Atp硫酸化酶的生物素標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ATP硫酸化酶的生物素標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物素化(b1tinylat1n)是指將生物素共價(jià)連接到蛋白質(zhì)、核酸或其它分子上的過程。由于生物素的分子量不大(分子量為244.31)，生物素化反應(yīng)快速、高效且不易被干擾。生物素化的分子能通過生物素與鏈霉親和素、親和素互作，且不受高熱、PH、蛋白酶解的影響。生物素與鏈霉親和素、親和素的結(jié)合特異且高效，因此這一互作在生物技術(shù)的許多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。另外，多個(gè)生物素化分子可以發(fā)生交聯(lián)來形成個(gè)科研人員感興趣的蛋白，同時(shí)允許和多個(gè)鏈霉親和素、親和素、中性親和素蛋白結(jié)合，增加了對此蛋白的檢測靈敏度。此外還有大量的生物素化分子的應(yīng)用有待開發(fā)。
[0003]ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase, ATPS)廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物中，但它在各種生物體當(dāng)中的生物學(xué)作用略有不同。在植物和部分微生物中，是催化硫酸鹽同化反應(yīng)第一步的關(guān)鍵酶。在ATPS的催化下，硫酸根離子與ATP反應(yīng)，產(chǎn)生腺嘌呤-5’-磷酸硫酸ATS和焦磷酸鹽PPi ο而在一些化學(xué)自養(yǎng)菌和化能無機(jī)營養(yǎng)菌中，ATPS是催化硫化氫氧化生成無機(jī)硫酸鹽最后一步的酶，其作用是催化ATS和PPi反應(yīng)生成ATP和硫酸根離子，即上述反應(yīng)的逆反應(yīng)。ATPS已經(jīng)從產(chǎn)黃青霉菌、鼠肝、卷心菜等生物體中提取并純化得到，而且編碼ATPS的基因也已經(jīng)從原核生物、真核生物、動(dòng)物和植物中克隆出來并在適當(dāng)?shù)乃拗髦械玫奖磉_(dá)。不同來源的ATPS結(jié)構(gòu)不同，大腸桿菌來源的ATPS是異源二聚體且需要GTP激活，酵母、真菌以及植物來源的ATPS是單體或是同源寡聚體。在分子生物學(xué)方面，目前已通過氨基酸修飾等手段研究其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，加深了對ATPS作用機(jī)制的了解。偶連ATP硫酸化酶可以應(yīng)用于很多方面，如:PPi定量、RNA測定、DNA測序、DNA聚合酶酶活測定等等。
[0004]ATP硫酸化酶被生物素修飾之后就可以同親和素進(jìn)行固相親和作用。生物素與親和素是一對特異性相當(dāng)高的親和配體，并且具有解離速率慢、不易受干擾等特點(diǎn)。目前，生物素化的手段有化學(xué)修飾和生物修飾，但修飾后的生物素化蛋白活性普遍不高。生物素化的ATP硫酸化酶可應(yīng)用于焦磷酸測序反應(yīng)中，酶活會(huì)直接關(guān)系到測序反應(yīng)的準(zhǔn)確度，所以急需找到一種可操作性強(qiáng)，產(chǎn)物活性高的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是一種ATP硫酸化酶的生物素標(biāo)記方法，包括以下步驟:
(1)使用PBS緩沖液溶解ATP硫酸化酶；
(2)使用PBS緩沖液對ATP硫酸化酶進(jìn)行透析；
(3)活化生物素；
(4)平衡生物素至10°C以下；
(5)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入ATP硫酸化酶，按照生物素與ATP硫酸化酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液； (6)使用PBS緩沖液對混合溶液進(jìn)行透析，去除雜質(zhì)和游離生物素；
(7)采用superdex200進(jìn)行分子排阻；
(8)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(9)加入保護(hù)劑，冷藏保存至-80°C— -16°C。
[0006]所述步驟(I)-步驟(7 )中，PBS緩沖液pH值為8.0。
[0007]所述溶解ATP硫酸化酶，使ATP硫酸化酶濃度為1.5_2mg/ml。
