專利名稱：一類光親和標記雙功能探針分子及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類光親和標記雙功能探針分子。本發(fā)明所涉及的探針分子具有Y 氨基丁酸 B 型受體(Gamma Aminobutyric Acid B Rec印tor，簡稱 GABAbR 或 GABAb 受體)強親和力、高選擇性的結(jié)合能力，同時可用于在活細胞水平對膜上GABAb受體的標記、示蹤、分析因激活或拮抗引起的胞內(nèi)相關(guān)信號蛋白的動態(tài)變化過程，以及用于新靶點的發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)譜的研究，為與GABAb受體相關(guān)疾病的診斷和相應治療藥物的開發(fā)提供更為直接的精確的重要信息。本發(fā)明還涉及該類探針分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計及制備方法。
背景技術(shù)：
藥物發(fā)現(xiàn)過程包括許多階段，如靶點的鑒別、先導化合物的發(fā)現(xiàn)、小分子化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、臨床前及臨床試驗等。靶點的鑒別是藥物發(fā)現(xiàn)與發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟 (Curr. Opin. Chem. Biol. 2002,6 :427 43 ，而目前基因水平上的生物技術(shù)不能確定針對某種疾病的小分子藥物的特異性蛋白質(zhì)靶點。可以預見，在基因組學基礎(chǔ)上開展的蛋白質(zhì)組學研究將推動藥物開發(fā)方面的實質(zhì)性突破，使得生命科學研究能實現(xiàn)其最終目標，研制出治療包括癌癥和艾滋病等在內(nèi)的多種疾病的藥物。因此針對藥物發(fā)現(xiàn)的技術(shù)重心已經(jīng)由基因組轉(zhuǎn)向了蛋白質(zhì)組。光親和標記技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學的主要策略之一，它不僅對蛋白質(zhì)進行鑒別，同時也對其功能及相互作用進行研究。光親和標記技術(shù)是結(jié)合現(xiàn)代分子生物學、細胞生物學、有機化學等多學科的優(yōu)勢， 運用合成的光親和小分子化合物作為工具探針，經(jīng)特定波長的光照射分解產(chǎn)生高活性的中間體，與其受體活性部位形成特異性的不可逆的共價結(jié)合。探針分子(參見

圖1)包括三個功能部位活性基團(activity group)、光親和標記基團(photoaffinity labeling group)、報告基團(importer group)，功能部位之間通過連接部位(spacer)連接。活性基團的作用是將探針分子導向受體蛋白的活性中心；光親和標記基團的作用是在探針分子被導向受體蛋白的活性中心之后經(jīng)特定波長的紫外光照射分解產(chǎn)生高活性的卡賓或氮賓中間體，將探針分子共價修飾在受體蛋白的活性中心；報告基團主要是方便以后的分離、純化、檢測等操作。光親和標記技術(shù)是在分子水平上研究配體與受體相互作用的核心工具之一，闡明配體與受體相互作用的機理對藥物先導物的發(fā)現(xiàn)有著巨大的推動作用(Curr. Top. Med. Chem. 2002,2:271 觀8)。它在藥物的發(fā)現(xiàn)中主要有兩個方面的應用新靶點的確定及靶標蛋白與小分子配體作用模式的確定。運用這一技術(shù)的優(yōu)勢在于可在不同的層面對疾病相關(guān)的靶點進行深入的研究1)未知作用靶點的活性化合物通過設(shè)計探針標記捕獲的靶標蛋白，進而確定該活性化合物的作用靶點，更進一步，對由生物大分子與探針分子形成的共價復合物的解析可獲取小分子活性化合物與其作用靶點的作用模式；2)已知作用靶點，但具體作用模式未知的活性化合物，運用這一技術(shù)可直接從微觀角度解析其與靶標蛋白的可能的作用模式。運用光親和標記技術(shù)，大量的與疾病相關(guān)的靶點被發(fā)現(xiàn)，多種小分子與生物大分子作用的模式被確定，這些信息對合理藥物設(shè)計具有非常重要的意義。比如新的藥物靶點的發(fā)現(xiàn)，或者對一個已知蛋白的功能作新的闡述，這對于從分子水平闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療的意義是不言而喻的。這些靶點可被發(fā)展為高效、高速的高通量篩選模型，并在短時間內(nèi)隨機篩選大量的小分子化合物，發(fā)現(xiàn)一些更高活性的小分子化合物作為先導物用于進一步的新藥開發(fā)研究。這樣，從一個小分子探針為起點，其母體化合物或許在類藥性、有效性甚至代謝穩(wěn)定性等方面存在問題，但新發(fā)現(xiàn)的化合物則不受原有結(jié)構(gòu)的限制，有更寬的改造空間。γ -氨基丁酸(GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在體內(nèi)通過作用于離子通道型的GABAa、GABAe受體及代謝型的GABAb受體而發(fā)揮生理功能。GABAb 受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)家族的C家族，具有七次跨膜結(jié)構(gòu)，它存在于神經(jīng)元的突觸前及突觸后部位，介導慢的抑制性效應，在腦內(nèi)參與許多重要的生理活動和病理變化，包括認知損害、癲癇、痙攣及藥物成癮等。