專利名稱：一種抗磷酸化Oct4蛋白的抗體及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗磷酸化0ct4蛋白的抗體,具體講,涉及一種針對0ct4蛋白343位磷酸化的抗體。
背景技術(shù)：
干細胞按分化能力分為全能性、 多能性和專能性干細胞。0ct4是全能性或多能干細胞標記物，在胚胎干細胞、胚胎生殖細胞和胚胎/生殖細胞腫瘤中陽性表達，但在分化的組織中均表達降低或消失，提示其在胚胎干細胞、生殖細胞和胚胎/生殖腫瘤中的表達與這些細胞的多能性分化特性密切相關(guān)。在成體組織和體細胞腫瘤中亦發(fā)現(xiàn)0ct4陽性表達。迄今為止，0ct4在成體組織中的表達主要局限于具有干細胞特性的細胞，如皮膚基底細胞層中的個別細胞、乳腺干細胞和胃干細胞等。0ct4 mRNA及其蛋白質(zhì)在未受精的卵母細胞中出現(xiàn)，也在桑椹胚期(32 64個細胞)的所有胚胎細胞中有豐富表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，0ct4在原腸胚前期的胚胎外胚層亦有表達。因此被認為是胚胎干細胞和生殖細胞的標記物。研究證實，內(nèi)細胞群0ct4表達比分化的滋養(yǎng)外胚層細胞高31倍，與鼠類相同。因此，在植入前的桑椹胚階段決定0ct4在內(nèi)細胞群表達，在周圍滋養(yǎng)層中表達下調(diào)的機制對植入前胚胎的正常發(fā)育具有關(guān)鍵作用。在桑椹胚階段，0ct4表達使每個細胞都具有全能性。滋養(yǎng)層細胞形成過程是0ct4表達下降致細胞分化的結(jié)果，細胞失去全能性，分化為滋養(yǎng)層細胞利于胚泡進行子宮內(nèi)膜植入。可見，0ct4在內(nèi)細胞群持續(xù)表達和滋養(yǎng)層表達下降是形成不同的分工共同維持胚胎發(fā)育。0ct4在胚胎生殖細胞中表達出現(xiàn)在睪丸生殖細胞的孕17 37周，高峰出現(xiàn)在性腺發(fā)育的孕17 24周。出生后睪丸曲精小管無陽性表達。此期可能是睪丸胚胎生殖細胞數(shù)最多時，而后逐漸向其他組織分化，形成睪丸的各種結(jié)構(gòu)。最近，在羊水中發(fā)現(xiàn)有0ct4表達陽性的細胞，該細胞有活躍的分裂能力。因為被證實在細胞增殖時才表達的細胞周期調(diào)節(jié)劑cyclin A在這些細胞中表達。由于有三個胚層起源的不同胚胎/胎兒細胞存在于羊水中，要搞清這些陽性羊水細胞的細胞起源尚需進一步研究。相對胚胎干細胞和生殖細胞而言，0ct4的表達在所有類型的分化細胞中均下降。Solter發(fā)現(xiàn)在排出的卵母細胞、小鼠植入前胚胎細胞、原胚腔的外胚層、原生殖細胞和胚胎干細胞中均有0ct4表達，而當這些細胞進入分化狀態(tài)后其表達消失。在4 8個胚胎細胞組成的胚泡中，不同水平的0ct4表達預示胚泡或向內(nèi)細胞群發(fā)育，或向滋養(yǎng)外胚層發(fā)育。0ct4在原腸胚形成前期的全能和多分化潛能細胞中表達，在分化成內(nèi)胚層和中胚層過程中下調(diào)。同樣，Yeom等也發(fā)現(xiàn)在鼠原腸胚形成前期的胚胎全能性細胞產(chǎn)生的各種胚胎體細胞組織和生殖細胞中均表達0ct4。此種表達在原腸胚期呈下降調(diào)節(jié)，此后僅維持在種系中表達。因此，高水平的0ct4表達認為與維持細胞全能性相關(guān)，而0ct4表達的下調(diào)認為與分化有關(guān)。0ct4通過結(jié)合位于轉(zhuǎn)錄起始點近側(cè)或遠側(cè)的八聚體基序來激活轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育過程中起重要作用。0ct4缺陷的小鼠胚胎迅速死去，不能引發(fā)胚胎發(fā)育。原因是缺少內(nèi)細胞群形成，胚胎全能性細胞不能進行維持發(fā)育和自我修復。與基礎(chǔ)表達水平相比，小于兩倍的0ct4表達就可使胚胎全能性細胞分化成原始的內(nèi)胚層和中胚層，而抑制其表達致使胚胎全能性細胞分化成滋養(yǎng)外胚層綜上所述，0ct4是胚胎早期發(fā)育過程中重要的決定和保護因素，其表達情況直接決定胚胎發(fā)育結(jié)果。0ct4是參與調(diào)控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性的最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時也是體外建立誘導多功能干細胞(iPS)的關(guān)鍵基因。