專利名稱：一種制備灰樹花蛋白聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種利用灰樹花菌體自身內(nèi)源酶系和外源酶制備 灰樹花蛋白聚糖的方法。
背景技術(shù)：
灰樹花是一種重要的藥食兩用真菌，灰樹花子實體多數(shù)作為食用菌直接食用，部 分經(jīng)過簡單的提取、加工制成功能食品，沒有對其主要成分做進一步的分離和深加工，不能 形成真正意義上的綜合利用?；覙浠ǖ鞍拙厶谴嬖谟诩毎谥?，是一種極富生物活性的物質(zhì)，已證實其對腫瘤、 肝炎、糖尿病、心腦血管等疑難病都有較好的治療或輔助治療效果，還是一種良好的生物反 應調(diào)節(jié)劑，它能夠通過刺激免疫系統(tǒng)而提高機體的免疫能力，在相互依賴的機體系統(tǒng)中，對 維持體內(nèi)平衡起關(guān)鍵作用，幫助機體適應環(huán)境和調(diào)節(jié)壓力。灰樹花細胞壁中除含有大量的蛋白質(zhì)外，還含有甘露糖蛋白、葡聚糖、其他雜 多糖、纖維素、半纖維素和幾丁質(zhì)等成分。目前已被應用的產(chǎn)品主要有灰樹花多糖，灰樹花 多糖實際上是多種多糖成分和多糖蛋白的混合物，尚未有灰樹花蛋白聚糖的生產(chǎn)和應用。目前灰樹花多糖的提取方法較多，主要有熱水法、堿法、酸堿一體法、超聲波法和 酶法等，大多數(shù)采用簡單的熱水提取或堿提取，經(jīng)乙醇沉淀得到灰樹花多糖粗品，加工成產(chǎn) 品銷售，純品灰樹花多糖采用層析技術(shù)獲得，大多停留在實驗室階段。而灰樹花蛋白聚糖的 提取技術(shù)報道很少。在中國專利(CN :1255429C)中披露了一種灰樹花蛋白聚糖的制備方法，該方法采 用熱水提取灰樹花子實體，再用堿性溶液繼續(xù)處理子實體，并對其提取液進行中空纖維超 濾，經(jīng)濃縮干燥得到灰樹花蛋白聚糖干粉。由于未經(jīng)過純化過程，此類灰樹花蛋白聚糖的含 量較低，一般只能達到60%左右，而且含有多種非生物活性的雜質(zhì)，限制了灰樹花蛋白聚糖 的活性發(fā)揮。同時，產(chǎn)生大量強堿性液體，對環(huán)保造成壓力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述技術(shù)存在的不足，提供一種以灰樹花菌體為原料制備灰樹花蛋白 聚糖的方法，具體步驟包括菌體自溶、酶解，并對酶解提取液微濾、超濾、層析、干燥，得到灰 樹花蛋白聚糖，上述的制備工藝簡單，工藝參數(shù)易于控制，產(chǎn)物灰樹花蛋白聚糖的得率、純 度都比較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)，所得灰樹花蛋白聚糖可廣泛應用于醫(yī)藥、食品、食品添加劑 及其它輕工領(lǐng)域。本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案是一種制備灰樹花蛋白聚糖的方法，，包括灰樹花蛋 白聚糖的提取、分離和純化步驟，具體如下(1)誘導自溶調(diào)節(jié)菌體濃度為1-10% (w/v)，之后添加占總量0.01-0. 5% (w/v) 的無機鹽；用酸調(diào)節(jié)PH至4. 5-6. 0，在40-60°C條件下保溫2_10h獲得自溶溶液；(2)酶解將步驟(1)所得自溶溶液用堿調(diào)節(jié)pH至7. 0-8. 5，添加0. 01-0. 1% (w/v)酶制劑，在40-60°C條件下保溫2-8h ；90°C滅酶活，冷卻后離心，收集上清液；(3)膜分離對步驟(2)所得的清液微濾，在進行超濾脫鹽和濃縮；同時通過超濾 調(diào)節(jié)濃縮液的離子強度，使?jié)饪s液電導率在lOOi! s/cm以下，并調(diào)節(jié)濃縮液蛋白聚糖濃度 在左右；(4)超濾濃縮液經(jīng)過層析純化、冷凍干燥等步驟，得到灰樹花蛋白聚糖。