專利名稱：針對(duì)馬鈴薯中抗病性的種質(zhì)與分子標(biāo)記的制作方法
本中請(qǐng)要求以在1997年7月30日提交的系列號(hào)為60/054,267的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)為優(yōu)先權(quán)，其中將其全部?jī)?nèi)容插入本文僅供參考。
依據(jù)35U.S.C.§202(c)，大家公認(rèn)美國(guó)政府擁有本文所述的發(fā)明的某些權(quán)利，其中本發(fā)明部分借助來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部的資金得以進(jìn)行。
植物病害每年都給美國(guó)以及世界上其它地方的農(nóng)民造成數(shù)十億美元的損失。制造出天然抵抗病害的農(nóng)作物已是植物育種工作者數(shù)十年來(lái)的一個(gè)目標(biāo)。近年來(lái)，分子遺傳技術(shù)已經(jīng)對(duì)傳統(tǒng)的育種方法進(jìn)行了補(bǔ)充，例如鑒定出編碼具有抗真菌或抗細(xì)菌性質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因(通常不是植物基因)，然后在植物中高水平地表達(dá)該基因。
另一種途徑是使用來(lái)自野生物種的基因來(lái)提高培養(yǎng)的農(nóng)作物的抗病性和其它的農(nóng)學(xué)特性。但對(duì)大多數(shù)情況來(lái)說(shuō)，育種工作者已被限制到那些可以通過(guò)直接的性雜交或通過(guò)幾個(gè)物種的跨接雜交(bridging crosses)得到的遺傳重組的技術(shù)上。
在某些情況下，原生質(zhì)體融合已經(jīng)提供了很寬范圍的可以利用的基因。通過(guò)這一技術(shù)，把兩個(gè)物種的體細(xì)胞結(jié)合在一起。然后由該結(jié)合體可以再生出植物，并且檢查該植物的所期望的屬性的表達(dá)和生育力。以這種方式可能會(huì)把來(lái)自廣泛分離著的性不親和的物種的有用性狀摻入到繁殖系當(dāng)中。采用其它的分子技術(shù)，也可能鑒定出在那些野生物種中決定著賦予有用性狀(諸如對(duì)一種或多種植物病原體的抗性)的基因。然后可以把該基因摻入到多種不同物種的基因組中，以便開(kāi)發(fā)對(duì)一種或多種植物病原體的抗性。
馬鈴薯(Solanum tuberosum)是世界上第四種最有價(jià)值的農(nóng)作物。在美國(guó)，該作物的價(jià)值每年超過(guò)二十億美元。盡管其價(jià)值很高，但這種商業(yè)作物經(jīng)歷了許多的病害問(wèn)題，其中包括諸如晚疫和早疫之類的葉部病害、病毒病害、諸如那些由線蟲(chóng)或輪枝孢屬的種導(dǎo)致的土壤問(wèn)題、以及諸如細(xì)菌性萎蔫病(在土壤中)或歐文氏軟腐病(在儲(chǔ)藏中)之類的細(xì)菌病害。在農(nóng)作物的損失、與施加化學(xué)藥品有關(guān)的開(kāi)支以及殺蟲(chóng)劑的使用對(duì)環(huán)境的影響方面，這些病害的代價(jià)是很高的。如果可以得到抗性馬鈴薯品種的話，那么可以使這類花銷降低到最小或者免除。但是，尚未把對(duì)晚疫、歐文氏軟腐病和許多其它病害的足夠的抗性摻入馬鈴薯的栽培品種中，這一部分是因?yàn)槿狈τN工作者可以用于開(kāi)發(fā)抗性栽培品種的抗性基因的良好的多樣性。
其中特別嚴(yán)重的是由真菌蔓延疫霉導(dǎo)致的晚疫病。晚疫仍是全世界范圍內(nèi)對(duì)馬鈴薯最具毀滅性的病害之一。盡管它很重要，但是目前在美國(guó)沒(méi)有培育出具有足夠的晚疫抗性的主要的栽培品種。直到近來(lái)，還是通過(guò)培養(yǎng)方法(例如輪作、農(nóng)作物衛(wèi)生)和使用殺真菌劑來(lái)保護(hù)該作物以防病害。迄今在美國(guó)，親和交配類型的缺乏已經(jīng)妨礙了性重組。但是，第二交配類型現(xiàn)已在美國(guó)普及開(kāi)來(lái)，并且所述真菌的許多株系已經(jīng)對(duì)一種主要的、非常有效的注冊(cè)用于馬鈴薯晚疫防治的內(nèi)吸殺真菌劑(Metalaxyl)變得有抗性了。
晚疫真菌對(duì)除馬鈴薯以外的農(nóng)作物同樣是一種具毀滅性的病原體。它感染番茄、茄子以及其它茄科的種。其它的疫霉屬的種使一個(gè)很寬系列的在農(nóng)學(xué)上重要的植物致病，其中包括葡萄、鱷梨以及若干種果樹(shù)和堅(jiān)果樹(shù)。因此，通過(guò)分子遺傳技術(shù)可以引入這些物種中的對(duì)疫霉屬的種具有抗性的來(lái)源也是很有價(jià)值的。
對(duì)許多馬鈴薯病原體具有抗性的可能的來(lái)源存在于有關(guān)的茄屬的種中。已將若干茄屬的種與培養(yǎng)的馬鈴薯雜交，以便漸滲入抗病性基因。
當(dāng)性雜交技術(shù)失敗時(shí)，通過(guò)體細(xì)胞融合已經(jīng)嘗試了抗病性的轉(zhuǎn)移。已經(jīng)把馬鈴薯的原生質(zhì)體與許多性不親和的野生的茄屬的種(例如S.brevidens、S.bulbocastanum、S.commersonii、S.po1yadenium、S.etuburosum)融合在一起，并且已經(jīng)再生出許多能育的體細(xì)胞雜種(Austin等人，1985,1993；Ehlenfeldt&Helgeson,1987；Kim-Lee等人，1993；Novy&Helgeson,1994b)。針對(duì)有用的抗病性，已經(jīng)篩選出體細(xì)胞雜種(Helgeson等人，1986；Austin等人，1988；Novy&Helgeson,1994b)，并且這些抗性是可以遺傳的(Helgeson等人，1993)。
Solanum bulbocastanum是一種特別令人滿意的野生物種，從該物種中找到了有用的抗病性遺傳性狀，這是因?yàn)樗憩F(xiàn)出對(duì)包括線蟲(chóng)、早疫、晚疫和輪枝孢屬在內(nèi)的若干種馬鈴薯病原體的抗性。由本發(fā)明人和其它人已經(jīng)生產(chǎn)出S.bulbocastanum與培養(yǎng)的馬鈴薯的抗病害或抗蟲(chóng)害的體細(xì)胞雜種。在一個(gè)實(shí)例中，對(duì)抗線蟲(chóng)的S.bulbocastanum-馬鈴薯的體細(xì)胞雜種的BC1和BC2后代的分析揭示出線蟲(chóng)抗性基因座可能存在于S.bulbocastanum的第11染色體上(Brown等人，1996)。但是，S.bulbocastanum中晚疫抗性的染色體定位迄今仍未被確定下來(lái)。
顯然，對(duì)鑒定出諸如S.bulbocastanum這樣的野生馬鈴薯物種中的所述抗性存在著現(xiàn)時(shí)的需要，以便繼續(xù)改進(jìn)培養(yǎng)的馬鈴薯的抗病特性。也存在著對(duì)鑒定出野生馬鈴薯物種中決定著抗病性的基因的需要。一經(jīng)分離后，然后可以通過(guò)分子遺傳技術(shù)將這些基因引入除馬鈴薯之外的物種當(dāng)中，以便賦予對(duì)一種或多種植物病原體的抗性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種賦予抗晚疫真菌蔓延疫霉以及抗包括早疫病、歐文氏軟腐病和輪枝孢屬在內(nèi)的其它真菌病原體的抗性的馬鈴薯原生質(zhì)體。這種種質(zhì)的最基本的形式是通過(guò)馬鈴薯與S.bulbocastanum的體細(xì)胞雜交生產(chǎn)出的組織培養(yǎng)物。還提供了從這些雜種再生出的能育的植物以及由與在農(nóng)學(xué)上優(yōu)選的栽培的馬鈴薯物種雜交得到的后代。