在全能胚胎干細胞和生殖系干細胞表達。在早期胚胎中，在ICM階段，0ct4為維持其全能性而發(fā)揮作用。傳統(tǒng)認為0ct4的激活有3種模式遠端依賴性共激活，構(gòu)象依賴性共激活，0ct4聚合體依賴性共激活。在本發(fā)明中，發(fā)明人提出了一種新的激活模式，即磷酸化依賴性激活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)0ct4蛋白的C末端的343位蘇氨酸殘基是一個新的磷酸化位點，此位點的磷酸化決定了 0ct4作為轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控，即343位蘇氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢鶗r，0ct4對下游基因Nanong、Sox2的正向調(diào)控能力下降，因而失去維持干細胞自我復制及多潛能分化的能力。 本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出抗磷酸化0ct4蛋白的抗體。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出這種抗體的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的第一發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種抗磷酸化0ct4蛋白的抗體,所述的抗體是針對0ct4蛋白343位磷酸化的抗體。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為所述的抗體的為單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述單克隆抗體的制備方法包括以下步驟⑴合成多肽合成第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQ ID NO 1 50mg,非磷酸化的多肽SEQ ID NO 1 20mg ；SEQ ID NO : I 的氛基酸序列為Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-Hi s ；第8位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 1的氨基酸序列為Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-AlaLeu-Gly-Ser-Pro-Met-His ；⑵血清階段兔子經(jīng)過5次免疫后，取全血，析出血清，檢測血清的滴度，篩選出特異性較強的免疫兔；(3)細胞融合篩選出的兔子的脾細胞與小鼠SP2/0細胞進行融合；(4)初篩脾細胞融合后14 18天，篩選陽性克隆進行細胞培養(yǎng)；(5)復篩將孔板的上清進行ELISA復篩，復篩時，分別使用第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQID NO :1和非磷酸化的多肽SEQ ID NO 1包被反應板，將血清添加入反應板進行抗原抗體反應，與磷酸化的多肽反應陽性而非磷酸化的多肽反應陰性克隆繼續(xù)維護，得到上清中抗體與抗原反應的特異性的陽性克隆；(6)腹水制備在細胞株鑒定合格后，收集合格雜交瘤細胞稀釋后對鼠進行腹腔注射；5_7天后取腹水，取腹水后置4°C過夜，離心、取上清獲得單克隆抗體。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所 述的多克隆抗體的制備方法包括以下步驟(I)多肽合成合成磷酸化的多肽 第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 2 15mg，非磷酸化的多肽SEQID NO 2 Ilmg ；其中SEQ ID NO 2 的氨基酸序列為Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val_Thr-Ala-Leu-GlySer-Pro ;第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 2的氨基酸序列為Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro ；(2)動物免疫選用健康家兔2只，經(jīng)過5ml/只、5次免疫后，收集血清50_70ml/只；(3)免疫血清的鑒定利用10ug/ml抗原包被，ELISA的方法鑒定血清的效價及特異性。