專利名稱：空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體及其包被的免疫磁珠和應(yīng)用的制作方法
空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體及其包被的免疫磁珠和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體及其包被的免疫磁珠和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C. jejuni)大量存在于各種野生或家養(yǎng)動物的腸道內(nèi)，污染水源或食物后可引起腹瀉的暴發(fā)流行，被感染的動物常無明顯的癥狀，并長期攜帶此菌。目前C. jejuni感染已成為全球范圍內(nèi)急性胃腸炎最常見的病因之一。在發(fā)展中國家，它是兒童腹瀉死亡的重要病原，也是旅行者腹瀉的最常見原因，在美國和其他工業(yè)化國家，空腸彎曲桿菌感染引起的腹瀉是沙門氏菌、志賀氏菌或大腸桿菌(0157:H7)引起的腹瀉的2 7倍。該菌還可引起格林-巴利綜合征和兒童急性遲緩性癱瘓。C. jejuni傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的取樣量較少，劃線培養(yǎng)后，一些雜菌快速攝取培養(yǎng)基中的有效營養(yǎng)成分， 嚴(yán)重干擾C. jejuni的分離培養(yǎng)，造成傳統(tǒng)分離方法的敏感性和檢出率降低；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELESA)、核酸探針雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實時定量PCR(Real-time PCR)等方法敏感、特異、且檢出率較高，但存在一定的非特異性反應(yīng)，不能區(qū)分活菌和死亡細(xì)菌。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種空腸彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位串聯(lián)表達(dá)后制備的人工多肽及其特異性抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供包被有該抗體的免疫磁珠。
本發(fā)明的又一目的是提供該免疫磁珠的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
空腸彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位串聯(lián)表達(dá)后制備的人工多肽，是由人工分析空腸彎曲菌特異性表面蛋白的抗原表位，人工設(shè)計、改造、串聯(lián)、表達(dá)后獲得，其氨基酸序列為SEQ ID No. 1，編碼所述含空腸彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列為SEQ ID No. 2。
所述的含空腸彎曲菌特異性多抗原表位的人工多肽的特異性抗體。
由所述的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠。
一種利用所述的試劑盒富集檢測空腸彎曲菌的方法，按如下步驟進(jìn)行
(1)樣品的預(yù)增菌依據(jù)GB/T 4789. 9進(jìn)行，樣品加入預(yù)增菌培養(yǎng)液后，在微需氧條件(5 %氧氣、10 % 二氧化碳、85 %氮氣)下，以IOOrpm的振蕩速度，36 士 1 °C培養(yǎng)4h ；必要時測定增菌液的PH值并調(diào)整至7. 2士0. 2，42士1°〇繼續(xù)培養(yǎng)對11-4811 ；也可用等效的方法進(jìn)行預(yù)增菌；
(2)取所述預(yù)增菌液20-30mL，加入權(quán)利要求3所述的免疫磁珠50 μ L，37°C孵育 lh;
(3)將其放于磁力架上，3min后棄去上清，加入30mL PBS緩慢重懸，磁力架吸下免疫磁珠后，棄去上清，如此重復(fù)洗滌3次；(4)吸附后的免疫磁珠直接鋪于顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，或直接提取DNA用PCR 或熒光PCR進(jìn)行檢測；為避免免疫磁珠上抗體影響菌落的生長狀態(tài)，可以向吸附后的免疫磁珠中加入ImL 50mmol/L甘氨酸溶液(pH2. 0)，間斷振蕩洗脫Ih ；將離心管放于磁力架上， 待免疫磁珠全部被吸附于管壁上時取出上清，用洗脫下的菌液直接鋪于顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，或直接提取DNA后用PCR或熒光PCR進(jìn)行檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明選擇空腸彎曲菌4個位于菌體表面的特異性蛋白各選取一個抗原性較強的表位，人工設(shè)計出一條空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽，并利用純化的多肽作為抗原免疫新西蘭兔，獲得的空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體對空腸彎曲菌具有良好的特異性。