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種晚疫抗性馬鈴薯植物，該植物包括來(lái)自Solanum bulbocastanum的含有賦予抗晚疫抗性的基因的基因組的區(qū)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，S.bulbocastanum的基因組區(qū)段來(lái)自第8染色體并且與一個(gè)或多個(gè)下列標(biāo)記共分離(1)本文稱作GO2586的RAPD標(biāo)記；(2)本文稱作PO9587的RAPD標(biāo)記；以及(3)RFLP標(biāo)記CT88、RFLP標(biāo)記、RFLP標(biāo)記CT148、RFLP標(biāo)記CT252和RFLP標(biāo)記CT68。所述的馬鈴薯植物也可以對(duì)至少一種其它的病害具有抗性，諸如馬鈴薯早疫、歐文氏軟腐病以及輪枝孢屬萎蔫病。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)馬鈴薯植物親代細(xì)胞與Solanumbulbocastanum細(xì)胞之間的體細(xì)胞雜交，將前面提到的晚疫抗性基因摻入到該馬鈴薯植物中。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)用含有所述基因的植物轉(zhuǎn)化載體遺傳轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞，將晚疫抗性基因摻入到所述植物中。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，該核酸分子互補(bǔ)于Solanum bulbocastanum基因組0.6Kb區(qū)段的一部分或全部，它與賦予抗晚疫抗性的基因共分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述區(qū)段包括分別具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列的RAPD標(biāo)記GO2586或PO9587的部分或全部。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種在馬鈴薯與Solanumbulbocastanum的能育的體細(xì)胞雜種后代的雜交育種中監(jiān)測(cè)晚疫抗性的方法。該方法包括(a)進(jìn)行雜交；(b)從雜交的個(gè)體后代中分離出基因組DNA；以及(c)在該基因組DNA中，檢測(cè)預(yù)先確定與晚疫抗性共分離的遺傳標(biāo)記的存在或是缺乏，遺傳標(biāo)記的存在或缺乏指示了雜交育種的個(gè)體后代中晚疫抗性存在或缺乏。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記選自以上所列舉的RAPD和RFLP標(biāo)記的組中。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定賦予抗晚疫抗性的Solanum bulbocastanum基因的方法。該方法包括(a)在Solanumbulbocastanum與馬鈴薯的體細(xì)胞雜種的后代中，克隆出與晚疫抗性表型共分離的DNA區(qū)段；(b)提供Solanum bulbocastanum的基因組的基因組文庫(kù)；(c)分離出含有與共分離的DNA區(qū)段雜交的區(qū)段的基因組文庫(kù)的克??；以及(d)鑒定出位于賦予晚疫抗性的分離基因組克隆中的至少一種基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與晚疫抗性共分離的克隆的DNA區(qū)段包括以上所列的RAPD或RFLP標(biāo)記之一的部分或全部。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了由前面提到的方法生產(chǎn)的來(lái)自Solanum bulbocastanum的晚疫抗性基因。本發(fā)明還提供了包括該抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物。
鑒于以下所列舉的詳細(xì)描述和實(shí)施例，將會(huì)更好地了解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
圖2．具有RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA)和RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)記以及抗晚疫抗性的Solanum bulbocastanum的第8染色體的MapMaker分析。圓括號(hào)中的百分?jǐn)?shù)(左欄)表示重組頻率，它是通過(guò)用群體大小去除完全共遺傳的偏差來(lái)計(jì)算的。百分?jǐn)?shù)一欄以右的數(shù)字表示以厘摩表示的標(biāo)記間的距離。第8染色體的圖表以右的圓括號(hào)中的數(shù)字表示群體中的個(gè)體的任意的代碼。最右一欄列出了RAPD標(biāo)記，它是由擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄物(例如“GO2-586”或“PO9-587”)和RFLP標(biāo)記的十聚(decameric)引物和大小來(lái)命名的?？剐曰蜃伞癛”表示。圖的比例為10.0cM/1.21cm。
圖3．Tanksley等人(1992)公開(kāi)的番茄的第8染色體的圖譜，該圖譜顯示出S.bulbocastanum的晚疫抗性基因在番茄第8染色體上的大約對(duì)應(yīng)的位置。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)鑒定出同來(lái)源于Solanum bulbocastanum與培養(yǎng)的馬鈴薯(Solanum tuberosum)的體細(xì)胞雜種的晚疫抗性相連的遺傳標(biāo)記。分析回交(BC2)群體抗晚疫的抗性以及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)和RFLP標(biāo)記。三個(gè)測(cè)試群體來(lái)源于馬鈴薯與S.bulbocastanum的兩種不同的體細(xì)胞雜種。將每個(gè)體細(xì)胞雜種均與栽培品種Katahdin雜交以產(chǎn)生BC1親代，所有的BC1親代都對(duì)晚疫具有抗性。將BC1后代與三種不同的馬鈴薯繁殖系(Norland,Atlantic與A89804-7)雜交，其中所有的這三種繁殖系都對(duì)晚疫真菌敏感。每種BC2群體各含有超過(guò)50個(gè)的個(gè)體，并且針對(duì)抗晚疫的性狀出現(xiàn)以分離。在每種群體中，晚疫抗性與RAPD標(biāo)記(“GO2586”)的存在相關(guān)(＞95％)，而該標(biāo)記是S.bulbocastanum的第8染色體的關(guān)鍵。這種新的分子標(biāo)記的鑒定在實(shí)施例2中進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述。
進(jìn)一步的遺傳分析已經(jīng)導(dǎo)致鑒定出同樣與S.bulbocastanum的第8染色體的抗性基因或基因有關(guān)的另一種RAPD標(biāo)記和幾種RFLP標(biāo)記。這些標(biāo)記例如包括RFLP標(biāo)記CT88和RAPD標(biāo)記PO9587，它似乎位于抗性基因座的兩側(cè)(見(jiàn)圖2)。其它緊密相連的RFLPs包括CT148、CT252和CT68(見(jiàn)圖2)。正如本文更加詳細(xì)地討論的那樣，這些標(biāo)記共同限定了在S.bulbocastanum的第8染色體上的特定位置，其中該染色體攜帶賦予抗晚疫和某些其它馬鈴薯病害的抗性的基因。在第8染色體上的抗性基因的大概位置(如Tanksley等人(1992)所作的圖)示于圖3中。
