣能選擇性地從人血漿中直接分離純化HSA。實(shí)施例三C12PEG修飾物混合吐80-碳酸鉀鹽-水液-固萃取體系分離純化HSA依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 55克C12PEG修飾物、0. 9毫升吐溫80儲(chǔ)備液，1. 7克 碳酸鉀鹽溶液于比色管中，PH7. 0-8. 5，加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩2分鐘，混 合均勻，靜置15分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH3-6范圍內(nèi)，并加入1. 7克碳酸鉀鹽，置于電 動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩2分鐘，取下倒置15分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清 白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋 中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉5. 8毫克。一次正萃固相收得率可達(dá)80%以上，一次反萃取率大于50%。實(shí)施例四C12PEG修 飾物混合吐溫80-檸檬酸鈉-水液-固萃取體系分離純化HSA依次取2. 0毫升HSA溶液、0. 4克C12PEG修飾物、0. 9毫升吐溫80儲(chǔ)備液，2. 4克 檸檬酸鈉溶液于比色管中，PH4. 0-6. 0加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩5分鐘，混 合均勻，靜置15分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH 3-6范圍內(nèi)，并加入2. 2克檸檬酸鈉，置于 電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩5分鐘，取下倒置15分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血 清白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析 袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉6. 2毫克。一次正萃固相收得率可達(dá)60%以上，一次反萃取率可達(dá)55%。以下是對(duì)牛血清白蛋白的萃取實(shí)施例 實(shí)施例五C16PEG修飾物混合吐溫80-磷酸鈉-水液-固萃取體系分離純化BSA
1.萃取方法
依次取2. 0毫升BSA溶液、0. 64克C16PEG修飾物、1. 1毫升吐溫80儲(chǔ)備液，4. 4克 磷酸鈉溶液于比色管中，PH4. 8-8. 1，加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩5分鐘，混合 均勻，靜置15分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚合 物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH 3-6范圍內(nèi)，并加入4. O克磷酸鈉，置于電動(dòng) 震蕩機(jī)上平置振蕩5分鐘，取下倒置15分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白 蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋中 的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉28毫克。在最佳條件下，一次正相萃取率可達(dá)100% ；—次反萃取率可達(dá)70%。2.純度檢測(cè)1) SDS-PAGE 的檢測(cè)電泳條件同前，粗牛血漿濃度為5mg. mL—1，BSA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為lmg. mL—1，萃取蛋白濃 度為1. 5mg. mL—1，點(diǎn)樣量均為8 μ L，從左到有分別為粗蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品，萃取蛋白。由圖6可知萃取蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品蛋白電泳帶一致，與血漿比電泳條帶明顯減少，說(shuō) 明經(jīng)過(guò)此體系也能選擇性地從牛血漿中直接分離純化BSA。2)高效毛細(xì)管電泳HPCE的檢測(cè)配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品2mg. mL—1，新生牛血漿2mg. mL—1，萃取所得的BSA2mg. mL—1，利用 毛細(xì)管電泳進(jìn)行蛋白純度檢測(cè)，進(jìn)樣前樣品用0.22um微孔濾膜過(guò)濾。毛細(xì)管有效長(zhǎng)度 50mmX 75um，采用壓力進(jìn)樣，先用0. Imol · L-1NaOH溶液沖洗3min，再依次用二次蒸餾水， 20mmol · pH = 9. 