專利名稱：雜交瘤細(xì)胞株和抗體與免疫吸附劑和免疫親和柱與試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株、由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及其應(yīng)用，由該抗體制得的免疫吸附劑，以及裝有該免疫吸附劑的免疫親和柱和試劑盒，及其它們在純化黃曲霉毒素B1、B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL,β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON 中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物，是一組以二吠喃香豆素為基本結(jié)構(gòu)的化合物。目前已分離鑒定出12種，尤其是黃曲霉毒素B1,B2,GijG2^M1和M2為強污染物質(zhì)，廣泛存在于糧食谷物和飼料及其加工品中，在目前已知的兩百多種真菌毒素中毒性最強、污染頻率最高。黃曲霉毒素具有誘導(dǎo)突變、抑制免疫和致癌的作用。黃曲霉毒素作用的靶器官主要是肝臟，被公認(rèn)為致肝癌物質(zhì)，即使食用含有低水平的黃曲霉毒素食物，長期食用的人其肝臟也將受到損害。國際癌癥中心將其定為一類致癌劑。雜色曲霉素是由雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等產(chǎn)生的一種具有致癌性的真菌毒素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于黃曲霉毒素前體物質(zhì)，可與DNA形成加合物。雜色曲霉素產(chǎn)生菌及雜色曲霉素在世界各地糧食及飼料中的污染很常見。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，我國各地糧食中雜色曲霉素的污染非常普遍，其中以小麥最明顯，污染率最高可達(dá)100%。雜色曲霉素可能與胃癌、肝痛的發(fā)生密切相關(guān)。

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，它首先從有赤霉病的玉米中分離得到。玉米赤霉烯酮的產(chǎn)毒菌主要是鐮刀菌屬的菌株，如禾谷鐮刀菌和三線鐮刀菌。玉米赤霉烯酮及其同類物主要污染玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物，其中，玉米的陽性檢出率為45%，最高含毒量可達(dá)到2909mg/kg ;小麥的檢出率為20%，含毒量為0.364-11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮及其同類物的耐熱性較強，110°C下處理Ih才被完全破壞。玉米赤霉烯酮及其同類物具有雌激素作用，主要作用于生殖系統(tǒng)，可使家畜、家禽和實驗小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥。妊娠期的動物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮及其同類物的食物可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎。食用含赤霉病麥面粉制作的各種面食也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀，如惡心、發(fā)冷、頭痛、神智抑郁和共濟失調(diào)等。目前，黃曲霉毒素、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物的檢測方法主要有薄層層析法，酶聯(lián)免疫法(ELISA)，免疫親和層析-液相色譜法，免疫親和層析-熒光光度法等。其中，薄層層析法要接觸大量的標(biāo)準(zhǔn)品，不利于實驗者的健康，而且靈敏度很低。酶聯(lián)免疫法，只適用于定性檢測，很容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的現(xiàn)象。而免疫親和層析-液相色譜法可以定量地檢測許多樣品中的黃曲霉毒素的含量。由于該方法靈敏特異，而且不使用有毒的溶劑如氯仿和二氯甲烷等，應(yīng)用越來越廣泛。免疫親和層析方法的關(guān)鍵在于選擇一種高效特異的抗體，但是，利用現(xiàn)有技術(shù)中的液液提取、固相萃取、加熱蒸發(fā)濃縮等方法的添加回收率均較低，對后續(xù)的檢測步驟造成很強的基質(zhì)效應(yīng)，并且現(xiàn)有技術(shù)中沒有能夠同時純化待處理基質(zhì)中6種黃曲霉毒素(BpB2、GpGyM1和M2)和雜色曲霉素的免疫吸附介質(zhì)，也沒有能夠同時純化待處理基質(zhì)中6種玉米赤霉烯酮同類物(a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和ΖΟΝ)的免疫吸附介質(zhì)，更沒有能夠同時純化待處理基質(zhì)中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素以及6種玉米赤霉烯酮同類物的免疫吸附介質(zhì)，而能夠同時純化分析多種病毒素顯然能夠提高檢測的效率。因此，當(dāng)務(wù)之急，是要制備出性能穩(wěn)定、特異的免疫吸附劑，并建立一種經(jīng)濟、快捷、精確、安全，并且能同時純化6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素以及6種玉米赤霉烯酮同類物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雜交瘤細(xì)胞株、由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及其在純化和檢測玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和ZON中至少一種中的應(yīng)用，由該抗體制得的免疫吸附劑，以及裝有該免疫吸附劑的免疫親和柱(IAC)和試劑盒，及其它們在純化以及檢測黃曲霉毒素BpB2ApG2JpM2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N中至少一種中的應(yīng)用，以及具體提供一種純化黃曲霉毒素G2、MpM2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β -ZER、β -Z0L、ZAN、Z0N的方法和一種檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON的方法。本發(fā)明的第一方面是提供一種雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5504。該雜交瘤細(xì)胞株已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。