其中步驟(1)中所采用的菌體是灰樹花液體發(fā)酵菌絲體或灰樹花鮮子實體或兩 者的混合物，采用灰樹花鮮子實體時預先進行破碎，破碎至破碎至粒徑0. 1-1. 0cm，所添加 的無機鹽為硫酸鎂、氯化鎂、硝酸鎂、碳酸鈣、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀中的 一種或數(shù)種的混合物。之所以采用這種方式，主要是在步驟(1)中，為誘導菌體自身內(nèi)源酶系進行自溶 提供激活的條件，在步驟(1)中的條件下，可以誘導灰樹花菌體內(nèi)源自溶酶的活性提高，產(chǎn) 生自溶效果，將菌體中的內(nèi)容物，包括灰樹花蛋白聚糖更多的溶出。其主要作用機理是生物體細胞中存在一系列自溶酶，包括蛋白酶、脂肪酶、多種糖類水解酶，其中微 生物體內(nèi)的含量相對較高。在特定條件下(如特定的發(fā)育階段等)生物體啟動自溶系統(tǒng)， 非重要器官或年齡較長的細胞發(fā)生自溶，自溶酶將細胞及其內(nèi)容物分解為可被利用的營養(yǎng) 物質(zhì)以保證完成特定的發(fā)育階段。用無機鹽的形式添加鎂、鈣、鉀等離子，補充灰樹花菌體 自身內(nèi)源自溶酶體系的輔酶因子，即可激活酶促反應，增加酶活性，在促進菌體細胞自溶和 細胞內(nèi)容物大量釋放的同時，也提高了目標產(chǎn)物的提取效率，并降低了能耗。這種誘導自溶是為了分解細胞壁，增加細胞通透性，釋放出內(nèi)容物和水溶性灰樹 花蛋白聚糖，步驟2是在步驟1的基礎上將灰樹花蛋白聚糖與其他物質(zhì)，主要包括部分蛋白 質(zhì)、脂肪、纖維素等進一步分離，進一步強化步驟1的效果。這兩步的另一效果就是大大減 少酸堿的用量，使反應在溫和的條件下進行，降低了處理時酸堿對于蛋白聚糖的消耗。步驟1中所采用的調(diào)節(jié)pH的酸，主要采用檸檬酸、乙酸、鹽酸、硫酸中的一種或數(shù) 種的混合物。采用上述的酸進行調(diào)節(jié)，可使灰樹花細胞環(huán)境處于類似于特定生長階段需要 自溶的環(huán)境，并使自溶過程中的酶促反應持續(xù)進行，可以更好的起到誘導自溶的效果；而將 pH控制在4. 5-6. 0，在40-60°C條件下保溫2_10h，是為了在最大程度上適應菌體自溶酶的 活性條件，使酶促反應快速高效的進行，以提高灰樹花蛋白聚糖的溶出度。一般控制PH優(yōu) 選4. 5-5. 5 ；反應溫度優(yōu)選45-55°C ；反應時間優(yōu)選4_6h。上述步驟(1)中調(diào)節(jié)菌體濃度時首先取樣測定濕菌絲體或鮮子實體的含水量，然 后計算出濕菌體中的干物質(zhì)含量和水分含量，補加水至步驟(1)中所要求的1-10% (w/v) 即可，而在添加無機鹽之前，為了使上述的菌體能夠更好的誘導發(fā)生自溶反應，一般采用濕 法粉碎的方式使菌體充分分散，以提高自溶效果。經(jīng)過步驟1后的自溶溶液中是含有部分固體物質(zhì)的，但是隨著堿的加入和pH值的 升高，固體物質(zhì)逐漸糊化，之后隨酶解反應的繼續(xù)，整個液體會由粘稠狀逐漸變稀，固形物 減少。因此只需酶解過程中不斷攪拌，即可促進固形物的分解，直到酶解結(jié)束，經(jīng)過一次離 心即可獲得清液。步驟2中所采用的調(diào)節(jié)pH的堿主要選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉中的一種或 數(shù)種的混合物；而所采用的酶制劑中的酶一般選自纖維素酶、淀粉酶、中性蛋白酶、堿性蛋 白酶、木瓜蛋白酶中的一種或數(shù)種的混合物。