1的硼酸鈉緩沖溶液，二次蒸餾水各沖洗5min. 2次實(shí)驗(yàn)間隔中用 0. Imol · IZ1NaOH 溶液沖洗 3min。分別用20mmol · Λ 30mmol · Λ 40mmol .L—1 的硼酸鈉(pH = 9. 1)做背景緩沖液， 用毛細(xì)管電泳對(duì)5mg · πιΓ1新生牛血漿白蛋白檢測(cè)，進(jìn)樣壓力為2psi，進(jìn)樣時(shí)間為20sec， 20°C下用5kV的分離電壓，檢測(cè)波長(zhǎng)為191nm。研究表明20mmol · Γ1硼酸鈉緩沖液對(duì)蛋白 具有較好的分離，因此選擇20mmol · L—1硼酸鈉緩沖溶液做背景緩沖液。分別試驗(yàn)分離電壓15KV，10KV, 5KV，背景緩沖液，20mmol · L—1，pH = 9. 1進(jìn)樣壓力 為2psi，進(jìn)樣時(shí)間為20sec，20°C下檢測(cè)波長(zhǎng)為191nm。當(dāng)分離電壓為5、10、15KV時(shí)，萃取蛋 白與標(biāo)樣蛋白均比血漿所得電泳峰少，初步說(shuō)明血漿經(jīng)過(guò)萃取得到了提純的蛋白，電壓越 大，樣品出峰時(shí)間越早，但分離效果較差，故選用5KV進(jìn)樣壓力為lpsi，進(jìn)樣時(shí)間為lOsec。背景緩沖液，20mmol -^,pH = 9. 1硼砂緩 沖液，20°C下檢測(cè)波長(zhǎng)為191nm，分離電壓5KV。得圖5-8，5-9，5-10。從圖7、圖8、圖9可以看出通過(guò)HPCE檢測(cè)，粗蛋白和萃取蛋白、標(biāo)準(zhǔn)品有明顯的差 異，經(jīng)過(guò)提取的蛋白得到了純化。因sigma公司制品是結(jié)晶后產(chǎn)品，單位體積濃度比我們的 凍干粉略大，這一點(diǎn)從電泳圖的響應(yīng)上也可看出。實(shí)施例六C16PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨鹽-水液-固萃取體系分離純化BSA1.萃取方法依次取2. O毫升BSA溶液、0. 4克C16PEG修飾物、1. 2毫升吐溫80儲(chǔ)備液，2. 2克 硫酸銨溶液于比色管中，PH 3. 3-5. 8，加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩8分鐘，混 合均勻，靜置12分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH2. 5-4. 5范圍內(nèi)，并加入2. O克硫酸銨，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩8分鐘，取下倒置12分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血 清白蛋白被反萃入；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋中的 大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉12毫克。在最佳條件下，一次正萃取率可達(dá)100% ；—次反萃取率可達(dá)70%。2.純度檢測(cè)HPLC純度檢測(cè)色譜條件流動(dòng)相A :pH = 5. 0,0. 2M的磷酸二氫鈉緩沖液；流動(dòng)相B :40%乙腈水 溶液。檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ；柱溫30°C ；流速Iml · mirT1 ；HatichiDL7000高效液相色譜儀，單 泵四流路，二極管陣列紫外檢測(cè)器。反相C18柱，25cm*4. 6mm。洗脫方式0minl00 % pH = 5. 0,0. 2M的磷酸二氫鈉緩沖液(A)線形梯度-IOminlOO% 40%乙腈水溶液(B)洗脫，維持 2min,從100% B線形梯度-IOmin再回到100% A。(緩沖液經(jīng)過(guò)0. 45 μ m的纖維微孔濾膜 過(guò)濾脫氣)HSA標(biāo)準(zhǔn)品，萃取HSA，牛血漿樣品配置成一定濃度的溶液，經(jīng)過(guò)0. 22 μ m的微孔 濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)白蛋白，萃取白蛋白，血漿濃度均為4mg. ml/1進(jìn)樣量為10yL。從圖10、圖11、圖12可看出，同濃度的萃取蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白響應(yīng)基本是粗血漿中 的一倍，說(shuō)明此體系也能純化BSA。通過(guò)HPLC對(duì)萃取BSA進(jìn)行了初步的純度檢測(cè)，確知經(jīng) 過(guò)萃取BSA與標(biāo)準(zhǔn)品成分基本一致，與粗蛋白相比，主要成分響應(yīng)也明顯提高。在實(shí)際應(yīng)用 中，選擇合適的鹽對(duì)高效分離蛋白，節(jié)約成本有重要的意義。實(shí)施例七C12PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨鹽-水液-固萃取體系分離純化BSA1.萃取方法依次取2. 0毫升BSA溶液、0. 3克C12PEG修飾物、1. 1毫升吐溫80儲(chǔ)備液，2. 5克 硫酸銨溶液于比色管中，加水定容到10. OmL,PH 3. 1-6. 