本發(fā)明的第二方面是提供由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體，其中，該單克隆抗體為抗玉米赤霉烯酮a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON中至少一種的抗體。本發(fā)明的第三方面是提供上述單克隆抗體在純化和檢測玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -Z`OL, ZAN 和 ZON 中至少一種中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四方面是提供一種免疫吸附劑，其特征在于，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為上述單克隆抗體和由雜交瘤細(xì)胞株CGMCCN0.5506分泌得到的單克隆抗體。本發(fā)明的第五方面是提供一種裝載有上述免疫吸附劑的免疫親和柱。本發(fā)明的第六方面是提供一種含有上述免疫吸附劑或上述免疫親和柱的試劑盒；優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種，所述保存液優(yōu)選為含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液。本發(fā)明的第七方面是提供上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素1、B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON 中至少一種中的應(yīng)用。本發(fā)明的第八方面是提供一種純化黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER, β -ZOL, ZAN、ZON的方法，該方法包括，使含有黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL,β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON的液體樣品通過上述免疫親和柱，使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N吸附至該免疫親和柱上，然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON洗脫下來，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種。本發(fā)明的第九方面是提供一種檢測黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON的方法，該方法包括，(I)根據(jù)上述純化黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON的方法，得到待測液，所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON洗脫下來而得到的溶液；⑵使所述待測液進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性或定量檢測。本發(fā)明通過開發(fā)出性能穩(wěn)定、特異的單克隆抗體，實現(xiàn)了對6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素和6種玉米赤霉烯酮同類物的同時純化和檢測。由實施例的結(jié)果可以看出，對玉米樣品、牛奶樣品和飼料樣品的檢測中，添加回收率都在80-100%之間，RSD均小于5%。表明本發(fā)明的方法完全 兩足對黃曲霉毒素B1' B2> G1^ G2> M1^ M2、雜色曲霉素和玉米赤霉稀麗冋類物a-ZER、a-ZOL、β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON純化和檢測的分析要求。


附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式
一起用于解 釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:圖1為黃曲霉毒素B1'B2、G1'G2、M1和M2標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖；圖2為雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖；圖3為玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種雜交瘤細(xì)胞株ZEN-F09B10 CGMCC N0.5504。該雜交瘤細(xì)胞株已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，分類命名為抗玉米赤霉醇單克隆抗體細(xì)胞株。本發(fā)明還提供由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體，其中，該單克隆抗體為抗玉米赤霉烯酮同類物a-ZER( a -玉米赤霉醇，a-zearalanol)、a-ZOL( a -玉米赤霉烯醇，a -zearalenol)、β -ZER( β -玉米赤霉醇，β -zearalanol)、β -ZOL ( β -玉米赤霉烯醇，β -zearalenol)、ZAN(玉米赤霉酮，zearalanone)和 ZON(玉米赤霉烯酮，zearalenone)中至少一種的抗體。本發(fā)明中上述雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法。S卩，首先將玉米赤霉烯酮同類物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備作為免疫原，然后將該免疫原對小鼠進(jìn)行免疫，通過將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細(xì)胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中，所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。所述免疫原與載體蛋白的相對用量可以為本領(lǐng)域常規(guī)選擇，例如，所述免疫原與載體蛋白的摩爾比為2-8: I。具體地，本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體的制備方法可以包括以下步驟:(I)制備玉米赤霉烯酮免疫原將5mg玉米赤霉烯酮ZON溶于4mL吡唳中，加入3mg的O-羧甲基輕胺,在室溫下攪拌24h，之后真空干燥，用水溶解后調(diào)pH到8.0，用乙酸乙酯提取3次，脫水結(jié)晶。將結(jié)晶物溶于二氧六環(huán)中配成5mmol/L的溶液，稱取30mg BSA溶于2mL、0.05mol/L (pH 7.4)的PBS中。