專利名稱：表面定位的空腸彎曲桿菌多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是細(xì)胞表面定位的空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)多肽及其在對空腸彎曲桿菌的免疫、在彎曲桿菌的診斷以及在具有抗彎曲桿菌活性的化合物的鑒定中的用途。
背景技術(shù)：
彎曲桿菌感染的出現(xiàn)彎曲桿菌是一種革蘭氏陰性微需氧細(xì)菌，首先作為人類病原體于1973年被發(fā)現(xiàn)。自那時(shí)起它就成為發(fā)達(dá)世界中痢疾疾病最常見的細(xì)菌病因，其導(dǎo)致的疾病比更為傳統(tǒng)上認(rèn)為的食源病原體，志賀菌屬和沙門氏菌屬合起來導(dǎo)致的疾病還要多。在不同的致病彎曲桿菌菌株中，空腸彎曲桿菌是最重要的，是99％的彎曲菌病的病因。全球水平的監(jiān)測表明，自從該生物體首先被承認(rèn)是病原體以來，報(bào)告的彎曲菌病病例數(shù)目在穩(wěn)定增加。的確，世界衛(wèi)生組織現(xiàn)在將導(dǎo)致彎曲菌病的細(xì)菌視為世界上最重要的腸炎病原體。國際公共衛(wèi)生官員估計(jì)僅空腸彎曲桿菌每年在全世界就導(dǎo)致4到5億的痢疾病例，在美國最近的2000年數(shù)據(jù)中它是排名第一的食源病原體，表明了相對于其他更為引人注意的食源疾病的病因，彎曲桿菌的重要性。在數(shù)據(jù)中，彎曲桿菌是55％以上病例和33％住院的病因。
彎曲桿菌感染的癥狀痢疾是彎曲菌病最一貫和顯著的表現(xiàn)。痢疾常常是出血的?？漳c彎曲桿菌通常的癥狀還包括發(fā)燒、惡心、嘔吐、腹痛、頭痛和肌肉疼痛。病例中大部分程度輕，不需要住院且可以是自限的。但是空腸彎曲桿菌感染可以是嚴(yán)重且威脅生命的。如果有其他疾病(例如癌癥、肝臟疾病和免疫缺陷相關(guān)的疾病)則死亡更為常見。五歲以下的兒童和15-29歲的年輕成年人是最經(jīng)常受到影響的年齡組。潛伏期(接觸和最初癥狀發(fā)作之間的時(shí)間)通常是兩到五天，但是發(fā)作可以在攝入后短至2天或者多達(dá)10天。疾病通常持續(xù)不超過一周；但是嚴(yán)重的病例可以持續(xù)多達(dá)三周(CDC Guidelines for confirmation offood-borne disease outbreaks.MMWR，1996；4559)。
彎曲桿菌的長期后果彎曲桿菌感染有時(shí)可以具有長期的后果。一些患者可能出現(xiàn)稱為吉一巴(Guillain-Barr é)綜合征的疾病，它在彎曲菌病后影響機(jī)體的神經(jīng)。盡管少見，它是西方世界中急性全身性癱瘓的最常見原因。在少數(shù)彎曲桿菌患者中，它在痢疾疾病后的數(shù)周開始。當(dāng)人的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗彎曲桿菌組分的抗體，并且這些抗體攻擊人體神經(jīng)細(xì)胞的組分原因是它們在化學(xué)上與細(xì)菌的組分相似，這時(shí)就出現(xiàn)吉一巴綜合征1。吉-巴綜合征從腳開始擴(kuò)散到全身。刺痛感覺讓位與可以導(dǎo)致癱瘓的虛弱。它持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，通常需要悉心護(hù)理。完全康復(fù)是常見的，但是患者可能遺留下嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。大約15％的吉-巴綜合征患者在一年后仍然臥床或者束縛于輪椅上。據(jù)估計(jì)每1000例報(bào)告的彎曲桿菌病中有大約1例(0.1％)會發(fā)展為吉-巴綜合征。在英國多達(dá)40％的彎曲桿菌病綜合征病例在彎曲桿菌病后出現(xiàn)2。
米-費(fèi)(Miller Fisher)綜合征是另一種相關(guān)的在彎曲桿菌病之后出現(xiàn)的神經(jīng)綜合征，它也是由于免疫擬態(tài)而產(chǎn)生1。在米-費(fèi)綜合征中，頭部比身體的神經(jīng)受到更多影響。
與彎曲桿菌感染有關(guān)的另外一種慢性病況是一種稱為Reiter′s綜合征的關(guān)節(jié)炎。這是一種反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，最通常影響的是大的負(fù)重關(guān)節(jié)例如膝蓋和后背。它是與特定遺傳組成密切相關(guān)的并發(fā)癥；具有人淋巴細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)的人最易患病。
此外，彎曲桿菌還會導(dǎo)致闌尾炎或者感染腹腔(腹膜炎)，心臟(心肌炎)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦膜炎)膀胱(膽囊炎)以及尿道和血流。
參考文獻(xiàn)1.Ang CW等人，(2001)Infect Immun.69(4)2462-2469.
2.Rees等人，(1995)N Eng1 J Med 3331374-1379.
彎曲桿菌病的治療罹患彎曲桿菌病的患者如果痢疾持續(xù)應(yīng)當(dāng)飲用足量的液體以維持水平衡?？沽〖菜幬锢缈┡啥“房梢跃徑庖恍┌Y狀。彎曲桿菌病通常是自限疾病，但是一旦發(fā)現(xiàn)，建議使用抗生素進(jìn)行特異治療，因?yàn)橹委熆梢钥s短病程。在更為嚴(yán)重的腸胃炎病例中，通常在指導(dǎo)組培結(jié)果以前就使用抗生素。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、克拉霉素或阿奇霉素)是對空腸彎曲桿菌最有效的藥物。也可以使用氟化蒽醌類抗生素(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星或莫西殺星)。
但是在許多國家已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了彎曲桿菌對抗生素藥物的抗性，并且在升高(Pedungton和Kaneene(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2)161-170)。在歐洲、亞洲和美國對蒽醌的抗性在升高。抗性的升高至少部分與在家禽飼料中使用抗生素有關(guān)(Smith等人，(1999)N Eng1J Med 3401525-1532。
彎曲桿菌治療、預(yù)防和診斷的新策略因?yàn)椴±脑黾右约翱剐缘膹V泛出現(xiàn)，對開發(fā)新型有效的用于治療和預(yù)防彎曲桿菌感染的制品有著相當(dāng)大的需要。一方面，由于抗性的出現(xiàn)，需要有新型的抗彎曲桿菌化合物。另一方面觀察和實(shí)驗(yàn)研究提供了在人中出現(xiàn)獲得性免疫性的證據(jù)，這對疫苗開發(fā)的觀念提供了支持，特別是對于危險(xiǎn)人群(Scott和Tribble(2000)InCampylobacter，第二版.Nachamkin和Blaser編，American Societyfor Microbiology，pp.303-319)。此外，需要有新型的快速可靠方法診斷彎曲桿菌感染。
這些目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)可以通過鑒定和使用適宜的彎曲桿菌多肽，這些多肽可以作為靶標(biāo)，即免疫系統(tǒng)和/或抗體的靶標(biāo)、細(xì)胞毒性抑制劑的靶標(biāo)或者診斷中指示分子的靶標(biāo)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及的是空腸彎曲桿菌的表面定位多肽。在本申請的上下文中，“表面定位”多肽定義為至少部分地(即多肽鏈的部分或者多肽分子群的一部分)定位于空腸彎曲桿菌細(xì)胞外膜以外的多肽。因此，表面定位的多肽是完全或者部分暴露于外膜以外空間的多肽。表面定位的多肽還包括所有能夠在通過這里描述的低pH表面蛋白提取獲得的級分中被鑒別的多肽或者多肽片段。
表面定位的多肽是抗菌治療和/或細(xì)菌感染診斷中引人注目的靶標(biāo)，因?yàn)檫@種多肽暴露于細(xì)胞外空間意味著與這些多肽相互作用的化合物(例如用于預(yù)防、治療或者診斷細(xì)菌感染的化合物)通常不需要進(jìn)入或者穿過外膜就可以發(fā)揮作用。
空腸彎曲桿菌多肽在細(xì)胞表面的定位現(xiàn)在只能實(shí)驗(yàn)確定，不能用生物信息學(xué)確定，因?yàn)閷@種定位還沒有共同的分選信號或者基序。有可能以一定程度的確定性預(yù)測多肽是否進(jìn)入周質(zhì)，但是還沒有確定多肽表面定位的一般基序，因此還不能僅從序列就預(yù)測任何給定的周質(zhì)多肽(或者非周質(zhì)多肽)是否被運(yùn)輸?shù)奖砻妗Ｔ诳漳c彎曲桿菌中確證的表面多肽的數(shù)目相對較少，主要包括鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白和少量非鞭毛相關(guān)的表面蛋白，例如PEB1-4。
本發(fā)明的發(fā)明者在空腸彎曲桿菌的細(xì)胞表面級分中鑒別了51種不同的多肽。使用的方法確定了表達(dá)水平相對較高的多肽。這些多肽暴露于表面，同時(shí)以相對大的量存在，使它們非常適于作為抗體的靶標(biāo)，因此用于被動或者主動免疫/疫苗接種。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及一種用作藥物的組合物，其包含-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的表面定位彎曲桿菌多肽的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，或-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，或-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，或-能夠與所述多肽結(jié)合的抗體。
在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，用于制備免疫動物或者人抵抗彎曲桿菌，優(yōu)選為空腸彎曲桿菌感染的藥物的用途。
此外，在一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及能夠與選自SEQ ID NO1-51的多肽結(jié)合的抗體用于制造藥物以治療或預(yù)防動物或者人中彎曲桿菌，優(yōu)選為空腸彎曲桿菌的感染的用途。
所鑒別的51個(gè)表面定位的多肽中，15個(gè)(SEQ ID NO37-51)已經(jīng)在使用來自其他細(xì)菌的關(guān)鍵基因進(jìn)行同源性搜索時(shí)作為搜索命中結(jié)果得到的36000個(gè)以上的其他基因座中有所描述，參見WO02/077183。WO 02/077183沒有描述所鑒別的多肽的亞細(xì)胞定位，也沒有確定它們的表達(dá)水平。
在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及一種抗體，它能夠與選自SEQ IDNO1-36的多肽結(jié)合。
在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及一種抗體，它能夠與選自SEQ IDNO37-51的多肽結(jié)合，并且能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明上述抗體的方法。
暴露于表面與相當(dāng)大量存在兩個(gè)性質(zhì)的組合還使本發(fā)明的發(fā)明者確定的51個(gè)多肽非常適于作為診斷彎曲桿菌病的靶標(biāo)，這可以高度靈敏地檢測完整的細(xì)胞。因此，在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及了使用能夠識別這里描述的細(xì)胞表面定位多肽的指示分子，檢測空腸彎曲桿菌或者其部分的方法。
此外，51個(gè)多肽的表面定位使它們適于作為抑制劑的靶標(biāo)。這些抑制劑可以是殺菌的或者抑菌的或者阻止空腸彎曲桿菌與宿主生物相互作用(毒性)。因此，在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及了鑒別這里描述的細(xì)胞表面定位多肽的抑制劑的方法。
定義-疫苗-用于表示能夠在人或者動物中誘導(dǎo)針對微生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答的組合物。
-保護(hù)性免疫應(yīng)答-用于表示在生物體內(nèi)誘導(dǎo)記憶的免疫應(yīng)答(體液/抗體和/或細(xì)胞)，使感染性物質(zhì)(這里是空腸彎曲桿菌)與次級而不是初級應(yīng)答相遇，這樣減輕其對宿主生物的影響。
-多肽-除非特別說明，這里使用的術(shù)語“多肽”還可以指多肽的變體或片段。優(yōu)選的多肽是抗原性多肽。
-片段-用于表示多肽的非全長部分。因此，片段自身也是多肽。
-變體-給定參考多肽的變體指的是表現(xiàn)出與所述參考多肽具有一定程度序列一致性的多肽，但是又與所述參考多肽不同。
-抗原/抗原的/抗原性/免疫原/免疫原的/免疫原性-所有都指的是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。
-免疫原性載體-指的是直接或者間接輔助或加強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物。
-表達(dá)載體-指的是(優(yōu)選為重組的)用于從多核苷酸序列產(chǎn)生多肽的質(zhì)?；蚴删w或病毒。表達(dá)載體包含表達(dá)構(gòu)建體，表達(dá)構(gòu)建體包含下列各項(xiàng)的組裝(1)在基因表達(dá)中具有調(diào)控作用的遺傳元件例如啟動子或增強(qiáng)子，(2)被轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列，并且與(1)的元件有效連接；以及(3)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始和終止序列。
多肽的結(jié)合伴侶指的是能夠與所述多肽結(jié)合的分子。這種結(jié)合可以是通過另一個(gè)分子間接的，但是優(yōu)選是直接的。結(jié)合伴侶可以是任何類型的分子，例如小的疏水分子或者例如細(xì)胞或細(xì)胞外大分子如蛋白質(zhì)、糖或核酸。優(yōu)選類型的結(jié)合伴侶包括抗體、配基或抑制劑。
-多數(shù)-術(shù)語“多數(shù)”表示的是多于1個(gè)，優(yōu)選多于10個(gè)。
-指示分子-術(shù)語“指示分子”涵蓋了能夠與給定多肽和/或細(xì)胞特異結(jié)合，并且能夠產(chǎn)生可檢測信號的分子或者分子復(fù)合物。優(yōu)選地，指示分子是抗體或者包含抗體分子。因此，優(yōu)選的指示分子是與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)或者形成復(fù)合物的抗體。
-來自宿主的分子或者宿主分子-指的是通常在可以被空腸彎曲桿菌感染的宿主生物中找到的分子。宿主來源的分子優(yōu)選是多肽，優(yōu)選是人多肽。
-抗體-在這里使用的術(shù)語“抗體”要涵蓋的是抗體以及其功能等價(jià)物。因此，這包括了多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人化的、人的或者嵌合抗體、單鏈抗體以及抗體的結(jié)合片段，例如但是不止限于，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab′)2片段，F(xiàn)ab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段，抗獨(dú)特型抗體、包含抗體片段的嵌合，以及這些中任何一項(xiàng)的表位結(jié)合片段。該術(shù)語還包括多價(jià)、多特異例如雙特異抗體以及單克隆抗體的混合物。
-解離常數(shù)，Kd，是描述大分子例如抗體及其抗原之間結(jié)合(或親和性或親合力)強(qiáng)度的量度。Kd越小，結(jié)合越強(qiáng)。
-分離的-其與這里公開的多肽、多核苷酸以及抗體有關(guān)?！胺蛛x的”指的是這些多肽、多核苷酸以及抗體從其天然的(通常是細(xì)胞)環(huán)境的組分中被鑒別、分離和/或回收。天然環(huán)境的污染組分是通常干擾多肽診斷或者治療使用的物質(zhì)，可以包括酶、激素以及其他蛋白或者非蛋白溶質(zhì)。本發(fā)明的多肽、多核苷酸以及抗體優(yōu)選是分離的，本發(fā)明的疫苗和其他組合物優(yōu)選包含分離的多肽或者分離的多核苷酸或者分離的抗體。
詳述1。從實(shí)驗(yàn)ACE003b和ACE003c中每個(gè)抗原的四只隨機(jī)選擇的小鼠，取血清1∶2000稀釋，用全細(xì)胞彎曲桿菌裂解物(B，D)或者100ng重組蛋白(A，C)對其進(jìn)行Western印跡檢查。分子量標(biāo)記蛋白的分子量kD97，64，51，39，28，19，14。
圖2?？贵w滴度測定的示例。從實(shí)驗(yàn)ACE003b和ACE003c中每個(gè)抗原的四只隨機(jī)選擇的小鼠，在第21天取血清(之前在第1天和14天免疫)，系列稀釋，對相應(yīng)的重組蛋白(100ng/點(diǎn))進(jìn)行Western印跡。
圖3。小鼠口服攻毒的結(jié)果。根據(jù)以下進(jìn)行包括不同抗原和對照組合的5個(gè)實(shí)驗(yàn)方塊表示明礬陰性對照，三角表示抗原(除ACE017外)，ACE017的抗原也用三角表示，但是陽性對照是甘氨酸洗脫物(Rombus)，陰性對照是CBP(參見下面)并用方塊表示。
實(shí)驗(yàn)名稱 使用的抗原ACE003b Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明礬ACE003c Cj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明礬ACE011a Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明礬ACE011b Cj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明礬
ACE017 Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，食纖維素梭桿菌(Clostridium cellulovorans)的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBP，Sigma Aldrich C8581)，在文中提及的空腸彎曲桿菌菌株的甘氨酸洗脫物。
圖4顯示了本申請的序列表。
表1。在13個(gè)隨機(jī)選擇的空腸彎曲桿菌和一個(gè)大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)菌株中出現(xiàn)的8種抗原。對來自14種列出的菌株的全細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡，使用對所有8種抗原的血清作為探針。
來自2003年11月23日提交的丹麥優(yōu)先權(quán)申請PA 2003 01726的列表1，以及2003年11月25日提交的美國臨時(shí)申請60/524,617在這里引用作為參考。
用作藥物的組合物在第一個(gè)主要方面，本發(fā)明涉及一種用作藥物的組合物，其包含-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的表面定位彎曲桿菌多肽的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，或-能夠與所述多肽結(jié)合的抗體。
在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，組合物包含-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，
-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞。
所述的組合物可以用作疫苗用于對需要進(jìn)行免疫的個(gè)體進(jìn)行積極免疫。這在“本發(fā)明的疫苗組合物和疫苗接種方法”一節(jié)中有描述。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含的多肽包含選自SEQ ID NO1-36的序列，或者多肽包含所述序列的抗原性片段或變體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含的多肽包含選自由SEQ ID NO37-51的序列或者多肽包含所述序列的抗原性片段或變體。
在另一個(gè)重要的實(shí)施方案中，組合物包含能夠與多肽結(jié)合的抗體，所述多肽選自SEQ ID NO1-51的表面定位彎曲桿菌多肽。
所述的組合物可以例如用于對需要進(jìn)行免疫的個(gè)體進(jìn)行被動免疫。這在“本發(fā)明的抗體和制備抗體的方法”一節(jié)中有描述。