本發(fā)明提供了一種用于培育對(duì)晚疫具有抗性的馬鈴薯栽培品種的新的和有用的種質(zhì)和生殖原種。所述種質(zhì)包括由S.bulbocastanum與馬鈴薯的體細(xì)胞融合產(chǎn)生的能育的雜種及其后代，它們含有攜帶了晚疫抗性的一個(gè)或多個(gè)基因的S.bulbocastanum基因組的一部分。正如下面更加詳細(xì)地描述的那樣，通過(guò)緊密連鎖的RAPD標(biāo)記GO2586或PO9587或者諸如CT88這樣的緊密連鎖的RFLP標(biāo)記的存在來(lái)方便地監(jiān)測(cè)該基因組片段的存在。特別優(yōu)選的生殖原種是通過(guò)將體細(xì)胞雜種與具有所希望的農(nóng)藝學(xué)品質(zhì)的馬鈴薯栽培品種反復(fù)地回交來(lái)得到的，其中通過(guò)檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的RAPD或RFLP標(biāo)記來(lái)監(jiān)測(cè)S.bulbocastanum的賦予晚疫抗性的基因組區(qū)段的存在。
馬鈴薯-S.bulbocastanum的體細(xì)胞雜種的產(chǎn)生、能育的抗性植物的選擇以及包括一個(gè)或多個(gè)抗病性基因的接下來(lái)的回交世代的產(chǎn)生都是通過(guò)為植物育種工作者和分子生物學(xué)家所熟知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在實(shí)施例1中更加詳細(xì)地描述了優(yōu)選的方法。
本發(fā)明還提供了新的分子標(biāo)記以便在不必針對(duì)抗病性進(jìn)行田間或溫室試驗(yàn)的情況下便于含有來(lái)自S.bulbocastanum的賦予所述抗性的基因組區(qū)段的培育后代的選擇。通過(guò)使用RAPD標(biāo)記并使用商購(gòu)可得的寡核苷酸10-mers作為PCR擴(kuò)增的引物制造出一種緊密連鎖的標(biāo)記GO2586。通過(guò)在使所述寡核苷酸結(jié)合到基因組DNA中的任意互補(bǔ)序列上的條件下，用多個(gè)10-mers溫育所述的基因組DNA來(lái)生產(chǎn)RAPD標(biāo)記。通過(guò)PCR擴(kuò)增介于束縛在一起的兩組引物之間的DNA的長(zhǎng)度，由此產(chǎn)生了一個(gè)DNA區(qū)段，該區(qū)段是在基因組DNA中介于引物之間的區(qū)段的拷貝、即一個(gè)RAPD片段。GO2586RAPD標(biāo)記的核苷酸序列如本文SEQ ID NO:1所示。
由此產(chǎn)生的RAPD片段是對(duì)種具有特異性的標(biāo)記，該標(biāo)記通過(guò)比較RFLP分析可以為具體的染色體提供線索并且通過(guò)各種雜交可以歸結(jié)為顯性標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明，RAPD標(biāo)記GO2586(它是由購(gòu)自操縱子技術(shù)公司的“GO2”十聚寡核苷酸引發(fā)的一個(gè)586bp的片段)為S.bulbocastanum的第8染色體提供線索。馬鈴薯-S.bulbocastanum體細(xì)胞雜種的BC2后代的分析表明晚疫抗性與GO2586RAPD片段的存在相關(guān)，其頻率大于95％。晚疫抗性與所述標(biāo)記的這種密切分離表明一個(gè)或多個(gè)抗性基因存在于所述標(biāo)記的位置上或其附近。因此，通過(guò)檢測(cè)該標(biāo)記的存在或缺少便可以監(jiān)測(cè)出在進(jìn)一步的雜交中的晚疫抗性。通過(guò)這種方式，不用針對(duì)抗病性進(jìn)行長(zhǎng)期的溫室或田間試驗(yàn)便可以選擇出具有攜帶抗性基因的高度可能性的后代，從而使得育種過(guò)程更為迅速和高效。
本發(fā)明還提供了第二種RAPD標(biāo)記PO9587，該標(biāo)記也與S.bulbocastanum中的抗性基因緊密連鎖并且通過(guò)如上針對(duì)GO2586所述的同樣的方案加以鑒定。RAPD標(biāo)記PO9587的核苷酸序列如本文SEQ IDNO:2所示。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了RFLP分子標(biāo)記，所述標(biāo)記在便于含有S.bulbocastanum賦予所述抗性的區(qū)段的生殖后代的選擇中是有用的。這些標(biāo)記還可以協(xié)助確定所述抗性基因在染色體上的位置并且得到含有所述基因的分離的基因組區(qū)段。來(lái)自三種不同來(lái)源的RFLP CT88的核苷酸序列(由Tanksley等人出版(http://probe.nalusda.gov:8300/cgi-bin/browse/solgenes)、來(lái)自R4馬鈴薯以及來(lái)自S.bulbocastanum)分別如本文SEQ ID NOS:3,4和5所示。
一旦生成后，可以在任何適合的克隆載體中維持有用的RAPD或RFLP片段。例如，在由商購(gòu)可得的PCR試劑盒(Invitrogen公司)提供的質(zhì)粒載體中維持根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的GO2586標(biāo)記。應(yīng)當(dāng)指出的是通過(guò)使用商購(gòu)可得的十聚物以及實(shí)施例2中所述的方法和其中所引用的對(duì)比文獻(xiàn)，獲得RAPD應(yīng)當(dāng)可以由本領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員重現(xiàn)。另一方面，本文所述的RAPD片段可以通過(guò)核苷酸的合成、使用標(biāo)準(zhǔn)的方法加以復(fù)制。
通過(guò)將RAPD片段或其部分或者以上討論的或圖2中所示的任何相連的RFLPs標(biāo)記為探針以便與S.bulbocastanum基因組中的互補(bǔ)序列雜交，從而將它們用于監(jiān)測(cè)晚疫抗性基因的存在或缺乏。可以根據(jù)任何標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)標(biāo)記克隆的片段，其中許多方法都示于《現(xiàn)代分子生物學(xué)方案》(Frederick M.Ausubel等人編輯，John Wiley&Sons,1997)。互補(bǔ)的基因組DNA是由幾種標(biāo)準(zhǔn)方法之一進(jìn)行檢測(cè)的，所述方法包括、但不限于(1)原位雜交；(2)Southern雜交；(3)“斑點(diǎn)”雜交；以及(4)相配的擴(kuò)增反應(yīng)、諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。正如以上所討論的那樣，互補(bǔ)的基因組DNA的檢測(cè)表示出賦予晚疫抗性的基因的存在，這是由于R基因與RAPD標(biāo)記或RFLPs緊密連鎖。
使用為分子生物學(xué)家所熟知的方法，同樣可以將RAPD片段或其部分或者任何前面提到的RFLP片段用于鑒定和分離S.bulbocastanum的緊密連鎖的晚疫抗性基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用合適的克隆載體構(gòu)建S.bulbocastanum的基因組文庫(kù)，所述載體例如為粘粒、酵母人工染色體(YAC)或細(xì)菌人工染色體(BAC)。然后通過(guò)與克隆的RAPD片段和/或一個(gè)或多個(gè)RFLP標(biāo)記雜交來(lái)篩選文庫(kù)，并分離出雜交克隆。然后例如通過(guò)作圖、測(cè)序和轉(zhuǎn)錄物分析來(lái)進(jìn)一步分析雜交克隆，以便鑒定出編碼所述抗性因子的候選的開(kāi)放讀框。一旦鑒定出候選的開(kāi)放讀框后，為了確定所述抗性基因及其所編碼的蛋白的特征，又可以對(duì)它們進(jìn)行進(jìn)一步的分析(例如通過(guò)構(gòu)建和體外表達(dá)cDNA分子)。
