專利名稱：一種海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5及其基因、分離純化、化學合成和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種來源于海南湍蛙(Amolops hainanensis)的廣譜抗微生物肽 Hainanenin-5及其基因、分離和化學合成方法和應用，屬于生物醫(yī)學技術領域。
背景技術：
隨著抗生素的廣泛、大量使用，病原微生物對抗生素所產生的耐藥性亦逐漸提高， 已成為感染性疾病治療的難點，尤其近期出現“超級病菌”的威脅，均迫使人們去尋找新型的抗微生物制劑。近期的研究發(fā)現，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時具有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性如在最小作用濃度時，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對真菌也有抑制作用；不會誘導抗藥菌株的產生；對于局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研制目前受到廣泛重視。同時抗菌肽還具有分子量小，穩(wěn)定性高、不易產生抗藥性力等特點?？咕氖巧矬w內經誘導產生的一類具有生物活性的小分子多肽，抗菌肽廣泛存在于細菌、植物和動物體中，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分。與傳統(tǒng)的抗生素不同，兩棲類皮膚抗菌肽是通過干擾原核細胞膜結構導致質膜通透性增大，從而引起抑菌或殺菌作用，病原體對其不易產生抗藥性。兩棲類抗菌肽除了具有高效、廣譜且不易產生耐藥性的抗菌活性外，還具有抗腫瘤，病毒，原蟲等活性，且對人體正常細胞幾乎無作用。因此，在耐抗生素病原菌株不斷出現，病毒和腫瘤等疾病對類健康造成極具威脅的今天，抗菌肽將有望成為新一代的抗病原微生物及腫瘤的藥物。據國內外文獻報道，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產品已進入三期臨床； Intrabiotics公司生產的活性多肽IB-367已獲準用于治療癌癥病人因多種細菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽 nisin治療胃潰瘍的臨床試驗也取得良好的療效。我國擁有豐富的兩棲類動物資源，它是中國生物資源的重要組成部分，其中很多物種具有食用或藥用等價值，具有很大的開發(fā)利用潛力。兩棲動物由于長期生活在潮濕、 陰暗、微生物大量滋生的環(huán)境下，在長期自然進化過程中形成了三套防御機制(1)物理屏障，粘液腺分泌大量糖蛋白和蛋白聚糖，包裹在皮膚外表面，阻礙病原菌的侵入；( 獲得性免疫系統(tǒng)，兩棲動物皮膚中含有抗體IgG; (3)先天免疫系統(tǒng)，主要由大量的抗菌肽構成。 目前，對兩棲類中蛙類抗菌肽尤其是皮膚和腸道抗菌肽研究的最清楚。自Zasloff從水蛙皮膚中分離到Magainins后，相繼從不同的蛙類中分離到許多具有廣譜的抑菌活性的抗菌月太家方矣(如 Dermaseptins、Temporins、Ranatuerins、Brevinins、Tigerinins)，一些還具有獨特的抗真菌活性。我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質的研究還鮮有報道。海南湍蛙(Amolops hainanensis)為蛙科湍蛙屬的兩棲動物，是中國的特有物種，分布于海南等地。本發(fā)明的海南湍蛙(Amolops hainanensis)環(huán)狀抗菌肽Hainanenin-5分子量小， 結構簡單，僅含一個二硫鍵，方便化學合成及基因工程制備。相比較兩棲動物來源的已報道的其他家族抗菌肽，Hainanenin-5抗微生物活性更強，且具有廣譜的抗微生物活性，對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌均有活性，其中包括大量臨床分離耐藥菌株，此外還具有溶血性低有益特點，均使Hainanenin-5成為外用抗菌藥物開發(fā)的優(yōu)良模板。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種具有很強的抗微生物活性的來源于海南湍蛙(Amolops hainanensis)的一種抗微生物肽Hainanenin-5及其基因、分離純化、化學合成分析和應用。為了實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術方案海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5是從兩棲類海南湍蛙皮膚分泌液中先經 Sephadex G-50凝膠過濾，然后反相高壓液相層析(RP-HPLC)分離得到的一種C端含有七元Rana Box的環(huán)狀多肽，分子量為2337. 91道爾頓，等電點為10. 11。多肽全序列一級結構為苯丙氨酸丙氨酸亮氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸蘇氨酸賴氨酸精氨酸亮氨酸脯氨酸絲氨酸亮氨酸苯丙氨酸半胱氨酸亮氨酸異亮氨酸蘇氨酸精氨酸賴氨酸半胱氨酸。含有4個堿性氨基酸殘基O個精氨酸和2個賴氨酸)，無酸性氨基酸殘基，靜電荷為+4，說明它是一種堿性多肽。第15位和第21位的的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。