本發(fā)明的疫苗組合物和疫苗接種方法疫苗接種或者主動免疫的目的是通過使用抗原性或者免疫原性組合物誘導(dǎo)針對感染性微生物的記憶性免疫應(yīng)答，提供保護(hù)性免疫。因此，疫苗是能夠在人或者動物中誘導(dǎo)針對微生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答的組合物。
這種免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞應(yīng)答和/或體液應(yīng)答，例如特異的T細(xì)胞應(yīng)答或者抗體應(yīng)答。
因此，在一個(gè)重要的實(shí)施方案中，組合物是疫苗組合物。
即本發(fā)明涉及一種組合物作為疫苗的用途，所述組合物包含-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的空腸彎曲桿菌多肽的序序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞。
這里的變體優(yōu)選與所述的序列具有至少95％的序列一致性，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列一致性。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO1，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO2，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO3，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO4，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO5，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO6，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO7，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO8，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO9，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO10，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO11，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO12，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO13，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO14，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO15，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO16，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO17，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO18，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO19，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO20，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO21，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO22，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO23，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO24，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO25，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO26，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO27，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO28，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO29，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO30，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO31，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO32，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO33，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO34，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO35，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO36，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO37，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO38，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO39，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO40，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO41，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO42，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO43，或者其抗原性片段或變體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO43中的X1是V，X2是A，X3是T。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO43中的X1是A，X2是T，X3是A。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO44，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO45，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO46，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO47，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO48，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO49，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO50，或者其抗原性片段或變體。
在以上組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO51，或者其抗原性片段或變體。
在組合物的一些實(shí)施方案中，多肽由選自SEQ ID NO1-51的序列組成。在另一些實(shí)施方案中，多肽包含選自SEQ ID NO1-51多肽的序列或者所述序列的抗原性片段或變體，以及標(biāo)簽(例如his標(biāo)簽即多聚組氨酸標(biāo)簽)。
組合物可以只包含選自SEQ ID NO1-51中的一種多肽或者其片段或變體。但是在其他實(shí)施方案中組合物包含SEQ ID NO1-51的組中一種以上的多肽和/或選自SEQ ID NO1-51的組的多肽一種以上的片段。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含一種以上，例如2種，例如3種，例如4種，例如5種，例如6種，例如7種，例如8種，例如9種，例如10種，例如范圍在5到10，或者10個(gè)以上的一些多肽和/或片段，例如10到20范圍的，選自SEQ ID NO1-51的組的不同多肽或者其抗原性片段或變體。
類似地，組合物可以只包含本發(fā)明的一種多核苷酸、一種表達(dá)載體或者一種重組病毒或重組細(xì)胞。但是在其他實(shí)施方案中，組合物包含一種以上的多核苷酸、表達(dá)載體或者重組病毒或重組細(xì)胞，例如2種，例如3種，例如4種，例如5種，例如6種，例如7種，例如8種，例如9種，例如10種，或者多于10種，如在10到20范圍的，如這里描述的本發(fā)明中不同的多核苷酸、表達(dá)載體或者重組病毒或重組細(xì)胞。
而且，在一些實(shí)施方案中本發(fā)明的重組細(xì)胞可以表達(dá)SEQ ID NO1-51的組中一種以上多肽和/或選自SEQ ID NO1-51的組多肽的一種以上的抗原性片段或變體。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含的重組細(xì)胞包含一種以上例如2種，例如3種，例如4種，例如5種，例如6種，例如7種，例如8種，例如9種，例如10種，例如范圍在5到10，或者10種以上的一些多肽和/或片段，例如10到20范圍的，選自SEQ ID NO1-51的組的不同多肽或者其抗原性片段或變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的組合物包含多個(gè)這里描述的重組病毒或重組細(xì)胞。
包含多肽的疫苗在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含多肽的組合物，所述多肽包含選自SEQ ID NO1-51(例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))的序列或者所述序列的抗原性片段或變體，組合物用作疫苗。優(yōu)選的片段和變體是那些在這里的章節(jié)中描述的片段和變體。
因此，在本實(shí)施方案中，通過直接給服通常位于空腸彎曲桿菌細(xì)胞表面的多肽提供抗原性或者免疫原性。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，對多肽進(jìn)行選擇使疫苗組合物包含能夠與不同MHC分子(例如不同MHC I類分子)結(jié)合的多個(gè)多肽。優(yōu)選地，用作疫苗的組合物包含能夠與最頻繁出現(xiàn)的MHC I類分子結(jié)合的多肽和/或片段。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，組合物包含與MHC I類分子結(jié)合的一個(gè)或更多多肽和/或片段和/或能與MHC II類分子結(jié)合的一個(gè)或更多多肽。因此，在某些實(shí)施方案中疫苗組合物能夠產(chǎn)生特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答和/或特異的輔助T細(xì)胞應(yīng)答。與MHC分子的結(jié)合可以例如根據(jù)Andersen等人，(1999)Tissue Antigens 54185；或Tan等人，(1997)J.Immunol.Methods 20925的描述測定。
佐劑和免疫原性載體優(yōu)選地，本發(fā)明的用作疫苗的組合物，即疫苗組合物，包含藥物上可以接受的載體，這在“用于本發(fā)明的組合物”一節(jié)中有描述。
組合物還可以包含佐劑。佐劑是一些物質(zhì)，它們混合到疫苗組合物中以后增加或者改變了對多肽或者其他抗原的免疫應(yīng)答。佐劑可以例如是下列中的任何一項(xiàng)AIK(SO4)2、AlNa(SO4)2，AINH4(SO4)、硅膠、明礬、Al(OH)3，Ca3(PO4)2、高嶺土、碳、氫氧化鋁、磷酸鋁、胞壁酰二肽、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-DMP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11687，也被稱作nor-MDP)、N-乙酰-胞壁酰-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′，2′-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(CGP 19835A，也被稱作MTP-PE)、含RIBI(MPL+TDM+CWS)的2％鯊烯/Tween-80.RTM.乳劑、脂多糖和衍生物包括脂肪A，弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑、Merck佐劑65、多核苷酸(例如多聚IC和多聚AU酸)、來自結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium、tuberculosis)的蠟質(zhì)D、在短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)，百日咳桿菌(Bordetellapertussis)，和布魯氏菌屬(Brucella)的成員中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)、脂質(zhì)體或者其他脂類乳劑、Titermax、ISCOMS、QuilA、ALUN(參見US58767和5,554,372)、脂肪A衍生物、霍亂腸毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基質(zhì)或者GMDP、白介素1、白介素2、Montanide ISA-51和QS-21。用于本發(fā)明的優(yōu)選佐劑包括MontanideISA-51和QS-21。Montanide ISA-51(Seppic，Inc.)是基于礦物油的弗氏不完全佐劑的佐劑類似物，它通常作為乳劑給服。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals，F(xiàn)ramingham，MA)是高度純化的水溶性皂角苷，它作為水溶液給服。
能夠根據(jù)本發(fā)明使用的佐劑的合意功能列在下表中。
表1 佐劑的作用方式
來源John C.Cox和Alan R.Coulter Vaccine 1997 Feb；15(3)248-56根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可以包含一種以上的不同佐劑。還考慮到本發(fā)明的彎曲桿菌多肽或者其一個(gè)或更多片段以及佐劑可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞蚍珠_給服。
通常選擇的佐劑是例如與明礬沉淀的抗原組合使用的弗氏完全或者不完全佐劑，或者殺死的百日咳桿菌。在Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples & Practice(2nd edition，1986)61-63頁中提供了佐劑的一般討論。但是Goding提出當(dāng)目標(biāo)抗原分子量低或者免疫原性弱時(shí)，則推薦其與免疫原性載體偶聯(lián)(見下面)。已經(jīng)提示各種不同的皂角苷提取物和細(xì)胞因子在免疫原性組合物中可以用作佐劑。最近提議使用一個(gè)眾所周知的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)作為佐劑(WO 97/28816)。
此外，本發(fā)明的疫苗組合物可以包含免疫原性載體例如支架結(jié)構(gòu)，例如蛋白或者多糖，彎曲桿菌多肽或其片段能夠與所述支架結(jié)構(gòu)連接。疫苗組合物中存在的彎曲桿菌多肽或者其抗原性片段或變體可以與免疫原性載體(例如蛋白)相連。多肽與載體蛋白的結(jié)合或連接可以是共價(jià)或非共價(jià)的。免疫原性載體蛋白可以獨(dú)立于佐劑存在。載體蛋白的功能可以是例如增加特定片段的分子量，以提高它們的活性或免疫原性，賦予穩(wěn)定性，增加生物活性或者提高在血清中的半壽期。而且，免疫原性載體蛋白可以幫助彎曲桿菌多肽或者其片段向T細(xì)胞的呈遞。載體蛋白可以是但是不止限于，匙孔血藍(lán)蛋白、血清蛋白例如鐵傳遞蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白、或者激素例如胰島素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，破傷風(fēng)類毒素和/或百日咳類毒素也是適宜的載體。另外，可以加入葡聚糖例如sepharose。在另一個(gè)實(shí)施方案中，也可以加入抗原呈遞細(xì)胞(例如能夠?qū)⒍嚯幕蛘咂淦蜗騎細(xì)胞呈遞的樹突狀細(xì)胞)以獲得與載體蛋白相同的效果。
制備疫苗組合物的方法已經(jīng)例如在US 5,470,958和其中的參考文獻(xiàn)中討論。如果注射的話，本發(fā)明疫苗組合物的有效量多肽組分，對于人受試對象而言，通常的范圍是從大約0.1到大約1000μg，例如從大約1到大約900μg，例如從大約5到大約500μg，一般在從大約0.01到大約10.0μg/kg受試動物體重。以上提到的范圍只是指示性的，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
本發(fā)明的有效量抗原性多肽可以是在沒有免疫調(diào)節(jié)劑的情況下能夠引發(fā)可檢測到的體液免疫應(yīng)答的量。對于許多免疫原，對人受試對象，這是在大約5-100μg的范圍中。要使用的適當(dāng)量的免疫原取決于需要免疫原引發(fā)的免疫應(yīng)答。而且，所需的確切有效量隨受試對象不同而不同，取決于受試對象的物種、年齡和一般情況，正在治療的病況的嚴(yán)重性、給藥方式等等。因此不是總能夠明確確切的有效量。但是適當(dāng)?shù)挠行Я靠梢杂杀绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)或者本領(lǐng)域的先驗(yàn)進(jìn)行確定。
DNA疫苗組合物和包含重組病毒或重組細(xì)胞的疫苗組合物DNA或RNA疫苗指的是通過在患者的細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸構(gòu)建體將例如抗原性多肽決定簇引入患者中，所述多核苷酸構(gòu)建體包括與目標(biāo)多肽(這里是SEQ ID NO1-51的任何一個(gè)多肽或者是其抗原性片段或變體)的編碼序列有效連接的表達(dá)控制序列。由于這種片段可能不含有甲硫氨酸起始密碼子，還選擇地包括這種密碼子作為表達(dá)控制序列的部分。多核苷酸構(gòu)建體可以是非復(fù)制的和線形的多核苷酸、環(huán)形表達(dá)載體或者自主復(fù)制質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體。構(gòu)建體可以整合到宿主基因組中?？梢赞D(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體可以用于根據(jù)本發(fā)明的個(gè)體免疫方法中。構(gòu)建表達(dá)載體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(參見例如Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook等人，，編，Cold Spring Harbor Laboratory，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。優(yōu)選的是包含大量基因的組合物，所述基因表達(dá)選自本發(fā)明的SEQ ID NO1-51的多種多肽和/或本發(fā)明的多種抗原性片段，籍此可以針對多種不同的預(yù)選靶標(biāo)同時(shí)進(jìn)行疫苗接種。
也可以通過將編碼特異抗原性多肽的多核苷酸摻入到活的但是無害的載體例如病毒或細(xì)胞(例如減毒或毒性降低的大腸桿菌或沙門氏菌)中制備疫苗。無害的重組病毒或者重組細(xì)胞注射到目標(biāo)接受者中。這種重組細(xì)胞可以是死的或者活的。如果是活的，重組生物可以在宿主中復(fù)制，同時(shí)產(chǎn)生并且向宿主免疫系統(tǒng)呈遞抗原性多肽。還考慮到這種類型的疫苗可能比非復(fù)制類型的疫苗更為有效。為了使這種疫苗有效，載體生物必須是有生活力的，且或者是天然的無毒的或者具有減毒或毒性降低的表型。