為了實現(xiàn)本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明還涉及該抗體在檢測0ct4蛋白343位蘇氨酸的磷酸化的應用。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為當0ct4蛋白343位蘇氨酸的磷酸化時，0ct4蛋白對下游基因Nanong、Sox2的正向調(diào)控能力下降，從而失去維持干細胞自我復制及多潛能分化的能力。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述的應用包括所述的抗體在檢測干細胞增殖、細胞分化、干細胞多潛能性、干細胞自我復制能力中的應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)0ct4蛋白的C末端的343位蘇氨酸殘基是一個新的磷酸化位點，此位點的磷酸化決定了 0ct4作為轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控，即343位蘇氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢鶗r，0ct4對下游基因Nanong、Sox2的正向調(diào)控能力下降，因而失去維持干細胞自我復制及多潛能分化的能力。本發(fā)明根據(jù)以上對0ct4新的磷酸化位點的研究成果，制備了針對此位點的多克隆及單克隆特異性磷酸化抗體，此抗體能夠特異識別0ct4的磷酸化狀態(tài)。


圖I為構(gòu)建質(zhì)粒的示意圖；圖2為截取掉T343位點后的質(zhì)粒在293細胞中表達的免疫沉降及免疫印跡圖譜；圖3為圖2結(jié)果的輝度掃描后計算數(shù)值的比較結(jié)果；圖4為T343位點突變?yōu)榉橇姿峄谋彼岬馁|(zhì)粒在293細胞中表達的免疫沉降及免疫印跡圖譜；圖5為圖4結(jié)果的輝度掃描后計算數(shù)值的比較結(jié)果；圖6為采用倒置顯微鏡10倍下病毒濃度感染胚胎干細胞系E14的照片，從左到右依次為對照組、0ct4組、T343A組堿性磷酸酶染色后的細胞集落數(shù)數(shù)量；圖7顯示的是在倒置顯微鏡的觀察病毒濃度感染胚胎干細胞系E14，在40倍下每個視野計數(shù)克隆的數(shù)目，統(tǒng)計得到的比較結(jié)果；
圖8為Sox2、Nanog在T343A_0ct4的感染的細胞中表達的免疫印跡法的圖譜，從左到右依次為對照組、0ct4組、T343A組堿性磷酸酶染色后的細胞集落數(shù)數(shù)量圖；圖9為通過測量熒光素酶的表達量、熒光強度計算并統(tǒng)計得到的比較結(jié)果，其中pBK-null組為空白對照，pBK-0ct4組為將0ct4的表達質(zhì)粒及Sox2啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞；T343A組為將T343A_0ct4的表達質(zhì)粒及Sox2啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞；圖10為通過測量熒光素酶的表達量、熒光強度的計算并統(tǒng)計得到的比較結(jié)果，其中pBK-null組為對照，pBK-0ct4組為將0ct4的表達質(zhì)粒及Nanog啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中；T343A組為將T343A_0ct4的表達質(zhì)粒及Nanog啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中；圖11為Sox2、Nanog的拯救實驗結(jié)果的明場照片,倒置顯微鏡放大40倍下胚胎干細胞E14堿性磷酸酶染色檢測細胞集落數(shù)，從左到右依次為對照組、突變?yōu)門343A組、轉(zhuǎn)入Sox2質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)入Nanog質(zhì)粒組；圖12為圖11中的細胞集落數(shù)采用克隆數(shù)計數(shù)的方法統(tǒng)計得到的柱狀圖；圖13為小鼠受精卵注射0ct4或T343A-0ct4轉(zhuǎn)錄的mRNA后的發(fā)育狀況圖；采用 倒置顯微鏡放大40倍后的照片，從左到右依次為對照組、注射0ct4組、注射T343A-0ct4組；圖14為采用實施例I制備的抗T343位蘇氨酸磷酸化的單克隆抗體對本實施例中得到的空白質(zhì)粒empty、野生型0ct4的pBK_wt組、pBK_M6A組、pBK_M6D組轉(zhuǎn)入293細胞中表達得到的蛋白進行雜交后得到的圖譜；圖15為采用Western Blot的方法檢測細胞裂解液中total-0ct4的表達量的圖