因此，GABAb受體作為藥物作用的重要靶點，其結(jié)構(gòu)特征、作用機理以及信號轉(zhuǎn)導途徑的研究，對于闡明相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機理以及相應治療藥物的開發(fā)具有重要意義。雖然GABAb受體具有重要的生理及病理意義，但其結(jié)構(gòu)的特殊性使得利用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學方法進行研究非常有難度；而ABPP技術(shù)，盡管目前已經(jīng)廣泛的用于不同酶家族的研究，在離子型受體方面的應用也有報道，但是在GPCR家族尤其是GABAb受體方面的應用仍然很少。一般來說，GPCR的不同構(gòu)象在體內(nèi)同時存在并處于平衡狀態(tài)，而GPCR的不同的小分子配體可以使受體在不同的構(gòu)象之間轉(zhuǎn)換。這種體系的復雜性可能是制約ABPP廣泛用于GABAb受體研究的主要原因。如果能克服上述困難，成功設(shè)計合成強親和力、高選擇性的光親和探針分子，將會對GABAb受體的生理學和結(jié)構(gòu)特征的研究起到相當大的推動作用。此外，利用小分子光親和探針還可以將GABAb受體固定在激活或拮抗狀態(tài)，來研究活性狀態(tài)下6々8^受體在細胞上的定位及功能，以及所引起胞內(nèi)信號的變化。因此，開發(fā)6々8^受體的強親和力、高選擇性的小分子配體對深入研究GABAb受體，以及開發(fā)新型作用于GABAB 受體的藥物具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一類對GABAb受體具有強親和力、高選擇性的光親和標記雙功能探針分子。本發(fā)明的另一個目的是提供上述的光親和標記雙功能探針分子的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供上述的光親和標記雙功能探針分子的用途。本發(fā)明所涉及的光親和標記雙功能探針分子可用于活細胞水平對膜上GABAb受體的標記、示蹤、分析因激活或拮抗引起的胞內(nèi)信號蛋白的動態(tài)變化過程以及用于新靶點的發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)譜的研究，為深入研究GABAb受體提供更有效的研究工具，為開發(fā)新型作用于GABAb受體的藥物提供重要信息。根據(jù)本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明提供一類結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子
權(quán)利要求
1. 一類結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，其中，通式I中Ri 為 Ric ；R2的定義與權(quán)利要求1相同；R3為三氟甲基雙吖丙啶基、苯甲酰基或二苯甲酮基；X的定義與權(quán)利要求1相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，其中，通式I為如下的通式II:
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，其中，通式II為如下的通式III
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，其中，通式III中η為2 ；R2 為生物素或 Alexa Fluro 488。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，其中，通式II為如下的通式IV
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，其中，通式IV中n為2 ；R2為生物素、四乙基羅丹明或ΗΑ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子，該光親和標記雙功能探針分子具體為
9.權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)式如通式I所示的光親和標記雙功能探針分子的用途 所述光親和標記雙功能探針分子(1)作為活性的GABAb受體探針分子，特異性標記細胞膜上的GABAb受體，包括在原代神經(jīng)細胞和過表達系統(tǒng)；或(2)作為GABAb受體特異性示蹤劑；或(3)作為特異性探針，用于觀察細胞膜內(nèi)信號蛋白的變化以及用于新靶點的發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)譜的研究。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類光親和標記雙功能探針分子。本發(fā)明所涉及的探針分子具有GABAB受體強親和力、高選擇性的結(jié)合能力，同時可用于在活細胞水平對膜上GABAB受體的標記、示蹤、分析因激活或拮抗引起的胞內(nèi)相關(guān)信號蛋白的動態(tài)變化過程，以及用于新靶點的發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)譜的研究，為與GABAB受體相關(guān)疾病的診斷和相應治療藥物的開發(fā)提供更為直接的精確的重要信息。
文檔編號C07F9/6558GK102532197SQ20101060629
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉劍峰, 南發(fā)俊, 李新, 林欣, 蔣明, 陳林海 申請人:中國科學院上海藥物研究所