專利名稱：二硫鍵穩(wěn)定的多價(jià)抗體的制作方法
ニ硫鍵穩(wěn)定的多價(jià)抗體 本發(fā)明涉及新的雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)。此類抗體包含針對目的抗原的第一特異性，和針對第二目的抗原(例如用于延長它們的體內(nèi)血清半衰期的血清載體蛋白)的第 ニ特異性。還提供用于產(chǎn)生此類分子的方法和包含它們的藥物組合物?？贵w的高特異性和親合性使得它們成為理想的診斷和治療試劑，特別是用于調(diào)節(jié)蛋白蛋白相互作用。重組抗體技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展已導(dǎo)致抗體片段例如Fv、Fab、Fab' 和F(ab' )2片段及其他抗體片段的產(chǎn)生。這些較小的分子保留了完整抗體的抗原結(jié)合活性并且還可以呈現(xiàn)與完整免疫球蛋白分子相比改善的組織穿透和藥物動力學(xué)性質(zhì)。甚至，從最近成功的產(chǎn)品(例如1^(^1"0@并且11^611113 )來看，抗體片段經(jīng)證明是多用途的治療劑。雖然此類片段顯現(xiàn)出許多優(yōu)于完整免疫球蛋白的優(yōu)點(diǎn)，但它們也受累于增加的血清清除率，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈x予其體內(nèi)長存在期的Fc結(jié)構(gòu)域(Medasan等人，1997， J.Immunol. 158 :2211-2217)。之前已經(jīng)描述了具有雙特異性的抗體，即其與兩個(gè)不同的抗原結(jié)合(關(guān)于綜述，參見 Segal 等人，1999，Curr.Opin. Immunol. 11 :558-562 ；Pluckthun & Pack， 1997， Immunotechnology，3:83-105 ；Fischer 禾ロ Leger，2007，Pathobiology，74，3—14)。 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了雙特異性抗體。之前的制備異-雙特異性基于抗體的分子的方法通常使用化學(xué)交聯(lián)或者蛋白質(zhì)工程技木?；瘜W(xué)交聯(lián)受累于異-和同ニ聚體形成的低產(chǎn)量以及它們隨后的色譜分離的要求。蛋白工程方法已經(jīng)進(jìn)行了非常詳細(xì)的描述(例如knobs-into-holes engineering ； Ridgway等人，1996，ProteinEng. 9 (7) :617-621)或已經(jīng)用于具有不適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性特征的分子(例如雙抗體(diabody)，scFv)。在一些情況下，雙特異性抗體還可受累于空間位阻問題，其使得兩個(gè)抗原不能同時(shí)結(jié)合到各個(gè)抗體臂。單可變結(jié)構(gòu)域抗體又名單域抗體或dAb，相當(dāng)于抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)的可變區(qū)。Ward等人，1989，Nature，；341，討4づ46已經(jīng)描述了鼠單域抗體。也已經(jīng)描述了人和〃路馬它化(camelised)“人單域抗體(Holt 等人，2003，Trends in Biotechnology, 21, 484-490)。也已經(jīng)從駱駝(駱駝和美洲駝)和軟骨魚(斑紋須鯊和鉸ロ鯊)中獲得了單域抗體。這些生物已經(jīng)進(jìn)化出高親和カ單V樣結(jié)構(gòu)域(駱駝中稱為VhH，鯊魚中稱為V-NAR)， 所述結(jié)構(gòu)域裝配到Fc-等價(jià)恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)架作為它們的免疫系統(tǒng)的完整和重要的元件(關(guān)于綜述，參見 Holliger & Hudson ；2005, Nature Biotechnology, 23 (9) :1126-1136) EP0368684中已經(jīng)描述了單域抗體-酶融合物，W02004/058820中也已經(jīng)描述了單域效應(yīng)子群融合物，其包含單可變結(jié)構(gòu)域。W02007/024715中已經(jīng)描述了雙可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白。EP1517921中已經(jīng)描述了包含具有不同特異性的兩個(gè)單域抗體的雙特異性配體。用于改進(jìn)抗體片段例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2及其他抗體片段的半衰期的方法是已知的。ー種方法將所述片段與聚合物分子綴合。因此，通過與聚乙ニ醇(PEG;參見，例如 W098/25791、W099/64460 和 W098/37200)綴合改善動物中 Fab'、F(ab' )2 片段的短的循環(huán)半衰期。另ー種方法通過與和Fcfoi受體相互作用的試劑綴合來修飾抗體片段(參見例如W097/34631)。另ー個(gè)用于延長半衰期的方法使用結(jié)合血清白蛋白的多肽(參見例如Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem. 12 :750-756 ；EP0486525 ；US6267964 ；W004/001064 ； W002/076489 ；和W001/45746)。然而，仍然需要產(chǎn)生具有長的體內(nèi)半衰期的抗原結(jié)合免疫球蛋白，作為具有長的半衰期的免疫球蛋白的替代物，因?yàn)樗鼈兣cFcfoi受體相互作用，不必通過與PEG綴合進(jìn)行化學(xué)修飾或與人血清白蛋白綴合。