-i'TfeP曰。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的解釋和說明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。本發(fā)明所用的試劑均為市售。
具體實施例方式實施例I 0ct4磷酸化位點單克隆抗體的制備方法；I :多肽合成合成憐酸化的多妝！Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His50mg,非憐酸化的多妝 lAla-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His 20mg。2 :血清階段兔子經(jīng)過5次免疫后，取全血，析出血清，檢測血清的滴度。使用部分血清用western blot的方法檢測與抗原反應的特異性，篩選出特異性較強的免疫兔。3 :細胞融合篩選出的兔子的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按5 I的比例混合在一起，力口Λ 45% PEG溶液，37C水浴90s，加入培養(yǎng)液終止PEG作用，使用選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，只有融合成功的細胞可以存活。4 :初篩
脾細胞融合后14-18天，對融合細胞進行酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)進行初篩，使用非憐酸化的多妝 Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His 包被反應板，將血清添加入反應板進行抗原抗體反應，篩選出陽性克隆繼續(xù)維護，然后將ELISA陽性的克隆轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)。5 :復篩將24孔板的上清進行ELISA復篩，分別使用磷酸化的多肽Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Valp-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His 和非憐酸化的多妝 Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His包被反應板,將血清添加入反應板進行抗原抗體反應與磷酸化的多肽反應陽性而非磷酸化的多肽反應陰性克隆繼續(xù)維護，得到上清中抗體與抗原反應的特異性的陽性克??；用蛋白印跡方法(western blot)檢測這些陽性克隆的上清中抗體與抗原反應的特異性，具體方法分別將0ct4的磷酸化及非磷酸化表達質(zhì)粒導入293細胞中，使其產(chǎn)生0ct4的磷酸化及非磷酸化的蛋白，將這些細胞裂解液中的蛋白轉(zhuǎn)移到雜交膜上，用陽性克隆的上清進行抗原抗體免疫反應，進一步篩選出特定氨基酸位點磷酸化的特異性抗體。 6 :腹水制備在細胞株鑒定合格后，收集合格雜交瘤細胞加于PBS (PH值7. 4)或生理鹽水(無菌)中，200萬 500萬/只鼠進行腹腔注射。雜交瘤細胞注入小鼠腹腔后5-7天即可產(chǎn)生腹水。用無菌注射器抽取約2 5ml/只。隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次。取腹水后置4 過夜。離心500rpmX lOmin。取上清獲得單克隆抗體。實施例2 0ct4磷酸化位點多克隆抗體的制備方法I :多肽合成合成憐酸化的多妝Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser Pro-NH215mg,非憐酸化的多妝 Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-NH21Img。2 :動物免疫選用健康家兔2只，經(jīng)過5ml/只、5次免疫后，收集血清50_70ml/只。