通過(guò)分子遺傳技術(shù)，可以使用由此鑒定出的賦予抗病性的克隆來(lái)把晚疫抗性引入培養(yǎng)的馬鈴薯中。例如，可以使用二元細(xì)菌人工染色體(BIBAC)載體來(lái)將BAC基因組插入片段轉(zhuǎn)移到馬鈴薯中(已經(jīng)使用載體BIBAC2(Hamilton等人，1996)來(lái)將大的(＞150kb)DNA插入片段轉(zhuǎn)移到煙草中)?？梢詫⒑衼?lái)自S.bulbocastanum的有關(guān)的基因組插入片段的BIBAC載體轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌中并用于轉(zhuǎn)化所選擇的馬鈴薯栽培品種。另一方面，可以通過(guò)BIBAC克隆的biolistic送遞來(lái)轉(zhuǎn)化馬鈴薯細(xì)胞。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法可以評(píng)價(jià)推定的轉(zhuǎn)基因克隆，以測(cè)定轉(zhuǎn)化是否已經(jīng)成功。
也可以使用賦予了抗病性的克隆來(lái)把抗性引入除馬鈴薯之外的物種中的蔓延疫霉中，所述的物種對(duì)該生物體的感染敏感。這些物種包括、但不限于番茄、茄子以及其它茄屬的種。而且，有可能S.bulbocastanum的晚疫抗性基因可以為除晚疫之外的病害賦予抗性，從而對(duì)于在馬鈴薯以及其它植物物種中引入抗病性而言可以有更加廣闊的用途。對(duì)把抗性引入導(dǎo)致葡萄、鱷梨、果樹(shù)和堅(jiān)果樹(shù)生病的其它疫霉屬的種來(lái)說(shuō)，該基因可能特別有用。而且，所述基因的功能一經(jīng)確定后，這就可以導(dǎo)致在其它物種中抗性的新機(jī)理的識(shí)別。
提供下列實(shí)施例來(lái)更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。它們的目的是舉例、而并非限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1在Solanum bulbocastanum與馬鈴薯的體細(xì)胞雜種及其后代中對(duì)晚疫的抗性墨西哥州野生物種S.bulbocastanum對(duì)晚疫具有高度的抗性。但是，S.bulbocastanum是一種1EBN物種，因此直接與馬鈴薯雜交是及其困難的。
體細(xì)胞雜交可以提供一種回避在茄屬的種之間的性不親和性的方式，這就導(dǎo)致產(chǎn)生了在育種計(jì)劃中可以直接使用的能育的植物。列于本實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以捕獲到S.bulbocastanum中的抗性并且通過(guò)使用體細(xì)胞雜交可以將所述的抗性傳遞到馬鈴薯的繁殖系中。材料與方法用于體細(xì)胞雜交的馬鈴薯及其有關(guān)的物種得自John Bamberg博士及其同事的位于WI Sturgeon海灣4312公路42的內(nèi)部區(qū)域馬鈴薯引入站(NRSP-6)。這些物種包括S.bulbocastanum、PI243510和馬鈴薯PI23900(馬鈴薯)。馬鈴薯栽培品種(Katahdin,Atlantic)的原種拷貝得自威斯康星州的馬鈴薯證明計(jì)劃。所有的栽培品種和野生物種以及測(cè)試材料都如Haberlach等人(1985)所述通過(guò)在體外克隆的方法進(jìn)行常規(guī)的維持。在體外增殖單個(gè)的克隆以便進(jìn)行分析。
如Haberlach等人(1985)所述，從體外枝條的葉子中分離出原生質(zhì)體。采用聚乙二醇(PEG)方案用原生質(zhì)體進(jìn)行體細(xì)胞雜交。在大多數(shù)情況下，接下來(lái)使用Austin等人(1985)的方法。但是，在融合嘗試后加入PEG、稀釋以及使細(xì)胞成為小片之后，將所述細(xì)胞懸浮在0.3M的蔗糖中、而不是在0.6M的甘露糖醇中。輕輕地振蕩(40RPM)細(xì)胞懸浮液45分鐘，然后在巴布科克瓶中于1300rpm下離心(HNII離心機(jī)，IEC)10分鐘。這一改進(jìn)導(dǎo)致活的原生質(zhì)體和融合的細(xì)胞濃縮在瓶中蔗糖溶液的表面，從而使活細(xì)胞與成為小片的碎片分離開(kāi)來(lái)。
以類似于Haberlach等人(1985)報(bào)道的方法，將得到的融合細(xì)胞再生成完整的植株。一開(kāi)始，把細(xì)胞平鋪到培養(yǎng)基(CUL,Haberlach等人，1985)上，當(dāng)在顯微鏡中的愈傷組織已經(jīng)出現(xiàn)時(shí)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(DIF,Haberlach等人，1985)上。2-3周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到由Lam(1977)研制的分化培養(yǎng)基上。在芽已經(jīng)形成后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到發(fā)育培養(yǎng)基(PM,Haberlach等人，1985)中。然后切下所形成的枝條并使其在標(biāo)準(zhǔn)的繁殖培養(yǎng)基(PROP,Haberlach等人，1985)上生根，并且在體外在試管中加以維持。針對(duì)實(shí)驗(yàn)，制備出參比拷貝的克隆拷貝。
如Williams等人(1990)所述進(jìn)行DNA的提取以及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的分析。染色體特異性的番茄基因組(TG)和cDNA(CD)探針得自康奈爾大學(xué)的Steve Tanksley博士。通過(guò)這種方法分析四種推定的體細(xì)胞雜種。為了完成雜種性的分析，如實(shí)施例2中更加詳細(xì)地描述的那樣進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)的分析。挑選出總共109種引物(從測(cè)試的380種引物中)，它們都給出了在馬鈴薯與S.bulbocastanum之間可以清楚地計(jì)分的多態(tài)性。與推定的體細(xì)胞雜種的每一種一起使用這些引物中的若干種引物。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)廣泛地使用了所述雜種中的三種。這些雜種被稱作J101、J103和J138。在雜交中，馬鈴薯親代被稱作K(對(duì)于Katahdin)或A(對(duì)于Atlantic)。因此，例如J101K1是由從J101和Katahdin雜交得到的漿果萌發(fā)的第一代種子。類似地，J101K6和J101K27是由分別來(lái)自所述雜交的種子6和種子27得到的幼苗。BC2后代是通過(guò)在所述雜交中加上種子號(hào)碼和栽培品種系來(lái)命名的。因此，命名為J101K6A22的雜交是來(lái)自品系J101K6與Atlantic雜交的第22代幼苗。這一簡(jiǎn)潔的稱呼避免使用可以應(yīng)用到該個(gè)體的或長(zhǎng)或短的提供信息的術(shù)語(yǔ)((S.bulbocastanum+馬鈴薯)×Katahdin)×Atlantic。
在田間比較易感的和抗性植株。對(duì)這些研究而言，在生長(zhǎng)季節(jié)過(guò)程中的不同時(shí)間里，記錄下顯示出晚疫損害的葉子的百分?jǐn)?shù)。對(duì)詳細(xì)的溫室研究來(lái)說(shuō)，采用改進(jìn)的Horsfall-Barret評(píng)定方案來(lái)估計(jì)受蔓延疫霉感染的葉子的百分?jǐn)?shù)。與這些分?jǐn)?shù)有關(guān)的感染％的評(píng)定和范圍如下9，看不出感染；8,<10％；7,11-25％；6,26-40％；5,41-60％；4,61-70％；3,71-80％；2,81-90％；1,>90％；0,100％感染。結(jié)果從23個(gè)愈傷組織中總共得到了80根植株。這些植物(來(lái)自5個(gè)愈傷組織)中的24株顯示出與親代物種的任何一方有著明顯的形態(tài)差異。其它的56株植物看起來(lái)與馬鈴薯非常類似。一開(kāi)始，使用染色體特異性的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記來(lái)證明來(lái)源于S.bulbocastanum與馬鈴薯細(xì)胞融合的植物中的四株的確是體細(xì)胞雜種。除了鑒別的S.bulbocastanum帶之外，所述雜種還保留著顯著的馬鈴薯帶(

