專利名稱：一組新型合成抗菌肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組新型合成抗菌肽及其在治療細(xì)菌感染疾病中的應(yīng)用，該系列抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌有顯著殺菌活性。
背景技術(shù)：
自從抗生素發(fā)明以來(lái)，人類在控制和治療微生物感染中取得了較大的成就，但隨著目前抗生素的持續(xù)使用，目前微生物抗藥性已成為微生物感染控制的重大問(wèn)題，以至于某些微生物細(xì)菌已沒(méi)有控制殺滅的一線藥物。如在臨床藥物治療中，萬(wàn)古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性菌感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床治療難題。抗菌肽是一類廣泛存在于微生物及動(dòng)植物體內(nèi)的小分子多肽，通常由30多個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為2-7KDa。抗菌肽的殺菌機(jī)制是直接破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，致使細(xì)胞內(nèi)容物因高滲透壓而溢出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕囊蚱渚哂袕V泛的生物學(xué)活性而其在醫(yī)學(xué)上具有良好的應(yīng)用前景，但現(xiàn)有天然抗菌肽在含量、抗菌活性、化學(xué)合成和溶血作用等方面還存在諸多缺陷。由于抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)含量極微，從動(dòng)物體內(nèi)提取抗菌肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，這成為制約抗菌肽進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用的最大障礙。近年來(lái)，多肽在人體中的作用已越來(lái)越多的被科學(xué)界發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的醫(yī)藥效果也引起了人們的高度關(guān)注。因此開(kāi)發(fā)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抗菌活性高、化學(xué)合成容易的抗菌肽成為當(dāng)前抗菌藥物開(kāi)發(fā)迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組抗菌活性高、成本較低的新型合成抗菌肽，以及所述合成抗菌肽系列。本發(fā)明的另一目的是提供所述新型合成抗菌肽及其系列在治療細(xì)菌感染疾病中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段是一種新型合成抗菌肽，其特征在于，是對(duì)天然抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，包括如下序列
WYQ-a :Arg Arg Trp Trp Arg ； WYQ-b :Phe Arg Trp Trp Arg0進(jìn)一步提供一組合成抗菌肽系列，包括前述WYQ-a =RRWffR (Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)； WYQ-b =FRWffR (Phe-Arg-Trp-Trp-Arg)的核心序列 RRffR (Arg-Trp-Trp-Arg)。進(jìn)一步，本發(fā)明的新型合成抗菌肽系列還包括上述合成抗菌肽的核心序列 RRffR (Arg-Trp-Trp-Arg)，以及核心序列 RRWR(Arg-Trp-Trp-Arg)的 N 末端和 / 或 C 末端的修飾、氨基酸的取代、替換、環(huán)化、L-型氨基酸變D-型氨基酸、缺失或加入而得到的類似功能擬肽或多肽。
進(jìn)一步，所述合成抗菌肽及其系列，在治療細(xì)菌感染疾病中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述合成抗菌肽及其系列，在對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌或/和革蘭氏陰性菌殺菌上的應(yīng)用。本發(fā)明在已有天然發(fā)現(xiàn)的抗菌肽序列Lactoferricin B4_9 RRWQWR的基礎(chǔ)上，結(jié)合虛擬組合庫(kù)設(shè)計(jì)技術(shù)，DNAstar, Bioedit, sequence logo等分析軟件和網(wǎng)站，設(shè)計(jì)了一組含有5個(gè)氨基酸的全新多肽序列，該組多肽抗菌活性較LfcinB4_9有極大改善，且解決了 LfcinB4^9的溶血毒性問(wèn)題。本發(fā)明提供的一組新型合成抗菌肽，其制備方法可以是固相化學(xué)法直接合成，制備的抗菌肽通過(guò)質(zhì)譜鑒定?？咕脑诟咝⒕耐瑫r(shí)也有可能作用于高等有機(jī)體包括人體細(xì)胞，因?yàn)榭咕牡淖饔梅绞蕉际窃诩?xì)胞膜上穿孔使得細(xì)胞發(fā)生滲漏而死亡。因此，將抗菌肽能否使紅細(xì)胞發(fā)生滲漏作為其是否有毒性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，如果抗菌肽能使紅細(xì)胞中的血紅蛋白發(fā)生滲漏， 就可以通過(guò)檢測(cè)OD49tl值確定毒性的大小。本發(fā)明還檢測(cè)了抗菌肽對(duì)人體紅細(xì)胞的溶血活性。實(shí)驗(yàn)表明，在高濃度下抗菌肽溶血率依然非常低，證實(shí)本發(fā)明抗菌肽的溶血毒性極小。綜上所述，本發(fā)明提供一組新型人工設(shè)計(jì)合成的抗菌肽。這些抗菌肽可方便地采用固相化學(xué)法或?qū)⒕幋a抗菌肽的基因克隆到載體后在宿主細(xì)胞中表達(dá)獲得。該合成抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜殺傷活性，并較天然抗菌肽有更強(qiáng)的殺菌活性，且對(duì)動(dòng)、植物細(xì)胞無(wú)任何毒害作用。本發(fā)明所述一組合成抗菌肽抗菌譜廣、不需要任何修飾連接且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便。實(shí)驗(yàn)證明無(wú)論是G+菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)還是G-菌(革蘭氏陰性菌)都有顯著的抑菌和殺菌活性且無(wú)溶血活性，提示其在抗菌藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面有很重要價(jià)值。


