專(zhuān)利名稱(chēng)：類(lèi)人彈性蛋白及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種類(lèi)人彈性蛋白及使用基因工程技術(shù)生產(chǎn)類(lèi)人彈性蛋白的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人彈性蛋白是一種水溶性較低、無(wú)定形、疏水性強(qiáng)且廣泛交聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白， 其在皮膚、肺臟、韌帶和血管等組織中含量較高，并在維持組織彈性中發(fā)揮著重要作用。人彈性蛋白基因是定位于第7號(hào)染色體的單拷貝基因，其外顯子交替編碼疏水重復(fù)序列和含有賴(lài)氨酸的蛋白序列。人彈性蛋白原全長(zhǎng)有760個(gè)氨基酸殘基，分子量約為70kDa。彈性蛋白原的翻譯后修飾包括信號(hào)肽切除和部分脯氨酸殘基的羥化。盡管彈性蛋白疏水性極強(qiáng)， 然而其可被高度水化，而且僅在水分子存在的條件下，彈性蛋白才具有彈性。在大多數(shù)組織，彈性蛋白的合成開(kāi)始于妊娠中期，在出生時(shí)和新生兒期達(dá)到峰值， 此后其表達(dá)水平迅速降低，成年后幾乎完全消失。彈性蛋白的表達(dá)調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平。例如，TNF-α和bFGF下調(diào)彈性蛋白基因表達(dá)，而糖皮質(zhì)激素、IL-1、IL-10 和IGF-I等則促進(jìn)其表達(dá)。TGF-β 1則通過(guò)提高彈性蛋白mRNA穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)彈性蛋白的沉積。彈性蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在多種剪接變異體，從而翻譯產(chǎn)生多種彈性蛋白原。然而每一種剪接變異體均由編碼高度疏水和高度親水多肽的外顯子交替排列。彈性蛋白的疏水區(qū)含有大量的脂肪族氨基酸重復(fù)序列，該獨(dú)特序列的基本結(jié)構(gòu)為GX、PX、GGX和PGX，其中X為 G、A、V、L和I中的任意一種。富含賴(lài)氨酸的區(qū)域是彈性蛋白中主要的交聯(lián)功能域。在正常生理?xiàng)l件下，彈性蛋白幾乎不被降解。然而，在某些病理?xiàng)l件下，彈性蛋白可被降解產(chǎn)生大量的彈性蛋白肽，該降解過(guò)程主要由MMP-2、MMP-9、MMP-7和MMP-12完成。 此外，在炎癥條件下，白細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶可使彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)完全崩解。彈性蛋白肽并非簡(jiǎn)單的彈性蛋白降解產(chǎn)物，其能通過(guò)受體依賴(lài)方式作用于組織細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，產(chǎn)生重要的生物學(xué)效應(yīng)。knior等發(fā)現(xiàn)彈性蛋白原和彈性蛋白降解片段可對(duì)人白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生特異性趨化效應(yīng)，由此提出細(xì)胞表面存在彈性蛋白肽膜受體。此后，Wrenn等發(fā)現(xiàn)125I標(biāo)記的彈性蛋白原能夠以受體介導(dǎo)方式與動(dòng)脈韌帶成纖維細(xì)胞結(jié)合?，F(xiàn)已表明，彈性蛋白受體存在于多種細(xì)胞表面，其由3個(gè)亞基組成，其中分子量為67kDa的亞基(elastin binding protein，EBP)介導(dǎo)與彈性蛋白結(jié)合。EBP不僅與VGVAPG序列高親和性結(jié)合，而且其具有半乳糖凝集素特性，可與半乳糖和乳糖結(jié)合，此后證實(shí)EBP是β半乳糖苷酶的一種剪接變異體。除了 VGVAPG等彈性蛋白肽以外，EBP尚可通過(guò)識(shí)別Bl層粘連蛋白中的LGTIPG序列而與之結(jié)合。彈性蛋白及彈性蛋白肽的主要生物學(xué)效應(yīng)是趨化細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞增殖。