圖1)。用RAPD探針評(píng)價(jià)其余的潛在的雜交植物(見(jiàn)實(shí)施例2)。通過(guò)這些技術(shù)證實(shí)總共13個(gè)以上的體細(xì)胞雜種。被證實(shí)的雜種來(lái)源于四個(gè)不同的愈傷組織薄片，因此可能來(lái)源于四個(gè)不同的融合事件。
檢查親代植株與具有代表性的體細(xì)胞雜種的葉子和主干的外觀。和許多的我們的其它雜種的情況一樣，在所述雜種中可以看到親代物種雙方的性狀。在這種情況下，在雜種中表現(xiàn)出S.bulbocastanum主干的紫色。但是，所述雜種的葉子是混合色的、而不是如野生物種那樣是單色的。
用馬鈴薯栽培品種“Katahdin”和“Atlantic”進(jìn)行四種體細(xì)胞雜種的雜交，以便測(cè)試所述雜種的生育力。每個(gè)測(cè)試的雜種都產(chǎn)生了活的種子以及有性后代。由這些后代品系選出的個(gè)體的進(jìn)一步雜交也是成功的。因此，親代系以及兩代連續(xù)的回交群體對(duì)抗病性的評(píng)價(jià)都是可以利用的。
用離脫葉或葉盤(pán)進(jìn)行抗蔓延疫霉抗性的初級(jí)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)表明體細(xì)胞雜種和一些后代至少保留了一些S.bulbocastanum親代所示的對(duì)晚疫的抗性。
這些初級(jí)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果是在第一生長(zhǎng)季節(jié)過(guò)程中在田間試驗(yàn)中得到證實(shí)的。S.bulbocastanum與馬鈴薯之間的體細(xì)胞雜種以及來(lái)自所述體細(xì)胞雜種的后代顯示出明顯的抗性并且在試驗(yàn)田中在死馬鈴薯品系的褐色背景中作為“綠島”顯然是很引人注意的。盡管栽培品種Atlantic、Russet Burbank和Snowden被殺死，但11個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)系顯示出低于10％的感染。在每種情況下，活的測(cè)試植物被易感的栽培品種Russet Burbank包圍著，其中該栽培品種已在生長(zhǎng)季節(jié)中的8月9日被所述真菌殺死。比較起來(lái)，J101K27和J101K6A22在8月15日的葉感染％分別為5.0％和7.8％。
在墨西哥州的Toluca，在第二生長(zhǎng)季節(jié)和接下來(lái)的夏季中測(cè)試十四株BC1和BC2系。用在去年夏季中在威斯康星州具有抗性的所有品系同樣在Toluca田間試驗(yàn)中獲得了良好的抗性。
在第三生長(zhǎng)季節(jié)中，在威斯康星州的Hancock進(jìn)行了額外的田間試驗(yàn)。在試驗(yàn)田中再次得到了幾種天然的晚疫流行病，而且普通栽培品種的產(chǎn)量也受到了晚疫流行病的嚴(yán)重抑制。例如，在維持有效的殺真菌劑噴灑方式的地塊中，Russet Burbank的產(chǎn)量高達(dá)1.7kg/植物。在不使用殺真菌劑的產(chǎn)量試驗(yàn)中，該產(chǎn)量幾乎減少了一半、達(dá)到0.86kg/植物。在Hancock的第三生長(zhǎng)季節(jié)中，一株來(lái)源于S.bulbocastanum的品系J103K7以1.36kg/植物的產(chǎn)量在所有的90個(gè)測(cè)試系中名列第一，而J138A12則以1.32kg/植物的產(chǎn)量排名第四。
為了測(cè)試潛在分離的BC1和BC2群體的抗性，在威斯康星州Biotron大學(xué)的新的研究溫室中建造了一套設(shè)備。在其中，對(duì)濕度和溫度密切地控制以使均一的流行病成為可能。對(duì)于來(lái)自四個(gè)不同的體細(xì)胞雜種的六個(gè)BC1的每一個(gè)而言，都獲得了抗性和易感性的分離。來(lái)自這些品系之一的具有代表性的實(shí)驗(yàn)示于表1。將這些品系中的三個(gè)品系進(jìn)一步與Atlantic或Norland雜交。在表2中包括了關(guān)于這些BC2品系的具有代表性的結(jié)果。借助這些品系再次獲得了抗性的明顯的分離以及親代雙方的易感性和抗性的最大程度的恢復(fù)。
表1．來(lái)自針對(duì)晚疫抗性的BC1系的Biotron試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)
表2.在BC1系J101K6與馬鈴薯cv.Atlantic之間雜交的BC2后代中針對(duì)晚疫抗性的分離的實(shí)例
這些結(jié)果表明S.bulbocastanum與馬鈴薯的體細(xì)胞雜種是抗晚疫的非常有效的抗性的來(lái)源。而且，通過(guò)常規(guī)的性雜交可以將該性狀傳遞到馬鈴薯的繁殖系中。該抗性至少在兩代有性后代中攜帶著，并且通過(guò)剛剛得到的第三季的結(jié)果，所述抗性在幾個(gè)不同的地方已經(jīng)穩(wěn)定了4個(gè)不同的年份。由于目前沒(méi)有北美的栽培品種具有抵抗該病害的足夠的抗性，因此對(duì)于向商業(yè)品系中引入抗性而言，這些品系將會(huì)是非常有用的。
來(lái)自S.bulbocastanum的抗蔓延疫霉的抗性似乎比來(lái)源于S.demissum的具有種族特異性的抗性(Black&Gallegly,1957)更為普通。已知幾乎所述真菌的每個(gè)種族都是在墨西哥州的Toluca發(fā)現(xiàn)的，并且它們實(shí)際上是從其中體細(xì)胞雜種的后代顯示出良好的抗性的田地中分離出來(lái)的。在Toluca，在兩個(gè)不同的生長(zhǎng)季節(jié)中對(duì)葉的觀察表明實(shí)質(zhì)上形成了一些損傷并且芽胞形成受到限制也發(fā)生了。盡管抗病性非常有效，但參與的基因的數(shù)目仍是不清楚的。對(duì)每種測(cè)試的體細(xì)胞雜種來(lái)說(shuō)，BC1系的抗病性似乎分離開(kāi)來(lái)。因此，看起來(lái)晚疫抗性基因在體細(xì)胞雜交中所用的S.bulbocastanum的克隆中是雜合的。
實(shí)施例2與來(lái)源于Solanum bulbocastanum-馬鈴薯的體細(xì)胞雜種的晚疫抗性連鎖的RFLPs和RAPD標(biāo)記的鑒定實(shí)施例1描述了馬鈴薯-S.bulbocastanum的體細(xì)胞雜種及其后代的產(chǎn)生，它們對(duì)馬鈴薯的晚疫具有抗性。本實(shí)施例描述與這些后代中的抗病性共分離的DNA標(biāo)記的鑒定。
由于Bonierbale等人(1988)完成了馬鈴薯中限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的圖譜，因此馬鈴薯中性狀的詳細(xì)的遺傳作圖已經(jīng)成為可能。通過(guò)使用事先已在番茄中作圖的番茄的克隆，通過(guò)二倍體種間雜交來(lái)確立馬鈴薯的圖譜。番茄的圖譜和馬鈴薯的圖譜顯示出幾乎同線的基因順序(Tanksley等人，1992)。
