專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種可用于分離純化組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，屬 于生物技術領域。
背景技術：
組織型纖溶酶原激活劑是纖維蛋白溶解系統(tǒng)中與纖維蛋白溶解相關的一種重要 的絲氨酸蛋白酶類。它能將纖溶酶原激活為纖維蛋白溶解酶，即纖溶酶，被激活的纖溶酶 可催化溶解纖維蛋白，使血栓溶解。由于其特異性及內源性使它被廣泛用于急性血栓栓塞 性疾病的臨床治療。目前，應用基因工程的方法已可獲得組織型纖溶酶原激活劑突變體 (Val4-Cys261)，研究如何獲得低價、安全的組織型纖溶酶原激活劑有良好的應用前景。親和層析是利用生物分子間專一的親和力進行分離的一種層析方法。這種專一吸 附能力是由于共價偶聯(lián)在惰性載體上的物質(配基)與待純化的物質間專一、可逆的親和 力(包括靜電作用、氫鍵、疏水作用等)。可用配基是親和層析的核心部分。用作親和層析配基分離純化組織型纖溶酶原激活劑的有苯甲脒及其衍生物，還有 基于組織型纖溶酶原激活劑與纖溶蛋白酶原結合位點設計的肽配基。一些研究通過由三、 四個氨基酸組成的小肽探索組織型纖溶酶原激活劑活性位點的親和性，已獲得肽配基如 QDES。此外還有根據(jù)組織型纖溶酶原激活劑與纖維蛋白的特異性結合位點設計的肽配基， 如GPRP，KKKK，KKKKGPRG ；通過組織型纖溶酶原激活劑與纖溶酶原結合位點設計的配基，如 KCPGRVRVVGGC等。相對于仿生親和配基，肽配基具有高效、安全等優(yōu)點，即使配基不慎脫落， 也不易造成機體中毒。我國的報道多涉及組織型纖溶酶原激活劑突變體研究，缺少分離純 化組織型纖溶酶原激活劑的有效方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽及其用途， 可用于分離純化組織型纖溶酶原激活劑及其片段。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案是該組織型纖溶酶原激活劑及其片段 的親和肽具有如下結構X1X2X3X4X5X6X7其中，X1為丙氨酸或甘氨酸；X2為脯氨酸或蘇氨酸；X3、X4均為谷氨酸；X5為異亮氨 酸、亮氨酸或纈氨酸；X6為甲硫氨酸；X7為天冬氨酸。進一步地，本發(fā)明在所述X5和X6之間設有一個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異 亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。進一步地，本發(fā)明所述X1X2X3X4X5X6X7的序列為選自SEQ ID Nos. 1至12中的任一 種。進一步地，本發(fā)明所述氨基酸殘基的序列為選自SEQ ID Nos. 13至46中的任一 種。
進一步地，本發(fā)明用于分離純化或檢測組織型纖溶酶原激活劑或其片段。進一步地，本發(fā)明通過將所述親和肽連接于固相支持物上以分離純化或檢測組織 型纖溶酶原激活劑或其片段。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是(1)本發(fā)明的親和肽對組織型纖溶酶原激活劑及其片段具有較強的親和性，因此 對組織型纖溶酶原激活劑及其片段有較好的分離純化效果。(2)本發(fā)明的親和肽包含七至八個氨基酸殘基，屬于小肽，穩(wěn)定性好，即使不慎脫 落也不易引起機體免疫反應，有較好的安全性。(3)本發(fā)明的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的作用位點為其37環(huán)上帶正電的 殘基，因此本發(fā)明的親和肽也可與組織型纖溶酶原激活劑片段有特異性的相互作用，進而 用于分離純化組織型纖溶酶原片段。


圖1為序列如SEQ ID No. 1所示的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑結合示意圖；其中，1表示組織型纖溶酶原激活劑，2表示組織型纖溶酶原激活劑上與配基相吸 附的殘基，3表示序列如SEQ ID No. 1所示的親和肽。
具體實施例方式實施例1 組織型纖溶酶原激活劑及其片段親和肽配基的設計本發(fā)明的親和肽采用分子動力學方法，是以組織型纖溶酶原激活劑與纖溶酶原激 活物抑制劑作用位點為基礎設計的。組織型纖溶酶原激活劑和纖溶酶原激活物抑制劑的三維結構取自蛋白質數(shù)據(jù)庫 (Pdb)。選取纖溶酶原激活物抑制劑的B鏈，其殘基序列如下所示=Met-Ala-Pr0-Glu-Glu-I Ie-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-His-Asn-Pro-Thr-Gly-Thr-Val-Le u-Phe-Met-Gly-Gln-Val-Met-Glu-Pro，以此三十三肽為親和肽，在常溫和水環(huán)境下對組織 型纖溶酶原激活劑進行至少4ns的分子動力學模擬，過程中讓親和肽與組織型纖溶酶原激 活劑自由吸附，計算體系接近平衡時該三十三肽與組織型纖溶酶原激活物的相互作用能大 小。其中兩個谷氨酸與天冬氨酸是該親和肽與組織型纖溶酶原激活物相互作用的主要位點 (Lamba, D. etc.，J. Mol. Biol.，1996，258，117-135)，因此該三十三肽可簡化為包含這三個 帶負電殘基的八肽片段Ala-Pro-Glu-Glu-IIe-IIe-Met-Asp作為親和肽，計算該八肽與組 織型纖溶酶原激活劑的相互作用能，比原三十三肽的親和性略高。因此以該八肽為模板，根 據(jù)親疏水性對帶負電殘基周圍的疏水基(X1X2X5X6位點)進行突變研究，突變的目標氨基酸 殘基包括色氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸，從中選擇與組織型纖溶酶原相互作用較 強的肽作為優(yōu)選的親和肽。以上所設計的親和肽具有第一種結構或第二種結構，其中，第一禾中結構為=X1X2X3X4X5X6X7其中，X1為丙氨酸或甘氨酸；X2為脯氨酸或蘇氨酸；X3、X4均為谷氨酸；X5為異亮氨 酸、亮氨酸或纈氨酸；X6為甲硫氨酸；X7為天冬氨酸。第二種結構為在第一種結構的X5和X6之間還設有一個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。實施例2 組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽與其相互作用能分析采用實施例1中所述方法，以蘇氨酸突變體系(即分別將X2X5X6位點突變?yōu)樘K氨 酸)為例，利用公式(1)計算各親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的相互作用能，結果如表1 所示。Eint = Ep+l-Ep-El (1)公式⑴中，Eint表示組織型纖溶酶原激活劑與親和肽間的相互作用能，Ep+l表示 組織型纖溶酶原激活劑與親和肽的總勢能，Ep表示組織型纖溶酶原激活劑的勢能，&表示 親和肽的勢能。表1組織型纖溶酶原激活劑與不同親和肽配基結果分析