使用減毒細(xì)菌進(jìn)行疫苗接種的策略和用于疫苗接種的適宜細(xì)菌菌株已經(jīng)在例如Makino等人，(2001)Microb.Pathog.311-8；Gentschev等人，(2002)Int.J.Med.Microbiol.291577-582；Turner等人，(2001)Infect.Immun.694969-4979；WO99/49026；和WO03/022307中描述。
可以應(yīng)用的載體的其他示例是包含例如WO 90/07936，WO91/02805，WO 93/25234，WO 93/25698，和WO 94/03622公開的逆轉(zhuǎn)錄病毒，如Berkner，Biotechniques 6616-627，1988；Li等人，Hum.Gene Ther.4403-409，1993；Vincent等人，Nat.Genet.5130-134，1993；和Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994)公開的腺病毒，如U.S.4,769,330；U.S.Pat.No.5,017,487；和WO 89/01973中公開的痘病毒，如WO 90/11092公開的裸露DNA，如WO 93/03709公開的與多陽離子分子復(fù)合的多核苷酸分子以及如Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847851，1987公開的與脂質(zhì)體結(jié)合的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，DNA可以與殺死或者滅活的腺病毒連接，如Curiel等人，Hum.Gene Ther.3147-154，1992；Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896094，1992公開的。其他適宜的組合物包括如Wu等人，J.Biol.Chem.26416985-16987，1989公開的DNA配基，以及如Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417，1989公開的脂-DNA組合。此外，可以通過將DNA包被到可生物降解的橡膠珠上提高細(xì)胞攝取裸露DNA的效率。
疫苗載體優(yōu)選包含與編碼免疫原性多肽的多核苷酸序列有效連接的適宜啟動子。本發(fā)明中可以使用任何能夠在靶標(biāo)細(xì)胞中指導(dǎo)高水平轉(zhuǎn)錄起始的啟動子。因此非組織特異的啟動子例如巨細(xì)胞病毒(DeBernardi等人，Proc Natl Acad Sci USA 889257-9261，以及其中的參考文獻(xiàn))、小鼠金屬硫蛋白I(Hammer等人，J Mol ApplGen 1273-288)、HSV胸腺嘧啶激酶(McKnight，Cell 31355-365)和SV40早期(Benoist等人，Nature 290304-310)啟動子也可以使用。
疫苗接種的方法在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及的是任何一種或者更多-多肽，其包含選自SEQ ID NO1-51的序列(例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))；或者包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含編碼所述多肽的序列的多核苷酸，-包含編碼所述多肽的序列的表達(dá)載體，或者-包含所述多核苷酸或所述表達(dá)載體的重組病毒或重組細(xì)胞，的用途，其用于制備用于免疫動物或人以抵御空腸彎曲桿菌的感染的藥物。優(yōu)選地，免疫誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
類似地，本發(fā)明涉及了免疫免疫動物或人以抵御空腸彎曲桿菌感染的方法，包含給服一個(gè)或更多-多肽，其包含SEQ ID NO1-51的任何序列，例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè)；或者包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含編碼所述多肽的序列的多核苷酸，-包含編碼所述多肽的序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或所述表達(dá)載體的重組病毒或重組細(xì)胞，的步驟，籍此免疫所述動物或人以抵抗空腸彎曲桿菌的感染。
動物可以是任何鳥或者哺乳動物，例如雞、鴨、火雞、奶?；蛘哓i。特殊的靶標(biāo)人群可以是來自危險(xiǎn)群體(例如4周歲以下的兒童群體、工業(yè)化國家的人群或者到發(fā)展中國家的未接觸過抗原或者半免疫的旅行者群體)的個(gè)體。
根據(jù)本發(fā)明的組合物的給藥方式包括，但是不止限于全身給藥例如靜脈內(nèi)或者皮下給藥，皮內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、口服給藥以及一般地任何形式的粘膜給藥。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性作用可以例如通過如RIA檢測血清樣品中的抗體進(jìn)行測定。此外，可以通過測定例如對T細(xì)胞依賴性抗原性多肽之T細(xì)胞反應(yīng)性的增加測定這種作用，其中所述的增加的反應(yīng)性是針對這種抗原性多肽的正常免疫應(yīng)答提高的特征。免疫刺激作用還可以以尤其是IL-2，IL-3，IFN-γ和/或GM-CSF的T細(xì)胞產(chǎn)生，增加進(jìn)行測定。這樣可以通過篩選T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，IL-3，IFN-γ或GM-CSF的增加，容易地鑒定出具有誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的多肽或者其片段，如US 07/779,499中描述的，在這里引用作為參考。Young等人，(2000)在Campylobacter，第二版.Nachamkin和Blaser編，AmericanSociety for Microbiology，pp.287-301中也描述了一系列適宜的動物模型，它們可以用于治療和預(yù)防策略以及組合物的效力評價(jià)上。Scott and Tribble(2000)在Campylobacter，第二版.Nachamkin和Blaser編，American Society for Microbiology，pp.303-319中描述了與針對彎曲桿菌免疫相關(guān)的許多方面，包括可能的靶標(biāo)人群，動物模型和疫苗接種策略。
這里描述的多核苷酸和表達(dá)載體可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法引入到靶標(biāo)細(xì)胞中例如作為裸露DNA(Donnelly等人，Annu Rev Immunol 15617-648)、整合到IS-COMS中、脂質(zhì)體或者紅細(xì)胞血影、或者通過生物彈射擊轉(zhuǎn)移，鈣沉淀或者電穿孔?；蛘呖梢允褂没诓《镜妮d體作為將編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸引入到動物或人細(xì)胞中的方式。優(yōu)選的病毒載體包括那些來自復(fù)制缺陷的肝炎病毒(例如HBV和HCV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(參見例如WO89/07136；和Rosenberg等人，NEng J Med 323(9)570-578)、腺病毒(參見例如，Morsey等人，J Cell Biochem，Supp.17E)、腺相關(guān)病毒(Kotin等人，Proc Natl Acad Sci USA 872211-2215)、復(fù)制缺陷的單純皰疹病毒(HSV；Lu等人，摘要，66頁，Abstracts of theMeeting on Gene Therapy，Sep.22-26，1992，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)、金絲雀痘病毒，以及這些載體的任何改良版本。如需要，在導(dǎo)入患者前可體外培養(yǎng)和克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
除了直接體內(nèi)步驟，也可以使用離體步驟，其中細(xì)胞取自動物，修飾后放到相同或者另一只動物上。顯然可以使用任何以上提到的組合物，在離體的背景下，將根據(jù)本發(fā)明的抗原性多肽或者編碼這種多肽的多核苷酸引入組織細(xì)胞。病毒、物理和化學(xué)的攝取實(shí)驗(yàn)方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。因此作為向患者直接給服本發(fā)明的多肽或者能夠表達(dá)這種多肽的載體的另一種選擇，可以從患者中取出輔助T細(xì)胞；使用相同的抗原性多肽或載體離體刺激那些T細(xì)胞；將刺激后的T細(xì)胞引入到同一患者中。
本發(fā)明的抗體和制備抗體的方法在另一個(gè)主要的實(shí)施方案中，用作藥物的組合物包含能夠結(jié)合多肽的抗體，所述多肽選自SEQ ID NO1-51的表面定位彎曲桿菌多肽。這樣的藥物可以用于抗體治療，例如對需要接受的個(gè)體進(jìn)行被動免疫。
因此在另一個(gè)主要的方面中，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合(優(yōu)選是特異結(jié)合)多肽的抗體，所述多肽選自SEQ ID NO1-36和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO1的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO2的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO3的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO4的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO5的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO6的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ IDNO7的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO8的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO9的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO10的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO11的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO12的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO13的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO14的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO15的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ IDNO16的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO17的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO18的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO19的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO20的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO21的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO22的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO23的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO24的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ IDNO25的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO26的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO27的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO28的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO29的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO30的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO31的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO32的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO33的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ IDNO34的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO35的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO36表示的多肽和/或其片段和/或其變體，在這個(gè)上下文中，“特異結(jié)合”并不是意味著絕對的特異性。在一些實(shí)施方案中抗體也可以特異結(jié)合例如來自其他彎曲桿菌種類的多肽，這些多肽與來自空腸彎曲桿菌的多肽有高度的序列一致性，例如與來自空腸彎曲桿菌的多肽有90％以上的，例如95％以上的或者98％以上的序列一致性的多肽。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體能夠結(jié)合(優(yōu)選地特異結(jié)合)選自SEQID NO1-36的多肽，例如SEQ ID NO1的多肽，例如SEQ ID NO2的多肽，例如SEQ ID NO3的多肽，例如SEQ ID NO4的多肽，例如SEQ ID NO5的多肽，例如SEQ ID NO6的多肽，例如SEQ IDNO7的多肽，例如SEQ ID NO8的多肽，例如SEQ ID NO9的多肽，例如SEQ ID NO10的多肽，例如SEQ ID NO11的多肽，例如SEQ ID NO12的多肽，例如SEQ ID NO13的多肽，例如SEQID NO14的多肽，例如SEQ ID NO15的多肽，例如SEQ ID NO16的多肽，例如SEQ ID NO17的多肽，例如SEQ ID NO18的多肽，例如SEQ ID NO19的多肽，例如SEQ ID NO20的多肽，例如SEQ ID NO21的多肽，例如SEQ ID NO22的多肽，例如SEQ IDNO23的多肽，例如SEQ ID NO24的多肽，例如SEQ ID NO25的多肽，例如SEQ ID NO26的多肽，例如SEQ ID NO27的多肽，例如SEQ ID NO28的多肽，例如SEQ ID NO29的多肽，例如SEQID NO30的多肽，例如SEQ ID NO31的多肽，例如SEQ ID NO32的多肽，例如SEQ ID NO33的多肽，例如SEQ ID NO34的多肽，例如SEQ ID NO35的多肽，例如SEQ ID NO36的多肽。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體還能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合，即能夠結(jié)合保持其結(jié)構(gòu)完整性(優(yōu)選是保持其外膜完整性，即其中外膜沒有被通透化)的生活的或者死亡的空腸彎曲桿菌細(xì)胞?？贵w與完整細(xì)胞的結(jié)合可以例如通過流式細(xì)胞儀，根據(jù)Rioux等人，(2001)Infect.Immun.695162-5165或者在Singh等人，(2003)Infect.Immun.713937-3946中的描述測定。
在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合，優(yōu)選特異結(jié)合完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞并且能夠結(jié)合，優(yōu)選特異結(jié)合選自SEQ ID NO37-51的多肽和/或其片段和/或其變體的抗體，例如SEQ ID NO37的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO38的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO39的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO40的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ IDNO41的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO42的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO43的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO44的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO45的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO46的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO47的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO48的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO49的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ IDNO50的多肽和/或其片段和/或其變體，例如SEQ ID NO51的多肽和/或其片段和/或其變體。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體能夠結(jié)合，優(yōu)選特異結(jié)合完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞并且能夠結(jié)合，優(yōu)選特異結(jié)合選自SEQ ID NO37-51的多肽，例如SEQ ID NO37的多肽，例如SEQ ID NO38的多肽，例如SEQ ID NO39的多肽，例如SEQ ID NO40的多肽，例如SEQID NO41的多肽，例如SEQ ID NO42的多肽，例如SEQ ID NO43的多肽，例如SEQ ID NO44的多肽，例如SEQ ID NO45的多肽，例如SEQ ID NO46的多肽，例如SEQ ID NO47的多肽，例如SEQ ID NO48的多肽，例如SEQ ID NO49的多肽，例如SEQ IDNO50的多肽，例如SEQ ID NO51的多肽。
優(yōu)選的抗體是結(jié)合的解離常數(shù)或Kd低于5×10-6M的抗體，例如低于10-6M，例如低于5×10-7M，例如低于10-7M，例如低于5×10-8M，例如低于10-8M，例如低于5×10-9M，例如低于10-9M，例如低于5×10-10M，例如低于10-10M，例如低于5×10-11M，例如低于10-11M，例如低于5×10-12M，例如低于10-12M，例如低于5×10-13M，例如低于10-13M，例如低于5×10-14M，例如低于10-14M，例如低于5×10-15M，或者低于10-15M。可以使用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法，例如ELISA(例如如Orosz和Ovadi(2002)J.Immunol.Methods 270155-162中的描述)或表面等離子共振分析測定結(jié)合常數(shù)。
抗體可以用于哺乳動物(優(yōu)選是人，更優(yōu)選是免疫損害患者)的被動免疫。可以進(jìn)行使用抗體的治療以治愈或者防止空腸彎曲桿菌的感染。