用于產(chǎn)生標(biāo)記的一種可供選擇的方法為使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNAs(RAPDs)。該技術(shù)在PCR熱循環(huán)儀中使用混合在一起的DNA聚合酶、合成的寡核苷酸(10-mers)和基因組DNA以生成泳帶，所述泳帶是以混合的形式存在的基因組DNA序列的拷貝(J.G.K.Williams等人，1990)。該步驟通常產(chǎn)生于大約5種與8種特異性泳帶之間，其中作為顯性標(biāo)記可以使其在不同的雜交過(guò)程中均出現(xiàn)。此外，如果特異性泳帶可以與特性(諸如抗病性)或與具體的染色體或與上述兩者相關(guān)的話，那么可以切下并擴(kuò)增所述條帶，然后將其用作標(biāo)準(zhǔn)的RFLP。對(duì)于評(píng)價(jià)來(lái)自野生物種的DNA漸滲現(xiàn)象延伸到培養(yǎng)的物種中來(lái)說(shuō)，該方法很奏效。但是，RAPDs是對(duì)種具有特異性的，因此必須針對(duì)每個(gè)不同的物種開(kāi)發(fā)出一套方法，這與其中種間同線性適用的RFLPs不同。材料與方法正如實(shí)施例1中詳細(xì)的描述的那樣，通過(guò)Austin等人(1985和1993)的方法生產(chǎn)出S.bulbocastanum(PI243510)和馬鈴薯(PI203900)的體細(xì)胞雜種。植物來(lái)源于能育的雜種，并將這些品系中的三個(gè)品系分別稱作J101、J103和J138。將所述的體細(xì)胞雜種的植株作為母本與馬鈴薯cv Katahdin(KAT)雜交，以便產(chǎn)生BC1后代。將三個(gè)BC1后代作為種子親本與三種不同的馬鈴薯繁殖系(Norland,Atlantic和A89804-7)雜交，以便產(chǎn)生BC2群體。
對(duì)RFLP和RAPD分析來(lái)說(shuō)，僅僅從體外無(wú)菌培養(yǎng)中維持的植物中分離出DNA。如McGrath等人(1994)所述的那樣，進(jìn)行針對(duì)RAPD標(biāo)記的DNA操作和PCR擴(kuò)增方案(Williams等人，1990)以及通過(guò)參照RFLP標(biāo)記為S.bulbocastanum的染色體分配RAPD標(biāo)記，其中例外的是使用了如McGrath等人(1996)所述的改進(jìn)的熱循環(huán)分布。RAPD標(biāo)記是由十聚-核苷酸引物(由操縱子技術(shù)公司得到)和以下標(biāo)表示的擴(kuò)增片段的大小來(lái)命名的(例如由引物GO2擴(kuò)增的586bp的片段表示為GO2586)。
同樣用包含在MapMaker計(jì)算機(jī)程序包(Lander等人，1987)中的最大似然算法分析RAPD標(biāo)記的分離。使用MacIntosh的MapMaker2.0版。將數(shù)據(jù)編譯成代碼，并在“數(shù)據(jù)類型”選項(xiàng)下以“單倍體”群體進(jìn)行分析。對(duì)于種間體細(xì)胞雜種的分析而言，MapMaker的使用是不標(biāo)準(zhǔn)的并且不提供三點(diǎn)連接的數(shù)據(jù)。但是，重組頻率在本文中是特別有意義的。顯示出等同分離的標(biāo)記具有的重組頻率為0.0％。由單個(gè)的變化偏離了完全共遺傳的標(biāo)記(例如有一個(gè)標(biāo)記存在于一個(gè)額外的個(gè)體中)表明重組頻率與群體的大小成正比；在本例中為1/101個(gè)個(gè)體或?yàn)?.0％。因此，該數(shù)值的倍數(shù)表明在任何一對(duì)的標(biāo)記之間觀察到的不同的數(shù)目。
結(jié)果使用RAPD標(biāo)記分析，針對(duì)S.bulbocastanum確立了12個(gè)同線性的小組，這對(duì)應(yīng)于所述物種中染色體的基數(shù)。通過(guò)比較RFLP分析將所述小組與染色體相關(guān)聯(lián)。S.bulbocastanum的同線性小組A(第8染色體)的RFLPs和RAPD片段的MapMaker分析示于圖2中。該同線性小組含有RAPD標(biāo)記GO2586和PO9587以及RFLP CT88?？雌饋?lái)CT88和GO2586位于抗性區(qū)域(R)的一側(cè)、而PO9587位于該抗性區(qū)域的另一側(cè)(圖2)。
GO2586的核苷酸序列如本文SEQ ID NO:1所示。PO9587的核苷酸序列如本文SEQ ID NO:2所示。CT88的三個(gè)核苷酸序列示于本文中。SEQ ID NO:3是由Tanksley等人出版的序列(http://probe.nalusda.gov.8300/cgi-bin/browse/solgenes)；SEQ ID NO:4來(lái)自R4馬鈴薯；而SEQ ID NO:5來(lái)自S.bulbocastanum(PT29)。在這三個(gè)序列中注意到了輕微的差別。R4馬鈴薯的標(biāo)記長(zhǎng)度為589bp，而S.bulbocastanum RFLP為592bp,Tanksley等人的序列為596bp。此外，S.bulbocastanum CT88的同系物擁有兩個(gè)TaqI位點(diǎn)，而其它的兩種僅僅具有一個(gè)所述的位點(diǎn)。
馬鈴薯與S.bulbocastanum的融合產(chǎn)生了17個(gè)經(jīng)證實(shí)的體細(xì)胞雜種。所述的體細(xì)胞雜種對(duì)早疫和晚疫都有相當(dāng)?shù)目剐?。?duì)于既抗早疫又抗晚疫的高度的抗性而言，發(fā)現(xiàn)一些雜交的后代發(fā)生了分離。所述后代中的一些甚至對(duì)致病性非常強(qiáng)的種族復(fù)雜的真菌株系都有高度的抗性。選出幾種具有高度抗性的克隆并將它們與馬鈴薯進(jìn)一步雜交。通過(guò)與馬鈴薯栽培品種的雜交已經(jīng)產(chǎn)生了三套BC2作圖的群體。首先在威斯康星州的田間研究表明在這些材料中對(duì)輪枝孢屬、早疫和晚疫的抗性。在北達(dá)科他州、愛(ài)德華王子島、華盛頓州、紐約州、緬因州、西弗吉尼亞州和墨西哥州的Tuloca進(jìn)行關(guān)于晚疫抗性的后續(xù)研究。重復(fù)墨西哥州和威斯康星州的第二季和第三季的研究，在這些材料中的晚疫抗性似乎是持久的。
在實(shí)施例1、表1和表2中顯示出在所選擇的BC1和BC2群體中晚疫抗性的分離。以下的表3顯示出與針對(duì)S.bulbocastanum第8染色體的RAPD標(biāo)記GO2586的存在或是缺乏有關(guān)的關(guān)于晚疫抗性的BC2后代的分離分析的結(jié)果。表3中所示的數(shù)據(jù)是通過(guò)PCR擴(kuò)增、接下來(lái)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色以觀察擴(kuò)增的586bp條帶的存在或是缺乏來(lái)產(chǎn)生的。
表3.與RAPD標(biāo)記GO2586的存在或是缺乏有關(guān)的BC2后代的分離
正如可以從表3中(以及其它未顯示出的結(jié)果)看到的那樣，BC2克隆中的晚疫抗性與RAPD標(biāo)記GO2586的存在非常相關(guān)(＞95％)，而所述的標(biāo)記已為S.bulbocastanum的第8染色體提供了線索。抗性表型與所述標(biāo)記的這種高度的相關(guān)性表明決定著賦予晚疫抗性的基因存在于染色體上的GO2586標(biāo)記處或者其附近。因此，可以將所述標(biāo)記用作分子標(biāo)記，以便使抗性在整個(gè)育種計(jì)劃中一直維持下去并且鑒定和分離出抗病性的生殖原種。此外，已知所述抗性基因相當(dāng)接近所述的標(biāo)記，因此將會(huì)便于所述基因的分離。
也可以將以上討論的RFLP和RAPD標(biāo)記CT88和PO9587用作分子標(biāo)記，從而使抗性在整個(gè)育種計(jì)劃中維持下去。使用與抗性有關(guān)的RAPD和RFLP標(biāo)記的組合可以為接下來(lái)的育種過(guò)程中的分離以及最終在決定著賦予抗晚疫和其它病害的抗性的S.bulbocastanum基因的分離和克隆中提供額外的優(yōu)點(diǎn)。
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本發(fā)明并不局限于以上所述的和例舉的實(shí)施方案，但是在不偏離所附權(quán)利要求的范圍的情況下能夠進(jìn)行變化和改動(dòng)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Helgeson,John P.