多種蛋白質(zhì)存在于血漿中并且包括甲狀腺素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、α 1酸糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白，或其任何片段。體內(nèi)的血清載體蛋白循環(huán)具有以天計(jì)的半衰期，例如對于甲狀腺素結(jié)合蛋白，5天或?qū)τ谵D(zhuǎn)甲狀腺素蛋白，2天(Bartalena & Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13 :583-598)，或碘化 α 1 酸糖蛋白的周轉(zhuǎn)的第二階段，65 小時(shí)(Bree 等人，1986，Clin. Pharmacokin. 11 :336-342)。來自 Gitlin 等人(1964， J.Clin. Invest. 10:1938-1951)的數(shù)據(jù)表明孕婦中，α 1酸糖蛋白的半衰期是3. 8天，轉(zhuǎn)鐵蛋白12天和纖維蛋白原2.5天。血清白蛋白是血管和血管外區(qū)室中豐富的蛋白，其在人體中具有大約 19 天的半衰期(Peters, 1985，Adv Protein Chem. 37 :161-245)。這與 IgGl 的半衰期(大約 21 天)相似(Waldeman & Strober, 1969，Progr. Allergy, 13 :1-110)。本發(fā)明提供了改善的雙特異性抗體融合蛋白，其可以重組產(chǎn)生并且能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原，特別是兩個(gè)不同/相異抗原。因此，本發(fā)明提供雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且進(jìn)一歩包含具有對第二目的抗原的特異性的單域抗體(dAb)，特別地其中第一抗原和第二抗原是不同的實(shí)體。如本文使用的，單域抗體并非指單鏈Fv。單鏈Fv特征在于彼此連接的2個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其形成獨(dú)立實(shí)體，或僅通過其中的一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域與另ー實(shí)體連接。如本文使用的，多價(jià)是指具有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)例如兩個(gè)或三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(例如兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))的實(shí)體。各結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合相同抗原上的相同表位或不同表位，或可以結(jié)合不同(相異)抗原。本發(fā)明還提供雙特異性抗體融合蛋白，其包含具有對目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且進(jìn)一歩包含至少ー個(gè)具有對第二目的抗原的特異性的單域抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體融合物將能夠選擇性地結(jié)合兩個(gè)目的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二抗原是相同抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ab或Fab'片段所結(jié)合的目的抗原可以是細(xì)胞相關(guān)蛋白， 例如細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)上的細(xì)胞表面蛋白， 或其可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何醫(yī)學(xué)上相關(guān)的蛋白，例如在疾病或感染期間上調(diào)的那些蛋白，例如受體和/或它們相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白的具體實(shí)例包括粘著分子例如整聯(lián)蛋白例如β 1整聯(lián)蛋白例如VLA-4、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白或L-選擇蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla, CDllb, CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、 CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、I COS, BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、DPCRl、DPCRl、 dudulin2、FLJ20584, FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、 LTK, MAL2、MRP2、連接素樣 2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMPl 1、 DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、MHC I類和MHC II類抗原、和VEGF，和當(dāng)適當(dāng)時(shí)，其受體。