首先，彈性蛋白和彈性蛋白肽可以通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP和鈣離子水平趨化單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。其次，彈性蛋白和彈性蛋白肽可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖，其機(jī)制涉及開(kāi)放L型鈣離子通道、激活百日咳毒素敏感的G蛋白，同時(shí)c-Src、Ras/Raf/MEK/ ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PDGF受體也參與細(xì)胞增殖過(guò)程。由此可見(jiàn)，彈性蛋白肽在創(chuàng)面愈合過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，隨著對(duì)彈性蛋白研究逐漸深入，使用彈性蛋白中具有生物學(xué)活性的部分功能模塊制備組織工程支架和靶向給藥系統(tǒng)的報(bào)道日益增多。這些研究多使用由VPGXG串聯(lián)重復(fù)序列(其中X為V、A或G等非P氨基酸)構(gòu)成的重組蛋白分子，即彈性蛋白樣蛋白 (elastin-like protein, ELP)，結(jié)果表明ELP具有非常好的生物相容性、極低的免疫原性、 良好的藥代動(dòng)力學(xué)。此外，ELP可以作為融合標(biāo)簽，使得原核表達(dá)的重組蛋白純化過(guò)程變得非常簡(jiǎn)單。1) 生物相容性ELP沒(méi)有細(xì)胞毒性和急性系統(tǒng)毒性，沒(méi)有皮膚刺激性和系統(tǒng)免疫原性。此外，ELP不會(huì)改變出凝血時(shí)間也不會(huì)誘導(dǎo)紅細(xì)胞裂解。ELP具有生物降解特性， 由其制備的支架材料移植至體內(nèi)2周后即被全部降解。2) 低免疫原性ELP免疫原性極低，僅在與福氏完全佐劑存在時(shí)皮下注射ELP才可誘導(dǎo)產(chǎn)生微量的抗體反應(yīng)。Cappello等對(duì)由蠶絲肽與ELP融合構(gòu)成的 [(GVGVP) 8 (GAGAGS) 2] 18的免疫原性進(jìn)行了細(xì)致研究。在不使用佐劑時(shí)，皮下注射IOmg蛋白并分別于6周和8周時(shí)進(jìn)行增強(qiáng)免疫，第9周時(shí)使用ELISA法檢測(cè)抗(VPGVG) 8抗體發(fā)現(xiàn)抗體滴度均小于2，表明沒(méi)有誘導(dǎo)出針對(duì)ELP的抗體。然而，在福氏完全佐劑的存在下，分別于第0、2、3、5和7周時(shí)皮下注射IOmg蛋白可誘導(dǎo)抗ELP抗體產(chǎn)生，其滴度為480。3)藥代動(dòng)力學(xué)作為融合蛋白載體，ELP具有非常好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，其在裸鼠的循環(huán)半衰期為8 12小時(shí)。在設(shè)計(jì)大分子藥物載體時(shí)，載體分子量超過(guò)腎臟過(guò)濾截留值有益于提高循環(huán)半衰期。使用mC標(biāo)記分子量為59kDa的ELP進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，靜脈注射后， ELP表現(xiàn)為兩相藥代動(dòng)力學(xué)，其分布半衰期為7. 3min，代謝半衰期為8. 4h，初始分布容積為 1. 4mL，血漿清除率為0. 32mL/h。4)易于純化ELP具有溫度依賴(lài)的聚集性，即當(dāng)溫度大于臨界值(Tt)時(shí)，ELP出現(xiàn)聚集，而在溫度低于Tt值時(shí)，ELP重新溶解，其中Tt值與ELP疏水性、ELP鏈長(zhǎng)和溶液中鹽離子強(qiáng)度密切相關(guān)。根據(jù)該特性，在純化特定組成的ELP融合蛋白時(shí)，僅需調(diào)整溫度和鹽離子濃度使得融合蛋白凝聚-溶解即可實(shí)現(xiàn)對(duì)ELP融合蛋白的純化。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用該方法進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的凝聚-溶解過(guò)程即可使融合蛋白純度達(dá)到95%以上。盡管彈性蛋白在醫(yī)學(xué)、美容、化妝品和保健品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景，但是動(dòng)物體內(nèi)彈性蛋白因發(fā)生交聯(lián)，水溶性很差，難于再加工。