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體包被的免疫磁珠可以從體積較大的樣品預(yù)增菌液中將空腸彎曲菌富集，極大地提高下一步分離培養(yǎng)或PCR檢測的敏感性；并且本發(fā)明空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體包被的免疫磁珠能夠特異性地吸附樣品預(yù)增菌液中空腸彎曲菌，可排除其它雜菌對下一步的分離培養(yǎng)或PCR檢測的干擾，以提高空腸彎曲菌的檢出率。由于磁珠包被有特異性抗體，富集效果及效率大大提高，磁珠與細(xì)菌結(jié)合是通過非共價鍵結(jié)合，不會影響空腸彎曲菌的生理和生化特性。
具體實施例方式實施例1空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的制備1.空腸彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位串聯(lián)表達(dá)后制備的人工多肽(也稱空腸彎曲菌多表位抗原，或稱C. jejuni多表位抗原重組蛋白，下同)的設(shè)計、合成與克隆通過Epitope Conservancy Analysis軟件預(yù)測空腸彎曲菌4個位于菌體表面的特異性蛋白(gi號分別為6967637、6967894、6968218和6968454)的抗原表位，從每個蛋白各選取一個抗原性較強的表位，人工設(shè)計出一條多肽，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID No. 1，長度為53個氨基酸；結(jié)合原核表達(dá)載體E. coli密碼子的簡并性，設(shè)計的人工多肽核酸序列為=SEQ ID No. 2，長度為159bp，并在其上下游分別添加BamH I和Hind III酶切位點。經(jīng)人工合成并克隆至PMD18-T載體，獲得克隆質(zhì)粒pMD18-T-CJMEA-A。2.空腸彎曲菌多表位抗原的質(zhì)粒構(gòu)建按照堿裂解法提取重組質(zhì)粒pMD18-T-CJMEA-A，BamH I和Hind III雙酶切后電泳，回收大小為171bp的特異性目的片段，與表達(dá)載體pET-32a(+)用T4DNA連接酶(TaKaRa 公司)按照說明書的條件進(jìn)行連接，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL2KDE3) 中，篩選到陽性表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CJMEA-A。對表達(dá)質(zhì)粒pET_32a_CJMEA-A進(jìn)行PCR擴增、 BamH I和Hind III雙酶切，電泳后在大小約為171bp處均出現(xiàn)特異性條帶。對表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-CJMEA-A進(jìn)行測序，確定其核苷酸序列無誤。3.空腸彎曲菌多表位抗原的表達(dá)及純化將含有表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_CJMEA-A的E. coli BL21 (DE3)于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6tltlmiSO. 6-0. 8)，加入IPTG至濃度為ImM，37°C誘導(dǎo)Mi后離心，菌體沉淀用PBS緩沖液重懸，超聲裂解后離心，上清用0. 45 μ m微孔濾膜過濾后，用His Bind Purification Kit(NoVagen公司)按照說明書的方法純化。純化的重組蛋白用SDS-PAGE電泳分析，觀察到約27kD的特異性蛋白條帶，大小與預(yù)計相似，說明純化的C. jejuni多表位抗原重組蛋白純度較好。
實施例2空腸彎曲菌多表位抗原的反應(yīng)原性和免疫原性鑒定
1.免疫轉(zhuǎn)印
將實施例1純化的C. jejuni多表位抗原重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，凝膠用半干轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad)電轉(zhuǎn)印至PVNF膜(Osmonics公司)。將轉(zhuǎn)印后的PVNF膜用5%脫脂奶粉溶液封閉，加入1 200稀釋的兔抗C. jejuni全菌陽性血清，37°C作用1. 后洗膜； 加入1 10000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG，37°C作用Ih后洗膜；用 3，3_二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5min后，顯示單一的特異性條帶，大小與重組蛋白相似，說明制備的C. jejuni多表位抗原重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
2.兔免疫試驗