構建了海南湍蛙(Amolops hainanensis)皮膚cDNA文庫，從中篩選得到 Hainanenin-5的前體序列，基因測序結果表明編碼海南湍蛙(Amolops hainanensis) Hainanenin-5前體的基因由321個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為1ATGTTCACCA TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT CAACTTATCT61CTCTGTGAGC AACAGAGAGA TGCCGAAGAA GAAAGAAGAG ACGATGAAGA TAAAAGGGAT121GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA AGCGTTTGCC ATCACTGTTT181TGTTTGATTA CCAGAAAATG TTGAAGCTTG AGCTGGAAAT CATCTGATGA GAAATATAAT241TTAGCTAAAT GCACATCAGA TATCTTATAA AAAATAAAAA TTCTCACATG CAAAAAAAAA301AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A編碼海南湍蛙(Amolopshainanensis)成熟肽 Hainanenin-5 為第 139-201 位核苷酸，其氨基酸序列為=PhelAla2Leutly4Ala5Val6Thr7Lys8Arg9Leuic1ProlSeri2Leu13Wie14Cys1 5Leu16 Ile17Thr18Arg19Lys20Cys21 (FALGAVTKRLPSLFCLITRKC)。Hainanenin-5的化學合成方法根據編碼海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗菌肽hainanenin-5成熟肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC 反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95% ；用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜 (MALDI-T0F-MS)測定其分子量?；瘜W合成得到的高純度Hainanenin-5抗微生物肽可以溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測。本發(fā)明的有益效果在于從海南湍蛙皮膚分泌物凍干粉中分離純化得到抗微生物肽Hainanenin-5，從已構建海南湍蛙(Amolops hainanensis) cDNA文庫中克隆得到編碼抗微生物肽Hainanenin-5前體的基因，通過化學合成方法得到成熟肽Hainanenin-5。該環(huán)狀抗菌肽hainanenin-5分子量小，結構簡單，僅含一個二硫鍵，方便化學合成及基因工程制備。相比較兩棲動物來源的已報道的其他家族抗菌肽，Hainanenin-5抗微生物活性更強， 且具有廣譜的抗微生物活性，對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌均有活性，其中包括大量臨床分離耐藥菌株，此外還具有溶血性低有益特點，均使Hainanenin-5成為外用抗菌藥物開發(fā)的優(yōu)良模板。


圖IA為本發(fā)明海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗微生物肽Hainanenin-5的 SephadexG-50凝膠過濾柱層析圖。箭頭所示為活性峰。圖IB為本發(fā)明海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗菌肽Hainanenin-5反相高壓液相色譜圖。箭頭a所示為Hainanenin-5。
具體實施例方式下面結合技術方案詳細敘述本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的內容并不局限于此。實施例1Hainanenin-5的分離純化選取健康狀況良好的成年海南湍蛙(A. hainanensis) (n = 5)，用超純水淋洗背部。采用電刺激法收集皮膚分泌物，用電擊器對蛙背部皮膚進行電刺激，電壓I0V，電擊時間3ms，經刺激后，將皮膚分泌物用0. 9%的生理鹽水沖洗至干凈的容器內，12000rpm離心20min，棄上清、冷凍干燥后保存。_20°C保存?zhèn)溆谩５谝徊絢phadex G-50凝膠過濾層析0. 9gA. hainanensis背部皮膚分泌物凍干粉用 IOmlO. IM 磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4, ρΗ6· 0)緩沖液溶解，12000rpm 離心 IOmin, 取上清液上樣于已平衡好的kphadex G-50凝膠排阻色譜柱(1. 6cmx90cm, Amersham Bioscience)，用同樣緩沖液洗脫，流速3mL/10min，用自動部分收集器收集3mL/管，220nm 檢測并收集各峰檢測抗菌活性，凍干備用。第二步反相高壓液相層析(RP-HPLC)為=S^hadex G-50凝膠排阻色譜分離得到的活性成分的峰重新溶解于純水中，40C，12000rpm離心15min，取上清液，用0. 45 μ m濾膜過濾，收集濾液上樣于經含1%。三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(Hypersil BDS C18,30cmx0. 46cm)用乙腈(含1%。三氟乙酸)構成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫，215nm檢測多肽濃度。收集得到的各峰，凍干濃縮，用滅菌的去離子水重新溶解并進行抗菌活性檢測。第三步一級結構分析純化的Hainanenin-5分子量測定采用電噴霧四級桿飛行時間串聯(lián)質譜法(ESI-Q-TOF-MS，Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)。等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。實施例2抗微生物肽Hainanenin-5前體基因的克隆及基因測序，包括采用 AxyPr印TM Multisource Total RNA Miniprep Kit 提取海南湍蛙(Amolops hainanensis)皮膚總RNA，利用Creator SMART cDNA library建庫試劑盒構建海南湍蛙(Amolops hainanensis)皮膚 cDNA 文庫。