4°C下，將二者混合，再向其中緩慢滴加3mg的N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)和溶于0.5mL二氧六環(huán)的溶液中的6mg的N，N’ - 二環(huán)己碳二亞胺(DCC)，將所得混合物于室溫下攪拌反應(yīng)24h，透析、離心、冷凍備用。(2)制備雜交瘤細(xì)胞和抗玉米赤霉烯酮的單克隆抗體動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用玉米赤霉烯酮免疫原免疫5只小鼠。取適量玉米赤霉烯酮免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑進(jìn)行免疫，之后佐劑改為不完全佐劑，共免疫6次，每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外，其余均為腹腔注射。免疫結(jié)束后處死小鼠，取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合:將脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞按照10: I的比例進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。雜交瘤細(xì)胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到對玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON有很好的特異性反應(yīng)的細(xì)胞。最后篩選出分泌玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細(xì)胞CGMCC N0.5504，制備出單克隆抗體。本發(fā)明的上述單克隆抗體可應(yīng)用于純化和檢測玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN 和 ZON 中的至少一種。本發(fā)明提供一種免疫吸附劑，其特征在于，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為上述單克隆抗體(抗體A)和由雜交瘤細(xì)胞株Afla-D12A1CGMCC N0.5506(該雜交瘤細(xì)胞株已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，分類命名為抗雜色曲霉素黃曲霉毒素單克隆抗體細(xì)胞株)分泌得到的單克隆抗體(抗體B)。其中，抗體B為抗黃曲霉毒素Bp B2、Gp G2、Mp M2，和雜色曲霉素中至少一種的抗體。本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5506和抗體B的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法。即，首先將黃曲霉毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備作為免疫原，然后將該免疫原對小鼠進(jìn)行免疫，通過將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細(xì)胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中，所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。所述免疫原與載體蛋白的相對用量可以為本領(lǐng)域常規(guī)選擇，例如，所述免疫原與載體蛋白的摩爾比為2-8: I。具體地，本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體的制備方法可以包括以下步驟:(I)制備黃曲霉毒素免疫原將4mg黃曲霉毒素B1溶于2mL丙酮中，加入40 μ LlO %的H2SO4，在56°C攪拌反應(yīng)4h，將反應(yīng)所得產(chǎn)物蒸干后，加入5mL H2O,用25mL氯仿提取兩次，然后用20mL H2O洗滌有機層，保留有機層，蒸去有機溶劑，得到黃色固體產(chǎn)物。取1.0mg黃色固體產(chǎn)物，向其中加入2mL 0.5%的BSA溶液(4mL PBS中溶解20mgBSA)，在 37°C 下反應(yīng) 30min ;加入 100 μ L 6.5mM 的 NaHB4,在 4°C 反應(yīng) 30min ;加入 50 μ L0.1N的HC1，除去過量的NaHB4。在4°C條件下，用PBS溶液透析3天，制得免疫原，即黃曲霉毒素 B1-BSA(Aflatc)Xin B1-BSA)。本發(fā)明中，所述固相載體可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種適用于與抗體進(jìn)行偶聯(lián)的固相載體，包括但不限于纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠中的至少一種，優(yōu)選為溴化氰(CNBr)活化的瓊脂糖凝膠；所述瓊脂糖凝膠的濃度可以為常規(guī)的各種選擇，如4%。該CNBr活化的瓊脂糖凝膠可以以干粉形式商購獲得，如購自美國GE公司，使用時，加入酸溶液進(jìn)行溶脹即可，該酸處理方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在此不再贅述。當(dāng)使用凍干形式并含有添加劑的CNBr活化的瓊脂糖凝膠時，優(yōu)選在低PH值(如pH值為2-3)的條件下洗去添加劑，然后再與抗體進(jìn)行偶聯(lián)。所述將抗體A和抗體B與固相載體偶聯(lián)的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，具體地，該方法可包括:(I)用偶聯(lián)緩沖液溶解抗體，所述抗體為抗體A和抗體B，得到第一抗體溶液，(2)使所述第一抗體溶液與活化的固相載體接觸進(jìn)行偶聯(lián)，得到偶聯(lián)液，(3)將偶聯(lián)液中偶聯(lián)后的固相載體轉(zhuǎn)移至濃度為0.05-1M的Tris-HCl緩沖液中靜置，以封閉偶聯(lián)液中偶聯(lián) 后的固相載體上的殘留活性位點，(4)用洗滌液洗滌靜置后的固相載體，以去除未偶聯(lián)的抗體，得到洗滌后的固相載體，(5)用含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液清洗洗滌后的固相載體。本發(fā)明對所述抗體和固相載體的用量比例以及抗體A和抗體B的相對用量沒有特別的限定，一般地，使所述抗體與固相載體盡可能飽和偶聯(lián)，因此，所述抗體一般過量于固相載體。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)需要選擇抗體與固相載體的用量比。