將實施例1純化的C. jejuni多表位抗原重組蛋白加入等量的弗氏完全佐劑 (GIBC0公司)乳化，皮下多點注射成年新西蘭兔，0. 5mg/只，2周后加入等量弗氏不完全佐劑乳化抗原進(jìn)行二免，第5周和第8周時分別進(jìn)行三免和四免，方法同二免，第10周時采血收集血清(下文稱抗血清)，用ELISA方法鑒定血清抗體和重組蛋白。結(jié)果顯示制備的抗血清與重組蛋白反應(yīng)效價大于1 512000，與C. jejuni菌體反應(yīng)效價為1 3200，重組蛋白與抗C. jejuni全菌血清反應(yīng)效價為1 50，說明制備的抗血清與菌體具有良好的反應(yīng)性。鑒定好的抗血清用C. jejuni多表位抗原重組蛋白偶聯(lián)的凝膠做親和層析，純化后的抗體用紫外分光光度計測定蛋白濃度后分裝，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> ELISA反應(yīng)程序為滅活的C. jejuni菌體或C. jejuni多表位抗原重組蛋白用 lmol/L 的 Tris-HCl (pH 為 7. 5)稀釋至 10 μ g/mL，4°C包被過夜；1% BSA (質(zhì)量濃度)4°C封閉過夜；預(yù)稀釋好的抗血清或抗C. jejuni全菌血清、以及陰性對照血清倍比稀釋，加入酶標(biāo)板，每孔100 μ L，37°C作用1. Oh ；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗)1 10000稀釋，37°C作用 l.Oh ；鄰苯二胺(0PD)37°C避光顯色 15min ；用 2mol/L H2SO4 終止顯色，測定OD49tlnm值，計算P/N值，以P/N彡2. 5的血清最高稀釋度作為血清效價。
3.重組蛋白抗血清特異性實驗
將空腸彎曲桿菌ATCC四428、霍亂弧菌ATCC 51394、副溶血型弧菌89001 (中國藥品生物制品檢定所)、阪崎氏腸桿菌ATCC四討4、蠟樣芽孢桿菌ATCC 63301、沙門氏菌ATCC14028、大腸埃希菌ATCC 25922、甲型溶血型鏈球菌CMCC 32205、痢疾志賀氏菌 CMCC(B) 51105、單增李斯特菌CMCC(B) M002、銅綠假單胞桿菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923滅活后調(diào)整菌體濃度至5 X IO5包被ELISA板，兔抗重組蛋白陽性血清(即空腸彎曲菌多表位抗原的特異性抗體)以1 25稀釋后再做倍比稀釋，間接ELISA確定發(fā)現(xiàn)除空腸彎曲桿菌ATCC 294^(P/N為6.8)以外，其它菌的P/N均小于2. 5，說明制備的抗血清(即空腸彎曲菌多表位抗原的特異性抗體)具有良好的特異性。
實施例3空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠的制備
1.取165 μ L磁珠懸浮液(含磁珠5mg)至離心管內(nèi)，用磁力架將磁珠沉淀(以下簡稱磁力沉淀，其具體操作步驟是，將離心管放于磁力架上，待上層液體變澄清后棄掉上清，保留底部的磁珠，移開磁力架)；2.加入ImL磁珠偶聯(lián)緩沖液，重懸磁珠后，磁力沉淀；3.先后加入75. 7 μ L磁珠偶聯(lián)緩沖液和74. 3 μ L實施例2中制備的純化空腸彎曲菌特異性抗體(含抗體100 μ g)混勻，再加入100 μ L處理液并混勻，置37°C搖床上孵育 1 后，磁力沉淀；4.加入ImL封閉液重懸磁珠，37°C搖床上孵育1小時后，磁力沉淀；5.加入ImL儲備液，渦旋振蕩5_10s后，磁力沉淀；重復(fù)該操作一次；加入240 μ L 儲備液混勻(溶液總體積250 μ L)，于4°C冰箱保存。磁珠偶聯(lián)緩沖液lmol/L的硼酸鹽緩沖液，其pH為7. 4 ；處理液組成是3mol/L的硫酸銨/lmol/L的硼酸鹽緩沖液；封閉液組成是0. 5g牛血清白蛋白(BSA)溶于IOOmLPBS中，其pH為7. 4 ；儲備液組成是0. Ig BSA溶于IOOmL PBS中，其pH為7. 4 ；PBS =Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L,其 pH 為 7· 4 ；實施例4利用實施例3制備的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠富集檢測空腸彎曲菌的具體步驟如下1.樣品的預(yù)增菌依據(jù)GB/T 4789. 9進(jìn)行，樣品加入預(yù)增菌培養(yǎng)液后，在微需氧條件(5%氧氣、10%二氧化碳、85%氮氣)下，以IOOrpm的振蕩速度，36士 1°C培養(yǎng)4h。必要時測定增菌液的PH值并調(diào)整至7. 2士0. 2。42士 1°C繼續(xù)培養(yǎng)Mh_48h ；也可用等效的方法進(jìn)行預(yù)增菌；2.取所述預(yù)增菌液20_30mL，加入實施例3制備的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠50 μ L，37°C孵育Ih ；3.將其放于磁力架上，3min后棄去上清，加入30mL PBS緩慢重懸，磁力架吸下免疫磁珠后，棄去上清，如此重復(fù)洗滌3次；4.吸附后的免疫磁珠直接鋪于顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，或直接提取DNA用PCR 或熒光PCR進(jìn)行檢測。為避免免疫磁珠上抗體影響菌落的生長狀態(tài)，可以向吸附后的免疫磁珠中加入ImL 50mmol/L甘氨酸溶液(pH2. 