可溶性抗原包括白細(xì)胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨細(xì)胞病毒抗原)，免疫球蛋白 (例如IgE)，干擾素(例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y)，腫瘤壞死因子-α，腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生長因子(例如PDGF- α 和PDGF-β)和當(dāng)適當(dāng)時(shí)，其受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原、細(xì)菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV, H印A、B和C)、生物恐怖試劑、放射性核素和重金屬、及蛇和蜘蛛毒和毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體融合蛋白質(zhì)可以用于功能性地改變目的抗原的活性。例如，抗體融合蛋白質(zhì)可以直接或間接地中和、拮抗或激動(agonise)所述抗原的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，被本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白中的單域抗體結(jié)合的第二目的抗原可以是細(xì)胞相關(guān)蛋白，例如細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)上的細(xì)胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目的抗原還可以是任何醫(yī)學(xué)上相關(guān)的蛋白，例如在疾病或感染期間上調(diào)的那些蛋白，例如受體和/或它們相應(yīng)的配體。細(xì)胞表面蛋白的特別的實(shí)例包括粘著分子例如整聯(lián)蛋白例如β 1整聯(lián)蛋白例如VLA-4、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白或 L-選擇蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla, CDllb, CD18、CD19、 CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、ICOS、BCMP7、CD137、 CD27L、CDCPU DPCRU DPCRU dudulin2、FLJ20584, FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、 KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、連接素樣 2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、 BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1 和 2)、MHC I 類和 MHC II類抗原、和VEGF，和當(dāng)適當(dāng)時(shí)，其受體?？扇苄钥乖ò准?xì)胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨細(xì)胞病毒抗原)，免疫球蛋白 (例如IgE)，干擾素(例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y)，腫瘤壞死因子-α，腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生長因子(例如PDGF- α 和PDGF-β)和當(dāng)適當(dāng)時(shí)，其受體。其他抗原包括細(xì)菌細(xì)胞表面抗原、細(xì)菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV, H印A、B和C)、生物恐怖試劑、放射性核素和重金屬、及蛇和蜘蛛毒和毒素?？梢员粏斡蚩贵w結(jié)合的其他抗原包括血清載體蛋白，允許細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能招募的多肽，和核素螯合蛋白。因此，在一個(gè)實(shí)例中本發(fā)明提供了雙特異性抗體融合蛋白，所述蛋白包含具有針對目的抗原的第一特異性的免疫球蛋白部分，并且進(jìn)一歩包含具有針對第二蛋白的特異性的單域抗體，后者提供招募效應(yīng)子功能的能力，例如補(bǔ)體途徑激活和/或效應(yīng)子細(xì)胞招募。 此外，本發(fā)明的融合蛋白可以用于通過與核素螯合蛋白結(jié)合的單域抗體螯合放射性核素。 此類融合蛋白用于成像或用于治療的放射性核素靶向方法。因此，在一個(gè)實(shí)例中，提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)，其包含具有針對目的抗原的特異性的抗體Fab或Fab'片段，所述片段與至少ー個(gè)dAb融合，所述dAb具有針對招募多肽的特異性，所述dAb通過與所述招募多肽結(jié)合，直接或間接地提供招募細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的能力。可以直接招募效應(yīng)子功能(effector function)，因?yàn)樾?yīng)子功能與細(xì)胞相關(guān)，所述細(xì)胞在它的表面上具有招募分子。當(dāng)dAb與招募分子的結(jié)合引起例如可以直接或間接地招募效應(yīng)子功能或可以經(jīng)由信號傳導(dǎo)途徑活化的因子的釋放吋，可發(fā)生間接招募。實(shí)例包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN γ、組胺、Clq、調(diào)理素及經(jīng)典的和可選擇的補(bǔ)體活化級聯(lián)的其他成員，例如C2、C4、C3-轉(zhuǎn)化酶，和C5至C9。