本發(fā)明的抗體包括以下優(yōu)選的機(jī)理組1.作為抗菌(影響細(xì)菌的生活力)物質(zhì)起作用的功能抑制抗體。不論患者的免疫狀態(tài)如何，這種抗體都應(yīng)當(dāng)是有效的。優(yōu)選地，這些抗體能夠減緩空腸彎曲桿菌的生長至低于50％(例如低于25％例如低于10％，例如低于5％)未加入抗體的對照的生長。
2.設(shè)計(jì)目的是增強(qiáng)吞噬細(xì)胞殺死的調(diào)理抗體。這種抗體的有效性可以取決于患者的免疫狀態(tài)，但是即使在免疫損害的患者中它們也非常有可能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞殺死。
3.與治療性分子例如毒素或殺菌物質(zhì)(例如篦麻毒素)或放射性同位素偶聯(lián)的抗體。偶聯(lián)治療性分子與抗體的技術(shù)是眾所周知的，參見例如Thorpe等人，(1982)Immunol.Rev.62，119-158。不論患者的免疫狀態(tài)如何，這種抗體都應(yīng)當(dāng)是有效的。
有或者沒有治療性分子偶聯(lián)的抗體可以用作治療劑，它可以單獨(dú)給服或者與化療劑或者其他治療藥物組合使用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是調(diào)理的而且是抑制功能的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是調(diào)理的但不是抑制功能的。后一組抗體可以是例如針對彎曲桿菌生活力非必需的靶標(biāo)多肽的抗體。
在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及了在非人的動物中制備抗多肽抗體的方法，所述多肽選自SEQ ID NO1-36，包括以下步驟a.提供-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-36的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，或-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，或-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，b.將包含所述多肽、多核苷酸、載體、重組病毒或重組細(xì)胞的組合物引入所述動物中，c.在所述動物中制備抗體，以及d.分離抗體以及任選地，純化抗體。
在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及了在非人的動物中制備抗多肽抗體的方法，所述多肽選自SEQ ID NO37-51，其中的抗體能夠結(jié)合完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞，方法包括以下步驟a.提供-多肽，它包含選自SEQ ID NO37-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體；或-包含編碼所述多肽的序列的多核苷酸；或-包含編碼所述多肽的序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，b.將包含所述多肽、多核苷酸、載體、重組病毒或重組細(xì)胞的組合物引入所述動物中，c.在所述動物中制備抗體，d.分離抗體以及任選地，純化抗體，以及e 篩選能夠結(jié)合完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞的抗體。
優(yōu)選地在能夠產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物中進(jìn)行以上方法。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以上方法是非治療性的。
單克隆/多克隆抗體本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體，或者多克隆抗體，或者單克隆抗體的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體或者其片段。單克隆抗體(Mab′s)是這樣的抗體，其中每個(gè)抗體分子都是相似的，因此識別相同的表位?？贵w可以是任何種類的抗體，但是優(yōu)選是IgG或IgA抗體。
一般通過雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體。制備單克隆抗體以及制備合成抗體的雜交瘤的方法對本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員是眾所周知的。產(chǎn)生抗體的雜交瘤可以例如通過產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與無限增殖化的細(xì)胞系融合制備?？梢酝ㄟ^以下步驟制備單克隆抗體。使用抗原(例如全長多肽或者其片段)免疫動物。通常通過向免疫活性的哺乳動物給服免疫有效量(即足以產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量)的抗原，完成免疫。優(yōu)選地，哺乳動物是嚙齒動物例如家兔、大鼠或小鼠。然后對哺乳動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫程序，加強(qiáng)免疫的時(shí)間足以使哺乳動物產(chǎn)生高親和性的抗體分子。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞懸液取自每只分泌所需抗體的經(jīng)過免疫的哺乳動物。在充足時(shí)間產(chǎn)生高親和性抗體之后，處死動物(例如小鼠)，從一個(gè)或更多的淋巴結(jié)、脾臟和外周血中獲得產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞。優(yōu)選的是脾細(xì)胞，它們可以在生理培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法被機(jī)械地分成單個(gè)細(xì)胞。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞通過與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合而無限增殖化。小鼠淋巴細(xì)胞與小鼠的同源骨髓瘤產(chǎn)生高百分比的穩(wěn)定融合，但是也可以使用大鼠、家兔和青蛙的體細(xì)胞。一般在融合劑例如聚乙二醇的存在下通過與骨髓瘤細(xì)胞融合使所需的產(chǎn)生抗體的動物的脾細(xì)胞無限增殖化。適于作為融合伴侶的多種骨髓瘤細(xì)胞系的任何一種可以是，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞系，可以從位于Rockville，Md的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。
還可以使用其他對重組DNA技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的方法產(chǎn)生單克隆抗體。已經(jīng)開發(fā)出了另外一種替代方法，被稱為“組合抗體展示”方法，用于鑒定和分離具有某種特異性的抗體片段，并且可以用于制備單克隆抗體。
多克隆抗體是識別特定給定抗原的抗體分子的混合物，因此多克隆抗體可以識別例如多肽內(nèi)的不同表位。多克隆抗體一般從已經(jīng)接受抗原免疫的哺乳動物的血清中純化。多克隆抗體可以例如根據(jù)AntibodiesA Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，ColdSpring Harbor Labora tory Press，1988中描述的任何方法制備。多克隆抗體可以來自任何適宜的哺乳動物，例如來自小鼠、大鼠、家兔、驢、山羊和綿羊。
特異性本發(fā)明抗體的特異性可以是針對SEQ ID NO1-51中任何一個(gè)多肽的單特異性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是雙特異的或者多特異的，其具有至少一部分對SEQ ID NO1-51中任何一個(gè)多肽是特異的。
單克隆抗體可以是單價(jià)的，即只有一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對于單價(jià)抗體，免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸序列優(yōu)選包含在本領(lǐng)域中被稱為CH1，CH2，CH3和CH4的抗體分子結(jié)構(gòu)部分。優(yōu)選地是那些在本領(lǐng)域內(nèi)被稱為CL的結(jié)構(gòu)部分。此外，恒定結(jié)構(gòu)域可以是重鏈或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(分別是CH或CL)，本發(fā)明涉及多種不同的單價(jià)抗體組合物。例如，輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域能夠與另一個(gè)輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域或者與一個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域通過二硫橋結(jié)合。相反，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域可以形成兩個(gè)獨(dú)立的二硫橋，產(chǎn)生與另一條重鏈和一條輕鏈通過二硫橋連接或者形成重鏈多聚物的可能性。因此在另一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及包含單價(jià)多肽的組合物，其中的恒定鏈結(jié)構(gòu)域C具有能夠形成至少一個(gè)二硫橋的半胱氨酸，且組合物包含至少兩條由所述二硫橋共價(jià)連接的單價(jià)多肽。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是具有至少兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多價(jià)抗體。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以對相同配基或者對不同配基具有特異性。
多特異性，包括雙特異性在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及多特異性抗體，它具有對至少兩個(gè)不同實(shí)體的親和性，并且能夠與這兩個(gè)實(shí)體特異結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體是雙特異性抗體，它攜帶至少兩個(gè)不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)來自抗體。本發(fā)明的雙特異分子還可以是單鏈雙特異分子。多特異分子也可以是單鏈分子或者可以包含至少兩個(gè)單鏈分子。多特異，包含雙特異的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道的任何適宜方式制備。已經(jīng)開發(fā)出多種方法，例如在WO94/09131；WO 94/13804；WO 94/13806或美國專利Nos.5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858中描述的方法。
使用根據(jù)本發(fā)明的雙特異性或者多特異性抗體，與單特異性/單價(jià)抗體相比提供了幾個(gè)優(yōu)勢。雙特異性/多特異性抗體具有的第一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異識別和結(jié)合SEQ ID NO1-51所示空腸彎曲桿菌多肽中的任何一個(gè)，而另一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用于其他目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)另外的結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于與空腸彎曲桿菌多肽結(jié)合，例如與第一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的相同空腸彎曲桿菌多肽上的另一個(gè)表位結(jié)合。這樣，對空腸彎曲桿菌的特異性可能提高，且抗體的親和力也可能提高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用至少一個(gè)其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域與哺乳動物細(xì)胞例如人的細(xì)胞特異結(jié)合。優(yōu)選地，至少另一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合免疫活性細(xì)胞例如白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和/或嗜曙紅細(xì)胞，目的是增強(qiáng)抗體在治療方法中的作用。可以通過確定至少一個(gè)其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異結(jié)合哺乳動物蛋白(例如人蛋白，例如選自分化群蛋白(CD)中的任何一個(gè)蛋白特別是CD64和/或CD89)實(shí)現(xiàn)上述要求。
人化抗體使用非人抗體用于人的治療并不總是合意的，因?yàn)榉侨说摹巴庠础北砦豢赡軙l(fā)待治療個(gè)體中的免疫應(yīng)答。為了消除或者使與非人抗體相關(guān)的問題最少化，最好對嵌合抗體衍生物進(jìn)行工程化，即將非人的Fab可變區(qū)結(jié)合決定簇與人的恒定區(qū)(Fc)結(jié)合，使抗體分子“人化”。這種抗體表征為具有與以上描述的單克隆抗體和多克隆抗體等價(jià)的抗原特異性和親和性，以及向人給服時(shí)更低的免疫原性，因此更有可能被待治療的個(gè)體耐受。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人化抗體。人化抗體一般是嵌合抗體，包含來自人抗體的區(qū)域和來自非人抗體例如嚙齒動物抗體的區(qū)域。人化(也被稱為改型或者CDR移植)是已為大家接受的的技術(shù)，用于降低異種來源(通常是嚙齒類)單克隆抗體的免疫原性、增加與人免疫球蛋白的同源性并且增強(qiáng)它們對人免疫系統(tǒng)的活化。因此，人化抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基以及可能有一些框架殘基被來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代。
人化抗體必需保持對抗原的高度親和性以及其他有利的生物學(xué)性質(zhì)。為了達(dá)到這個(gè)目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，使用親本和人化序列的三維模型對親本序列以及多種不同的理論產(chǎn)物進(jìn)行分析，制備人化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可以獲得的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。可以獲得計(jì)算機(jī)程序，闡明和顯示了所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這些顯示進(jìn)行研究，可以對某些殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用進(jìn)行分析，即對影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的殘基進(jìn)行分析。這樣，雖然是CDR殘基直接并且最顯著地影響抗體結(jié)合，但是可以從受體序列和輸入序列中選擇和組合FR殘基，使所需的抗體特征(例如對于靶標(biāo)抗原增加的親和性)被最大化。
獲得人化單抗的一種方法涉及制備嵌合抗體，在所述嵌合抗體中，包含一個(gè)抗體完整可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點(diǎn)與來自第二個(gè)抗體(優(yōu)選是人抗體)的恒定結(jié)構(gòu)域融合。實(shí)施這種嵌合化步驟的方法是例如在EP-A-0 120 694(Celltech Limited)，EP-A-0 125 023(GenentechInc.)，EP-A-0 171 496(Res.Dev.Corp.Japan)，EP-A-0173494(Stanford University)和EP-A-0 194 276(Celltech Limited)中描述的方法。
本發(fā)明的人化抗體可以通過能夠使用來自非人抗體的CDR替換至少一部分人抗體CDR的方法進(jìn)行。Winter描述了可以用于制備本發(fā)明人化抗體的方法(英國專利申請GB 2188638A)，其內(nèi)容在這里引用作為參考。
作為示例，本發(fā)明的人化抗體可以通過以下過程制備(a)通過常規(guī)技術(shù)構(gòu)建含有操縱子以及編碼抗體重鏈的DNA序列的表達(dá)載體，其中CDR和需要保持抗體結(jié)合特異性的這些可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的最小部分來自非人免疫球蛋白，抗體鏈的剩余部分來自人免疫球蛋白；(b)通過常規(guī)技術(shù)構(gòu)建含有操縱子以及編碼互補(bǔ)抗體輕鏈的DNA序列的表達(dá)載體，其中CDR和需要保持供體抗體結(jié)合特異性的這些可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的最小部分來自非人免疫球蛋白，抗體鏈的剩余部分來自人免疫球蛋白；(c)通過常規(guī)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中；以及(d)通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，產(chǎn)生人化抗體。
可以使用本發(fā)明的兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，第一個(gè)載體含有的操縱子編碼來自輕鏈的多肽，第二個(gè)載體含有的操縱子編碼來自重鏈的多肽。兩個(gè)載體含有不同的篩選標(biāo)記，但是此外除了抗體重鏈和輕鏈多肽序列外，優(yōu)選地兩個(gè)載體是相同的，以盡可能保證重鏈和輕鏈多肽的相同表達(dá)。或者可以使用單一載體，載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。輕鏈和重鏈多肽的編碼序列可以包含cDNA或者基因組DNA或者二者均包含。
用于表達(dá)本發(fā)明改變抗體的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌或者真核細(xì)胞。特別是可以使用用于該目的的明確確定類型的哺乳動物細(xì)胞，例如骨髓瘤細(xì)胞或者中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
構(gòu)建本發(fā)明載體的一般方法、產(chǎn)生本發(fā)明宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法以及從這些宿主細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明抗體所需的培養(yǎng)方法都是常規(guī)的技術(shù)。同樣，一旦制備出來，本發(fā)明的人化抗體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟純化。
人抗體在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的是抗體，其中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域由人抗體攜帶，即其中的抗體比人化抗體具有更高程度的人肽序列。