親和肽序列 相互作用能/(kcal/mol)
ATQQIIMD-389
APQQTIMD-262
Γ APQQIID-253^^
ATQQIMD-374
APQQTMD-290
ATQQTMD-293
APQQIMD-507從表1可看出，X2位點對親疏水性變化并不敏感，相對的，X5位點則對親疏水性變 化敏感，甲硫氨酸缺失的親和肽體系模擬過程中穩(wěn)定性較差，相互作用能相對較低，在其它 甲硫氨酸缺失的實驗中也有相同的特點。結合上述結果再對各位點進行突變研究，對X2位 點嘗試絲氨酸等各類親疏水性殘基，保留X6位的甲硫氨酸，對X5位點在其他甲硫氨酸缺失 的模擬實驗中，取丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸進行突變研究，根據(jù)相互 作用能進行優(yōu)選。本發(fā)明具有第一種結構的親和肽優(yōu)選如SEQ ID Nos. 1至12所示的序列。第二種結構為在第一種結構的X5和X6之間設有一個氨基酸殘基，所述氨基酸殘 基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。本發(fā)明具有第二種結構的親和肽優(yōu)選如SEQ ID Nos. 13至46所示的序列。其中，本發(fā)明最優(yōu)選的是具有如SEQ ID Nos. 1所示序列的親和肽，其親和性約是 模板親和肽的2. 3倍。結構如SEQ ID Nos. 1所示的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑相互 作用如圖1所示，卡通模式表示組織型纖溶酶原激活劑1，表面模式表示組織型纖溶酶原激 活劑上與配基相吸附的殘基2，范德華模式表示結構如SEQ ID No. 1所示的親和肽3。由圖 1可知，結構如SEQ ID Nos. 1所示的親和肽與組織型纖溶酶原激活劑緊密結合，具有良好的 親和性。實施例3 組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽配基連接于固相載體聚乙烯醇水凝膠體系由六條聚乙烯醇相互交聯(lián)而成，每條鏈均由40個聚乙烯醇單體構成，且每條鏈上連接5個結構如SEQ ID Nos. 1所示的親和肽，進行至少4ns的分子動 力學模擬，利用公式(1)計算固定化后該親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的相互作用能， 與未固定化該親和肽與組織型纖溶酶原激活劑的相互作用能相當。由此可知，固定化后的 親和肽具有良好的親和性，可用于分離純化或檢測組織型纖溶酶原激活劑或其片段。綜上，本發(fā)明的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽具有良好的親和性，可 用于組織型纖溶酶原激活劑的分離純化或檢測。本發(fā)明的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽可通過化學生物學中多肽的 常規(guī)方法合成，例如Merrifield固相合成法中常用的Fmoc方法。
權利要求
一種組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于具有如下結構X1X2X3X4X5X6X7其中，X1為丙氨酸或甘氨酸；X2為脯氨酸或蘇氨酸；X3、X4均為谷氨酸；X5為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸；X6為甲硫氨酸；X7為天冬氨酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于在 所述X5和X6之間設有一個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于所 述X1X2X3X4X5X6X7的序列為選自SEQ ID Nos. 1至12中的任一種。
4.根據(jù)權利要求2所述的組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽，其特征在于所 述氨基酸殘基的序列為選自SEQ ID Nos. 13至46中的任一種。
5.根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的親和肽的用途，其特征在于用于分離純化或 檢測組織型纖溶酶原激活劑或其片段。
6.根據(jù)權利要求5所述的親和肽的用途，其特征在于通過將所述親和肽連接于固相 支持物上以分離純化或檢測組織型纖溶酶原激活劑或其片段。
全文摘要
本發(fā)明公開一種組織型纖溶酶原激活劑及其片段的親和肽及其用途，屬于生物技術領域。該親和肽的結構為X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1為丙氨酸或甘氨酸，X2為脯氨酸或蘇氨酸，X3、X4均為谷氨酸，X5為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，X6為甲硫氨酸，X7為天冬氨酸。優(yōu)選在所述X5和X6之間設有一個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基為異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。本發(fā)明的親和肽通過固定于固相支持物上，可用于組織型纖溶酶原激活劑及其片段的分離純化或檢測，具有親和性強、安全性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，有良好的應用前景。
文檔編號C07K1/22GK101948509SQ20101029868
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權日2010年9月30日
發(fā)明者吳韜, 張錦, 王 琦 申請人:浙江大學