如本文使用的，“招募多肽〃包括Fc γ R(例如Fc γ RI、Fc YRII和Fc γ RIII)、 補(bǔ)體途徑蛋白(例如但不限于Clq和C3)、CD標(biāo)志物蛋白(分化標(biāo)志物群)(例如但不限于 CD68、CDl 15、CDl6、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD19、CD20 和⑶22)。其為CD標(biāo)志物蛋白的其他招募多肽包括CDl，CDld, CD2, CD5, CD8, CD9,⑶10， CDl 1, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD46, CD49, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62, D62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66e, CD68, CD70, CD71, CD72, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD88, CD89, CD90, CD94, CD95, CD98, CD106, CD114, CD116, CD117, CD118, CD120, CD122, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD137, CD138, CD141, CD142, CD143, CD146, CD147, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 和 CD304，或保留直接或間接地招募細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的能力的任何其片段。招募多肽還包括具有效應(yīng)子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。在一個(gè)實(shí)施方案中，dAb對其具有特異性的第二蛋白是補(bǔ)體途徑蛋白，特別優(yōu)選的
定 Clq0在優(yōu)選實(shí)施方案中，dAb對其具有特異性的第二蛋白是CD標(biāo)志物蛋白，特別優(yōu)選的是 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35。因此，還提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)，其包含對目的抗原具有特異性的抗體片段，所述片段與至少ー個(gè)dAb融合，所述dAb對選自CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、 ⑶8、⑶45、⑶16和⑶35的⑶分子具有特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，單域抗體為具有第一特異性的免疫球蛋白部分提供延長的半衰期。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab或Fab ‘片段，所述片段與至少ー個(gè)單域抗體融合，所述單域抗體對血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特異性，所述單域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1結(jié)合，為對所述目的抗原具有特異性的抗體片段提供延長的半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab或Fab ‘片段，所述片段與至少ー個(gè)單域抗體融合，所述單域抗體對血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特異性，所述單域抗體通過與所述血清載體蛋白、循環(huán)免疫球蛋白分子或CD35/CR1結(jié)合，為對所述目的抗原具有特異性的抗體片段提供延長的半衰期。如本文使用的，“血清載體蛋白"包括甲狀腺素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、α 酸糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和白蛋白、或任何其片段。如本文使用的，“循環(huán)免疫球蛋白分子〃包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM和IgD、或任何其片段。⑶35/CR1是在紅細(xì)胞上存在的蛋白，其半衰期為36天(正常范圍為觀至47天； Lanaro 等人，1971，Cancer, 28 (3) :658-661)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，dAb對其具有特異性的第二蛋白是血清載體蛋白，特別優(yōu)選的是人血清載體蛋白。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，血清載體蛋白是人血清白蛋白。因此，提供了雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab 或Fab'片段，所述片段與對人血清白蛋白具有特異性的至少ー種單域抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)，其包含對目的抗原具有特異性的抗體Fab或Fab'片段，所述片段與對人血清白蛋白具有特異性的至少一種單域抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，對目的抗原具有特異性的抗體片段是Fab片段。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，對目的抗原具有特異性的抗體片段是Fab'片段。