3 :免疫血清的鑒定應用酶聯(lián)免疫試驗,分別將10ug/ml抗原磷酸化的多肽Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-NH2 及非憐酸化的多妝 Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-NH2 包被反應板，將血清添加入反應板進行抗原抗體反應，篩選出與磷酸化的多肽反應陽性而非磷酸化的多肽反應陰性的動物血清；用蛋白印跡方法(western blot)檢測這些動物血清中抗體與抗原反應的特異性,具體方法為分別將0ct4的磷酸化及非磷酸化表達質(zhì)粒導入293細胞中，使其產(chǎn)生0ct4的磷酸化及非磷酸化的蛋白，將這些細胞裂解液中的蛋白轉(zhuǎn)移到雜交膜上，動物血清進行抗原抗體免疫反應，進一步確定特定氨基酸位點磷酸化的特異性抗體。實施例3 0ct4磷酸化位點的分析實驗首先使用NetPhos software 2. O (Blom et al. , 1999)分析 0ct4 蛋白的氨基酸殘基，分析的結(jié)果是C末端的T343是潛在的磷酸化位點。設(shè)計引物，用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法截掉T343位點，構(gòu)建N6蛋白表達質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒的示意圖如附圖I所示，將構(gòu)建得到的N6蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293細胞中使其表達，收集細胞裂解液，用0ct4抗體進行免疫沉降后轉(zhuǎn)移至雜交膜上，用抗磷酸化蘇氨酸的抗體進行雜交，同時設(shè)計對照組，對照組為全長的0ct4組，通過免疫沉降及免疫印跡實驗得到圖譜如附圖2所示，同時通過Odyssey infrared imaging system對條帶的粗細及輝度進行掃描，用掃描磷酸化0ct4條帶獲得的數(shù)值除以非磷酸化的0ct4的總蛋白的數(shù)值，計算得到其柱狀圖如附圖3所示，根據(jù)附圖3可看到，N6蛋白的磷酸化水平顯著降低。同樣的，利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法把T343位點的蘇氨酸突變?yōu)榉橇姿峄谋彼酺343A，同時設(shè)計對照組，對照組為正常野生0ct4。通過免疫沉降及免疫印跡實驗得到實驗結(jié)果如附圖4所示，同時通過Odyssey infrared imaging system對條帶的粗細及輝度進行掃描，用掃描磷酸化0ct4條帶獲得的數(shù)值除以 非磷酸化的0ct4的總蛋白的數(shù)值，計算得到其柱狀圖如附圖5所示，根據(jù)附圖5可看到，T343A蛋白的磷酸化水平也顯著降低，因此認為T343是0ct4蛋白的主要磷酸化位點。實施例4 0ct4在343位蘇氨酸的磷酸化通過對下游基因表達調(diào)控影響干細胞的自我復制及多潛能性實驗為了探討0ct4的磷酸化的在自我更新和全能性的胚胎干細胞的生理功能，將非磷酸化狀態(tài)的0ct4突變體T343A-0ct4(T343A)包裝為腺病毒，用105pfu/1000cells的病毒濃度感染胚胎干細胞系E14，以觀察T343A-0ct4對胚胎干細胞的多潛能性及自我復制能力的影響，如圖6和7所示，病毒感染后72小時，進行堿性磷酸酶染色實驗，觀察堿性磷酸酶陽性的E14細胞的克隆數(shù)，以評價胚胎干細胞的自我復制能力及多潛能性。突變組堿性磷酸酶染色檢測細胞集落數(shù)數(shù)量明顯減少與對照組(模擬組和正常0ct4組)，說明T343位蘇氨酸的磷酸化對胚胎干細胞的多潛能性及自我復制能力的維持非常重要。其中，采用倒置顯微鏡放大10倍后獲得圖6所示的照片，從左到右依次為對照組、0ct4組、T343A組堿性磷酸酶染色后的細胞集落數(shù)數(shù)量圖，圖7顯示的是在倒置顯微鏡的觀察病毒濃度感染胚胎干細胞系E14，放大40倍后每個視野計數(shù)克隆的數(shù)目，統(tǒng)計比較結(jié)果。當非磷酸化狀態(tài)的0ct4突變體T343A_0ct4(T343A)的腺病毒感染胚胎干細胞后，收集細胞裂解液，用免疫印跡方法(western blot)測量下游基因Sox2、Nanog的表達,如附圖8所示,這兩個維持胚胎干細胞的多能性的分子Sox2、Nanog在T343A_0ct4的感染的細胞中表達減少，其中a -Tubulin作為對照表明免疫印跡實驗電泳中各泳道的蛋白上樣量相等。