Austin,SandraNaess,Sara K.
(ⅱ)發(fā)明名稱針對(duì)馬鈴薯中抗病性的種質(zhì)與分子標(biāo)記(ⅲ)序列數(shù)5(ⅳ)通信地址(A)收信人Dann,Dorfman,Herrell&Skillman(B)街道1601市場(chǎng)街，Suite720(C)城市費(fèi)城(D)州PA(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼19103(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)存儲(chǔ)媒體類型軟磁盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ1.5版(ⅵ)目前申請(qǐng)的資料(A)申請(qǐng)?zhí)柹形唇o定(B)申請(qǐng)日1998年7月27日(ⅶ)在先申請(qǐng)的資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S60/054,267(B)申請(qǐng)日1997年7月30日
(ⅷ)律師/代理人的信息(A)姓名Janet E.Reed(B)登記號(hào)36,252(C)文獻(xiàn)/案件目錄號(hào)P98003WO(ⅸ)電信信息(A)電話215-563-4100(B)電傳215-563-4044(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度586個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來(lái)源Solanum bulbocastanum(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GGCACTGAGG GGTAGTAAGC CTCCTGCATG TACTAAGTAT GGTAGATCCA CTCAGGGTTG60TGCCATGATG GCTTAACTGG TTGTTTCAAG TATGGCCAGA ACGGTTATTT TATGAGAGAG 120TTTCCAAAGA ACATGCAGGG TAATGGTAAT GGGGATAATA GAACCCAGTC TTCTTCAGTG 180ACTCCACCAG ACAGAGCTGC ATCTAGAGGA GCTACTTCGA GGCAGGCGGA GGATCGAACG 240TCTTTATGCT ATCACTAGTC GCCAAGAGAA AGAGGATTCG CCAGATGTTG TCACTGGTAT 300GATCCAAGTC TTTAACTTTG ATTTTATACT TTTCTAGATC CAGGAGCGAG TTTATCCTTT 360GTAACTCCTT ATGTTGCGGT TAATTTTGAT GTTCTTCCTA AGAAACTTAT TGAGCCCTTC 420AGTGTTTCTA CACTTGTTGG TCTATTATAG TAGAGAGAGT CTGTTATGAT TGTACCGTTT 480TCGTCAATCA CAAGAGCACC ATGGTTGATT TAGTTGAGTT AGACATGGTA GAATTTGATG 540TTATTCTTGG TATGGACTGA CTTCATTCTT GTTATGCCTC AGTGCC 586(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度587個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來(lái)源Solanum bulbocastanum(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:GTGGTCCGCA TATAACTCAA GAACTTGTAA TGCATGTATC GGATATATGT ATACATGTTG60TCTTTTGCAA AGTTTACTTT TTTATTANTT AATCTTGTTT GTGTCTGGAG GTGGTGGTGG 120GGTGGGATAG TGGTGAAGCT AGAAATTTAG TTAAGTGTGT TCAAGATTTA AATATACATA 180TGAAAAATAA TTTTTGATCT ATATATATAG TTATAATTTT NTGATGAAGG TAGTTCAACT 240GACCACCCGT NACTACATGT GGCTACCGTA CTGGGTGGGG TGGAAGGTCN TGGTGTTTAC 300AGTGATGTGG GGGCCTCTGA AATGCTTTTG TGGGCAATGT GGGAATTACT GTTTATCTTT 360TCTTTATTGA AGTCATTGAG TGTTTGAGTT ATTTAACTAT GAAAGGTAGC TAGTGGGTAA 420TGTTATTGAT GACTTTGTGT GAAGAACAAA ATGTCAATCA TTCAGAGCGT TCAATGGGGG 480CACGTGCTGG AGTCCCATTT GGATTATTGG GTTTAGGGGT TGCCTAGGTG GTGGTGGTGG 540TGGTTGGTAA TGGATAATAA TGTTGGTGAA ATATGGGTGC GGAGGAG 587(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度596個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來(lái)源番茄(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GTTGGGCAGA AGAGCTAGGA AGAGTAAGCA TGTCAAGTGA TAGTTGCAGC CACTGGTGTT 60ATAGTTGTAG ACAACCCGTG AATCTCAGGA GACAAAATGA TGTTTGCCCC AATTGCGGTG120GTGGATTTGT TCAAGAGCTT GAAGACATAA CGAGTAGTAG TGTAGATAAT CAGACCCAGA180GGCCGAGATT CATGGAATCC GTCTCAAACT TTTTAAGACG ACAAATCTCA GCTACAAGTA240ATACTTCTGA GAGAGGGAGA TCTGATGGGG GTGCTGAACG AGGAAATTTG TGGAATCCGT300TGCTGATTTT CAGTGGTGAT ACGCCTGTTC ATATGCCTGG GGATGGTGGA GTTTTGGAGT360TTCTTAATGA GGCACCTTGG ATTCCGAGCA AGAAAATGGT GGTGATTATT TTGTTGGTCC420AGGAGTGGAG GAATTTTTTG AAGAAATTGT AAATAGAAAT CAGCGTGGTG CTCCTCCTCC480TGTCTCGAGA TGTTCAATTG ATTCCCTACC AACAGTCAAG ATATCAAAAA AGGATGTTAG540ATCGGATTCG CACTGCCCTG TTTGTAAGGA GAAATTTGCT CTGGGGACTA AGGCAA596(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度589個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來(lái)源馬鈴薯(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GTTGGGCAGA AGAGCTAGGA AGAGTAAGCA TGTCAAGTGA CAGTTGCAGC CACTGGTGTT60ATAGTTGTAG ACAACCCGTG AATCTCAGGA GACAAAATGA TGTTTGCCCC AATTGCAGTG 120GTGGATTTGT TCAAGAGCTT GAAGACATAA CGAGTAGTAG TGTAGATAAT CAGAGCCAGA 180GGCCGAGATT TATGGAATCC GTCTCAAACT TTTTAAGACG ACAAATCGCT ACAAGTAATA 240CTTCTGAGAG AGGGAGATCT GATGGGGGTG CTGAACGAGG AAATTTATGG AATCCATTGC 300TGATTTTCAG TGGTGATACG