2，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩10分鐘，混 合均勻，靜置10分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸餾水將聚 合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH3-6范圍內(nèi)，并加入2. 2克硫酸銨，置于電動(dòng) 震蕩機(jī)上平置振蕩10分鐘，取下倒置10分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清 白蛋白被反萃入；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋中的大 分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉9. 7毫克。在最佳條件下，一次正相萃取率可達(dá)70% ；—次反萃取率可達(dá)91. 69%。2.純度檢測(cè)HPLC純度檢測(cè)利用硫酸銨萃取體系最佳條件對(duì)牛血清樣品進(jìn)行一次正萃，一次反萃，將反萃后 液相透析，透析液進(jìn)行HPLC分析。由中國(guó)農(nóng)科院油料作物研究所張聞老師測(cè)試的HPLC結(jié) 果如圖13、圖14所示。從圖13、圖14兩圖的對(duì)比中不難看出，在同樣測(cè)定條件下萃取分離前血樣譜圖 中吸收峰很多，且分離效能很低，萃取分離后透析袋中的血樣吸收峰明顯減少，保留時(shí)間為 5.076的組分峰高(46mAU)比血樣中相應(yīng)保留時(shí)間組分(5. 134)峰高(6mAU)高出約7_8 倍，可是反萃后液相血清濃度大約比圖15的10%血清低20倍，不考慮透析過(guò)程中的稀釋， 可明顯看出有組分被提純。這說(shuō)明，通過(guò)本課題所選用的C12PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨-水液-固萃取 體系一次正萃，一次反萃，透析后能夠使血樣純化。
從圖15、圖16兩圖可以看出，萃取分離后的透析袋中血樣譜圖與標(biāo)準(zhǔn)BSA(98%， sigimaCo.)的譜圖在同樣測(cè)定條件下，所出峰的個(gè)數(shù)相近，白蛋白是一類結(jié)構(gòu)和功能相近 的蛋白組，標(biāo)準(zhǔn)BSA譜圖中保留時(shí)間為2. 531，3. 786，5. 503，10. 069四種主成分的總量應(yīng) 占到98%的大部分，而透析袋中血樣的譜峰，除溶劑峰1.769外，大部分也是由保留時(shí)間為 2. 519，3. 809,5. 471，10. 154的四種主成分所代表，由此可以初步知道通過(guò)本課題所選用的 C12PEG修飾物混合吐溫80-硫酸銨-水液-固萃取體系一次正萃，一次反萃，透析后能夠使 全血清樣的純度達(dá)到與sigima公司標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)募兌?。[色譜條件=Aginent1100液相色譜儀，反向C18柱，tc = 30°C，流速1.Oml/min ； 流動(dòng)相A :pH5. O磷酸鹽(0. 2mol/L磷酸二氫鈉)緩沖液；流動(dòng)相B :40%乙腈水溶液；梯度 洗脫方式0minl00% A線性梯度-IOmin到100% B洗脫，維持2min再回到100% A。二極 管列陣檢測(cè)器；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(98% )濃度4mg/mL，進(jìn)樣量是IOuL ；血樣10%的全牛 血清，進(jìn)樣量IOuL ；10%全牛血清經(jīng)萃取分離后透析袋中溶液，進(jìn)樣量是10uL。]實(shí)施例八C12PEG修飾物混合吐溫80-磷酸鉀-水液-固萃取體系分離純化BSA1.萃取方法依次取2. 0毫升BSA溶液、0. 6克C12PEG修飾物、0. 9毫升吐溫80儲(chǔ)備液，5. 3克 磷酸鉀溶液于25. OmL比色管中，pH6. 3-9. 0，加水定容到10. OmL，在電動(dòng)震蕩機(jī)中振蕩10 分鐘，混合均勻，靜置10分鐘后，體系分成聚合物固相和鹽水相，將鹽水相完全傾倒，用蒸 餾水將聚合物固相定容至10. OmL刻度，使體系酸度在pH3-6范圍內(nèi)，并加入5. 0克磷酸鉀， 置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩10分鐘，取下倒置10分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液 相，血清白蛋白被反萃入鹽水相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在 透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉7. 9毫克。在最佳條件下，一次正萃取率可達(dá)90 %，一次反萃取率可達(dá)70 %。2. C12PEG, C14PEG, C16PEG修飾物固相收得率對(duì)比C12PEG, C14PEG, C16PEG修飾物對(duì)血清白蛋白的親和力依次增大，本課題所采用的長(zhǎng) 鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80-鹽-水液-固萃取體系中，以檸檬酸鹽體系為 例，在相同條件下，各自的固相收得率和分配系數(shù)如圖17所示，體系檸檬酸0. 