針對人蛋白的人單抗可以使用攜帶人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠制備。使用來自這些用目標(biāo)抗原免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞制備分泌人單抗(單抗對來自人蛋白的表位具有特異親和性)的雜交瘤(參見例如Wood等人，國際申請WO 91/00906，Kucherlapati等人，PCT出版物WO 91/10741；Lonberg等人，國際申請WO92/03918；Kay等人，國際申請92/03917；Lonberg，N.等人，1994 Nature 368856-859；Green，L.L.等人，1994 NatureGenet.713-21；Morrison，S.L.等人，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Bruggeman等人，1993 Year Immunol 733-40；Tuaillon等人，1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman等人，1991 Eur J Immunol 211323-1326)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠可以從Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，Calif.，和Medarex，Inc.，Annandale，N.J獲得。已經(jīng)描述了在種系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(IH)基因的同源刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變體小鼠中會使小鼠在接受抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體，參見例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.733(1993)；和Duchosal等人，Nature 355258(1992)。人抗體也可以來自噬菌體展示文庫(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1992)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan，等人，，NatureBiotech 14309(1996))。
制備人單克隆抗體的適宜方法還已經(jīng)在WO03/017935，WO02/100348，US 2003 091561，和US 2003 194403中有所描述。
抗體的結(jié)合片段在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是抗體片段，優(yōu)選是抗原結(jié)合片段或者可變區(qū)。在本發(fā)明中有用的抗體片段的示例包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，它們被稱為Fab片段，每一個(gè)都有單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)以及殘留的″Fc″片段，這樣稱呼是因?yàn)樗子诮Y(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合片段、能夠交聯(lián)抗原的F(ab′)2片段以及另一個(gè)殘留片段(被稱為pFc′)。其他片段可以包括由抗體片段形成的雙功能抗體、線形抗體、單鏈抗體分子以及多特異性抗體。
抗體片段Fab、Fv和scFv與整個(gè)抗體的區(qū)別在于抗體片段只攜帶單一抗原結(jié)合位點(diǎn)。已經(jīng)通過多種方式，例如通過在Fv的VH的C端引入的半胱氨酸(Cumber等人，，1992)或者在scFv的VL的C端引入的半胱氨酸(Pack and Pluckthun，1992)，或者通過Fab的鉸鏈半胱氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)(Carter等人，，1992)，制備了具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的重組片段。
優(yōu)選的抗體片段保留了抗體的一些或者基本上所有的選擇性結(jié)合其抗原的能力。一些優(yōu)選的片段如下面確定(1)Fab是含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段。Fab片段可以通過木瓜蛋白酶消化完整抗體，產(chǎn)生完整的輕鏈和一條重鏈的一部分而獲得。
(2)Fab′是抗體分子的片段，可以通過使用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體之后進(jìn)行還原，產(chǎn)生完整的輕鏈和重鏈的一部分而獲得。每個(gè)抗體分子得到兩個(gè)Fab′片段。Fab′片段與Fab片段的區(qū)別在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了幾個(gè)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或更多半胱氨酸。
(3)F(ab′)2是抗體的片段，其可以通過使用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體接下來不進(jìn)行還原而獲得。F(ab′)2是兩個(gè)Fab′片段由兩個(gè)二硫鍵連接的二聚體。
(4)Fv是最小的抗體片段，它含有完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)。該區(qū)域由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域以松散、非共價(jià)結(jié)合而成的二聚體(VH-VL二聚體)組成。正是這種構(gòu)型使來自所有可變結(jié)構(gòu)域的CDR相互作用，確定了VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR共同賦予了抗體抗原結(jié)合特異性。但是，即使是單可變結(jié)構(gòu)域(或者只包含對抗原特異的三個(gè)CDR的一半Fv)也具有識別和結(jié)合抗體的能力，盡管比整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親和性低。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中抗體是單鏈抗體，明確為含有輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)的遺傳工程化的分子，兩個(gè)可變區(qū)由適宜的多肽銜接物連接成為遺傳融合的單鏈分子。這種單鏈抗體也被成為“單鏈Fv”或者“sFv”抗體片段。一般地，F(xiàn)v多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽銜接物，這使sFv能夠形成所需的結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的抗體片段可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道的任何適宜方式制備。已經(jīng)開發(fā)出幾種微生物表達(dá)系統(tǒng)，用于制備活性抗體片段，例如已經(jīng)描述了在多種不同宿主如大腸桿菌或酵母中產(chǎn)生Fab。片段可以作為Fab′或者Fv產(chǎn)生，但是此外已經(jīng)顯示VH和VL可以被柔韌的多肽銜接物以兩個(gè)方向中的任意一個(gè)遺傳連接，這種組合被稱為scFv。
用于本發(fā)明的組合物在用于藥物的組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含除了活性組分以外藥物上可以接受的載體。
如這里所使用的，與組合物或者載體相關(guān)使用的術(shù)語“藥物上可以接受的”表示該物質(zhì)能夠向人或動物給服而不會產(chǎn)生不合意的生理效果例如惡心、暈眩、腸胃不適等等。
含有溶解于其中或者分散于其中的活性成分的組合物的制備是本領(lǐng)域充分理解的。通常這種組合物以無菌可注射物的形式制備，或者是液態(tài)溶液或懸液，水或非水溶液，然而也可以制備適于在使用前溶解或者懸浮于液體中的固體形式。制劑也可以被乳化?；钚越M分可以與藥物上可以接受的、與活性組分相容的載體混合，載體的量適宜用于這里描述的方法中。適宜的載體有，例如水、鹽水、右旋葡萄糖、甘油、乙醇等等以及其組合。此外，如果需要的話，組合物可以含有提高活性成分有效性的微量輔助物質(zhì)例如潤濕或者乳化劑，pH緩沖劑等等。
本發(fā)明的組合物可以在其中包含藥物上可以接受的組合物組分的鹽。藥物上可以接受的鹽包括與無機(jī)酸(例如鹽酸或者磷酸)或者有機(jī)酸(例如乙酸、酒石酸、扁桃酸)等形成的酸式鹽(與多肽的自由氨基基團(tuán)形成)。與自由羧基基團(tuán)形成的鹽也可以來自無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨或者氫氧化鐵)以及有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等)。
藥物上可以接受的載體是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。示例性的液態(tài)載體有無菌的水溶液(它除了含有活性組分和水以外不含有其他物質(zhì))或者含有緩沖劑(例如生理pH值下的磷酸鈉、生理鹽水或者二者均含有，例如磷酸鹽緩沖液)。另外，含水載體可以含有一種以上的緩沖鹽以及鹽例如氯化鈉和氯化鉀、右旋葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇以及其他溶質(zhì)。液態(tài)組合物除了水以外還可以含有其他液相。示例性的這種其他液相是甘油、植物油(例如棉籽油)、有機(jī)酯類(例如油酸乙酯)和水-油乳劑。
含有本發(fā)明多肽或者抗體的組合物優(yōu)選含有至少占每份總藥物組合物重量0.1重量百分比的多肽或者抗體。重量百分比是多肽或者抗體與總組合物的重量之比。因此，例如0.1重量百分比是每100克總組合物0.1克多肽或者抗體。
組合物也可以是部分試劑盒(kit-in-part)，還包括抗生素物質(zhì)〔例如選自β-內(nèi)酰胺、頭孢霉素、青霉素、氨基糖苷抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、克拉霉素或阿奇霉素)以及蒽醌類抗生素(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、或莫西殺星)的抗生素〕和/或免疫刺激物質(zhì)(例如細(xì)胞因子、干擾素、生長因子例如GCSF或GM-CSF)。部分試劑盒(kit-in-part)可以用于同時(shí)、順序或者分別給藥。
本發(fā)明還涉及在實(shí)施這里描述的方法時(shí)有用的藥物組合物。這樣本發(fā)明涉及了包含藥物上可以接受載體以及-包含SEQ ID NO1-36任何一個(gè)序列、或者包含所述序列的片段或變體的分離多肽，-包含所述多肽編碼序列的分離多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或者-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞。
此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，藥物組合物包含如這里確定的本發(fā)明抗體以及藥物上可以接受的載體。
本發(fā)明的多肽本發(fā)明的片段在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及片段，優(yōu)選為SEQ ID NO1-51任何一項(xiàng)(例如SEQ ID NO1-36的任何一項(xiàng)或者SEQ ID NO37-51的任何一項(xiàng))給出的多肽的抗原性片段。這種片段的長度各有不同，可以從多肽的兩個(gè)連續(xù)氨基酸殘基到全長多肽減去一個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，片段的長度小于100個(gè)連續(xù)氨基酸，例如小于70或50個(gè)連續(xù)氨基酸，例如小于40個(gè)連續(xù)氨基酸，例如小于30個(gè)連續(xù)氨基酸，例如小于25個(gè)連續(xù)氨基酸，例如小于20個(gè)連續(xù)氨基酸。因此，例如片段長度可以是2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或者20個(gè)連續(xù)氨基酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，片段包含6個(gè)或者更多，例如7個(gè)或者更多，例如8個(gè)或者更多，例如9個(gè)或者更多，例如10個(gè)或者更多相應(yīng)全長序列的連續(xù)氨基酸殘基。優(yōu)選的范圍包括長度在5和50個(gè)連續(xù)氨基酸之間的片段，例如長度在5和25個(gè)連續(xù)氨基酸之間，例如長度在5和20個(gè)連續(xù)氨基酸之間。用另一種方式表示，片段由氨基酸序列的一部分組成，與全長多肽相比，它的長度小于全長多肽的100％。優(yōu)選地，片段長度小于全長多肽長度的99％，例如小于75％，例如小于50％，例如小于25％，例如小于20％，例如小于15％，例如小于10％。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，片段由氨基酸序列的部分組成，它的長度與全長的多肽相比小于100％，但是大于1％，例如小于100％但是大于5％，例如小于100％但是大于10％，例如小于100％但是大于20％，例如小于100％但是大于25％，例如小于100％但是大于50％的全長多肽長度。
優(yōu)選的特異片段包括如下片段，其包含選自SEQ ID NO52-119的片段的一個(gè)或多個(gè)殘基，例如兩個(gè)或者更多，例如三個(gè)或者更多，例如四個(gè)或者更多，例如五個(gè)或者更多，例如六個(gè)或者更多，選自SEQID NO52-119的片段的連續(xù)殘基。更為優(yōu)選的特異片段包括的片段由或者基本上由選自SEQ ID NO52-119的序列組成。
其他優(yōu)選的片段包括來自2003年11月21日提交的丹麥專利申請PA 2003 01726中序列表1以及2003年11月25日提交的美國暫時(shí)申請60/524,617的片段，在這里引用作為參考。
優(yōu)選地，本發(fā)明的片段是在完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞中或者其他細(xì)胞(如果在其中重組表達(dá))中暴露于表面的片段。可以使用對所述片段特異的單克隆抗體測定在表面的暴露，例如如Singh等人，(2003)Infect.Immun.713973-3946中的描述。另外優(yōu)選的片段能夠誘導(dǎo)可與完整空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合的抗體。這種抗體的確定可以通過使用所述片段制備單克隆抗體然后對單個(gè)抗體與完整細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)行表征，如Singh等人，(2003)Infect.Immun.713973-3946中所描述的。
SEQ ID NO1-51的全長多肽以及本發(fā)明的片段可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)技術(shù)制備。適宜的宿主細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞例如CHO，COS或HEK293細(xì)胞?；蛘呖梢允褂美ハx細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或者真菌細(xì)胞。在以上列出的細(xì)胞類型中異源表達(dá)多核苷酸序列以及接下來產(chǎn)生的多肽(例如使用標(biāo)簽序列例如組氨酸標(biāo)簽，在純化之后可以除去)的純化方法，對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是眾所周知的。或者可以合成制備本發(fā)明的片段。
本發(fā)明的變體在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及SEQ ID NO1-51(例如SEQ IDNO1-36的任何一項(xiàng)或者SEQ ID NO37-51的任何一項(xiàng))中提供的任何多肽的變體或者SEQ ID NO1-51中提供的任何多肽的片段的變體在用作藥物的組合物中的用途。
在這里使用時(shí)，短語例如“與SEQ ID NOX具有至少95％的序列一致性的多肽”與術(shù)語例如“SEQ ID NOX的多肽及其變體，其中的變體與所述的序列具有至少95％的序列一致性”可以交換使用，并且意指相同的對象。
變體優(yōu)選與給定的多肽或者片段具有至少75％的序列一致性，例如至少80％的序列一致性，例如至少85％的序列一致性，例如至少90％的序列一致性，例如至少91％的序列一致性，例如至少92％的序列一致性，例如至少93％的序列一致性，例如至少94％的序列一致性，例如至少95％的序列一致性，例如至少96％的序列一致性，例如至少97％的序列一致性，例如至少98％的序列一致性，例如至少99％的序列一致性。使用Wisconsin遺傳軟件包7.0中的GAP，BESTFIT，或者FASTA中的任何一種算法，使用缺省空位加權(quán)確定序列一致性。
給定多肽或者片段的優(yōu)選變體是這樣的變體，其中在變體與給定參考多肽或片段之間的所有氨基酸替代都是保守替代。保守氨基酸替代指的是具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
多肽或者其片段的變體還包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除或者插入的多肽或者片段的形式。優(yōu)選地，小于5，例如小于4，例如小于3，例如小于2，例如只有一個(gè)氨基酸被插入或者刪除。多肽或者其片段的“變體”還包括被氨基酸序列翻譯后修飾了的這些多肽或者片段的形式。
本發(fā)明的多核苷酸和表達(dá)載體在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及多核苷酸，優(yōu)選是分離的和/或重組的多核苷酸，包含選自SEQID NO1-51的序列的抗原性片段或者變體的編碼序列，例如選自SEQID NO1-36的序列的抗原性片段或者變體的編碼序列或者選自SEQID NO37-51的序列的抗原性片段或者變體的編碼序列。
此外，本發(fā)明涉及了包含多肽編碼序列的表達(dá)載體，所述多肽包含選自由SEQ ID NO1-51的序列，或者包含任何所述序列的片段或者變體。優(yōu)選的表達(dá)載體是適于DNA疫苗接種的表達(dá)載體。其他優(yōu)選的表達(dá)載體是本發(fā)明的多肽在啟動子控制下的表達(dá)載體，啟動子指導(dǎo)序列在大腸桿菌或者沙門氏菌中的表達(dá)。沙門氏菌表達(dá)載體在這里描述的本發(fā)明重組病毒或者重組細(xì)胞的制備中是有用的。
本發(fā)明的多核苷酸和表達(dá)載體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)制備。
本發(fā)明的重組細(xì)胞在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及了使用多核苷酸轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞，所述多核苷酸包含編碼多肽的序列，所述多肽包含選自SEQ ID NO1-36的序列或者包含所述序列的抗原性片段或者變體。優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞是大腸桿菌或者沙門氏菌細(xì)胞，更優(yōu)選是減毒的或者毒性降低的大腸桿菌或沙門氏菌。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及的是重組的減毒或者毒性降低的微生物細(xì)胞，優(yōu)選是被多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的大腸桿菌或者沙門氏菌細(xì)胞，所述多核苷酸包含編碼多肽的序列，所述多肽包含選自SEQ ID NO37-51的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或者變體。
在例如Makino等人，(2001)Microb.Pathog.311-8；Gentschev等人，(2002)Int.J.Med.Microbiol.291577-582；Turner等人，(2001)Infect.Immun.694969-4979；WO99/49026；和WO03/022307及其中的參考文獻(xiàn)中描述了適宜在這里使用的細(xì)菌菌株。適宜的沙門氏菌菌株的示例有CvD908-T7pol(Santiago-Machuca等人，(2002)Plasmid 47108-119)，ATCC39183，ATCC 53647和ATCC 53648。適宜的大腸桿菌菌株的示例有YT106和E1392/75-2A。