附圖8為為Sox2、Nanog在T343A_0ct4的感染的細胞中表達的免疫印跡法的圖譜，從左到右依次為對照組、0ct4組、T343A組堿性磷酸酶染色后的細胞集落數(shù)數(shù)量圖；同時用熒光素酶報告系統(tǒng)分析T343A_0ct4對Nanog和Sox2的啟動子活性的影響。將T343A-0ct4的表達質(zhì)粒及Nanog或Sox2的啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中，通過測量熒光素酶的表達量檢測0ct4的T343位的突變體對下游基因的調(diào)控作用的變化，結(jié)果顯示T343A-0ct4使得Nanog和Sox2的啟動子的活性明顯降低，如附圖9、10所示其中在圖9所示的實驗結(jié)果中分為3組，其中，pBK-null組為空白對照，pBK-0ct4組為將0ct4的表達質(zhì)粒及Sox2啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中；T343A組為將T343A-0ct4的表達質(zhì)粒及Sox2啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中；通過用突光素酶檢測試劑盒(Luciferase assay kit),使用Multimode MicroplateReader儀器測量熒光素酶的表達量，通過熒光強度的計算可知，轉(zhuǎn)入0ct4的T343位的突變體的熒光素酶的表達量較正常組顯著下降，表明0ct4的非磷酸化狀態(tài)影響了對下游基因Sox2的表達水平；其中在圖10所示的實驗結(jié)果中分為3組，其中，pBK-null組為對照，pBK_0ct4組為將0ct4的表達質(zhì)粒及Nanog啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中；T343A組為將T343A-0ct4的表達質(zhì)粒及Nanog啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入293細胞中；通過用突光素酶檢測試劑盒(Luciferase assay kit),使用 Multimode Microplate Reader 儀器測量熒光素酶的表達量，通過熒光強度的計算可知，轉(zhuǎn)入0ct4的T343位的突變體的熒光素酶的表達量較正常組顯著下降，表明0ct4的非磷酸化狀態(tài)影響了對下游基因Nanog的表達水平；因此，0ct4的T343位點的磷酸化是0ct4調(diào)控下游基因Sox2及Nanog所必須的。 同時，我們還進行了利用胚胎干細胞堿性磷酸酶染色檢測細胞集落數(shù)的拯救實驗，在單獨導入突變的T343A-0ct4時，胚胎干細胞的堿性磷酸酶陽性克隆數(shù)降低，如圖11中的T343A組所示，在T343A-0ct4病毒感染的胚胎干細胞基礎(chǔ)上分別導入Sox2或Nanog后，如圖11中的T343A+Sox2組、T343A+Nanog組所示，細胞的克隆數(shù)有較大程度的恢復，因此，T343A-0ct4對胚胎干細胞的自我更新和全能性的影響是通過調(diào)節(jié)Sox2及Nanog的表達來實現(xiàn)，如附圖11和附12所示。其中圖11為Sox2、Nanog的拯救實驗結(jié)果。觀察胚胎干細胞E14堿性磷酸酶染色檢測細胞集落數(shù)，當0ct4突變?yōu)門343A后，觀察胚胎干細胞E14的克隆形成能力有顯著下降，當轉(zhuǎn)入Sox2或Nanog的質(zhì)粒使其表達后,E14細胞受損克隆形成能力得到恢復,本圖是拯救實驗的明場照片，采用倒置顯微鏡放大40倍后拍照；圖12為拯救實驗結(jié)果采用克隆數(shù)計數(shù)的方法統(tǒng)計得到的柱狀圖，其中T343A+Sox2組、T343A+Nanog組與單獨導入T343A_0ct4組相比，差異顯著。實施例5 0ct4在343位蘇氨酸突變后對早期胚胎發(fā)育的影響為了研究0ct4的磷酸化在胚胎胚胎發(fā)育中的作用，在體外將0ct4或T343A_0ct4轉(zhuǎn)錄為mRNA，用微量注射的方法注入小鼠受精卵。將小鼠受精卵分為三組對照組、0ct4組(注射0ct4的mRNA)、T343A_0ct4組(注射T343A_0ct4的mRNA)，觀察胚胎發(fā)育；在24小時至92小時的時間段衡量胚胎發(fā)育，如圖13和表I所示，在24小時的2細胞階段0ct4及T343A-0ct4的注入沒有差異。經(jīng)過46小時，與對照組及正常0ct4組比較，注入T343A-0ct4 mRNA的組的胚胎發(fā)育遲緩，只有67. 6%的胚胎發(fā)育到6_8細胞期。在68小時，只有35. 3%的T343A-0ct4組胚胎發(fā)育為桑葚胚。在92小時，只有26. 5%的T343A-0ct4組胚胎發(fā)育為囊胚。圖13為小鼠受精卵注射0ct4或T343A_0ct4轉(zhuǎn)錄的mRNA后的發(fā)育狀況圖；采用倒置顯微鏡放大40倍后的照片。表I :T343A對于小鼠早期發(fā)育的效果比較表