9mol · Γ1 ； 吐溫 80 6% (ν/ν)長(zhǎng)鏈二元脂肪酸修飾物2.4% (w/v) ；pH5.00，溫度20°C a. (R) %, b. LgK0從圖17可以看出，20°C時(shí)，在本課題所采用的長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物 混合吐溫80-鹽-水液-固萃取體系中，在同樣萃取條件下，C12PEG, C14PEG, C16PEG修飾 物對(duì)HSA的親和力依次增大。一次萃取固相收得率1 %從40%— 70%— 90%，lgK從 1.6-1.85- 3. 0，在條件實(shí)驗(yàn)中選用萃取效果好的可達(dá)到明顯優(yōu)越的結(jié)果。
權(quán)利要求
液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)、液-固萃取體系形成將長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物、無(wú)機(jī)鹽形成液-固萃取體系，并且液-固萃取體系中無(wú)機(jī)鹽的濃度為0.5-3.5mol·L-1，聚合物吐溫80的質(zhì)量濃度為3～20％，長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物的濃度為0.2～3.0mg·mL-1，調(diào)節(jié)pH 3.5-9.5；(2)、在上述液-固萃取體系中加入血樣，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩2-10分鐘，取下倒置10-20分鐘，體系分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被萃入固相；(3)、將第(2)步的固相加蒸餾水溶解后，使體系酸度在pH 3-9范圍內(nèi)，并加入無(wú)機(jī)鹽使體系的無(wú)機(jī)鹽濃度達(dá)到0.5-3.5mol·L-1，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩2-10分鐘，取下倒置10-20分鐘，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被反萃入液相；(4)、將第(3)步的萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋中的大分子血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征在于 所述的長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物為碳十二長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇、碳十四長(zhǎng)鏈二 元脂肪酸聚乙二醇或碳十六長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征在于 所述的無(wú)機(jī)鹽為磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸銨或檸檬酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征 在于置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩4-6分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征 在于取下倒置12-16分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，其特征 在于正萃、反萃后需透析凍干。
全文摘要
本發(fā)明涉及液-固萃取體系分離純化血清白蛋白的方法，按以下步驟進(jìn)行將長(zhǎng)鏈二元脂肪酸聚乙二醇修飾物混合吐溫80聚合物、無(wú)機(jī)鹽形成液-固萃取體系，調(diào)pH；在液-固萃取體系中加入血樣，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩，取下倒置，體系分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被萃入固相；再將固相加蒸餾水溶解后，調(diào)pH并加入無(wú)機(jī)鹽，置于電動(dòng)震蕩機(jī)上平置振蕩，取下倒置，體系重新分成聚合物固相和鹽水液相，血清白蛋白被反萃入液相；再將萃入液相的血清白蛋白于透析袋中進(jìn)行透析，將留在透析袋中的血清白蛋白凍干后得血清白蛋白干粉。用本發(fā)明純化得到高純度、結(jié)構(gòu)未變、未聚合的血清白蛋白，并將通常需對(duì)血漿進(jìn)行前處理、粗分離、細(xì)分離一步完成。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101830979SQ20101015320
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者劉波, 沈靜茹, 雷灼霖 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)