本發(fā)明的方法和使用以上定義的組合物和其他產(chǎn)物可以用于在需要進(jìn)行以下治療的動物或人中治療或者預(yù)防空腸彎曲桿菌的感染和/或由這種感染導(dǎo)致的疾病。優(yōu)選地，動物是雞、鴨、火雞、奶牛或者豬。優(yōu)選的人群是危險(xiǎn)群體，例如4周歲以下的兒童群體、工業(yè)化國家的人群或者到發(fā)展中國家的未接觸過抗原或者半免疫的旅行者群體。
這里的治療和預(yù)防包括抗擊空腸彎曲桿菌的所有類型治療性治療和預(yù)防性治療以及其他治療，包括但是不止限于疫苗接種、預(yù)防、主動免疫、被動免疫、抗體給藥、根除性治療、改善性治療。特別地，使用本發(fā)明抗體的被動免疫是對免疫損害個(gè)體的適宜治療。
因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防動物或人中空腸彎曲桿菌感染的方法，包括給服下列任何一項(xiàng)的步驟-多肽，其包含SEQ ID NO1-51的任何序列(例如SEQ ID NO1-36的任何序列或者SEQ ID NO37-51的任何序列)，或者包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含編碼所述多核苷酸序列的表達(dá)載體，-包含所述多核苷酸或所述表達(dá)載體的重組病毒或重組細(xì)胞，或者-能夠特異結(jié)合所述多肽的抗體，籍此治療或預(yù)防在所述動物或人中的空腸彎曲桿菌感染。
優(yōu)選地，所述給藥通過胃腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口服或者鼻內(nèi)進(jìn)行優(yōu)選地，所述藥物是適宜進(jìn)行胃腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口服或者鼻內(nèi)給藥的藥物。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及在動物或人中針對空腸彎曲桿菌感染進(jìn)行的免疫方法，包括給服如下的步驟-多肽，其包含選自SEQ ID NO1-51的序列(例如SEQ ID NO1-36的任何序列或者SEQ ID NO37-51的任何序列)，或者包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，
-包含編碼所述多核苷酸序列的表達(dá)載體，或者-包含所述多核苷酸或所述表達(dá)載體的重組病毒或重組細(xì)胞優(yōu)選地，所述給藥通過胃腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口服或者鼻內(nèi)進(jìn)行。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及這里闡述的本發(fā)明抗體用于制造用于治療或預(yù)防動物或人的空腸彎曲桿菌感染的藥物的用途。因此，本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防空腸彎曲桿菌感染的方法，包含給服這里闡述的本發(fā)明抗體的步驟，從而治療或者預(yù)防空腸彎曲桿菌感染。優(yōu)選地，所述給藥通過胃腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口服或者鼻內(nèi)進(jìn)行。
本發(fā)明的診斷方法本發(fā)明的發(fā)明者確定的51個(gè)多肽既暴露于表面且在細(xì)胞中的相對高拷貝數(shù)目，這兩個(gè)特點(diǎn)的組合使它們非常適于作為檢測空腸彎曲桿菌的靶標(biāo)，使得對這種生物的檢測具有高度敏感性。
因此，在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及在樣品中檢測空腸彎曲桿菌或者其部分的方法，包括以下步驟a.將所述樣品與能夠與多肽特異結(jié)合的指示分子接觸，所述多肽選自SEQID NO1-36，以及b.確定指示分子是否產(chǎn)生了信號，從而檢測所述樣品是否含有空腸彎曲桿菌或者其部分。
優(yōu)選地，所述指示分子能夠結(jié)合(優(yōu)選為特異結(jié)合)完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及了檢測空腸彎曲桿菌的方法，包括以下步驟a.將所述樣品與能夠與多肽特異結(jié)合的指示分子接觸，所述多肽選自SEQID NO37-51，其中的指示分子還能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合(優(yōu)選為特異結(jié)合)以及b.確定指示分子是否產(chǎn)生了信號，從而檢測所述樣品是否含有空腸彎曲桿菌或者其部分。
在以上診斷方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在接觸步驟和測定步驟之間進(jìn)行一次漂洗步驟，目的是提高檢測的特異性。
樣品可以是例如糞便、尿、組織、組織提取物、液體樣品或者體液樣品例如血液、血漿或血清。樣品的另一個(gè)示例是食物樣品，例如肉樣品。
以上的方法可以例如用于診斷個(gè)體中的空腸彎曲桿菌感染或者彎曲桿菌病。在以上方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的指示分子不穿過空腸彎曲桿菌細(xì)胞的外膜。所述指示分子的優(yōu)選類型由抗體組成或者包含抗體，例如這里明確的本發(fā)明抗體。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解有多種眾所周知的臨床診斷化學(xué)步驟，其中可以使用指示分子形成結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)產(chǎn)物的量與樣品中配基(這里是空腸彎曲桿菌或者其部分)的量有關(guān)。因此，雖然這里描述了示例性的檢測方法，但是本發(fā)明不止限于此。
本發(fā)明還涉及診斷系統(tǒng)(優(yōu)選是試劑盒的形式)用于檢測生物樣品中空腸彎曲桿菌的存在(優(yōu)選是其含量)。制備診斷試劑盒的方法已經(jīng)在例如US 5,470,958及其參考文獻(xiàn)中有所描述。
診斷系統(tǒng)包括，根據(jù)本發(fā)明的指示分子(優(yōu)選是獨(dú)立包裝的藥劑，更優(yōu)選地還有使用說明)，其量足以進(jìn)行至少一次檢測?！鞍b的”指的是使用能夠在固定范圍內(nèi)容納本發(fā)明指示分子的固體基質(zhì)或者材料例如玻璃、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯或者聚碳酸酯)、紙、鋁箔等等。因此，例如，包裝可以是用于容納毫克量本發(fā)明標(biāo)記指示分子制劑的玻璃瓶，或者它可以是微量滴定板的孔，已經(jīng)有效附著了微克量的本發(fā)明的標(biāo)記指示分子，即連接在微量滴定板的孔中這樣能夠與配基結(jié)合。
“使用說明”通常包括描述試劑濃度或者至少一個(gè)檢測方法參數(shù)(例如試劑以及要混合的樣品的相對量、試劑/樣品混合物的維持時(shí)間、溫度、緩沖條件等等)的具體表述。
在多數(shù)實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷方法和系統(tǒng)包括作為指示分子一部分的標(biāo)記或者指示方法，標(biāo)記或指示方法能夠傳遞含有指示分子與預(yù)選配基(即包含SEQ ID NO1-51的任何序列的多肽和/或其片段)復(fù)合的結(jié)合反應(yīng)復(fù)合物形成的信號。這些標(biāo)記自身在臨床診斷化學(xué)中是眾所周知的。
標(biāo)記方法可以是與抗體或者抗原化學(xué)結(jié)合而不使其變性，形成熒光染料(染料)的熒光標(biāo)記物質(zhì)，熒光標(biāo)記物質(zhì)是有用的免疫熒光示蹤劑。適宜的熒光標(biāo)記物是熒光染料例如異氰酸熒光素(FIC)、異硫氰酸熒光素(FITC)、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯(DANSC)、四甲基羅達(dá)明異硫氰酸酯(TRITC)、麗絲胺、羅達(dá)明8200磺酰氯(RB 200 SC)。適宜的熒光物質(zhì)的其他示例包括傘形酮、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或者藻紅素等等。在DeLuca，″Im-munofluorescence Analysis″，inAntibody As a Tool，Marchalonis，等人，，eds.，John Wiley &Sons，Ltd.，pp.189-231(1982)中可以找到對免疫熒光分析技術(shù)的描述。
放射性元素可用作標(biāo)記物質(zhì)。示例性的放射性標(biāo)記物質(zhì)是產(chǎn)生γ射線發(fā)射的放射性元素。自身發(fā)出γ射線的元素，例如124I、125I、128I、132I和51Cr代表了一類產(chǎn)生γ射線的放射性元素指示組。特別優(yōu)選的是125I。另外一組有用的標(biāo)記方法是例如11C，18F，15O和13N的元素，它們自身發(fā)射正電子或者β粒子例如111In或3H。其他適宜的放射性標(biāo)記元素包括131I和35S。
在其他實(shí)施方案中，可以通過將抗體與另一個(gè)可被檢測的物質(zhì)例如酶、輔基、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或者生物發(fā)光物質(zhì)相偶聯(lián)而有助于使用抗體的檢測。適宜的酶的示例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、β半乳糖苷酶或者乙酰膽堿酯酶；適宜的輔基復(fù)合物的示例包括鏈親和素/生物素和親和素/生物素；化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的示例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的示例包括熒光素酶、熒光素和水母蛋白。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，指示基團(tuán)是酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)或者葡萄糖氧化酶。在主要指示基團(tuán)是例如HRP或者葡萄糖氧化酶的這些例子中，需要其他的試劑呈現(xiàn)指示分子/配基復(fù)合物(免疫反應(yīng)物)已經(jīng)形成的事實(shí)。這些用于HPR的其他試劑包括過氧化氫和氧化染料前體例如二氨基聯(lián)苯胺。對于葡萄糖氧化酶有用的其他試劑是2，2′-氨基-二-(3-乙基-苯噻唑啉-G-磺酸)。
標(biāo)記的連接(即多肽例如抗體的標(biāo)記)在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。例如，可以通過代謝摻入作為培養(yǎng)基組分提供的含有放射性同位素的氨基酸，對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。參見，例如Galfre等人，，Meth.Enzymol.，733-46(1981)。通過活化功能基團(tuán)進(jìn)行的蛋白質(zhì)連接或者偶聯(lián)技術(shù)是特別適用的。參見例如Aurameas，等人，，Scand.J.Immunol.，Vol.8Suppl.77-23(1978)，Rodwell等人，(1984)Biotech.3889-894，和美國專利No.4,493,795。
可以建立使用以上指示分子的各種不同的診斷檢測，用于空腸彎曲桿菌樣品的檢測。示例性的檢測在AntibodiesA LaboratoryManual，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbof LabofatoryPress，1988中有詳細(xì)描述。這種檢測的代表性示例包括對流免疫電泳(CIEP)、放射性免疫檢測、放射性免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、斑點(diǎn)印跡檢測、抑制或競爭檢測以及三明治檢測、免疫分析專用試管棒(纖維素試驗(yàn)紙)檢測、同步免疫檢測、免疫色譜檢測、免疫過濾檢測、橡膠珠凝集檢測、免疫熒光檢測、生物傳感器檢測以及弱光檢測(還參見例如U.S.4,376,110和4,486,530)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可以用于“ELISA”形式中檢測在流體樣品中預(yù)選配基的量?！癊LISA”指的是酶聯(lián)免疫吸附測定，它使用結(jié)合在固相上的抗體或者抗原以及酶-抗原或者酶-抗體偶聯(lián)物檢測和定量樣品中存在的抗原的量，可以容易地應(yīng)用于本發(fā)明。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的指示分子可以附著于固相基質(zhì)上形成固體支持物，固體支持物包含了所研究的診斷系統(tǒng)中的包裝。試劑通常通過從含水介質(zhì)中的吸附附著于固相基質(zhì)上，盡管也可以使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的適用于多肽(例如抗體)的其他附著方式。有用的固相基質(zhì)也是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。這些物質(zhì)是水溶性的，包括可以從Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway，N.J.)獲得的商標(biāo)為SEPHADEX的交聯(lián)葡聚糖；瓊脂糖；可以從AbbottLaboratories of North Chicago，III.獲得的1微米到5毫米直徑的聚苯乙烯小珠；基于聚氯乙烯、聚苯乙烯、交聯(lián)聚丙烯酰胺、硝酸纖維素或者尼龍的網(wǎng)例如薄片、條、或者板；或者管、盤或者如由聚苯乙烯或者聚氯乙烯制成的微量滴定板的孔。
另外一種診斷方法可以利用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的抗體組合物的多價(jià)性以交聯(lián)配基，這樣使多個(gè)配基與多肽聚集，產(chǎn)生可沉淀的聚集物。該實(shí)施方案與眾所周知的免疫沉淀方法相似。該實(shí)施方案包含的步驟是在結(jié)合條件下將樣品與包含本發(fā)明抗體的組合物混合形成結(jié)合混合物之后通過分離步驟分離形成的結(jié)合復(fù)合物。通常通過離心或者過濾從混合物中取出聚集物，完成分離。結(jié)合復(fù)合物的存在表明存在預(yù)選的待測配基。
本發(fā)明的結(jié)合伴侶和多肽抑制劑本發(fā)明涉及的51個(gè)多肽的表面定位使這些多肽成為非常適宜的結(jié)合伴侶(例如抑制劑)的靶標(biāo)。病原性微生物表面定位的多肽經(jīng)常與宿主生物相互作用。因此，表面定位多肽的任何類型的結(jié)合伴侶可以干擾宿主-病原的相互作用。因此結(jié)合伴侶經(jīng)常拮抗微生物的病原性(毒性)。結(jié)合伴侶還可以是與其結(jié)合的多肽的抑制劑。
因此，在另一個(gè)主要方面中，本發(fā)明涉及鑒別SEQ ID NO1-51提供的表面定位多肽的結(jié)合伴侶的方法。這些方法可以是生化的或者基于細(xì)胞的。
生化方法在一個(gè)主要方面，本發(fā)明涉及的是鑒別多肽的結(jié)合伴侶的方法，所述多肽選自SEQ ID NO1-36或者其片段，包括以下步驟a.提供選自SEQ ID NO1-36的多肽，或者其片段b.將所述多肽或者片段與推定的結(jié)合伴侶結(jié)合，以及c.測定所述的推定結(jié)合伴侶是否能夠結(jié)合所述的多肽或者片段。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的推定結(jié)合伴侶是來自宿主的分子。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽或者其片段被固定在固相支持物例如層析柱或者微量滴定板上提供，并且在接觸步驟之后，測定推定的結(jié)合伴侶是否結(jié)合到固相支持物上。可以通過直接與固相支持物結(jié)合，或者通過間接結(jié)合(例如使用特異抗體)，進(jìn)行多肽或者其片段的固定化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在接觸步驟和測定步驟之間進(jìn)行一個(gè)漂洗步驟，目的是提高檢測的特異性。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，推定的結(jié)合伴侶與可檢測的標(biāo)記形成復(fù)合物?？梢栽谶M(jìn)行接觸之前對推定的伴侶進(jìn)行標(biāo)記。或者可以在接觸步驟之后進(jìn)行標(biāo)記。此外，在該方法的一些實(shí)施方案中，固定化可以在多肽或者其片段與結(jié)合伴侶結(jié)合之后進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法是篩選方法，其中對于大量推定的結(jié)合伴侶重復(fù)該方法。測定結(jié)合的適宜方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，在本發(fā)明的其他部分提及了這些方法中的一些。
在另一方面中，選自SEQ ID NO1-51(例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))的多肽，其宿主來源結(jié)合伴侶可以如下鑒別電泳分離純化的宿主膜，印跡到膜上，與目標(biāo)多肽或者其片段共同孵育。然后使用對于目標(biāo)多肽或者其片段特異的抗體檢測結(jié)合。接下來可以從印跡上洗脫并且使用質(zhì)譜或任何其他本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)進(jìn)行分析，確定多肽或者其片段已經(jīng)與之結(jié)合的宿主的結(jié)合伴侶。
如果病原性生物的表面定位多肽之結(jié)合伴侶是宿主來源的分子，則這種表面定位多肽與宿主之間的相互作用對于細(xì)菌的毒性可能是重要的。因此干擾表面定位多肽與宿主來源的結(jié)合伴侶之間相互作用的化合物可能適于阻止或者治療空腸彎曲桿菌的感染。因此，本發(fā)明另外的方法涉及鑒別SEQ ID NO1-51的任何一個(gè)(例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))表面定位空腸彎曲桿菌多肽與宿主來源的結(jié)合伴侶相互作用的抑制劑的方法，包括以下步驟a.提供SEQ ID NO1-51的任何多肽(例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))或者其片段，b.提供所述多肽的宿主來源的結(jié)合伴侶(根據(jù)以上的描述確定或者由任何其他方法確定)c.將所述多肽與所述宿主來源的結(jié)合伴侶在沒有所述相互作用的推定抑制劑的情況下接觸，
d.將所述多肽與所述宿主來源的結(jié)合伴侶在所述的推定抑制劑存在下接觸，以及e.測定步驟d得到的所述多肽與所述宿主來源的結(jié)合伴侶的結(jié)合強(qiáng)度與步驟c得到的同樣強(qiáng)度相比是否降低。
在一些實(shí)施方案中，步驟c和d可以在兩個(gè)不同的樣品容器中進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，可以通過向步驟c的混合物中加入推定的抑制劑進(jìn)行步驟d。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對于大量的推定抑制劑重復(fù)該方法。
非常感興趣的是抑制表面定位多肽活性的結(jié)合伴侶。這種活性可以是酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性或者任何類型的其他生化或細(xì)胞活性，優(yōu)選為酶活性。
優(yōu)選的宿主來源結(jié)合伴侶是宿主多肽和宿主脂類。可以根據(jù)Szymanski和Armstrong(1996)Infect.Immun.643467-3474的描述測定結(jié)合。
在以上描述的生化方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合伴侶和表面定位多肽或者其片段的結(jié)合具有的解離常數(shù)或Kd小于5×10-6M，例如小于10-6M，例如小于5×10-7M，例如小于10-7M，例如小于5×10-8M，例如小于10-8M，例如小于5×10-9M，例如小于10-9M，例如小于5×10-10M，例如小于10-10M，例如小于5×10-11M，例如小于10-11M，例如小于5×10-12M，例如小于10-12M。可以通過例如表面等離子體共振測定解離常數(shù)。