本發(fā)明中，所述抗體A、抗體B與固相載體的重量比優(yōu)選為1: 0.2-5: 5-10。本發(fā)明中所述偶聯(lián)緩沖液可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種選擇，如0.1-0.3M的NaHCO3溶液，PH值可以為8-8.5。偶聯(lián)條件和偶聯(lián)方法可以為常規(guī)的選擇，如，可以在4_25°C條件下，采用翻轉(zhuǎn)式(end-over-end)的方法將抗體與固相載體充分均勻混合1_24小時。所述封閉和除去未偶聯(lián)的抗體的方法也可以為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。其中，所述在0.05-1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中靜置的條件可以為，在4_25°C下，靜置2_4小時。所述用洗滌液洗滌靜置后的固相載體中的洗滌液可以為低、高兩種PH值的緩沖液(如pH4.0的醋酸鹽緩沖液和PH8.0的Tris-HCl緩沖液)，所述洗滌的條件只要使得未偶聯(lián)的抗體基本被除去即可，一般地，按照依次用低、高PH的緩沖液洗滌的順序至少洗滌3個循環(huán)。可以通過測量未偶聯(lián)的抗體的量來計算兩種抗體總的偶聯(lián)率，偶聯(lián)率計算公式偶聯(lián)率(A+B)XlOOo7o^1
偶聯(lián)目U抗體總量(Α+Β)
所述測量未偶聯(lián)的抗體的量的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，如，通過紫外測定偶聯(lián)后的上清液中的蛋白濃度。本發(fā)明提供裝載有上述免疫吸附劑的免疫親和柱。將免疫吸附劑制備成免疫親和柱的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如，將上述清洗后的固相載體裝柱。所述含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液(PBS緩沖液的組成為IL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g、12水合磷酸氫二鈉2.86g、氯化鉀0.2g、氯化鈉8.Sg)可以作為該免疫親和柱的保存液。裝柱的方法例如可以為:使用上述保存液制備漿液，以75%瓊脂糖凝膠和25%保存液的比例進(jìn)行混合。以連續(xù)性的操作向柱內(nèi)傾入漿液。使用一個斜靠在柱內(nèi)壁上的玻璃棒進(jìn)行填柱操作，將有助于減少氣泡的產(chǎn)生。填柱后，關(guān)閉親和柱下端的開口，并取下親和柱的頂端部件。仔細(xì)操作，加入保存液以充填親和柱的余下部分，以在親和柱的頂端形成一個向上的彎液面。將頂端篩板以一定的角度插入到親和柱中，確保在篩板的下方?jīng)]有空氣。將篩板鎖定在基質(zhì)表面適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，打開親和柱下方的開口，用5倍柱床體積的無菌過濾的保存液過柱，并使用保存液保存，至此，親和柱已裝填并平衡完畢，可供直接使用?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法(如CN101059512A中公開的方法)計算免疫親和柱的動態(tài)柱容量(每毫升免疫吸附劑或柱床體積對待測物的最大吸收值)和絕對柱容量(每毫升固定抗體對待測物的最大結(jié)合容量)。結(jié)果表明所述本發(fā)明的免疫親和柱對黃曲霉毒素BpByGpG2JpM2和雜色曲霉素的動態(tài)柱容量和絕對柱容量分別為300ng/mL和880ng/mg,該免疫親和柱對玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和ZON的動態(tài)柱容量和絕對柱容量分別為600ng/mL和1800ng/mg。使用了 5_10次以后柱容量為總柱容量的60-90%左右，保存期為1.5年。本發(fā)明提供含有上述免疫吸附劑或含有上述免疫親和柱的試劑盒；優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種，最優(yōu)選為色譜級甲醇 。所述保存液優(yōu)選為含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液。此外,該試劑盒中還可包括盒體、黃曲霉毒素B2> G1^ G2> M1^ M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N的標(biāo)準(zhǔn)品、洗滌液和海綿托架中的至少一種。其中，所述洗滌液可以為磷酸鹽緩沖液(即IL水中含有0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀、2.9g十二水合磷酸氫二鈉和8.Sg氯化鈉的溶液)或水；所述海綿托架上設(shè)有孔和凹槽，所述凹槽中裝有上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液、裝有上述各種溶液的試劑瓶，以及裝有上述免疫吸附劑的IAC柱。本發(fā)明提供上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素GyMp M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β-ZER、β -ZOL, ZAN和ZON中至少一種中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供一種純化黃曲霉毒素GyMpM2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON的方法，該方法包括，使含有黃曲霉毒素GyMp M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β-ZER、β -ZOL, ZAN、ZON的液體樣品通過上述免疫親和柱，使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N吸附至該免疫親和柱上，然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素BpByGpG2JpM2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON洗脫下來，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種，最優(yōu)選為色譜純甲醇。該方法還可以包括在洗脫液洗脫之前，用洗滌液對免疫親和柱進(jìn)行洗滌，以除去免疫親和柱上非特異性吸附的殘余的液體樣品。所述洗滌液可以為水、磷酸鹽緩沖液和10%甲醇中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明，所述含有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON的液體樣品可以為任何含有上述物質(zhì)的液體樣品，優(yōu)選為食品的液體提取物、飼料的液體提取物、生物樣品的液體提取物和中藥的液體提取物中的至少一種。