CCTGTTCAAG ATGCCTGGGG ATGGTGGAGT TTTGGAGTTT 360CTTAATGAGG CTCTTGGCTT CCGACAAGAA AATGGTGGTG ATTATTTTGT TGGTCCAGGA 420GTGGAGGAAT TTTTTGAAGA AATTGTAAAT AGAAATCAGC GTGGTGCTCC TCCTGCCTCA 480AGATGTTCAA TTGATTCCCT ACCAACAGTC AAGATATCGA AAAAAGATGT TAGATCGGAT 540TCTCACTGCC CTGTTTGTAA AGAGAAATTT GCTCTGGGGA CTAAGGCAA 589(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度592個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類型(ⅵ)最初來(lái)源Solanum bulbocastanum(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GTTGGGCAGA AGAGCTAGGA AGAGTAAGCA TGTCAAGTGA CAGTTGCAGC CACTGGTGTT60ATAGTTGTAG ACAACCCGTG AATCTCAGCA GACAAAATGA TGTTTGCCCC AATTGCGGTG 120GTGGATTTGT TCAAGAGCTT GAAGACATAA CGAGTAGTAG TGTAGATAAT CAGAGCCAGA 180GGCCGAGATT CATGGAATCC GTCTCAAACT TTTTAAGACG ACAAATCCCA ACTACAAGTA 240ATACTTCTTG AGAGAGGGAG ATCTGATGGG GGTGCTGAAC GAGGAAATTT GTGGAATCCG 300TTGCTGATTT TCAGTGGTGA TACACCTGTT CGGATGCCTG GGGATGGTGG AGTTTTGGAG 360TTTCTTAATG AGGCTCTTGG CTTTCGACAA GAAAATGGTG GTGANTATTT TGTTGGCCCA 420GGAGTGGAGG AGTTTTTTGA AGAAATTGTA AATAAAAATC AGCGTGGTGC TCCTCCTGTC 480TCAAGATGCT CAATTGATTC CCTACCAACA GTCAAGATAT CGAAAAAGGA TGTTAGATCG 540GATTCTCACT GCCCTGTTTG TAAAGAGAAA TTTGCTCTGG GGACTAAGGC AA 59權(quán)利要求
1．一種晚疫抗性馬鈴薯植物，所述植物包括來(lái)自Solanumbulbocastanum的含有賦予抗晚疫的所說(shuō)抗性的基因的基因組的區(qū)段。
2．權(quán)利要求1的馬鈴薯植物，其中所述Solanum bulbocastanum基因組的區(qū)段為所述基因組第8染色體的區(qū)段。
3．權(quán)利要求1的馬鈴薯植物，其中所述賦予晚疫抗性的基因與選自由GO2586RAPD標(biāo)記、PO9587RAPD標(biāo)記、CT88 RFLP標(biāo)記、CT148RFLP標(biāo)記、CT252RFLP標(biāo)記和CT68RFLP標(biāo)記組成的組中的標(biāo)記共分離。
4．權(quán)利要求4的馬鈴薯植物，其中所述的標(biāo)記包括選自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5組成的組中的序列。
5．權(quán)利要求1的馬鈴薯植物，所述植物對(duì)至少一種選自由馬鈴薯早疫、歐文氏軟腐病和輪枝孢屬萎蔫病組成的組中的其它病害也具有抗性。
6．權(quán)利要求1的馬鈴薯植物，其中通過(guò)所述植物的親代細(xì)胞與Solanum bulbocastanum的細(xì)胞之間的體細(xì)胞雜交，將所述的晚疫抗性基因摻入所述植物中。
7．權(quán)利要求1的馬鈴薯植物，其中通過(guò)用包括所述基因的植物轉(zhuǎn)化載體遺傳轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞，將所述的晚疫抗性基因摻入所述植物中。
8．一種分離的核酸分子，所述核酸分子互補(bǔ)于選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5組成的組中的雙鏈分子的部分或全部。
9．權(quán)利要求8的核酸分子，其中所述核酸分子被設(shè)置在載體中。
10．一種在馬鈴薯與Solanum bulbocastanum的能育的體細(xì)胞雜種后代的雜交育種中監(jiān)測(cè)晚疫抗性的方法，該方法包括(a)進(jìn)行所述的雜交；(b)從所述雜交的個(gè)體后代中分離出基因組DNA；以及(c)檢測(cè)在所述基因組DNA中，預(yù)先確定與所述晚疫抗性共分離的遺傳標(biāo)記的存在或是缺乏、所述標(biāo)記的存在或缺乏表明了在所述雜交育種的個(gè)體后代中所述晚疫抗性存在或缺乏。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述的標(biāo)記選自由GO2586RAPD標(biāo)記、PO9587RAPD標(biāo)記、CT88RFLP標(biāo)記、CT148RFLP標(biāo)記、CT252RFLP標(biāo)記和CT68 RFLP標(biāo)記組成的組中。
12．一種鑒定賦予抗晚疫抗性的Solanum bulbocastanum的基因的方法，所說(shuō)的方法包括(a)在Solanum bulbocastanum與馬鈴薯的體細(xì)胞雜種的后代中，克隆出與所述的晚疫抗性表型共分離的DNA區(qū)段；(b)提供所述Solanum bulbocastanum的基因組的基因組文庫(kù)；(c)分離出含有與所述共分離的DNA區(qū)段雜交的區(qū)段的所述基因組文庫(kù)的克?。灰约?d)鑒定出設(shè)置在賦予所述晚疫抗性的所述分離的基因組克隆中的至少一種基因。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所說(shuō)與晚疫抗性共分離的克隆的DNA區(qū)段包括一種選自由GO2586RAPD標(biāo)記、PO9587RAPD標(biāo)記、CT88 RFLP標(biāo)記、CT148 RFLP標(biāo)記、CT252 RFLP標(biāo)記和CT68 RFLP標(biāo)記組成的組中的標(biāo)記的部分或全部。
14．由權(quán)利要求12的方法生產(chǎn)的來(lái)自Solanum bulbocastanum的晚疫抗性基因。
15．包括權(quán)利要求14所述的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的種質(zhì)、生殖原種、遺傳標(biāo)記以及用于把抗晚疫和其它病害的抗性引入培養(yǎng)的馬鈴薯植物中的方法。該種質(zhì)來(lái)源于含有賦予抗晚疫抗性的一個(gè)或多個(gè)基因的Solanum bulbocastanum基因組的區(qū)段。通過(guò)S.bulbocastanum與馬鈴薯的體細(xì)胞雜交,將S.bulbocastanum的基因組引入栽培的馬鈴薯中。本發(fā)明還提供了與所述抗病性基因共分離的S.bulbocastanum的RAPD片段的標(biāo)記。此外,本發(fā)明還提供了第8染色體RFLP標(biāo)記,該標(biāo)記與所述抗性基因也是緊密地連接在一起的。將這些標(biāo)記用于監(jiān)測(cè)在雜交育種中所述病害的抗性性狀的傳代情況。此外還將所述的標(biāo)記用于促進(jìn)決定著所述抗病性的S.bulbocastanum的一個(gè)或多個(gè)基因的分離。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1314782SQ98809716
公開(kāi)日2001年9月26日 申請(qǐng)日期1998年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月30日
發(fā)明者J·P·赫爾格森, S·奧斯丁, S·K·奈斯 申請(qǐng)人:威斯康星舊生研究基金會(huì), 美國(guó)農(nóng)業(yè)部