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體融合蛋白是翻譯融合蛋白，即基因融合物，其各個(gè)序列通過表達(dá)載體編碼?？蛇x地，已經(jīng)使用化學(xué)方法(即通過化學(xué)綴合或化學(xué)交聯(lián))來將抗體融合蛋白的組分融合。所述化學(xué)方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)例中，抗體片段是具有天然或經(jīng)修飾的絞鏈區(qū)的Fab'片段。當(dāng)用于制備本發(fā)明的雙特異性抗體融合蛋白質(zhì)的抗體片段是Fab'片段吋，通常在重鏈的C末端將所述片段延伸一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明的抗體融合物可以包括直接或經(jīng)由連接體與dAb翻譯融合(或化學(xué)融合)的!^ab'片段。此外，適當(dāng)?shù)目贵wFab'片段的實(shí)例包括 W02005003170 和 W02005003171 中描述的那些。在另ー個(gè)實(shí)例中，抗體片段是Fab片段。因此，本發(fā)明的抗體融合物可以包括與連接體序列翻譯融合(或化學(xué)融合)的Fab片段，所述連接體序列又與dAb翻譯融合(或化學(xué)融合)。優(yōu)選地，F(xiàn)ab片段是以鏈間半胱氨酸終止的Fab片段，如W02005/003169中描述的。因此，在一個(gè)實(shí)例中，F(xiàn)ab片段在IgGl的位置233處終止。 本發(fā)明中使用的抗體Fab或Fab ’片段可以來自任何物種，優(yōu)選來源于單克隆抗體、人抗體，或是人源化片段。本發(fā)明所用的抗體片段可以來源于免疫球蛋白分子的任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞類并且可以從任何物種(包括例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔子、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體Fab或Fab'片段是單克隆、完全人、人源化或嵌合抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體Fab或Fab'片段是完全人的或人源化的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法制備單克隆抗體，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler & Milstein, Nature，1975，256，495-497)，三體雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor 等人，Immunology iToday, 1983，4，72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等人，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy" , pp. 77-96, Aian R. Liss,Inc.,1985)。還可以使用單淋巴細(xì)胞抗體法，通過克隆和表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)cDNA產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗體，所述cDNA從選擇用于產(chǎn)生特異性抗體的單淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，通過例如 Babcook，J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93 (15), 7843-7848, WO 92/02551， W02004/051268 和 W02004/106377 描述的方法。人源化抗體是具有來自非人物種的ー個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)的來自非人物種的抗體分子(參見例如US 5，585，089)。還可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗體，并且此類方法包括 Brinkman 等人，J. Immunol. Methods, 1995,182,41-50 ；Ames 等人，J. Immunol. Methods 1995，184，177-186 ；Kettleborough 等人 Eur. J. Immunol.，1994，24952-958 ； Persic 等人，Gene，1997187，9—18 ；禾ロ Burton 等人，Advances in Immunology,1994, 57,191-280 ；WO 90/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；W092/18619 ；WO 93/11236 ； WO 95/15982 和 WO 95/20401 ；和 US 5, 698, 426 ；5,223, 409 ；5, 403, 484 ；5,580, 717 ； 5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ； 5，658，727 ；5, 733，743 ；和5，969，108中公開的方法。并且，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳動物)可以用來產(chǎn)生人源化抗體。完全人抗體是其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)(當(dāng)存在時(shí))全部為人來源，或與人來源的序列(不必來自相同抗體)基本上同一的那些抗體。