其中的中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別是一種特定的酶種，中性蛋白酶是由枯草芽 孢桿菌經(jīng)發(fā)酵提取而得的，屬于一種內(nèi)切酶，可用于各種蛋白質(zhì)水解處理，CAS 9068-59-1 ； 堿性蛋白酶是經(jīng)原生質(zhì)體誘變方法選育的枯草桿菌通過深層發(fā)酵、提取及精制而成的一種 蛋白水解酶，屬于一種絲氨酸高堿性蛋白酶，它能水解蛋白質(zhì)分子肽鏈生成多肽或氨基酸， 具有較強的分解蛋白質(zhì)的能力，分子量約為27300，CAS 9014-01-1 ；步驟2采用堿調(diào)節(jié)pH是為了給后續(xù)添加的酶提供酶活發(fā)揮的適宜條件，同時，在 堿性條件下灰樹花蛋白聚糖的溶出率遠高于中性條件，適合于灰樹花蛋白聚糖的提取分 離。堿性條件下的酶解，主要是進一步分解溶出的酸性游離蛋白，同時對灰樹花蛋白聚糖起 到初步純化作用。與CN1255429C相比，其用堿量為10-50倍/20-30倍體積，堿含量高達2_6 %，實際 上是作為溶劑使用的，而本發(fā)明使用堿僅僅是作為PH調(diào)節(jié)劑，而非溶劑或提取劑，用堿量 減少80%以上，降低了提取的成本和后續(xù)的環(huán)保處理壓力。之所以在處理過程中，酶處理結(jié)束后需及時升溫到90°C，主要是使酶失活，從而終 止整個的酶解反應，使酶解獲得的堿溶性灰樹花蛋白聚糖可以更好的得到溶解，而之后進 一步冷卻降溫，以利于固體和液體的分離，這樣就可以最大化的將菌體中的堿溶性灰樹花 蛋白聚糖提取出來，加之之前在步驟1中溶解在自溶溶液中的水溶性灰樹花蛋白聚糖，最 終經(jīng)過步驟2后的溶液中已經(jīng)含有了大量的灰樹花蛋白聚糖，可以方便的進行下一步的純 化；為了獲得更好的效果，發(fā)明人一般優(yōu)選步驟1和2中的處理條件為(1)誘導自溶調(diào)節(jié)菌體濃度至1-5% (w/v)，優(yōu)選菌體含量1-3% (w/v)的發(fā) 酵液；添加0. 01-0. 5 (w/v)的無機鹽，優(yōu)選硫酸鎂、碳酸鈣、氯化鈣或其混合物；用酸調(diào)節(jié) pH至4. 5-6. 0，所采用的酸優(yōu)選乙酸、鹽酸或其混合物；pH優(yōu)選4. 5-5. 5 ；反應溫度優(yōu)選 45-55°C ；反應時間優(yōu)選4-6h ；(2)酶解所采用的酶優(yōu)選為堿性蛋白酶、甘露聚糖酶、淀粉酶或其混合物，調(diào) 節(jié)溶液pH值至7. 5-8. 5，酶制劑的添加量優(yōu)選0. 02-0. 05 (w/v)，溫度50_55°C，攪拌反應 4-6h。在上述優(yōu)選條件下，灰樹花蛋白聚糖的得率最高，也就是單位原料的蛋白聚糖得 率(以菌體干品計)可達4% (w/w)以上，所得蛋白聚糖的含量最高，可達95% (w/w)以上。 經(jīng)HPLC檢測，所得蛋白聚糖為結(jié)構(gòu)均一物質(zhì)，所含蛋白均為結(jié)合蛋白。其中所述的蛋白聚 糖的含量是指蛋白聚糖作為一個整體時在所得純化物中的含量，包括蛋白部分和葡聚糖部 分。經(jīng)過步驟1和2處理所得的灰樹花蛋白聚糖提取液，其中含有大量的灰樹花蛋 白聚糖，為了方便進行下一步的超濾以及濃縮，一般先將上述的溶液進行微濾，以除去其 中的不溶性雜質(zhì)，之后進行超濾濃縮脫鹽即可得到濃縮液，其中微濾采用0. l-o. 22um 的中空纖維膜組件進行，可以獲得更好的效果；超濾工藝中，本發(fā)明優(yōu)選采用孔徑為 6000-50000Dalton的超濾膜組件完成，以提高灰樹花蛋白聚糖的收率。與CN :1255429C中 的超濾相比，其采用的是10萬道爾頓的濾膜，這樣只能截留10萬道爾頓以上的蛋白聚糖， 低于這個標準的蛋白聚糖就白白流失了，而本發(fā)明所采用的低分子量的濾膜，可回收6000 道爾頓以上的各種蛋白聚糖，較現(xiàn)有技術(shù)收率有了較大的提高。