[0008]所述活化生物素使用EDC/NHS和有機(jī)溶劑，生物素、EDC和NHS的摩爾比為4:5: 4，有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。
[0009]所述攪拌溫度為4°C，持續(xù)5小時(shí)以上，優(yōu)選為8小時(shí)。
[0010]所述透析過程溫度為4°C，持續(xù)12小時(shí)以上，優(yōu)選為18小時(shí)。
[0011]所述透析過程，PBS緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，PBS緩沖液更換一次以上。
[0012]所述保護(hù)劑含有PBS緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
[0013]所述保護(hù)劑優(yōu)選含有PBS緩沖液、甘氨酸、組氨酸、DTT、EDTA和疊氮鈉。
[0014]加入保護(hù)劑后，將保護(hù)劑與酶的混合液調(diào)節(jié)至pH 7.5。
[0015]本發(fā)明中二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑能夠使生物素和ATP硫酸化酶溶解于其中，在其中高效、充分的結(jié)合。制備得到的生物素化ATP硫酸化酶，非常適合應(yīng)用于焦磷酸測序反應(yīng)中，ATP硫酸化酶的高活性可確保測序反應(yīng)的準(zhǔn)確度。在測序反應(yīng)中，可與焦磷酸酶和ATP硫化酶協(xié)同作用，進(jìn)行通量高、讀長大的測序反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
(1)使用PH8.0的PBS緩沖液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶濃度為1.8mg/ml ;
(2)使用ILPBS緩沖液對10mlATP硫酸化酶溶液進(jìn)行透析，持續(xù)18小時(shí)，溫度為4°C，PBS緩沖液在6小時(shí)更換一次；
(3)活化生物素:將Imol生物素，1.25mol EDC, Imol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進(jìn)行生物素的活化；
(4)平衡生物素至10°C;
(5)將活化的生物素0.24mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入ATP硫酸化酶0.0lmol，混合，攪拌8小時(shí)，溫度為4°C，得到混合溶液；
(6)使用ILPBS緩沖液對10ml混合溶液進(jìn)行透析，持續(xù)18小時(shí)，溫度為4°C，去除雜質(zhì)和游離生物素，PBS緩沖液在6小時(shí)更換一次；
(7)采用GE分子排阻預(yù)裝柱superdex200進(jìn)行分子排阻，柱平衡和洗脫過程使用ρΗ8.0的PBS緩沖液；
(8)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(9)加入酶體積2倍的保護(hù)劑，保護(hù)劑含有1mMPBS緩沖液、20%甘氨酸、30%組氨酸、
0.15mM DTT、0.08mM EDTA 和 0.06mM 疊氮鈉，調(diào)節(jié)至 pH 7.5，保存至-16°C。
[0017]實(shí)施例2(1)使用PH8.0的PBS緩沖液溶解ATP硫酸化酶，ATP硫酸化酶濃度為1.5mg/ml ;
(2)使用ILPBS緩沖液對80mlATP硫酸化酶溶液進(jìn)行透析，持續(xù)12小時(shí)，溫度為4°C，PBS緩沖液在4小時(shí)更換一次；
(3)活化生物素:將Imol生物素，1.25mol EDC, Imol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進(jìn)行生物素的活化；
(4)平衡生物素至4°C;
(5)將活化的生物素0.22mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入ATP硫酸化酶0.0lmol，混合，攪拌5小時(shí)，溫度為4°C，得到混合溶液；
(6)使用ILPBS緩沖液對80ml混合溶液進(jìn)行透析，持續(xù)12小時(shí)，溫度為4°C，去除雜質(zhì)和游離生物素，PBS緩沖液在4小時(shí)更換一次；
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