因此，目前國(guó)外通常使用基因工程方法表達(dá)VPGXG串聯(lián)重復(fù)序列以獲取ELP，然而其表達(dá)量均較低，尚未形成商業(yè)化產(chǎn)品，尤其是針對(duì)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖的、由VAPGVG單元構(gòu)成的類(lèi)人彈性蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于公開(kāi)一種含有一個(gè)或多個(gè)VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元的類(lèi)人彈性蛋白，其結(jié)構(gòu)和功能均優(yōu)于動(dòng)物體內(nèi)彈性蛋白。本發(fā)明的目的還在于公開(kāi)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列，并提供一種含有該序列的DNA或含有該DNA的載體或質(zhì)粒。類(lèi)人彈性蛋白基本單元的氨基酸序列見(jiàn)序列表中的SEQ ID NO. :1 (下文簡(jiǎn)稱(chēng)“序
4列 1”)。類(lèi)人彈性蛋白基本單元的cDNA核苷酸序列見(jiàn)序列表中的SEQ ID NO. :2 (下文簡(jiǎn)稱(chēng)“序列2”)。類(lèi)人彈性蛋白(VAPGVGVAPGVGVAPGVGS ^2的氨基酸序列見(jiàn)序列表中的SEQ ID NO. :3 (下文簡(jiǎn)稱(chēng)“序列3”)。本申請(qǐng)文本中所用術(shù)語(yǔ)“類(lèi)人彈性蛋白”是指一種含有一個(gè)或多個(gè)序列1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在本申請(qǐng)文本所用的氨基酸三字母或單字母表達(dá)方式，采用IUPAC規(guī)定的氨基酸代碼(Eur J Biochem. 1984;138:9-37)。本發(fā)明公開(kāi)的類(lèi)人彈性蛋白含有一個(gè)或多個(gè)VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元。本發(fā)明公開(kāi)的類(lèi)人彈性蛋白能夠以非融合蛋白、融合蛋白、前體蛋白、蛋白原和前體蛋白原等形式存在。本發(fā)明公開(kāi)的類(lèi)人彈性蛋白的融合蛋白形式中，與之融合的多肽序列可位于類(lèi)人彈性蛋白的氨基末端、序列中段和羧基末端。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于公開(kāi)本發(fā)明類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案將一個(gè)或多個(gè)編碼 VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元的基因序列克隆至原核表達(dá)載體后構(gòu)建工程菌，工程菌發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)，收獲菌體，經(jīng)裂解菌體、親和層析和脫鹽等步驟獲得重組類(lèi)人彈性蛋白。具體而言，首先根據(jù)人彈性蛋白的特有序列VAPGVG設(shè)計(jì)類(lèi)人彈性蛋白基本單元， 并根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子將其反翻譯成核苷酸序列。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)兩條引物，使這兩條引物退火后分別在上游和下游形成BglII和BioI粘端，進(jìn)而克隆至pSP73的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間。然后，利用BamHI和BglII酶切可產(chǎn)生相同粘端，構(gòu)建pSP73-ELPn(n為自然數(shù))。將 ELPn以BglII和XhoI雙酶切后亞克隆至pET28a或pTAT后獲得原核表達(dá)載體pET28a_ELPn 和pTAT-ELPn，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得能夠表達(dá)類(lèi)人彈性蛋白的工程菌。將工程菌在含有明膠或明膠水解物的發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收獲菌體，經(jīng)均質(zhì)或超聲裂解菌體后使用親和層析、脫鹽等方法精制獲得高純度重組類(lèi)人彈性蛋白。


