專利名稱：與馬鈴薯y病毒屬病毒侵染有關的玉米蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的玉米蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
在過去的十年中，植物病毒和寄住之間的分子間相互作用取得了很大的進展。但是病毒侵染是如何在生化和生理水平上影響植物的細胞，組織乃至整株在植物病毒學的研究中還是個缺口。病毒是如何利用它自身的少數(shù)幾個蛋白來侵染植物并引起癥狀的還有很多方面有待研究。病毒在植物體內(nèi)引起的癥狀是植物在細胞水平上生理和結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化結(jié)合植物本身的生長發(fā)育的減緩而產(chǎn)生的。通過重組DNA技術(shù)的應用從而研究病毒的基因產(chǎn)物在癥狀產(chǎn)生過程中的作用使得我們逐步了解病毒侵染植物的這個過程。目前的研究手段主要有以下幾個1病毒突變的方式來確定與癥狀表達相關的基因產(chǎn)物和遺傳位點，應用這個方法研究病毒的例子很多，但是通過病毒突變的方式研究的結(jié)果更傾向于對病毒的研究，而不是對癥狀產(chǎn)生的生化機制的研究；II通過轉(zhuǎn)基因的方式在寄主植物中異源表達病毒基因，通過轉(zhuǎn)基因的方式可以把單個病毒基因產(chǎn)物的影響和病毒復制的影響區(qū)分開。 組成型表達花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)的VI基因會誘導轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生嚴重的褪綠癥狀，與花椰菜花葉病毒侵染后的癥狀非常相似，通過差異分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)VI基因的擬南芥和花椰菜花葉病毒侵染的擬南芥的幾個基因在表達方式的變化上是一致的，有報道病毒的移動蛋白對寄主植物有重要影響，這些方法為闡明病毒基因產(chǎn)物在癥狀產(chǎn)生和病毒防衛(wèi)反應中的作用提供了新的信息，但是還是有相當多的一些控制病毒病的因子沒有被發(fā)現(xiàn)，通過高通量的方法研究轉(zhuǎn)錄水平的變化可以更全面的研究病毒侵染后寄主的變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供與馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒侵染有關的玉米蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的玉米蛋白，名稱為ZmTrm2，來源于玉米(Zea mays L.)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的玉米蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的玉米蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有所述編碼基因的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列2由516個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1 位-第513位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。所述重組載體是在載體PVX或載體BMVpF3-5/13’A/G的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的重組載體。擴增所述編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明的另一個目的是提供序列表中序列1所示的蛋白在抑制植物病毒復制或防治植物病毒病害中的應用。序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在抑制植物病毒復制或防治植物病毒病害中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在抑制植物病毒復制或防治植物病毒病害中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組表達載體為在載體PVX的多克隆位點插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達載體；所述抑制植物病毒復制為抑制植物病毒在植物體中的復制；所述植物病毒為馬鈴薯Y病毒屬病毒；所述病毒病害是由馬鈴薯Y病毒屬病毒引起的病害；所述馬鈴薯Y病毒屬病毒為煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein bandingmosaic virus, TVBMV)或甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物為玉米；所述雙子葉植物為煙草。本發(fā)明通過半定量RT-PCR技術(shù)考察了 ZmTrm2在玉米的根、莖、葉、雄蕊、雌蕊、 種子中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它能夠在各個組織和器官中分布，通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) ZmTrm2存在于葉肉細胞的葉綠體中。半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在玉米葉片上瞬時沉默 ZmTrm2促進了甘蔗花葉病毒的系統(tǒng)侵染，在普通煙上表達ZmTrm2可以抑制煙草脈帶花葉病毒的復制。


圖1為半定量RT-PCR檢測ZmTrm2的組織分布。圖2為激光共聚焦顯微鏡觀察ZmTrm2的細胞內(nèi)亞定位。