所述食品包括但不限于谷類、調(diào)料、奶制品等，所述谷類包括但不限于花生、玉米、大豆和大米等，所述生物樣品包括但不限于血漿、肝、腎、肺和肌肉等。將所述食品、飼料、生物制品和中藥制成液體提取物的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如，可包括以下步驟:稱取一定量的樣品，用50-80%的甲醇水溶液提取后，用定性濾紙過濾，將濾液用純水稀釋，再用玻璃纖維濾紙過濾。本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素B1' B2> G1^ G2> M1^ M2、雜色曲霉素和玉米赤霉稀酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON的方法，該方法包括，(I)根據(jù)上述純化黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON的方法，得到待測液，所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素1、B2、Gp G2、Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON洗脫下來而得到的溶液；(2)使所述待測液 進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性或定量檢測。本發(fā)明對于檢測的具體方式?jīng)]有特別的限定，可以是先收集得到待測液，然后再手動使待測液進(jìn)行檢測系統(tǒng)，也可以為連用系統(tǒng)，使待測液自動進(jìn)入檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。所述檢測系統(tǒng)可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種用于分析檢測的儀器，優(yōu)選使用液相色
-1'TfeP曰。所述分析檢測的條件可以根據(jù)待檢測的物質(zhì)的不同進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如,對于黃曲霉毒素G2JpM2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物 a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ΖΟΝ，色譜條件可以為:①對于黃曲霉毒素B” B2, G1, G2, M1和M2,流動相:甲醇-水(甲醇/水的體積為45: 55);檢測器:熒光檢測器，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為440nm;色譜柱:C-18柱(柱長為150mm,內(nèi)徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);流速:0.8mL/min。②對于雜色曲霉素，流動相:甲醇-水(甲醇/水的體積為75: 25);檢測器:紫外檢測器波長:325nm ;色譜柱:C_18柱(柱長為250mm,內(nèi)徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m)；流速:0.8mL/min。③對于玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ΖΟΝ，流動相:乙腈-水(乙腈/水的體積比為60: 40);檢測器:熒光檢測器，激發(fā)波長為274nm，發(fā)射波長為440nm ;色譜柱:C_18柱(柱長為150mm，內(nèi)徑為4.6mm，填料直徑為5 μ m);流速:0.8mL/min。
所述“與標(biāo)準(zhǔn)品比較”的方法可以為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，例如，首先通過液相色譜對準(zhǔn)確配置成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，確定該標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰位置以及峰面積(或峰高)與濃度之間的關(guān)系。然后，在同樣條件下對待測液進(jìn)行檢測，通過與標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置的比較，確認(rèn)待測液中是否存在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的物質(zhì)，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(或峰高)的比較，確定待測液中與標(biāo)準(zhǔn)品相同的物質(zhì)的含量。通過以下實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。實施例1本實施例用于制備玉米赤霉烯酮免疫原和黃曲霉毒素免疫原(I) 將5mg玉米赤霉烯酮ZON溶于4mL卩比唳中，加入3mg的O-羧甲基輕胺,在室溫下攪拌24h，之后真空干燥，用水溶解后調(diào)pH到8.0，用乙酸乙酯提取3次，脫水結(jié)晶。將結(jié)晶物溶于二氧六環(huán)中配成5mmol/L的溶液，稱取30mg BSA溶于2mL、0.05mol/L(pH 7.4)的PBS中。4°C下，將二者混合，再向其中緩慢滴加3mg的N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)和溶于0.5mL 二氧六環(huán)的溶液中的6mg的N，N’ - 二環(huán)己碳二亞胺(DCC)，將所得混合物于室溫下攪拌反應(yīng)24h，透析、離心、冷凍備用。得到玉米赤霉烯酮免疫原，即Z0N-BSA。(2)將4mg黃曲霉毒素B1溶于2mL丙酮中，加入40 μ L 10%的H2SO4,在56°C攪拌反應(yīng)4h ;將反應(yīng)所得產(chǎn)物蒸干后，加入5mL H2O,用25mL氯仿提取兩次，然后用20mL H2O洗滌有機層，保留有機層；蒸去有機溶劑，得黃色固體產(chǎn)物。取1.0mg所述黃色固體產(chǎn)物，向其中加入2mL 0.5%的BSA溶液(4mL PBS中溶解有 20mg BSA)，在 37°C下反應(yīng) 30min ;加入 IOOyL 6.5mM 的 NaHB4,4°C反應(yīng) 30min ;加入50 μ L 0.1N的HC1，除去過量的NaHB4。在4°C條件下，用PBS溶液透析3天。