PrimeScript Reverse Transcriptase 反轉錄合成cDNA第一鏈，引物為正向SMARTer V Oligonucleotide :5' -MGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3'( X = undisclosed base in the proprietary SMARTer oligo sequence)反向 3，In-Fusion SMARTer CDS Primer 5，-CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3，(N = A, C, G, or T ;V = A, G, or C) ο利用 Advantage DNA Polymerase 合成第二鏈，引物為正向 5，-primer 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘。反向引物同為 3，h-Fusion SMARTer CDS Primer。設計一條特異性正向引物(Pl)和一條反向非特異性通用引物(3’ -primer)，以海南湍蛙(Amolops hainanensis)皮膚cDNA文庫為模板，PCR擴增Hainanenin-5前體的 cDNA。正向Pl 5‘ -CCAAAGATGTTSMCCWYGAAG-3‘ (M = A or C ;ff = A or T ;Y = C or T)反向非特異性通用引物為3’ -primer,其序列為 5' -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3 ‘所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定，pMD 19-T vector測序通用引物正向M13F:5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3‘；反向Ml3R 5 ‘ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ‘；具體步驟如下第一步、AxyPr印TMMultisource Total RNA Miniprep Kit 提取海南湍蛙 (Amolops hainanensis)皮膚總RNA(以下實驗所用器具和試劑均經過處理，無RNase)A.從新鮮宰殺的海南湍蛙(Amolops hainanensis)背部剪下一小塊皮膚組織，放入液氮預冷的細胞凍存管中，然后迅速放入液氮中保存；B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預冷的研缽內，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內加入少許液氮，研磨成粉末，加入400 μ 1 Buffer R_I，用注射器反復抽吸8_10 次，轉入1.5ml離心管(試劑盒提供)中。加入150μ1 Buffer R-II，漩渦振蕩15_30s， 12，OOOXg 離心 5min。C.將離心后的上清轉移至新的1. 5ml離心管中，加入250 μ 1異丙醇，混合均勻。 將制備管置于2ml離心管(試劑盒提供)中，轉移步驟4中的混合液到制備管中，6，000 Xg 離心lmin。棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，制備管中加入500 μ 1 Buffer WIA, 12，000 X g離心lmin。棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，制備管中加入700 μ 1 Buffer W2，12，000 Xg離心lmin ；以同樣的方法再用700 μ 1 Buffer W2洗滌一次。棄濾液，將制備管置回到2ml離心管中，12，OOOXg離心lmin。將制備管放入一干凈的1. 5ml離心管(試劑盒提供)中，在制備管膜中央加70-100 μ 1 Buffer TE0室溫靜置lmin，12，000Xg離心 Imin，洗脫得RNA。第二步、Creator SMART cDNA library 建庫試劑盒構建海南湍蛙(Amolops hainanensis) 1 月夫 cDNA 第一鏈的合成(mRNA反轉錄)
A.在新的0. 2ml PCR管(無DNase和RNase)中配制下列混合液模板 RNA1 μ gOligo dT Primer (50 μ Μ) 1 μ 1dNTP MixturedOmM each) 1 μ 1RNase free ddH20補充至10 μ 1，混勻后，短暫離心；PCR儀中65°C保溫5min后， 迅速在冰上急冷aiiin ；短暫離心后，在上述管中配制如下反轉錄反應液
上述混合液 ΙΟμΙ 5 χ Prime S cript Buffer 4 μ RNase Inhibitor (40υ/μ1) 0.5μ1 PrimeScript Reverse Transcriptase (200υ/μ1)_0.5μ1_RNase free dH20補充至20 μ 1體系，混勻后，短暫離心；在PCR儀中完成以下程序42°C，60min ；70°C, 15min ；4°C，保存。cDNA 保存于 _80°C。第二鏈的合成
第一鏈cDNA2μ1去離子水80μ1IOxAdvantage 2 PCR buffer10μ150xdNTP Mix2μ15，PCR primer2μ1CDS III/3'PCR primer2μ150 χ Advantage 2 Polymerase Mix2μ1第三步、海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗菌肽hainanenin-5的基因克隆篩選1、引物設計根據已報道的蛙類抗菌肽前體的信號肽保守序列設計正向簡并引物 5，-CCAAAGATGTTSMCCWYGAAG-3‘ (M = A or C ;ff = A or T ;Y = C or Τ)。引物使用前先 12000rpm離心5min，然后根據標明的摩爾數加入相應體積的ddH20溶解至20 μ M的濃度。2、PCR 擴增以合成的皮膚cDNA為模板，用上述簡并引物結合建庫試劑盒提供的接頭引物 3' -primer 5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-3，，進行 PCR 擴增。在 0. 2ml PCR 管中加入下列