圖1顯示類(lèi)人彈性蛋白基本單元示意圖，大寫(xiě)字母為引物ELPA和ELPB形成的、編碼VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元的基因序列，小寫(xiě)字母為載體經(jīng)BamHI和BioI酶切后形成的粘端。圖2顯示pTAT示意圖，使用圖中NcoI和BioI之間序列替換pET28a中相應(yīng)酶切位點(diǎn)之中的序列即為原核表達(dá)載體PTAT。圖3顯示pSP73-ELPn構(gòu)建示意圖。將引物退火形成的編碼VAPGVGVAPGVGVAPGVGS 基本單元的基因序列克隆至PSP73的BglII和XhoI之間獲得pSP73-ELPl。利用BamHI 和BglII酶切可產(chǎn)生相同粘端，重復(fù)將基本單元編碼序列克隆至BamHI和B10I之間，獲得 pSP73-ELPn0圖4顯示使用T7 promoter引物對(duì)pSP73_ELP32進(jìn)行DNA測(cè)序的結(jié)果。圖5顯示使用T7 promoter引物對(duì)pET28a_ELP32進(jìn)行正向DNA測(cè)序的結(jié)果。圖6顯示使用T7 terminator引物pET28a_ELP32進(jìn)行反向DNA測(cè)序的結(jié)果。
圖7顯示使用T7 promoter引物對(duì)pTAT_ELP32進(jìn)行正向DNA測(cè)序的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明不受下述具體文字描述的限制。 本發(fā)明可在權(quán)利要求所概括的范圍內(nèi)做各種改變，這些改變均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)或制造商建議的條件進(jìn)行。本發(fā)明中所述載體、宿主菌等可由商業(yè)途徑得到，如pSP73購(gòu)自Promega公司， pET28a和pET32a購(gòu)自Novagen公司，ER2566購(gòu)自NEB公司。pTAT結(jié)構(gòu)如圖2所示。實(shí)施例1.構(gòu)建表達(dá)類(lèi)人彈性蛋白的工程菌
化學(xué)合成引物 ELPA (SEQ ID NO. :4)和 ELPB (SEQ ID NO. 5)，并溶解于 10mmol/L Tris-HCl緩沖液(ρΗ8. 0)，將二者等摩爾混和后進(jìn)行退火反應(yīng)，條件為99°C水浴lOmin， 72°C水浴30min，37°C水浴lOmin，將退火產(chǎn)物保存于_20°C備用。將退火產(chǎn)物克隆至pSP73 的BglII和XhoI之間，獲得pSP73-ELPl。利用BglII和BamHI酶切可以產(chǎn)生相同的粘端，而且兩個(gè)酶切產(chǎn)生的粘端連接后即不能被BglII切開(kāi)也不能被BamHI切開(kāi)(如圖1所示)，將退火產(chǎn)物克隆至PSP73-ELP1的BamHI和XhoI之間，獲得pSP73_ELP2。使用BglII 和XhoI將ELP2從pSP73-ELP2切下，電泳并回收后克隆至pSP73_ELP2的BamHI和XhoI 之間，獲得PSP73-ELP4。使用BglII和XhoI將ELP4從pSP73_ELP4切下，電泳并回收后克隆至pSP73-ELP4的BamHI和BioI之間，獲得pSP73_ELP8。重復(fù)使用上述步驟，獲得 PSP73-ELP32。使用BglII和XhoI將ELP32從pSP73_ELP32切下，電泳并回收后克隆至原核表達(dá)載體pET32a和pTAT的BamHI和XhoI之間，分別獲得pET32a_ELP32和pTAT_ELP32。 使用NcoI和BioI將ELP32從pET3h-ELP32切下，電泳并回收后克隆至原核表達(dá)載體 pET28a 的 NcoI 和 XhoI 之間，分別獲得 pET28a_ELP32。將 pSP73_ELP32、pET28a_ELP32 和 PTAT-ELP32進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果如圖4、5、6和7所示。采用上述方法(如圖3所示)，可以構(gòu)建pET28a-ELPn和pTAT-ELPn (η為自然數(shù))。使用pET28a_ELP32轉(zhuǎn)化ER2566感受態(tài)細(xì)胞，獲得可以非融合表達(dá)類(lèi)人彈性蛋白ELP32的工程菌；使用pTAT-ELP32轉(zhuǎn)化ER2566感受態(tài)細(xì)胞，獲得可以融合表達(dá)類(lèi)人彈性蛋白ELP32的工程菌。類(lèi)人彈性蛋白ELP32含有32個(gè) VAPGVGVAPGVGVAPGVGS 基本單元，理論分子量 48. 9kDa。實(shí)施例2.工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)