得到黃曲霉毒素免疫原，即黃曲霉毒素B1-BSA0實施例2本實施例用于制備抗黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2和雜色曲霉毒素的單克隆抗體(抗體A)以及抗玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和ZON的單克隆抗體(抗體B)(I)動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用玉米赤霉烯酮免疫原免疫5只小鼠。取玉米赤霉烯酮免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑進(jìn)行免疫，之后佐劑改為不完全佐劑，共免疫6次，每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外，其余均為腹腔注射。免疫結(jié)束后處死小鼠，取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合:將脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞按照10: I的比例進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。雜交瘤細(xì)胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到對玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON有很好的特異性反應(yīng)的細(xì)胞。最后篩選出分泌玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細(xì)胞CGMCC N0.5504，制備出單克隆抗體Α。(2)動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右，雌性BALB/c小鼠。用黃曲霉毒素B1-BSA免疫3只小鼠。取黃曲霉毒素B1-BSAaooyg/只)加等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑進(jìn)行免疫，之后佐劑改為不完全佐劑，共免疫6次，每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外，其余均為腹腔注射。免疫結(jié)束后處死小鼠，取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合:將脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞按照10: I的比例進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。雜交瘤細(xì)胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到對黃曲霉毒素ByGpGyMpM2和雜色曲霉毒素都有很好的特異性反應(yīng)的細(xì)胞。最后篩選出分泌黃曲霉毒素和雜色曲霉毒素抗體的雜交瘤細(xì)胞CGMCC N0.5506，制備出單克隆抗體B。實施例3本實施例用于制備免疫親和柱1、瓊脂糖凝膠的制備稱取所需的Ig用CNBr活化的瓊脂糖凝膠粉末(商購自美國GE公司，每克凍干粉末可形成3.5ml終體積的溶脹瓊脂糖凝膠)，溶于ImM HCl中。將立即溶脹的瓊脂糖凝膠置于燒結(jié)玻璃過濾器中，用ImM HCl洗滌15min。

2、抗體偶聯(lián)(a)使用偶聯(lián)緩沖液(0.2M NaHCO3, pH8.3)溶解抗體，抗體為抗體A和抗體B，其中，抗體A和抗體B的濃度均為5.lmg/ml，抗體溶液體積為30ml，將抗體溶液置于冰浴中暫存。在一個帶蓋的可完全密封的容器中加入上述含有抗體的偶聯(lián)緩沖液，并迅速向其中加入步驟I洗漆好的瓊脂糖凝膠。室溫條件(20-25°C )下采用end-over-end的方式充分混勻上述的混和物2-4h，(b)計算偶聯(lián)率:在2，OOOrpm下離心步驟(a)得到的混合物,離心Imin,將瓊脂糖凝膠離心至管底，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，測定上清液的蛋白質(zhì)含量。通過公式I計算出抗體A和抗體B的總偶聯(lián)率為99.8%，說明偶聯(lián)很成功。取離心至管底的瓊脂糖凝膠，使用偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行洗滌，除去多余的抗體。(C)封閉:轉(zhuǎn)移固相載體至0.1M TriS-HCl緩沖液中，室溫條件下靜置2_4h，以封閉未偶聯(lián)的活性位點。(d)除去未偶聯(lián)上的多余的抗體，依次用低、高兩種pH的緩沖液對瓊脂糖凝膠進(jìn)行洗滌，至少洗滌3個循環(huán)，每種緩沖液的使用量至少為瓊脂糖凝膠體積的5倍。每個洗滌循環(huán)步驟:先用0.1M醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH值為4.0)洗滌，接著再用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH值為8.0)進(jìn)行洗滌。(e)用5倍瓊脂糖凝膠體積的含有0.01重量％ NaN3的PBS洗滌，并使用含有0.01重量％ NaN3的PBS溶液(保存液)保存。3、裝柱使用保存液制備漿液，以75%瓊脂糖凝膠和25%保存液的比例進(jìn)行混合。以連續(xù)性的操作向柱內(nèi)傾入漿液。使用一個斜靠在柱內(nèi)壁上的玻璃棒進(jìn)行填柱操作，將有助于減少氣泡的產(chǎn)生。填柱后，關(guān)閉親和柱下端的開口，并取下親和柱的頂端部件。仔細(xì)操作，力口入保存液充填親和柱的余下部分，以在親和柱的頂端形成一個向上的彎液面。將頂端篩板以一定的角度插入到親和柱中，確保在篩板的下方?jīng)]有空氣。將篩板鎖定在基質(zhì)表面適當(dāng)?shù)奈恢蒙希蜷_親和柱下方的開口，用5倍柱床體積的無菌過濾的保存液過柱，并使用保存液保存，至此，親和柱已裝填并平衡完畢，可供直接使用。實施例4本實施例用于檢測玉米樣品中的黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2以及玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和ZON ;檢測牛奶樣品中的黃曲霉毒素M1和M2 ;以及檢測飼料樣品中的雜色曲霉素。1、利用添加回收實驗檢測玉米樣品。