在上述的超濾工藝中，通過超濾調(diào)節(jié)濃縮液的離子強度，使?jié)饪s液電導率在 100 us/cm以下，使?jié)饪s液蛋白聚糖濃度在左右；兩個參數(shù)的調(diào)節(jié)方法為在濃縮超濾 的過程中，每間隔2h用電導率儀測定一次濃縮液的電導率，直到其電導率低于lOOys/cm; 采用硫酸_苯酚法測定濃縮液灰樹花蛋白聚糖中糖的含量，lorry法測定灰樹花蛋白聚糖 中蛋白含量，直到濃縮液蛋白聚糖濃度在左右，停止超濾。一般而言，之所以采用測定 電導率的方式，主要是測電導率的方法簡單易行，而含量時比較麻煩無法達到實時監(jiān)測， 所以發(fā)明人首先采用每間隔2h用電導率儀測定一次濃縮液的電導率的方法，確定電導率， 當電導率指標達到要求后才進行含量的測定，經(jīng)過發(fā)明人的長期摸索，一般當電導率低于 lOOys/cm，含量也就接近了 左右，這時再進行適時的含量測定，只到達到左右時停 止超濾即可，這樣的測定過程，可以簡化整個檢測的過程，降低對于超濾過程控制的難度。步驟4中對經(jīng)過超濾脫鹽的濃縮液進行層析純化，其中所采用的層析方法是 離子交換層析，所用層析介質(zhì)為D0WEX MXA-1或Q-S印harose FF或DEAE-S印hacel或 DEAE-Sepharose FF或717強堿性離子交換樹脂或D201大孔強堿性陰離子交換樹脂中的一 種，經(jīng)過層析純化后的濾液通過冷凍干燥即可獲得灰樹花蛋白聚糖，其單位原料的蛋白聚 糖得率(以菌體干品計)以及所得蛋白聚糖的含量最高，分別達到4%和95% (w/w) 0通過上述步驟制備的灰樹花蛋白聚糖純度95%以上，其中糖含量70-85%，蛋白 質(zhì)含量15-30% ；且可完全溶于水，糖鏈部分為以0-1，6_葡聚糖為主鏈，0-1，3_葡聚糖 為支鏈，其重均分子量范圍為10-50萬Dalton，高純度的產(chǎn)品其重均分子量為10-20萬 Dalton。較之現(xiàn)有技術(shù)獲得的灰樹花蛋白聚糖具有純度高，分子量均勻的特點。本發(fā)明灰樹花蛋白聚糖制備工藝采用誘導自溶、酶解、微濾、超濾、柱層析等步驟， 與現(xiàn)有熱水提取、堿法提取結(jié)合超濾的工藝在提取過程和提取效果上有顯而易見的進步1.處理時間大大縮短，只需幾小時的自溶和幾小時的酶解，整個處理過程一氣呵 成，無需重復；2.處理步驟單一，沒有同一條件下的多次提取，減少了勞動強度；3.制備過程條件溫和，無大量酸堿的使用，既避免了強堿性條件對目標產(chǎn)物的破 壞，又減輕了環(huán)保壓力；4.現(xiàn)有熱水提取結(jié)合堿法提取的工藝只是粗提工藝，所獲產(chǎn)品的蛋白聚糖含量 低，應用范圍有限，而本發(fā)明則大大改善了這一狀況。