完全人抗體的實(shí)例可以包括例如通過上述噬菌體展示方法產(chǎn)生的抗體和由其中鼠免疫球蛋白可變和/或恒定區(qū)基因已經(jīng)被它們的人對應(yīng)物取代的小鼠生產(chǎn)的抗體(例如，EP0M6073 BUUS 5, 545,806, US5, 569，825、US 5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5, 661, 016,US 5, 770, 429,EP 0438474 Bl 和EP0463151 Bl中一般性描述的)。本發(fā)明使用的抗體Fab或Fab'片段的起始材料可以使用任何適當(dāng)?shù)拿盖懈詈? 或消化技術(shù)(例如通過用胃蛋白酶處理)獲自任何完整抗體，特別是完整單克隆抗體?？蛇x地，或另外，可以通過使用重組DNA技術(shù)(包括操作和重表達(dá)編碼抗體可變和/或恒定區(qū)的 DNA)制備抗體起始材料。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以用于修飾、添加或缺失期望的氨基酸或結(jié)構(gòu)域。如本文使用的，對可變或恒定區(qū)的任何改變?nèi)匀话ㄔ谛g(shù)語"可變"和"恒定" 區(qū)內(nèi)?？贵w片段的起始材料可以獲自任何物種，包括例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、美洲駝、山羊或人?？贵w片段部分可以獲自ー種以上的物種，例如抗體片段可以是嵌合的。在一個(gè)實(shí)例中，恒定區(qū)來自一個(gè)物種而可變區(qū)來自另ー個(gè)物種。抗體片段的起始材料還可以是經(jīng)修飾的。在另ー個(gè)實(shí)例中，使用重組DNA工程技術(shù)產(chǎn)生抗體片段的可變區(qū)。此類工程改造的形式包括例如通過插入、缺失或改變天然抗體的氨基酸序列從天然抗體可變區(qū)產(chǎn)生的那些。這個(gè)類型的特別的實(shí)例包括那些工程改造的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含至少ー 個(gè)CDR和任選地，來自ー個(gè)抗體的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架氨基酸和來自第二抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其他部分。產(chǎn)生和制造這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，Boss等人，US 4，816，397 ；Cabilly 等人，US 6，331，415 ；Shrader 等人，WO 92/02551 ；Ward 等人，1989， Nature,341, 544 ；Orlandi 等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 ；Riechmann 等人，1988, Nature, 322，323 ；Bird 等人，1988，Science, 242,423 ；Queen 等人，US 5，585，089 ； Adair,W091/09967 ；Mountain 禾ロ Adair，1992Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10，1—142 ；Verma 等人，1998，Journalof Immunological Methods，216，165-181)。在本發(fā)明中，與Fab或Fab'片段融合的各個(gè)單域抗體可以直接或經(jīng)由連接體連接。本文使用的直接連接是指，F(xiàn)ab或Fab'的"最后ー個(gè)"氨基酸通過肽鍵與單域抗體的"第一個(gè)"氨基酸相連(或反之亦然)。
用于將dAb與Fab或Fab'連接的適當(dāng)?shù)倪B接體區(qū)域的實(shí)例包括但不限于，柔性連接體序列和剛性連接體序列。柔性連接體序列包括在Huston等人1988，PNAS 85: 5879-5883 ；Wright & Deonarain，Mol.Immunol. ,2007,44(11) :2860-2869 ；Alfthan 等人， Prot. Eng. , 1995,8(7) :725-731 ；Luo 等人，J. Biochem. , 1995,118(4) :825-831 ；Tang 等人，1996，J. Biol. Chem. 271 (26) 15682-15686 ；和 Turner 等人，1997，JIMM 205，42-54 中公開的那些(關(guān)于代表性實(shí)例，參見表1)。表1.柔性連接體序列
權(quán)利要求
1.一種多價(jià)抗體融合蛋白，其包含對于目的抗原具有第一特異性的Fab或Fab'片段， 且進(jìn)一歩包含其為對于第二目的抗原具有特異性的VH/VL對的兩個(gè)單域抗體(dAb)，其中所述兩個(gè)單域抗體通過在2個(gè)半胱氨酸殘基之間的ニ硫鍵連接，所述2個(gè)半胱氨酸殘基一個(gè)在VH中并且ー個(gè)在VL中，其中所述2個(gè)半胱氨酸殘基的位置選自VH37和VL95、VH44和 VL100、VH44 和 VL105、VH45 和 VL87、VH100 和 VL50、VHlOOb 和 VL49、VH98 和 VL46、VHlOl 和 VL46、VH105 和 VL43 以及 VH106 和 VL57。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多價(jià)抗體融合蛋白，其中VH的半胱氨酸在位置44上，并且VL的半胱氨酸在位置100上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述兩個(gè)單域抗體是協(xié)同結(jié)合所述第二抗原的互補(bǔ)VH/VL對。