(1)向玉米樣品中分別添加終濃度為20 μ g/kg,50y g/kg, 100 μ g/kg三個濃度梯度的黃曲霉毒素B1, B2, G1和G2,以及添加終濃度為20 μ g/kg, 50 μ g/kg, 100 μ g/kg三個濃度梯度的玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和ΖΟΝ。每個實驗做五組平行試驗。(2)玉米中黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2和玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON 的提取和檢測:準(zhǔn)確稱取經(jīng)過磨細(xì)(粒度小于2mm)的玉米50.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入100.0mL甲醇-水(甲醇/水體積比為8: 2)，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min，或搖床震蕩30min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0mL濾液并加入40.0mL pH7.0的PBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾I 2次，至濾液澄清。將實施例3制得的免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL樣品提取液注入該玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使樣品提取液以約6mL/min的流速緩慢通過免疫親和柱，直至2 3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 3mL空氣通過柱體。加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為l-2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。2、利用添加回收實驗檢測牛奶樣品中的黃曲霉毒素M1和仏(I)向牛奶中分別添加終濃度為0.1 μ g/L，0.5 μ g/L，1.0 μ g/L三個濃度梯度的黃曲霉毒素M1和仏。每個實驗做五組平行試驗。(2)提取和檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1和M2準(zhǔn)確量取50ml牛奶，在4000轉(zhuǎn)/分以上的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘。去掉奶皮，取得脫脂奶，備測。將實施例3制得的免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。移取50.0mL脫脂奶注入該玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使脫脂奶以約6mL/min的流速緩慢通過免疫親和柱，直至2 3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 3mL空氣通過柱體。加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為l_2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。3、利用添加回收實驗檢測飼料樣品中的雜色曲霉素。(I)向雞飼料中分別添加終濃度為10μ g/kg，20l.! g/kg，50l.! g/kg三個濃度梯度的雜色曲霉素。每個實驗做五組平行試驗。(2)飼料中雜色曲霉素的提取和檢測:準(zhǔn)確稱取經(jīng)過磨細(xì)(粒度小于2mm)的雞飼料50.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入
5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入100.0mL甲醇-水(甲醇/水體積比為8: 2)，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min，或搖床震蕩30min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0mL濾液并加入40.0mL pH7.0的PBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾I 2次，至濾液澄清。將實施例3制得的免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL樣品提取液注入該玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使樣品提取液以約6mL/min的流速緩慢通過免疫親和柱，直至2 3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 3mL空氣通過柱體。加入2.0mL色譜級甲醇洗脫，流速為l-2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。4、高效液相色譜條件
黃曲霉毒素B:、B2、Gp GyM1 和 M2:(a)流動相:甲醇-水(甲醇/水體積比為45: 55)；(b)檢測器:突光檢測器，激發(fā)波長為360nm,發(fā)射波長為440nm ；(c)色譜柱:C_18柱(柱長為150mm,內(nèi)徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min ；(e)光化學(xué)衍生化系統(tǒng):光化學(xué)衍生池(連接于色譜柱后，然后通向熒光檢測器)。雜色曲霉素:(a)流動相:甲醇-水(甲醇/水體積比為75: 25)；(b)檢測器:紫外檢測器，波長為325nm ；(c)色譜柱:C-18柱(柱長為250mm，內(nèi)徑為4.6mm，填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min。玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN 和 ZON:(a)流動相:乙腈-水(乙腈/水的體積比為60: 40)；(b)檢測器:熒光檢測器，激發(fā)波長為274nm，發(fā)射波長為440nm ；(c)色譜 柱:C_18柱(柱長為150mm,內(nèi)徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min5、定量用進(jìn)樣器吸取50 μ L標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值(峰高或峰面積)，得到黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2, M1, M2和雜色曲霉素以及玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖。其中，黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2, M1, M2的譜圖見圖1 (其中，Afla表示黃曲霉毒素)，雜色曲霉素的譜圖見圖2，玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N的譜圖見圖3。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖進(jìn)行比較，對玉米樣品、牛奶樣品和飼料樣品中的黃曲霉毒素G2為為、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β -ZER, β -ZOL,ZAN、ZON進(jìn)行定量，測出經(jīng)過免疫親和柱吸附和洗脫下的黃曲霉毒素B2、Gp G2、M1^M2和雜色曲霉素的含量，并根據(jù)公式II計算添加回收率。添加回收率=X 100%公式II