綜上所述，采用本發(fā)明所述的制備工藝，其中的誘導自溶處理灰樹花菌體可以將 灰樹花蛋白聚糖更多的溶出，調(diào)節(jié)適當?shù)腜H和溫度作為反應條件，可以獲得灰樹花自身內(nèi) 源酶系中酶的釋放、激活和參與化學反應的最適條件，反應所需的環(huán)境條件溫和，整個反應 不需要添加大量的酸、堿等輔料，減少提取成本的同時又減輕環(huán)保壓力；同時，以灰樹花濕 菌體和鮮子實體直接提取灰樹花蛋白聚糖，與現(xiàn)有的工藝，發(fā)酵后的處理過程一般發(fā)酵結(jié) 束后都要對菌體先進行干燥處理相比，減少了發(fā)酵結(jié)束后對菌絲體的干燥或子實體收獲后 的干燥、粉碎等中間環(huán)節(jié)，減少了能源消耗，大大降低了提取成本；添加鎂、鈣、鉀等離子，補 充灰樹花自身酶體系的輔酶因子，激活酶促反應，增加酶活性，提高了提取效率，并降低了 能耗；調(diào)節(jié)灰樹花菌體含量至1-10%左右，通過自溶以及酶促反應使細胞壁和細胞內(nèi)容物 更多的溶出，減少了后處理步驟的工作負荷，提高提取效率，達到最優(yōu)的效果。較之中國專 利(CN:1255429C)中披露的制備方法，灰樹花蛋白聚糖的純度有較大提高，但又不破壞灰樹花蛋白聚糖的基本結(jié)構(gòu)，更好的保存灰樹花蛋白聚糖的天然構(gòu)型，同時減輕了環(huán)保壓力。
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細說 明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1取灰樹花發(fā)酵液10L，其中折合干菌絲體含量2% (w/v)，添加lg硫酸鎂、20g碳酸 鈣，采用均質(zhì)機均質(zhì)后，充分混合，用乙酸調(diào)節(jié)溶液PH4. 5，升溫至50°C下自溶反應4h ；用氫 氧化鈉調(diào)節(jié)自溶液體的PH到8. 5，添加20g堿性蛋白酶，50°C下酶解4h，迅速升溫至90°C滅 活20min，冷卻后，4000r/min轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集離心清液，對清液微濾、超濾，調(diào)節(jié)超 濾液離子強度以及灰樹花蛋白聚糖濃度，采用DEAE-S印harose FF介質(zhì)的色譜柱層析，然后 超濾、冷凍干燥得到灰樹花蛋白聚糖。產(chǎn)物的灰樹花蛋白聚糖含量為96%，得率4. 2% (菌 體干品計)，蛋白聚糖中糖含量74%，蛋白含量22%，重均分子量為18萬Dalton。實施例2取灰樹花鮮子實體1500g，其中含水分80%，采用破碎機破碎至粒徑0. 1-0. 3cm, 添加純凈水定容到10L，調(diào)整至折合干菌體含量3% (w/v)，添加0.5g硫酸鎂、10g氯化鈣， 均質(zhì)機均質(zhì)，充分混合，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH5. 0，升溫至50°C下自溶6h ；用氫氧化鉀調(diào)節(jié)自 溶液體的PH到8. 0，添加20g木瓜蛋白酶、20g纖維素酶，50°C下酶解6h，迅速升溫至90°C 滅活lOmin，冷卻后，13000r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin，收集離心清液，對清液微濾、超濾，調(diào)節(jié)超 濾液離子強度以及灰樹花蛋白聚糖濃度，采用DEAE-Sephace色譜柱層析，然后超濾、冷凍 干燥得到灰樹花蛋白聚糖。產(chǎn)物的灰樹花蛋白聚糖含量為98%，得率4. 05% (以菌體干重 計)，蛋白聚糖中糖含量78%，蛋白含量20%，重均分子量為15萬Dalton。實施例3取灰樹花發(fā)酵液10L，折合干菌絲體含量2% (w/v)，添加10g硫酸鎂、5g碳酸鈣， 采用均質(zhì)機均質(zhì)后，充分混合，用檸檬酸調(diào)節(jié)溶液PH5. 0，升溫至50°C下自溶8h ；用碳酸 鈉調(diào)節(jié)自溶液體的PH到7. 