圖3為半定量RT-PCR檢測甘蔗花葉病毒的積累水平。圖4為半定量RT-PCR檢測煙草脈帶花葉病毒的積累水平。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、ZmTrm2的獲得一、玉米抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建1、玉米總RNA的提取1)取0. Ig新鮮的玉米葉片，加液氮研磨成粉末狀，移入一滅菌的1.5ml離心管中， 然后加入Iml的Tri-Reagent，劇烈振蕩搖勻或?qū)ml的Tri-Reagent加入到_80°C凍存的 1 X 106原生質(zhì)體中，劇烈振蕩:3min ；冰上放置5min。2)勻漿用IEC臺式冷凍離心機于4°C、12，OOOg條件下離心IOmin以除去不溶的成分，將上清轉(zhuǎn)入一新的1. 5ml離心管中。3)在室溫下靜置5min，加0. 2ml氯仿，劇烈震蕩15sec，然后在室溫下靜置 2-5min,再于 4°C、12，000 X g 的條件下離心 15min。4)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中，加0. 5ml異丙醇，混合(上下顛倒)， 使樣品在室溫下靜置15min，4°C、12，000 X g離心lOmin，則RNA會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀。5)棄上清，加入75 %的乙醇洗滌沉淀，然后4°C、7，500 X g離心5min (如RNA沉淀懸浮起來，則用12，OOOXg)，棄乙醇。6) RNA在室溫下干燥IOmin或在冷凍離心濃縮機上濃縮5min，加入30 μ 1 DEPC處理的超純水溶解沉淀，-70°C保存?zhèn)溆谩?、從植物總RNA中分離mRNA1)首先對總RNA定量，把定量的總RNA加入1. 5ml的離心管中。注意不要超過試劑盒所要求的量。2)力口 250 μ 1 OBB buffer 禾口 15 μ 1 Oligotex suspension，并且充分混合。3)把混合后的樣品放到70°C的水浴鍋中溫浴3分鐘(破壞RNA的二級結(jié)構(gòu))。4)取出樣品在室溫下放置10分鐘(讓poly (A)和poly⑴充分的雜交)。5) 16，000X g，離心 2 分鐘，沉淀 Oligotex 和 mRNA。棄上清。6)用400 μ 1的0W2緩沖液渦旋重懸Oligotex和mRNA的沉淀，然后轉(zhuǎn)移至分離柱中最大轉(zhuǎn)速離心1分鐘。7)再把離心柱轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml離心管中，加400 μ 1的0W2緩沖液，用最大的轉(zhuǎn)速離心1分鐘。8)再轉(zhuǎn)移離心柱至新的1. 5ml的離心管中，加60 μ 1預熱(70°C )的OEB緩沖液。 來回抽動3-4次，重懸沉淀。最大離心力離心lmin。9)為了得到更大的產(chǎn)量，再重復步驟8 一次。2、第一鏈 cDNA 合成1)取3個滅菌的PCR管，分別標記上driver、tester和control，將對應的mRNA按照下表的比例混勻。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)-3) 中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是在載體PVX或載體 BMVpF3-5/13’ A/G的多克隆位點間插入所述編碼基因得到的重組載體。
6.擴增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對，所述引物對中，一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
7.序列表中序列1所示的蛋白在抑制植物病毒復制或防治植物病毒病害中的應用。
8.序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在抑制植物病毒復制或防治植物病毒病害中的應用；所述蛋白的編碼基因為如下1)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
9.含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達載體在抑制植物病毒復制或防治植物病毒病害中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應用，其特征在于所述重組表達載體為在載體PVX的多克隆位點插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達載體；所述抑制植物病毒復制為抑制植物病毒在植物體中的復制；所述植物病毒為馬鈴薯Y病毒屬病毒；所述病毒病害是由馬鈴薯Y病毒屬病毒引起的病害；所述馬鈴薯Y病毒屬病毒為煙草脈帶花葉病毒或甘蔗花葉病毒。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物為玉米；所述雙子葉植物為煙
全文摘要
本發(fā)明公開了與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的玉米蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì);(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在玉米葉片上瞬時沉默ZmTrm2促進了甘蔗花葉病毒的系統(tǒng)侵染，在普通煙上表達ZmTrm2可以抑制煙草脈帶花葉病毒的復制。
文檔編號C07K14/415GK102180955SQ201110066700
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者周濤, 施艷, 曹言勇, 范在豐 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學