基于細(xì)胞的方法通過刪除或者破壞其結(jié)構(gòu)基因或者下調(diào)基因的表達(dá)(見下面)降低表面定位多肽的水平，可以影響細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)胞可以變得對細(xì)胞毒性化合物更為敏感。特別對于表面定位多肽，它們水平的降低可能影響細(xì)胞表面部分例如外膜或者細(xì)胞壁阻止化合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的功能。這樣，降低表面定位多肽的水平可以使細(xì)胞對多種不同的化合物變得更加“通透化”。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及的是鑒別具有針對空腸彎曲桿菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步驟a.提供敏化細(xì)胞，敏化細(xì)胞具有降低水平的SEQ ID NO1-36的任何多肽，以及b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抗菌化合物的敏感性。
優(yōu)選地，該方法是篩選方法，其中對多個(gè)推定抗菌化合物重復(fù)該步驟。優(yōu)選的推定抗菌化合物是不能穿過野生型空腸彎曲桿菌細(xì)胞外膜的化合物。
此外，本發(fā)明涉及鑒別具有針對空腸彎曲桿菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步驟a.提供敏化細(xì)胞，敏化細(xì)胞具有降低水平的SEQ ID NO37-51的任何多肽，以及b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抗菌化合物的敏感性，其中的推定抗菌化合物不能穿過野生型空腸彎曲桿菌的細(xì)胞外膜。
優(yōu)選地，該方法是篩選方法，其中對多個(gè)推定抗菌化合物重復(fù)該步驟。
該方法背后的理論基礎(chǔ)是具有低水平表面定位多肽的細(xì)胞對細(xì)胞毒性化合物表現(xiàn)出增加的敏感性，這樣可以確定具有低效力的抗菌化合物，在使用野生型細(xì)胞用于檢測時(shí)這些化合物會被遺漏。通過這種方法確定的化合物經(jīng)常需要被修飾以提高效力。這可以通過化學(xué)修飾進(jìn)行。
對表面定位多肽活性的抑制可能影響細(xì)菌的生活力(即存活、生長和/或增殖)。特別有趣的是空腸彎曲桿菌生活力必需的表面定位多肽的抑制。可以根據(jù)WO 02/077183中的描述研究空腸彎曲桿菌基因的必需性。必需表面定位多肽的抑制劑可能不需要進(jìn)入到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)就能影響細(xì)胞的生活力。因此，與細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的抑制劑相比，一般對作為有效抗菌物質(zhì)的必需表面定位多肽的抑制劑提出的要求更少。
因此，本發(fā)明涉及鑒別多肽抑制劑的方法，所述多肽選自SEQ IDNO1-36，包括以下步驟a.提供兩個(gè)細(xì)胞，它們的差異在于在SEQID NO1-36的任何多肽水平不同，b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抑制劑的敏感性，以及c.測定所述的兩個(gè)細(xì)胞是否在所述推定抑制劑存在下受到不同影響。
優(yōu)選地，對多個(gè)推定抑制劑重復(fù)該方法。優(yōu)選的抑制劑是不能穿過野生型空腸彎曲桿菌細(xì)胞外膜的化合物。
此外，本發(fā)明涉及鑒別多肽抑制劑的方法，所述多肽選自SEQ IDNO37-51，方法包含以下步驟a.提供兩個(gè)細(xì)胞，它們的差異在于在SEQID NO37-51的任何多肽水平不同，b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抑制劑的敏感性，其中的推定抗菌化合物不能穿過空腸彎曲桿菌細(xì)胞外膜，以及c.測定所述的兩個(gè)細(xì)胞是否在所述推定抑制劑存在下受到不同影響。
優(yōu)選地，對多個(gè)推定抑制劑重復(fù)該方法。
該方法背后的理論基礎(chǔ)是具有低活性必需多肽的細(xì)胞，其生活力與具有更高水平該多肽的細(xì)胞的生活力相比，受到該多肽更多的影響。如果兩個(gè)細(xì)胞受到不同的影響，這表明抑制劑作用于靶標(biāo)或者至少作用于相同的生化途徑。
在該方法的一些實(shí)施方案中，具有不同目標(biāo)多肽活性的兩個(gè)細(xì)胞是野生型細(xì)胞(或者其他具有野生型活性目標(biāo)基因的細(xì)胞)和具有降低的目標(biāo)多肽活性的敏化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在敏化細(xì)胞中不同或者降低的水平可能是目標(biāo)基因不同或者降低的表達(dá)水平(導(dǎo)致多肽不同或者降低的拷貝數(shù))。這可以通過將基因置于可調(diào)控的啟動子的控制下，或者通過對抑制必需多肽的編碼mRNA翻譯的反義RNA進(jìn)行可調(diào)控表達(dá)完成。在其他實(shí)施方案中，不同或者降低的活性可以是由于突變例如溫度敏感突變導(dǎo)致的目標(biāo)多肽不同或者降低的活性。
產(chǎn)生敏化細(xì)胞以及使用這些細(xì)胞用于篩選抑制劑的適宜方式已經(jīng)在WO 02/077183中有描述。敏化細(xì)胞可以通過在一定濃度的誘導(dǎo)物或者阻遏物或者其他條件(這提供了細(xì)菌生活力所需的一定的基因產(chǎn)物水平，使得基因產(chǎn)物功能的存在或者不存在成為生活力的限速步驟)下培養(yǎng)條件表達(dá)的空腸彎曲桿菌突變株得到。用于空腸彎曲桿菌的可調(diào)控啟動子已經(jīng)在例如Kelana等人，(2003)J Food Prot 661190-1197和Dedieu等人，(2002)Appl Environ.Microbiol.684209-421中有描述。靶標(biāo)基因的亞致死表達(dá)可以是使生長抑制至少大約10％，例如至少大約25％，例如至少大約50％，例如至少大約75％，例如至少大約90％，例如至少大約95％的表達(dá)。
在本發(fā)明基于細(xì)胞檢測的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過在多肽中使用突變(例如溫度敏感突變)降低細(xì)菌生活力所需多肽的水平。將這種細(xì)胞生長于介于允許和限制溫度之間的中間溫度下，產(chǎn)生的細(xì)胞具有降低活性的基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)理解可以使用降低但是不去除細(xì)菌生活力所需基因產(chǎn)物的活性或水平的任何突變，實(shí)施以上的方法。該方法還可以與條件表達(dá)方法組合在一起。在這個(gè)組合的方法中，產(chǎn)生這樣的細(xì)胞，其中在目標(biāo)基因中有溫度敏感突變，其中該基因是條件表達(dá)的。
當(dāng)篩選必需多肽的抑制劑時(shí)，可以通過直接比較實(shí)驗(yàn)樣品中的生長量與對照樣品中的生長量，測定生長抑制，生長量通過培養(yǎng)物相對于未接種培養(yǎng)基的光密度測定。檢測細(xì)胞增殖的其他方法包括測定綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告物構(gòu)建體的熒光發(fā)射、各種不同的酶活性檢測以及其他本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法。用于測定生活力的其他參數(shù)包括例如菌落形成單位。可以在固相、液相、上述兩種介質(zhì)的組合或者在體內(nèi)進(jìn)行以上方法。可以將多個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到瓊脂平板中，使用自動化和半自動化的設(shè)備進(jìn)行同時(shí)檢測。
本發(fā)明的基于細(xì)胞的檢測能夠檢測對目標(biāo)靶標(biāo)分子顯示低效力或中等效力的化合物，因?yàn)檫@種化合物在敏化細(xì)胞上比在非敏化細(xì)胞上具有顯著更高的效力。與非敏化細(xì)胞相比，在敏化細(xì)胞上檢測時(shí)效果可以是檢測的化合物可能具有兩倍到數(shù)倍更高的效力，例如至少10倍更高的效力，例如至少20倍更高的效力，例如至少50倍更高的效力，例如至少100倍更高的效力，例如至少1000倍更高的效力。
過表達(dá)表面定位多肽的突變的空腸彎曲桿菌還可以用于鑒別抑制這種多肽的化合物。如果該化合物是細(xì)胞毒性的，靶標(biāo)多肽的過表達(dá)可以使細(xì)胞更具抗性。因此，本發(fā)明還涉及尋找SEQ ID NO1-51(例如SEQ ID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))表示的任何表面定位空腸彎曲桿菌多肽的抑制劑的方法，包含以下步驟a.提供兩個(gè)細(xì)胞，它們的差異在于SEQ ID NO1-51(例如SEQID NO1-36的任何一個(gè)或者SEQ ID NO37-51的任何一個(gè))的任何表面定位空腸彎曲桿菌多肽的活性不同，其中一個(gè)細(xì)胞含有大致野生型拷貝數(shù)目的所述多肽而另一個(gè)細(xì)胞含有高于野生型拷貝數(shù)目的所述多肽，b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抑制劑的敏感性，以及c.測定所述的兩個(gè)細(xì)胞是否在所述推定抑制劑的存在下受到不同影響。
可以使用強(qiáng)啟動子或者引入多拷貝的表面定位多肽的結(jié)構(gòu)基因獲得過表達(dá)。強(qiáng)的空腸彎曲桿菌啟動子在Wosten等人，(1998)J.Bacteriol.180594-599中已有描述。由于不是抑制劑細(xì)胞靶標(biāo)的多肽的過表達(dá)也可以使細(xì)胞對某種抑制劑具有抗性，需要通過其他方式(例如生化檢測)來證實(shí)目標(biāo)靶標(biāo)多肽被推定抑制劑的抑制。
除了表面定位多肽的生化或者其他細(xì)胞活性的抑制劑之外，以上描述的細(xì)胞方法可以例如通過干擾基因調(diào)控，用于確定降低靶標(biāo)表達(dá)水平(從而確定其拷貝數(shù))的化合物。
在用于尋找結(jié)合伴侶或者抑制劑的任何基于細(xì)胞的或生化方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，對于大量候選化合物重復(fù)該方法。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于這里描述的基于細(xì)胞的方法中的突變體空腸彎曲桿菌，例如編碼表面定位多肽的基因被置于異源可調(diào)控啟動子控制下的菌株、攜帶表面定位多肽溫度敏感等位基因的菌株，以及過表達(dá)表面定位多肽的菌株。
通過靶向表面定位多肽(例如SEQ ID NO1-36表示的任何多肽)干擾細(xì)菌生長的其他方法包括使用特異的反義分子(例如反義RNA或DNA)以及使用對必需的表面定位多肽編碼mRNA特異的核酶分子，抑制基因表達(dá)。
實(shí)施例策略在項(xiàng)目中的實(shí)驗(yàn)步驟如下通過低pH洗脫分離表面蛋白。通過2-D凝膠和質(zhì)譜進(jìn)行分析?？寺〉酱竽c桿菌表達(dá)載體中。制備重組蛋白，免疫小鼠，使用空腸彎曲桿菌攻擊免疫的小鼠，尋找抵御疾病和腸內(nèi)移殖的防范。還分析了大腸桿菌和沙門氏菌的表面定位(如果是陽性的，有用于減毒載體菌株的可能性)。
細(xì)菌培養(yǎng)空腸彎曲桿菌(C.j.)菌株ML53(血清型019)，是來自人糞便的臨床分離物，由Karen Krogfeld(SSI)提供。按照常規(guī)37℃下在含10％CO2，5％O2的空氣中生長于血液瓊脂平板上。
表面蛋白的提取細(xì)菌在血液瓊脂平板上生長過夜，收集到50mM Tris pH7.8中，6000g離心5分鐘沉淀。沉淀重懸于0.2M甘氨酸pH2.2中，細(xì)菌懸液在室溫下輕輕混合10分鐘。6000g離心5分鐘再次沉淀細(xì)菌，收集含有表面蛋白的上清，使用NaOH中和，凍存于-80℃。進(jìn)行2-D凝膠電泳之前在Amersham Hi-Trap脫鹽柱上對樣品進(jìn)行脫鹽。
2-D凝膠電泳在Ettan Dalt 2系統(tǒng)(Amersham Biosciences)上或者在NovexNuPage系統(tǒng)(Invitrogen)上，根據(jù)凝膠系統(tǒng)提供的手冊進(jìn)行雙向凝膠電泳。
簡而言之第一相電泳在7cm或24cm的預(yù)灌注IPG凝膠條上進(jìn)行(pH范圍3-10或者6-11)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用EttanIPGphor等電聚焦系統(tǒng)(Amersham Biosciences)。在以下的條件下進(jìn)行等電聚焦7cm pH3-10凝膠條8000Vh，7cm pH6-11凝膠條16000Vh，24cm pH3-10凝膠條52000Vh。第二相使用預(yù)灌注的12.5％凝膠(Amersham Biosciences)，對24cm凝膠條在5W每膠的條件下進(jìn)行15分鐘電泳，然后在170W下進(jìn)行電泳4-6小時(shí)。7cm凝膠條在Novex NuPage system(Invitrogen)中進(jìn)行電泳，使用預(yù)灌注的4-12％凝膠(Invitrogen)在200伏特下電泳40分鐘。根據(jù)最初在Mortz等人，(2001)Proteomics 1(11)，1359-1363中描述的方法的改進(jìn)方法對凝膠進(jìn)行銀染。使用Amersham的Ettan Spot Picker，根據(jù)生產(chǎn)商的說明挑取用于質(zhì)譜分析的蛋白斑點(diǎn)。
質(zhì)譜挑取特異的蛋白斑點(diǎn)，置于Milli-Q水中。使用50mM NH4HCO3/50％乙醇漂洗這些凝膠塊，然后在96％乙醇中孵育脫水。在還原溶液(10mMDTT，50mM NH4HCO3)中56C下孵育進(jìn)行還原，然后在烷化溶液(55mM碘代乙酰胺，50mM NH4HCO3)中室溫黑暗孵育進(jìn)行烷化。然后進(jìn)行兩輪漂洗和脫水，之后加入5ul胰蛋白酶溶液(12.5ng/ul Promega胰蛋白酶，溶于50mM NH4HCO3，10％乙腈)。然后再加入碳酸氫鈉溶液，消化在37℃下孵育過夜。向過夜消化物中加入三氟乙酸，振蕩孵育。
提取物的一部分用于MALDI-TOF肽質(zhì)譜指紋分析(Reflex IV，BrukerDaltonics，Germany)，在特異的空腸彎曲桿菌數(shù)據(jù)庫中對所產(chǎn)生峰的列表進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。在數(shù)據(jù)庫搜索中使用Mascot搜索程序和評分算法(Matrix Science，UK)。肽質(zhì)耐受分別設(shè)置為60ppm和0.5Da。調(diào)整搜索參數(shù)，以包括Met的氧化、向Cys上加上氨甲酰甲基基團(tuán)，使胰蛋白酶錯(cuò)過每個(gè)肽中一個(gè)切割位點(diǎn)。
在2003年11月21日提交的丹麥專利申請PA 200301726中的清單1以及2003年11月25日提交的美國暫時(shí)申請60/524,617中給出(這里引用作為參考)。使用該步驟確定了共51個(gè)不同的空腸彎曲桿菌蛋白。這些蛋白的全長序列在SEQ ID NO1-51中給出(參見圖4)。序列列表中的蛋白質(zhì)根據(jù)Sanger研究所的分類進(jìn)行功能分類。根據(jù)基因組序列進(jìn)行預(yù)測的但是以前沒有表征、并且與以前表征過的蛋白沒有任何同源性的所有蛋白根據(jù)Sanger研究所的分類，劃分為假設(shè)蛋白。那些與已知蛋白有同源性的蛋白根據(jù)相對應(yīng)的已知蛋白進(jìn)行命名，使用前綴“可能的”或者“推定的”，這取決于同源性的程度。一些蛋白有小的基序，這樣不能夠給這些蛋白確切的生化/代謝功能，但是可以表明它們具有某種特性(例如核苷酸結(jié)合基序，膜結(jié)合位點(diǎn)等等)的事實(shí)。推定的周質(zhì)蛋白質(zhì)根據(jù)類似的基礎(chǔ)進(jìn)行分類--它們具有短的(4-6個(gè)氨基酸)N端基序，它可以介導(dǎo)向周質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
生物信息學(xué)研究使用由來自DNAStar公司的Lasergene序列分析軟件(Burland，TG(2000)Methods Mol.Biol.13271-91)確定的缺省參數(shù)進(jìn)行抗原性指數(shù)研究。預(yù)測SEQ ID NO52-119中提供的序列是它們對應(yīng)的全長多肽的特殊抗原性片段(參見圖4)。
在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)對應(yīng)于目標(biāo)蛋白的基因用PCR擴(kuò)增并且克隆到含有his-標(biāo)簽(pET101，Invitrogen)的大腸桿菌表達(dá)載體中。產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，使用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)4小時(shí)。根據(jù)以上制備甘氨酸洗脫物，通過三種獨(dú)立的方法分析洗脫物中重組空腸彎曲桿菌蛋白的存在考馬斯亮藍(lán)染色，使用抗his標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western印跡，以及質(zhì)譜分析。對8個(gè)質(zhì)粒(表達(dá)Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0715，Cj0772c，Cj1018c，Cj1380和Cj1643的質(zhì)粒)進(jìn)行表面定位檢測。發(fā)現(xiàn)所有8個(gè)質(zhì)粒都定位在大腸桿菌細(xì)胞表面。
根據(jù)以上描述培養(yǎng)和誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中純化重組蛋白，根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用NTA-Ni瓊脂糖(Qiagen)。純化的蛋白對PBS進(jìn)行透析，凍存于-80℃。
小鼠的免疫抗原劑量確定為了確定每個(gè)蛋白最佳的免疫劑量和疫苗接種時(shí)間，使用1，5，10和25微克每種蛋白免疫小鼠。溶解于PBS中的適量蛋白與100μg的明礬(Alhydrogel，Brenntag Biosector)混合，在室溫下振蕩30分鐘，用于每只小鼠的注射。用PRS調(diào)整體積至0.5ml。小鼠皮下免疫3次(0，14，28天)。在第0天和每次免疫后的第7天(第7，21和35天)取血。在第7天時(shí)200微升所有血液樣品取自從后眼窩血管叢，放置1小時(shí)使凝固，3500g離心10min，收集血清。
血液分析通過測定血液中的抗體滴度監(jiān)測抗體應(yīng)答。這通過Western印跡進(jìn)行。血清用PBS/0.1％Tween從1∶100到1∶25600系列稀釋。重組蛋白在制備型(2-D)(Invitrogen)凝膠上電泳，使膜上的1.5mm蛋白條帶對應(yīng)于100ng蛋白。使用具有1.5mm寬槽的Surf-Blot裝置(IdeaScientific，Minneapolis，MN)進(jìn)行Western印跡。使用血清稀釋液作為第一抗體，堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體(Sigma)作為第二抗體。用FastTab藥片(Sigma)使印跡顯色。在每只動物注射5，10和25微克抗原時(shí)，所有的抗原在血清稀釋度12800和25600之間都可以被檢測到。
針對攻擊的免疫使用根據(jù)以上制備的25微克重組蛋白疫苗在第0、14和28天免疫小鼠。在第7、21和35天取血，根據(jù)以上進(jìn)行檢測。在最后一次加強(qiáng)免疫兩周內(nèi)沒有用于攻擊實(shí)驗(yàn)的小鼠在攻擊前一周使用10微克重組蛋白再次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
小鼠口服攻擊空腸彎曲桿菌ML1和ML53(由Karen Krogfeld，SSI提供的臨床分離物)在42℃下在血液瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。在攻擊前一天，細(xì)菌收獲到含有1％酵母提取物的腦心浸出物培養(yǎng)液中，稀釋至OD600為0.05，獲得起始培養(yǎng)物。25ml起始培養(yǎng)物接種于含有20mlBHI瓊脂的75cm2搖瓶中，42C下孵育過夜。在攻擊當(dāng)天，6000g離心5分鐘收獲細(xì)菌，重懸于新鮮的BHI/YE培養(yǎng)液中使OD600為1(5×108到109菌落形成單位(cfu)/ml；通過將系列稀釋涂布于BHI瓊脂平板上測定每一批的實(shí)際cfu)。懸液保存在冰上直至用于攻擊小鼠(通常在制備后3小時(shí)內(nèi))。
每個(gè)抗原6-8只免疫的小鼠口服2.5-5×108cfu的空腸彎曲桿菌(0.5ml根據(jù)以上制備的懸液)進(jìn)行攻擊。每天收集5個(gè)糞便顆粒(或者在ACE017實(shí)驗(yàn)中所有的糞便顆粒)，置于0.5ml(或者5ml)添加10％甘油的BHINE培養(yǎng)液中，-80℃凍存。