0)，間斷振蕩洗脫Ih ；將離心管放于磁力架上， 待磁珠全部被吸附于管壁上時取出上清，用洗脫下的菌液直接鋪于顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，或直接提取DNA后用PCR或熒光PCR進(jìn)行檢測。實施例5分別制備實施例2中11種非空腸彎曲菌菌液各25mL(菌液濃度為105/mL)，添加空腸彎曲菌約IO2個，按照實施例4中的操作步驟進(jìn)行。吸附后的免疫磁珠或洗脫下的菌液直接鋪顯色平板后培養(yǎng)，可觀察到大量目標(biāo)菌落，熒光PCR鑒定均為空腸彎曲菌。同時將吸附后的免疫磁珠或洗脫下的菌液提取DNA，用熒光PCR鑒定，結(jié)果均陽性。用從市場采集樣品中隨機抽取生鮮雞肉、凍雞、環(huán)境污水樣品各40份。分別按照GB/T4789. 9-2008和以上免疫磁珠富集法進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)用GB/T 4789. 9-2008方法的檢出率依次為23. 75%U1. 25%,6. 25%,以上免疫磁珠富集法的檢出率依次為27. 50%, 15. 00%,7. 50%，表明免疫磁珠富集法的檢出率相比常規(guī)方法明顯提高。
權(quán)利要求
1.空腸彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位串聯(lián)表達(dá)后制備的人工多肽，其特征在于編碼所述人工多肽的核苷酸序列為SEQ ID No. 2、氨基酸序列為SEQ ID No. 1。
2.權(quán)利要求1所述的空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體。
3.由權(quán)利要求2所述的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠。
4.一種富集空腸彎曲菌的試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求3所述的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠。
5.一種利用權(quán)利要求3所述的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠富集檢測空腸彎曲菌的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行(1)依據(jù)GB/T4789. 9進(jìn)行樣品的預(yù)增菌將樣品加入預(yù)增菌培養(yǎng)液后，在5%氧氣、 10%二氧化碳、85%氮氣的條件下，以IOOrpm的振蕩速度，36士 1°C培養(yǎng)4h ；必要時測定增菌液的PH值并調(diào)整至7. 2 士0. 2，42士1°〇繼續(xù)培養(yǎng)對11-4811 ；亦或者用等效的方法進(jìn)行預(yù)增菌；(2)取步驟⑴得到的預(yù)增菌液20-30mL，加入權(quán)利要求3所述的空腸彎曲菌特異性抗體包被的免疫磁珠50 μ L，37°C孵育Ih ；(3)將其放于磁力架上，3min后棄去上清，加入30mLPBS緩慢重懸，磁力架吸下免疫磁珠后，棄去上清，如此重復(fù)洗滌3次；(4)吸附后的免疫磁珠直接鋪于顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，或直接提取吸附后的免疫磁珠上的DNA用PCR或熒光PCR進(jìn)行檢測；或者向吸附后的免疫磁珠中加入ImL 50mmol/L 甘氨酸溶液，間斷振蕩洗脫lh，將離心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上時取出上清，用洗脫下的菌液直接鋪于顯色平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)，或直接提取DNA后用PCR或熒光PCR進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體及其包被的免疫磁珠和應(yīng)用?？漳c彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位串聯(lián)表達(dá)后制備的人工多肽，其氨基酸序列為SEQ ID No.1，編碼所述含空腸彎曲菌特異性表面蛋白多抗原表位的核苷酸序列為SEQ ID No.2。一種富集空腸彎曲菌的試劑盒，含有包被空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽的特異性抗體的免疫磁珠。利用該免疫磁珠或試劑盒能從樣品預(yù)增菌液中將空腸彎曲菌富集，極大地提高下一步分離培養(yǎng)或PCR檢測的敏感性和檢出率，具有特異性好，靈敏度高，簡單，方便，快速，適合大規(guī)模樣品檢測的優(yōu)點。
文檔編號C07K16/12GK102532283SQ20111042745
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者唐泰山, 姜焱, 張常印, 張睿, 欒軍, 王凱民, 祝長青, 蔣原, 薛峰 申請人:江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心