圖1是抗菌肽WYQ-a的質(zhì)譜圖； 圖2是抗菌肽WYQ-b的質(zhì)譜圖。圖1中，MS參數(shù)
進(jìn)樣量Gnjection Volume) :1. 00μ 1 ；分子量(MW) :858. 05 ；氣流量離子源 (Probe):ESI ；
DL 管的溫度(DL Temp) 300° C ；霧化器的流速(Gas Flow) 1. 5L/min ； 加熱快的溫度(Block Temp) 250° C ；流動(dòng)相的流速(T. Flow) :0. 2ml/min ； 流動(dòng)相的比例(B. conc) :50%H20/50%ACN。圖2中，MS參數(shù)
進(jìn)樣量anjection Volume) 1. 00 μ 1 ；分子量(MW) :859. 41 ；氣流量離子源 (Probe):ESI ；
DL 管的溫度(DL Temp) 300° C ；霧化器的流速(Gas Flow) 1. 5L/min ； 加熱快的溫度(Block Temp) 250° C ；流動(dòng)相的流速(T. Flow) :0. 2ml/min ； 流動(dòng)相的比例(B. conc) :50%H20/50%ACN。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及的新型合成抗菌肽，是對(duì)天然抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，它們的序列包括
WYQ-a :Arg Arg Trp Trp Arg ； WYQ-b :Phe Arg Trp Trp Arg0本發(fā)明思路如下經(jīng)過(guò)研究后得出在Lactoferricin B4-9RRWQWR基礎(chǔ)上，新的核心序列RWWR，該結(jié)構(gòu)本身具有抗菌活性，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在其兩端加上不同的天然氨基酸殘基均具有顯著的抗菌活性，而且相比LfcinB4-9均未出現(xiàn)溶血毒型，有望作為治療細(xì)菌感染的新藥研究和開(kāi)發(fā)。為深入研究本發(fā)明中生物活性抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，利用美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物公司生產(chǎn)的Pioneer多肽合成儀制備本發(fā)明公開(kāi)的一組抗菌多肽和作為對(duì)照的抗菌肽，以供實(shí)驗(yàn)研究。新型合成抗菌肽WYQ-ει，WYQ-b及對(duì)照抗菌肽Lactoferricin B4_9的固相合成。按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相程序人工合成抗菌肽WYQ_a (Arg-Arg-Trp-Trp-Arg)、 WYQ-b (Phe-Arg-Trp-Trp-Arg)及對(duì)照抗菌肽 Lactoferricin B4_9 (Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg)合成肽經(jīng)反相HPLC(Vydac 218TP1022柱2. 2X25cm)純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統(tǒng)洗脫，MALDI-T0F和EPI質(zhì)譜分析?？咕暮铣捎缮虾Ｗ嫌蛏锟萍加邢薰?Sianghai Ziyu Biotechnology Co. , Ltd. Shanghai, China)。1.抗菌肽的制備(以制備0. Immol量的WYQ_a為例) 以下所有制備抗菌肽的試劑均購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。制備的WYQ-a 多肽序列為Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2 制備從C端到N端逐個(gè)進(jìn)行，由合成儀自動(dòng)控制。首先，稱量0. Immol的結(jié)合了第一個(gè)氨基酸即Arg的樹(shù)脂(購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，裝柱；再用20%哌啶二甲基甲酰胺溶液保護(hù)，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基 (Fmoc)保護(hù)的游離氨基酸溶解于碳二亞胺(DCC)，羥基苯并三唑(HOBt)/二異丙基乙基胺 (DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循環(huán)偶合反應(yīng)30min，三氟乙酸(TFA)清洗重復(fù)以上脫保護(hù)到偶合反應(yīng)步驟直到制備結(jié)束(具體操作步驟見(jiàn)pioneer多肽合成儀操作指南)，以乙醚將三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固體粗品多肽。2.抗菌肽的純化
稱量IOOmg干燥后的上述固體粗品多肽，溶于0. 1%三氟乙酸10ml，樣品處理后反相液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化。體系為0. 1%三氟乙酸(TFA)的H2O和0. 1%的乙腈(ACN)，收集洗脫峰。將液相色譜(HPLC)中純化出來(lái)的目標(biāo)峰放置凍干機(jī)(_50°C)中凍干后，再次進(jìn)行質(zhì)譜(MS)確認(rèn)正確與否，HPLC檢測(cè)純度。3.抗菌肽的鑒定