5，添加20g木瓜蛋白酶，50°C下酶解4h，迅速升溫至90°C滅活 20min，冷卻后，10000r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin，收集離心清液，對清液微濾、超濾，調(diào)節(jié)超濾液 離子強度以及灰樹花蛋白聚糖濃度，采用Q-S印harose FF色譜柱層析，然后超濾、冷凍干燥 得到灰樹花蛋白聚糖。產(chǎn)物的灰樹花蛋白聚糖含量為97%，得率4. 8% (以菌體干重計)， 蛋白聚糖中糖含量85%，蛋白含量12%，重均分子量為14萬Dalton。實施例4取灰樹花鮮子實體2500g，其中含水分80%，充分破碎至粒徑0. 5-1. 0cm，添加灰 樹花發(fā)酵液定容到10L，折合干菌體含量5% (w/v)，添加0. 5g硫酸鎂、20g氯化鈣，采用均 質(zhì)機均質(zhì)后，充分混合，用硫酸調(diào)節(jié)溶液PH5. 5，55°C下自溶6h ；用氫氧化鈉調(diào)節(jié)自溶液體 的pH到8. 5，添加20g木瓜蛋白酶、20g淀粉酶酶，60°C下酶解4h，迅速升溫至90°C滅活 15min，冷卻后，6000r/min速度離心lOmin，收集離心清液，對清液微濾、超濾，調(diào)節(jié)超濾液 離子強度以及灰樹花蛋白聚糖濃度，采用717強堿性離子交換樹脂色譜柱層析，然后超濾、 冷凍干燥得到灰樹花蛋白聚糖。產(chǎn)物的灰樹花蛋白聚糖含量為95%，得率4. 05% (以菌體干重計)，蛋白聚糖中糖含量65%，蛋白含量30%，重均分子量為20萬Dalton。比較例采用熱水提取灰樹花蛋白聚糖取灰樹花子實體粉(40-80目)lKg，加入20倍體積的水浸沒，80°C條件下保溫2h ； 重復提取2次；提取液粗過濾后用lOOOOODalton的中控纖維膜超濾，收集被截留部分為水 溶性蛋白聚糖溶液；提取后的灰樹花子實體用20倍4%的氫氧化鈉，30°C條件下保溫4h; 重復提取2次；提取液粗過濾后用lOOOOODalton的中控纖維膜超濾，收集被截留部分為堿 溶性蛋白聚糖溶液；將水溶性與堿溶性的蛋白聚糖溶液一起濃縮干燥即得灰樹花蛋白聚糖 干粉。上述方法中，提取物中的第一部分水溶性蛋白聚糖中，除葡聚糖外，還含有 大量a-多糖、雜多糖和其他雜多糖，如甘露糖、巖藻糖、半乳糖、木糖等組成的多糖，
葡聚糖含量較低；水溶多糖的分子量范圍比堿溶多糖大得多，高分子量的多糖占很大 的一部分。因此，所得產(chǎn)物純度較低，對后期分離純化造成較大的影響。上述方法與實施例4制備蛋白聚糖結(jié)果的比較見表1 表1灰樹花蛋白聚糖提取過程蛋白聚糖分析 本發(fā)明工藝中，未采用堿提取工藝，原因是2%以上的氫氧化鈉溶液的pH值為13 以上，中空纖維濾膜對此缺乏耐受性；此外，該氫氧化鈉提取液含有大量堿溶而水不溶的酸 性多糖，溶解性能大大降低，且此溶液粘稠度高，超濾操作極其困難，同時由上表可見，采用 本發(fā)明所述的工藝后，整個處理時間僅為現(xiàn)有技術(shù)的一半，大大提高了生產(chǎn)的效率。
權(quán)利要求
一種制備灰樹花蛋白聚糖的方法，包括灰樹花蛋白聚糖的提取、分離和純化步驟，其特征在于所述的灰樹花蛋白聚糖的提取包括如下步驟(1)誘導自溶調(diào)節(jié)菌體濃度為1 10％(w/v)，之后添加占總量0.01 0.5％(w/v)的無機鹽；調(diào)節(jié)pH至4.5 6.0，在40 60℃條件下保溫2 10h獲得自溶溶液；(2)酶解將步驟(1)所得自溶溶液調(diào)節(jié)pH至7.0 8.5，添加0.01 0.1％(w/v)酶制劑，在40 60℃條件下保溫2 8h；90℃滅酶活，冷卻后離心，收集上清液即可獲得灰樹花蛋白聚糖的提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述的分離和純化步驟為對步驟(2)所得的灰樹花蛋白聚糖的提取液進行微濾，之后進行超濾脫鹽和濃縮；超 濾濃縮液經(jīng)過層析純化、冷凍干燥，即可得到灰樹花蛋白聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于步驟(1)中所采用的菌體是灰樹 花液體發(fā)酵菌絲體或灰樹花鮮子實體或兩者的混合物，采用灰樹花鮮子實體時預先進行破 碎，破碎至粒徑0. 