最初添加的物質(zhì)的量檢測結(jié)果如表1、表2和表3所示。其中，表I中示出的是玉米中黃曲霉毒素B1,B2,GijG2的添加回收率；表2中示出的是玉米中玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β-ZOL.ZAN.ZON的添加回收率；表3中示出的是牛奶中黃曲霉毒素M1和M2的添加回收率；表4中示出的是飼料中雜色曲霉素的添加回收率。表I
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5504。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體，其中，該單克隆抗體為抗玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON中至少一種的抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在純化和檢測玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-Z0L、β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON中至少一種中的應(yīng)用。
4.一種免疫吸附劑，其特征在于，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為權(quán)利要求2所述的單克隆抗體和由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC N0.5506分泌得到的單克隆抗體。
5.裝載有權(quán)利要求4所述的免疫吸附劑的免疫親和柱。
6.含有權(quán)利要求4所述的免疫吸附劑或含有權(quán)利要求5所述的免疫親和柱的試劑盒；優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種，所述保存液優(yōu)選為含有0.001-0.1重量％的NaN3的PBS緩沖液。
7.權(quán)利要求4所述的免疫吸附劑、權(quán)利要求5所述的免疫親和柱、或權(quán)利要求6所述的試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素B1' B2> G1^ G2> M1^ M2、雜色曲霉素和玉米赤霉稀麗冋類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON 中至少一種中的應(yīng)用。
8.一種純化黃曲霉毒素BpByGpG2JpM2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON的方法，該方法包括，使含有黃曲霉毒素B1' B2, G1, G2,M1'M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER, β-ZOL、ZAN、ZON的液體樣品通過權(quán)利要求5所述的免疫親和柱，使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素BpByGpG2'Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZO N吸附至該免疫親和柱上，然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B。B2, G1, G2, M1, M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON洗脫下來，所述洗脫液優(yōu)選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述含有黃曲霉毒素G2、M1、M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON的液體樣品為食品的液體提取物、飼料的液體提取物、生物樣品的液體提取物和中藥的液體提取物中的至少一種。
10.一種檢測黃曲霉毒素B1、B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON 的方法，該方法包括， (1)根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，得到待測液，所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2、至少部分雜色曲霉素和至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON 洗脫下來而得到的溶液； (2)使所述待測液進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性或定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種雜交瘤細(xì)胞株CGMCC NO.5504和由該細(xì)胞株分泌得到的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種免疫吸附劑，該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗體，所述抗體為上述單克隆抗體和由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC NO.5506分泌得到的單克隆抗體。以及裝載該免疫吸附劑的免疫親和柱。本發(fā)明還提供含有上述免疫吸附劑或免疫親和柱的試劑盒。以及上述免疫吸附劑、免疫親和柱、試劑盒在檢測黃曲霉毒素、雜色曲霉素和玉米赤霉烯酮同類物中的應(yīng)用。并具體提供了分離方法和檢測方法。本發(fā)明通過開發(fā)出性能穩(wěn)定、特異的單克隆抗體，實現(xiàn)了對6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素和6種玉米赤霉烯酮同類物的同時純化和檢測。
文檔編號C07D493/22GK103160470SQ20111040994
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者王雄, 鮑蕾, 傅武勝, 梁成珠, 許艷麗, 呂寧, 果旗, 江帆, 劉卓, 王丹, 戚大海, 吳兆廣 申請人:北京中檢維康技術(shù)有限公司, 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 傅武勝