如圖1所示，制備的抗菌肽WYQ-a經(jīng)過(guò)質(zhì)譜(MS)分析，WYQ-a在質(zhì)譜圖中顯示計(jì)算出 WYQ-a的分子量為850. 05。由多肽序列計(jì)算出的理論值為850. 00。證明制備的多肽即為設(shè)計(jì)的WYQ-a抗菌肽。鑒定合格的抗菌肽產(chǎn)物備用?？咕腤YQ-b及對(duì)照抗菌肽Lactoferricin B4_9采用類似于WYQ_a抗菌肽的制備方法制備。利用瓊脂空板穴擴(kuò)散法和96孔板法檢測(cè)多肽的殺菌和抑菌活性，以預(yù)先合成的天然抗菌肽Lactoferricin B4_9RRWQWR為對(duì)照，進(jìn)行殺菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明本發(fā)明中抗菌肽的殺菌活性顯著強(qiáng)于對(duì)照抗菌肽。1、合成抗菌肽的殺菌活性檢測(cè)
以下實(shí)施案例中所使用的各種菌株均購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所。采用瓊脂板擴(kuò)散法對(duì)合成抗菌肽的殺菌活性進(jìn)行檢測(cè)，并以固相化學(xué)法合成的抗菌肽Lactoferricin B4^9RRffQffR作為對(duì)照，評(píng)價(jià)本發(fā)明中三條抗菌肽WYQ-ει，WYQ-b的殺菌活性。按以下步驟進(jìn)行測(cè)定抗菌肽的殺菌活性
菌種復(fù)蘇，接種斜面37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑菌于普通LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，稀釋菌液使菌濃度為105 106cfu /ml，按每個(gè)平板100 μ 1菌液接種于15ml LB固體培養(yǎng)皿中，待凝固后，涂布均勻后，打孔5mm，3個(gè)/平板，分別加入濃度1 mg/ml 10 μ 1合成抗菌肽溶液和LfcinB4-9溶液及超純水(LfcinB4_9作為陽(yáng)性對(duì)照，超純水作為陰性對(duì)照)，4°C靜置池后，將平板置于37°C培養(yǎng)他后，測(cè)量抑菌圈大小，判定殺菌能力，同時(shí)觀察抑菌圈在7d之內(nèi)的變化，判定殺菌持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 1 mg/ml 3種抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性的測(cè)定比較
革蘭ft 陽(yáng)性菌
革蘭ft 陰性菌
菌株名稱
枯草桿菌DB430 金黃色葡萄球菌
CMCC26003 大腸桿菌
iffCCS 賺
綠膿桿菌
01CC210104
幾種抗菌肽抑菌圈(
代表 5mm。上表中+號(hào)越多，說(shuō)明殺菌能力越強(qiáng)。從上表看出本發(fā)明的合成抗菌肽殺菌能力明顯且優(yōu)于對(duì)照抗菌肽。另外，本發(fā)明的合成抗菌肽在持續(xù)7d的時(shí)間里，抑菌圈大小未發(fā)生變化，而對(duì)照抗菌肽抑菌圈發(fā)生明顯縮小，表明其殺菌能力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。2、合成抗菌肽的抑菌活性檢測(cè)
以下實(shí)施例中所使用的各種菌株購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所。采用96孔板法對(duì)合成抗菌肽的殺菌活性進(jìn)行檢測(cè)，并用固相化學(xué)法合成的抗菌肽Lactoferricin B4^9RRffQffR作為對(duì)照，以評(píng)價(jià)本發(fā)明的2條抗菌肽WYQ-ει，WYQ-b的抑菌活性。按以下步驟進(jìn)行測(cè)定抗菌肽的抑菌活性
權(quán)利要求
1.一組新型合成抗菌肽，其特征在于，包括如下序列 WYQ-a :Arg Arg Trp Trp Arg ；WYQ-b :Phe Arg Trp Trp Arg0
2.一組合成抗菌肽系列，其特征在于，包括權(quán)利要求1的核心序列RRWR(Arg-Trp-Trp-Arg)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一組合成抗菌肽系列，其特征在于，包括所述核心序列 RRffR(Arg-Trp-Trp-Arg)的N末端和/或C末端的修飾、氨基酸的取代、替換、環(huán)化、L-型氨基酸變D-型氨基酸、缺失或加入而得到的擬肽或多肽系列。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述合成抗菌肽，在治療細(xì)菌感染疾病中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述合成抗菌肽，在對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌或/和革蘭氏陰性菌殺菌上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型合成抗菌肽及其應(yīng)用，所述新型合成抗菌肽是對(duì)天然抗菌肽的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成，它們的序列包括WYQ-aArgArgTrpTrpArg；WYQ-bPheArgTrpTrpArg。該合成抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜殺傷活性，并較天然抗菌肽有更強(qiáng)的殺菌活性，且對(duì)動(dòng)、植物細(xì)胞無(wú)任何毒害作用。所述合成抗菌肽抗菌譜廣、不需要任何修飾連接且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便。實(shí)驗(yàn)證明無(wú)論是G+菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)還是G-菌(革蘭氏陰性菌)都有顯著的抑菌和殺菌活性且無(wú)溶血活性，提示其在抗菌藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面有很重要價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102432672SQ20111041461
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者丁元, 林治華, 王遠(yuǎn)強(qiáng), 蔡家利, 韓英子 申請(qǐng)人:重慶理工大學(xué)