權(quán)利要求
1.一種抗磷酸化0ct4蛋白的抗體,其特征在于,所述的抗體是針對0ct4蛋白343位氨基酸磷酸化的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗磷酸化0ct4蛋白的抗體，其特征在于，所述的抗體的為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗磷酸化0ct4蛋白的抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的制備方法包括以下步驟 (1)合成多肽 合成磷酸化的多肽第8位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO : I 50mg, 非磷酸化的多肽SEQ ID NO: I 20mg ； (2)血清階段 兔子經(jīng)過5次免疫后，取全血，析出血清，檢測血清的滴度，篩選出特異性較強的免疫兔； (3)細胞融合 篩選出的兔子的脾細胞與小鼠SP2/0細胞進行融合； (4)初篩 脾細胞融合后14 18天，篩選陽性克隆進行細胞培養(yǎng)； (5)復篩 將孔板的上清進行酶聯(lián)免疫試驗復篩，復篩時，分別使用第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQ IDNO :I和非磷酸化的多肽SEQ ID NO : I包被反應板，將血清添加入反應板進行抗原抗體反應，篩選出與磷酸化的多肽反應陽性而非磷酸化的多肽反應陰性克隆繼續(xù)維護，得到上清中抗體與抗原反應的特異性的陽性克??； (6)腹水制備 在細胞株鑒定合格后，收集合格雜交瘤細胞稀釋后對鼠進行腹腔注射；5_7天后取腹水，取腹水后置4°C過夜，離心、取上清獲得單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗磷酸化0ct4蛋白的抗體，其特征在于，所述的抗體的為多克隆抗體的制備方法為包括以下步驟 (1)多肽合成 合成磷酸化的多肽第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 2 15mg，非磷酸化的多肽SEQID NO 2 Ilmg ； (2)動物免疫 選用健康家兔2只，經(jīng)過5ml/只、5次免疫后，收集血清50 70ml/只； (3)免疫血清的鑒定 利用10ug/ml抗原包被，ELISA的方法鑒定血清的效價及特異性。
5.權(quán)利要求I所述的抗體用于檢測0ct4蛋白343位蘇氨酸的磷酸化的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，當0ct4蛋白343位蘇氨酸的磷酸化時，0ct4蛋白對下游基因Nanong、SoX2的正向調(diào)控能力下降，從而失去維持干細胞自我復制及多潛能分化的能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述的應用包括所述的抗體在檢測干細胞增殖、細胞分化、干細胞多潛能性、干細胞自我復制能力中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Oct蛋白的磷酸化位點及抗磷酸化Oct4蛋白的抗體，具體講，涉及Oct4蛋白343位磷酸化及一種針對Oct4蛋白343位磷酸化的抗體。所述的抗體的為單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明還涉及抗體用于檢測Oct4蛋白343位蘇氨酸的磷酸化的應用。當Oct4蛋白343位蘇氨酸的磷酸化時，Oct4蛋白對下游基因Nanong、Sox2的正向調(diào)控能力下降，從而失去維持干細胞自我復制及多潛能分化的能力。所述的應用包括所述的抗體在檢測干細胞增殖、細胞分化、干細胞多潛能性、干細胞自我復制能力中的應用。
文檔編號C07K16/18GK102731653SQ20111008527
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者文錦華, 李凌松 申請人:文錦華, 李凌松