種子培養(yǎng)將攜帶PTAT-ELP32質(zhì)粒的ER2566工程菌劃線接種于含30 μ g/mL卡納霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，37°C、飽和濕度條件下培養(yǎng)16h，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單個(gè)菌落，接種于500mL含30 μ g/mL卡納霉素和5. Og/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。發(fā)酵培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C，pH6. 8 7. 0，溶氧30%，空氣流量為1 4VVM，攪拌轉(zhuǎn)速30(Tl000rpm，接種量5%。流加策略控制葡萄糖濃度為1. 0%，溶氧30%，pH6. 8 7. O。誘導(dǎo)方法當(dāng)菌液OD值達(dá)到50. O時(shí)，加入IPTG至終濃度0. 5mM誘導(dǎo)表達(dá)Mi后離心收獲菌體。發(fā)酵培養(yǎng)液成份為胰蛋白胨1.0 10.0g/L，酵母提取物10.0 50. Og/L， 葡萄糖 10. O 50. Og/L, NaCl 1. 0 10· Og/L, K2HPO4 5. 0 15· Og/L, NaH2PO4 2. 5 6· Og/ L，(NH4)2SO4 3. 6^8. 8g/L，明膠(明膠水解物)1. O 50. Og/L, MgSO4. 7H20 1. 5^5. Og/L,
6EDTA 0. 5 2. Og/L, FeCl3. 6H20 50. 0 200· Omg/L, MnSO4. 4H20 10. 0 30· Omg/L, ZnSO4 5. (TlO. Omg/L, H3BO3 1. 0 5· Omg/L, Na2MoO4. 2H20 1. 0 5· Omg/L, CoCl2. 6H20 1. 0 5. Omg/L, CuCl2. 2H20 1. 0 5. Omg/L。發(fā)酵培養(yǎng)液的最佳方案為胰蛋白胨1. Og/L，酵母提取物20. Og/L，葡萄糖30. Og/ L, NaCl 2. Og/L, K2HPO4 8. 7g/L, NaH2PO4 4. 2g/L, (NH4)2SO4 5. 6g/L，明膠(明膠水解物) 10. Og/L, MgSO4. 7H20 2. 5g/L, EDTA 1. Og/L, FeCl3. 6H20 100. Omg/L, MnSO4. 4H20 20. Omg/ L, ZnSO4 8. Omg/L, H3BO3 2. 5mg/L, Na2MoO4. 2H20 2. 5mg/L, CoCl2. 6H20 2. 5mg/L, CuCl2. 2H20 2. 5mg/L。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液lmL，8000g離心lOmin，棄上清，收獲菌體。每管加入500 μ L 雙蒸水重懸菌體，加入2 X SDS Loading Buffer, 100°C水浴lOmin, 12000g離心15min后取上清進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，使用考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，并對(duì)凝膠進(jìn)行薄層掃描分析， 可見(jiàn)約60kDa處有新生條帶，約占菌體總蛋白的42. 5%。實(shí)施例3.重組類(lèi)人彈性蛋白的純化
將發(fā)酵后收獲的菌體以1:5 (W/V)比例重懸于TE緩沖液(pH8.0，50mmol/L Tris-HCl, IOmM EDTA)中，超聲或均質(zhì)破碎菌體，4°C條件下以5000g離心30min，收獲上清，經(jīng)親和層析、脫鹽后精制分裝保存?zhèn)溆?。本發(fā)明利用人彈性蛋白特有VAPGVG序列設(shè)計(jì)并制備了具有促進(jìn)細(xì)胞增殖能力的重組類(lèi)人彈性蛋白，并通過(guò)適量添加絲氨酸增加了其水溶性，使得重組類(lèi)人彈性蛋白同時(shí)具有低免疫原性、高水溶性、高穩(wěn)定性、促細(xì)胞增殖活性，在制備皮膚創(chuàng)面敷料、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體、功能性化妝品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種類(lèi)人彈性蛋白，其特征在于其氨基酸序列中含有VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本單元。