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述第一抗原和第二抗原是不同的實(shí)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任ー項(xiàng)的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VHdAb與所述Fab或 Fab'重鏈直接或間接連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任ー項(xiàng)的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VLdAb與所述Fab或 Fab'輕鏈重鏈直接或間接連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VHdAb與所述Fab或 Fab ‘重鏈的C末端直接或間接連接，并且所述VLdAb與所述Fab或Fab ‘輕鏈的C末端直接或間接連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述ル(^13與所述Fab或 Fab ‘重鏈的N末端直接或間接連接，并且所述\dAb與所述Fab或Fab ‘輕鏈的N末端直接或間接連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任ー項(xiàng)的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VH和/或VL結(jié)構(gòu)域經(jīng)由具有SEQ ID NO :2 或SEQ ID NO :225中給出的序列的連接體與所述Fab或Fab ‘片段連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VHdAb經(jīng)由具有SEQ ID NO 228 中給出的序列的連接體與所述Fab或Fab'重鏈的N末端連接，并且所述VL dAb經(jīng)由具有 SEQ ID NO 229中給出的序列的連接體與所述Fab或Fab'重鏈的N末端連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任ー項(xiàng)的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述第二抗原是白蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任ー項(xiàng)的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述第二抗原是人血清白蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VH單域抗體包含對于CDR-Hl 具有圖5(e) SEQ ID NO :56或圖5 (k) SEQ ID NO :62中給出的序列的CDR，對于CDR-H2具有圖5(f) SEQ ID NO :57或圖5 (I)SEQ ID NO :63中給出的序列的CDR，和對于CDR-H3具有圖 5(g) SEQ IDNO :58 或圖 5(m)SEQ ID NO :64 中給出的序列的 CDR。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VL單域抗體包含對于CDR-Ll 具有圖5(h) SEQ ID NO :59或圖5 (n) SEQ ID NO :65中給出的序列的CDR，對于CDR-L2具有圖5⑴SEQ ID NO :60或圖5 (ο) SEQ ID NO :66中給出的序列的CDR，和對于CDR-L3具有圖 5 (j) SEQ IDNO :61 或圖 5 (ρ) SEQ ID NO :67 中給出的序列的 CDR0
15.根據(jù)權(quán)利要求12的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VH單域抗體包含SEQID NO :202 中給出的序列，并且所述VL單域抗體包含SEQ IDNO :203中給出的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的多價(jià)抗體融合蛋白，其中所述VH單域抗體包含SEQID NO :204 中給出的序列，并且所述VL單域抗體包含SEQ IDNO :205中給出的序列。
17.一種結(jié)合白蛋白的Fv或scFv，其包含具有SEQ ID NO :202中給出的序列的VH結(jié)構(gòu)域。
18.一種結(jié)合白蛋白的Fv或scFv，其包含具有SEQ ID NO :204中給出的序列的VH結(jié)構(gòu)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的結(jié)合白蛋白的Fv或scFv，其進(jìn)ー步包含具有SEQID NO :203 中給出的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的結(jié)合白蛋白的Fv或scFv，其進(jìn)ー步包含具有SEQID NO :205 中給出的序列的VL結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
多價(jià)抗體融合蛋白，其包含對于目的抗原具有第一特異性的免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab′片段，且進(jìn)一步包含其為VH/VL對的對于第二目的抗原具有特異性的兩個(gè)單域抗體(dAb)，其中所述兩個(gè)單域抗體通過二硫鍵連接。還提供的是通過二硫鍵穩(wěn)定的特定雙特異性抗體融合蛋白及其他抗體片段。
文檔編號C07K16/46GK102549018SQ201080042387
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者L·漢庫克, R·亞當(dāng)斯, S·P·海伍德 申請人:Ucb醫(yī)藥有限公司