通過涂布于彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基中對移殖進(jìn)行監(jiān)測。糞便顆粒勻漿，調(diào)整體積至2(或12)ml，將250ul的勻漿物置于1.5ml BHINE培養(yǎng)液中，置于血液瓊脂平板上。平板在42℃孵育2-3小時(shí)，150-250ul的液體涂布于Karmali瓊脂平板上，然后將其在42℃孵育48小時(shí)。對平板評分如下如果觀察到單層密集的菌苔則給1000分，如果在菌苔中無法區(qū)別分開的菌落則給100分，如果菌落數(shù)目小于100(在這種情況下對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù))則給0-100分。每天對每個(gè)抗原的所有小鼠的評分進(jìn)行平均。
染色篩選使用小鼠攻擊實(shí)驗(yàn)篩選13個(gè)空腸彎曲桿菌菌株和1個(gè)大腸彎曲桿菌菌株中8個(gè)抗原的存在。對全細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS凝膠電泳，Western印跡，使用來自免疫小鼠的血清。
結(jié)果如下面列出的，進(jìn)行了包括不同抗原和對照組合的五個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)名稱使用的抗原ACE003bCj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明礬ACE003cCj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明礬鋁ACE011a Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，明礬鋁ACE011b Cj0715，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，明礬鋁ACE017 Cj0092，Cj0143c，Cj0420，Cj0772c，Cj1018c，Cj1380，Cj1643，來自食纖維素梭桿菌(Clostridium cellulovorans)的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBP，Sigma Aldrich C8581)，空腸彎曲桿菌菌株ML1和ML53的甘氨酸洗脫物。
對來自實(shí)驗(yàn)ACE003b和ACE003c的小鼠血液的血液分析示例在

圖1和2中表示。
攻擊結(jié)果示于圖3中。
對不同空腸彎曲桿菌菌株中抗原存在進(jìn)行篩選的結(jié)果在表1中表示。
來自ML53(血清型019)菌株的ACE393的DNA測序來自菌株ML53的ACE393(SEQ ID NO120)的DNA測序顯示了在翻譯為蛋白質(zhì)序列后的氨基酸水平上與NCBI中發(fā)表的序列有3個(gè)區(qū)別。
區(qū)別如下氨基酸序列位置70V(公開序列)與A(ML53菌株)氨基酸序列位置136A(公開序列)與T(ML53菌株)氨基酸序列位置168T(公開序列)與A(ML53菌株)
對來自用于最初動物效力研究的菌株ML53(019)的重組ACE393的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。分析包括MALDI-TOF測定的完整質(zhì)量；1D凝膠分析；2D凝膠分析和2D膠Western印跡。數(shù)據(jù)(未顯示)是基于最初的構(gòu)建體，即序列包括C端的6個(gè)His標(biāo)簽和V5銜接物區(qū)域。在根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行Ni-His純化之后，使用ACE393進(jìn)行所有的檢測和分析。
對完整的ACE393分析觀察到兩個(gè)蛋白。這兩個(gè)分子量與預(yù)測的N端截短形式(-21個(gè)氨基酸以及類似的具有額外的C端19個(gè)氨基酸截短的N端截短形式)的分子量完全匹配。1D SDS PAGE顯示了兩個(gè)斑點(diǎn)，一個(gè)較大，一個(gè)較小。這與來自完整MALDI-TOF分析的數(shù)據(jù)完全對應(yīng)。來自這兩個(gè)斑點(diǎn)的多肽作圖數(shù)據(jù)沒有顯示任何差異，這很可能是由于過量上樣的原因。在2D膠分析中斑點(diǎn)的數(shù)目表明混合物可能含有兩種以上的組分。數(shù)據(jù)表明改變可能是由于SDS分子數(shù)目不同造成的電荷差異。使用小鼠抗體的Western印跡數(shù)據(jù)給出了相同的帶型，與銀染數(shù)據(jù)吻合。
天然和重組ACE 593的MALDI-TOF肽指紋分析天然形式在含有彎曲桿菌全細(xì)胞裂解物的4個(gè)不同2D膠中發(fā)現(xiàn)了天然形式的ACE393。這一確定是基于MALDI-TOF肽指紋分析，它的序列覆蓋為40到55％。
對公共序列和內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的ACE393序列(ML53，019)搜索MALDI-TOF肽指紋分析的數(shù)據(jù)。內(nèi)部序列給出另外兩個(gè)肽131-143 DIVLDTEIGGVAK(SEQ ID NO121)166-190 FAASTSTITLSDDINLNIEVEANEK(SEQ ID NO122)(粗體的氨基酸是兩個(gè)序列之間的差異)與公共序列相比含有最后一個(gè)修飾的肽(68-73；LDATIK(SEQ IDNO123))由于太小，不能被MALDI-TOF肽指紋分析發(fā)現(xiàn)。
重組形式對重組肽進(jìn)行MALDI-TOF肽指紋分析顯示了與天然蛋白分析中發(fā)現(xiàn)的修飾相同的兩個(gè)修飾。其他多肽從銜接物-His序列確定。
高變區(qū)根據(jù)″The genome sequence of the food-borne pathogenCampylo-bacter jejuni reveals hypervariable sequences.Nature.2000 Feb 10；403(6770)665-8″中的描述檢查靶標(biāo)序列中可能的高變和同多聚區(qū)。在這些可變區(qū)中沒有發(fā)現(xiàn)這里描述的靶標(biāo)，這樣這些靶標(biāo)特別適宜作為疫苗候選者。
權(quán)利要求
1.一種用作藥物的組合物，其包含-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的序列的表面定位彎曲桿菌多肽，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，或-能夠與所述多肽結(jié)合的抗體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中組合物包含-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的序列的多肽，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞。
3.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的變體與所述序列具有至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的序列一致性。
4.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗原性片段包含低于99％，例如低于75％，例如低于50％，例如低于25％，例如低于20％，例如低于15％，或者例如低于10％的全長所述序列。
5.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗原性片段包含少于70個(gè)的所述序列的連續(xù)氨基酸殘基，例如少于50個(gè)，例如少于40個(gè)，例如少于30個(gè)，例如少于20個(gè)所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。
6.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗原性片段包含6個(gè)或者更多，例如7個(gè)或者更多，例如8個(gè)或者更多，例如9個(gè)或者更多，例如10個(gè)或者更多的所述序列的連續(xù)氨基酸殘基。
7.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗原性片段包含選自SEQ ID NO52-119的片段中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，例如兩個(gè)或者更多連續(xù)的，例如三個(gè)或者更多連續(xù)的，例如四個(gè)或者更多連續(xù)的，例如五個(gè)或者更多連續(xù)的，例如六個(gè)或者更多選自SEQ ID NO52-119片段的連續(xù)氨基酸殘基。
8.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的多肽包含標(biāo)簽，例如組氨酸標(biāo)簽。
9.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的重組細(xì)胞是減毒或毒性降低的大腸桿菌細(xì)胞或者減毒或毒性降低的沙門氏菌細(xì)胞。
10.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的重組細(xì)胞是活的。
11.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的重組細(xì)胞是死的。
12.權(quán)利要求2-11任何一項(xiàng)的組合物，其中的藥物是疫苗。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中的組合物包含免疫原性載體，例如載體蛋白，其中的免疫原性載體優(yōu)選與所述多肽結(jié)合。
14.權(quán)利要求12-13任何一項(xiàng)的組合物，其中的組合物包含佐劑。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中的組合物包含能夠與選自SEQ ID NO1-36的多肽結(jié)合的抗體。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中的抗體還能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中的組合物包含能夠與多肽結(jié)合以及能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合的抗體，所述多肽選自SEQ ID NO37-51。
18.權(quán)利要求15到17任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗體是多克隆的。
19.權(quán)利要求15到17任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗體是單克隆的。
20.權(quán)利要求15到19任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗體是人抗體或者人化抗體。
21.權(quán)利要求15到20任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗體是抗體結(jié)合片段。
22.權(quán)利要求15到21任何一項(xiàng)的組合物，其中的抗體具有的解離常數(shù)或者Kd小于5×10-6M，例如小于10-6M，例如小于5×10-7M，例如小于10-7M，例如小于5×10-8M，例如小于10-8M，例如小于5×10-9M，例如小于10-9M，例如小于5×10-10M，例如小于10-10M，例如小于5×10-11M，例如小于10-11M，例如小于5×10-12M，例如小于10-12M，例如小于5×10-13M，例如小于10-13M，例如小于5×10-14M，例如小于10-14M，例如小于5×10-15M，或者小于10-15M。
23.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的組合物包含藥物上可以接受的載體。
24.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的組合物適宜全身給藥。
25.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的組合物適宜靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或者皮下給藥。
26.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的組合物適宜口服給藥。
27.以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)的組合物，其中的組合物適宜鼻內(nèi)給藥。
28.能夠結(jié)合選自SEQ ID NO1-36的多肽的抗體。
29.權(quán)利要求28的抗體，其中抗體還能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合。
30.能夠與選自SEQ ID NO37-51的多肽結(jié)合以及能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞結(jié)合的抗體。
31.權(quán)利要求28到30任何一項(xiàng)的抗體，包含權(quán)利要求18到22任何一項(xiàng)的特性。
32.使用包含多肽編碼序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞，所述多肽包含選自SEQ ID NO1-36的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或者變體。
33.權(quán)利要求32的重組細(xì)胞，其中的重組宿主細(xì)胞是大腸桿菌或者沙門氏菌細(xì)胞。
34.權(quán)利要求32或33的重組細(xì)胞，其中的重組細(xì)胞是減毒或毒性降低的細(xì)胞。
35.使用包含多肽編碼序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的減毒或毒性降低的大腸桿菌細(xì)胞或者減毒或毒性降低的沙門氏菌細(xì)胞，所述多肽包含選自SEQ ID NO37-51的序列，或者包含所述序列的抗原性片段或者變體。
36.-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，用于制備藥物以免疫動物或人抵抗彎曲桿菌，優(yōu)選為彎曲桿菌的感染的用途。
37.權(quán)利要求36的用途，其中的免疫誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。
38.權(quán)利要求36或37的用途，其中的藥物是適宜胃腸道外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、口服或者鼻內(nèi)給藥的藥物。
39.能夠與選自SEQ ID NO1-51的多肽結(jié)合的抗體，優(yōu)選是如權(quán)利要求28到31任何一項(xiàng)明確的抗體，用于制備藥物用于治療或預(yù)防動物或人彎曲桿菌，優(yōu)選為彎曲桿菌，的感染的用途。
40.在非人的動物中產(chǎn)生抗多肽抗體的方法，所述多肽選自SEQ IDNO1-36，包括以下步驟a.提供-多肽，它包含選自SEQ ID NO1-36的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，b.將包含所述多肽、多核苷酸、載體、重組病毒或重組細(xì)胞的組合物引入所述動物中，c.在所述動物中產(chǎn)生抗體，以及d.分離抗體以及任選地，純化抗體。
41.在非人的動物中產(chǎn)生抗多肽抗體的方法，所述多肽選自SEQ IDNO37-51，其中的抗體能夠結(jié)合完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞，包括以下步驟a.提供-多肽，它包含選自SEQ ID NO37-51的序列，或者它包含所述序列的抗原性片段或變體，-包含所述多肽編碼序列的多核苷酸，-包含所述多肽編碼序列的表達(dá)載體，或-包含所述多核苷酸或者所述表達(dá)載體的重組病毒或者重組細(xì)胞，b.將包含所述多肽、多核苷酸、載體、重組病毒或重組細(xì)胞的組合物引入所述動物中，c.在所述動物中制備抗體，d.分離抗體以及任選地純化抗體，以及e.篩選能夠結(jié)合完整空腸彎曲桿菌細(xì)胞的抗體。
42.權(quán)利要求40或41的方法，其中的動物是能夠產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物。
43.在樣品中檢測空腸彎曲桿菌或者其部分的方法，包括以下步驟a.將所述樣品與指示分子接觸，所述指示分子能夠與選自SEQ ID NO1-36的多肽特異結(jié)合，以及b.確定指示分子是否產(chǎn)生了信號，從而檢測所述樣品是否含有空腸彎曲桿菌或者其部分。
44.權(quán)利要求43的方法，其中的指示分子還能夠結(jié)合完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞。
45.檢測樣品中彎曲桿菌的方法，包括以下步驟a.將所述樣品與指示分子接觸，所述指示分子能夠與選自SEQ IDNO37-51的多肽特異結(jié)合，其中指示分子還能夠與完整的空腸彎曲桿菌細(xì)胞特異結(jié)合，以及b.確定指示分子是否產(chǎn)生了信號，這樣檢測所述樣品是否含有空腸彎曲桿菌或者其部分。
46.權(quán)利要求43到45任何一項(xiàng)的方法，其中所述的指示分子不穿過空腸彎曲桿菌細(xì)胞的外膜。
47.權(quán)利要求43到46任何一項(xiàng)的方法，其中所述的指示分子由抗體組成或者包含抗體，例如權(quán)利要求28到31的任何一項(xiàng)中明確的抗體。
48.鑒別多肽的結(jié)合伴侶的方法，所述多肽選自SEQ ID NO1-36或者其片段，包括以下步驟a.提供選自SEQ ID NO1-36或者其片段的多肽，b.將所述多肽或者片段與推定的結(jié)合伴侶接觸，以及c.測定所述的推定結(jié)合伴侶是否能夠結(jié)合所述的多肽或者片段。
49.鑒別具有針對空腸彎曲桿菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步驟a.提供敏化細(xì)胞，敏化細(xì)胞具有降低水平的選自SEQ ID NO1-36的任何多肽，以及b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抗菌化合物的敏感性。
50.鑒別具有針對空腸彎曲桿菌抗菌活性的化合物的方法，包括以下步驟a.提供敏化細(xì)胞，敏化細(xì)胞具有降低水平的選自SEQ ID NO37-51的任何多肽，以及b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抗菌化合物的敏感性，其中的推定抗菌化合物不能穿過野生型空腸彎曲桿菌細(xì)胞外膜。
51.鑒別多肽抑制劑的方法，所述多肽選自SEQ ID NO1-36，包括以下步驟a.提供兩個(gè)多肽水平有差異的細(xì)胞，所述多肽選自SEQ ID NO1-36的任何多肽，b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抑制劑的敏感性，以及c.測定所述的兩個(gè)細(xì)胞是否在所述推定抑制劑存在下受到不同影響。
52.權(quán)利要求51的方法，其中的推定抑制劑不穿過空腸彎曲桿菌細(xì)胞的外膜。
53.鑒別多肽抑制劑的方法，所述多肽選自SEQ ID NO37-51組成的組，包括以下步驟a.提供兩個(gè)多肽水平有差異的細(xì)胞，多肽選自SEQ ID NO37-51的任何多肽，b.例如通過生長檢測，測定所述細(xì)胞對推定抑制劑的敏感性，其中的推定抑制劑不能穿過空腸彎曲桿菌細(xì)胞外膜，以及c.測定所述的兩個(gè)細(xì)胞是否在所述推定抑制劑存在下受到不同影響。
全文摘要
本發(fā)明涉及空腸彎曲桿菌的表面定位多肽及其在針對彎曲桿菌疫苗接種中的用途。本發(fā)明還涉及多核苷酸、表達(dá)載體、表達(dá)這些表面定位多肽的重組病毒或者重組細(xì)胞在疫苗接種中的用途。此外，本發(fā)明涉及針對表面定位多肽的抗體的用途，用于抗彎曲桿菌治療。最后，公開了通過表面定位多肽檢測彎曲桿菌以及確定抗彎曲桿菌物質(zhì)的方法。
文檔編號G01N33/569GK1906210SQ200480039712
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者P·斯徹羅特茲-金, C·J·斯卡魯普, N·P·耐伯格, T·A·布羅科霍瓦 申請人:Ace生物科學(xué)公司