2.—種核酸分子，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述蛋白氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。
3.一種基因載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述核酸分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于包括類(lèi)人彈性蛋白的工程菌的構(gòu)建，工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)，類(lèi)人彈性蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和類(lèi)人彈性蛋白的純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于所述類(lèi)人彈性蛋白的工程菌的構(gòu)建如下使用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子反翻譯人彈性蛋白中的特定氨基酸序列并制備串聯(lián)重復(fù)序列，然后亞克隆至原核表達(dá)載體中獲得類(lèi)人彈性蛋白原核表達(dá)載體；將類(lèi)人彈性蛋白原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌獲得工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨1. 0 10. Og/L，酵母提取物10. 0 50. Og/L，葡萄糖10. 0 50. Og/ L, NaCl 1. 0 10· Og/L, K2HPO4 5. 0 15· Og/L, NaH2PO4 2. 5 6. Og/L, (NH4)2SO4 3. 6 8. 8g/L,明膠(明膠水解物)1. 0 30. 0g/L, MgSO4. 7H20 1. 5 5. 0g/L, EDTA 0. 5 2. 0g/L, FeCl3. 6H20 50. 0 200· 0mg/L, MnSO4. 4Η20 10. 0 30· 0mg/L, ZnSO4 5. 0 10· 0mg/L, H3BO3 1. 0 5· 0mg/L, Na2MoO4. 2Η20 1. 0 5· 0mg/L, CoCl2. 6Η20 1. 0 5· 0mg/L, CuCl2. 2Η20 1. 0 5· 0mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C，pH 6. 8^7. 0，溶氧15 30%，空氣流量為1 4VVM，攪拌轉(zhuǎn)速 30(Tl000rpm，接種量5%，種子培養(yǎng)基為含30mg/L卡那霉素和5. 0g/L葡萄糖的LB。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于所述類(lèi)人彈性蛋白的純化如下離心收集工程菌，裂解菌體，然后用緩沖液抽提，經(jīng)親和層析、精制和除熱源后獲得重組類(lèi)人彈性蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種類(lèi)人彈性蛋白及使用基因工程菌生產(chǎn)類(lèi)人彈性蛋白的方法，其中類(lèi)人彈性蛋白的生產(chǎn)方法包括構(gòu)建能夠表達(dá)類(lèi)人彈性蛋白的工程菌、發(fā)酵培養(yǎng)工程菌、誘導(dǎo)表達(dá)和純化類(lèi)人彈性蛋白。該方法獲得的工程菌可高效可溶表達(dá)重組類(lèi)人彈性蛋白，同時(shí)，重組類(lèi)人彈性蛋白具有分子量高和免疫原性低等特點(diǎn)，其不僅能夠作為藥物載體、皮膚敷料和化妝品的添加劑，而且能夠用于制備組織工程支架材料。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102241747SQ20111016256
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者李立文 申請(qǐng)人:李立文