1-1. 0cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于步驟(1)中所添加的無機鹽為硫 酸鎂、氯化鎂、硝酸鎂、碳酸鈣、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀中的一種或數(shù)種的 混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于步驟⑴中采用酸調(diào)節(jié)pH，所采用 的酸為檸檬酸、乙酸、鹽酸、硫酸中的一種或數(shù)種的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于步驟⑵中采用堿調(diào)節(jié)pH，所采用 的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉中的一種或數(shù)種的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述制備方法，其特征在于步驟(2)中而所采用的酶制劑中的 酶選自纖維素酶、淀粉酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或數(shù)種的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述的微濾采用0.1-0. 22 y m的中空 纖維膜組件完成；所述的超濾采用采用孔徑為6000-50000DaltOn的超濾膜組件完成，超濾 的進程以超濾濃縮液的電導率達到100y s/cm以下時，或/和濃縮液中的蛋白聚糖濃度達時，終止超濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述層析采用離子交換層析，所用層析 介質(zhì)為 DOWEX MXA-1 或 Q-S印harose FF 或 DEAE-S印hacel 或 DEAE-S印harose FF 或 717 強堿性離子交換樹脂或D201大孔強堿性陰離子交換樹脂中的一種。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，提供了一種制備灰樹花蛋白聚糖的方法，本發(fā)明制備的灰樹花蛋白聚糖中糖含量50-90％，蛋白含量10-50％，其制備方法包括菌體自溶、酶解，并對酶解提取液微濾、超濾、層析、干燥，得到灰樹花蛋白聚糖。本發(fā)明工藝簡單，工藝參數(shù)易于控制，產(chǎn)物灰樹花蛋白聚糖的得率、純度都比較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。所得灰樹花蛋白聚糖可廣泛應用于醫(yī)藥、食品、食品添加劑及其它輕工領(lǐng)域。
文檔編號C07K1/36GK101914131SQ20101026446
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者丁艷, 張心青, 徐澤平, 楊傳倫, 王秀芝, 甄春峰, 蘇亞平, 虞鳳慧 申請人:山東京博控股發(fā)展有限公司;山東仁和生物有限公司