試劑(總體積20 μ 1):ddH208(^1
cDNA 模板Ipl
正向引物Pl(20pM)0.50
反向引物 CDSlII(20nM)0.50
2xPfu PCR MasterMix_lO^il混勻后，短暫離心。PCR條件為94°C變性5min ；30個循環(huán)94°C變性30s，56°C退 火30s，72°C延伸40s ；72°C延伸IOmin ；4°C保存。反應結束后，取5 yl產物于1 %瓊脂糖凝 膠電泳檢測目的條帶。3、目的片段回收擴增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的DNA 片段與測序載體pMD 19_T vector連接，轉化進CaCl2-MgCl2法制備好的DH5 a感受態(tài)細 胞。取100 Pl轉化菌液均勻涂布在含有100 u g/ml氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基平 板上；表面晾干后，放在37°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12-16h，長出的菌落進行下一步菌落PCR 測定。4、目的片段序列測定挑取單菌落做模板，以M13-F和M13-R為引物，菌落PCR檢測單菌落中插入片段大 小。引物序列如下M13-F 5' -GTAAAACGACGGCCAGTG-3，M13-R 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3，挑選含有目的片段的陽性克隆送到DNA測序公司測序。測序結果與GeneBank數 據庫中序列進行比對。第四步、海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗菌肽Hainanenin-5前體的基因序列 測定和結果編碼海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗微生物肽Hainanenin-5前體的基因 由321個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為1ATGTTCACCA TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT CAACTTATCT61CTCTGTGAGC AACAGAGAGA TGCCGAAGAA GAAAGAAGAG ACGATGAAGA TAAAAGGGAT121GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA AGCGTTTGCC ATCACTGTTT181TGTTTGATTA CCAGAAAATG TTGAAGCTTG AGCTGGAAAT CATCTGATGA GAAATATAAT241TTAGCTAAAT GCACATCAGA TATCTTATAA AAAATAAAAA TTCTCACATG CAAAAAAAAA301AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗微生物肽Hainanenin-5編碼區(qū)的cDNA核苷 酸的序列表為序列長度為321個堿基，序列類型核酸，鏈數單鏈，拓撲學環(huán)狀結構，序 列種類cDNA，來源海南湍蛙(Amolops hainanensis)皮膚組織。編碼海南湍蛙(Amolopshainanensis)成熟肽 Hainanenin-5 為第 139-201 位核 苷酸，其氨基酸序列為=PhelAla2Luetly4Ala5Val6Thr7Lys8Arg9Lueic1ProllSer12Lue13Phe14Cys1 5Luel6Ile17Thr18Arg19Lys20Cys21 (FALGAVTKRLPSLFCLITRKC)。實施例3抗微生物肽Hainanenin-5的化學合成方法
1、根據推斷的成熟肽Hainanenin-5氨基酸序列，用自動多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。2、分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F-MS)。實施例4抗微生物肽Hainanenin-5的藥理實驗1. Hainanenin-5抗微生物活性檢測1. 1抑菌圈分析法將化學合成的Hainanenin-5以2mg/ml的濃度溶解在無菌超純水中。細菌接種于Luria-Bertani (LB)固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，用接種環(huán)挑取單菌落均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，將經過滅菌的直徑為0. 5cm 的小濾紙片粘貼于培養(yǎng)基表面，取10 μ 1待測樣品滴加于濾紙片上。37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18-20h，觀察抑菌圈形成與否，有抑菌圈形成則表示樣品有抑菌活性。抑菌圈的大小可以衡量抗菌活性的強弱。將對hainanenin-5敏感的菌株記錄下來。1. 2Hainanenin-5 對敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)測定。該實驗以傳統(tǒng)抗生素氨芐青霉素作陽性對照，無菌液體MH作陰性對照；最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高于陰性對照5%的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無菌液體MH培養(yǎng)基，37°C恒溫振蕩器中200rpm培養(yǎng)10-1 !至對數生長期；用紫外分光光度計測菌液eoonm光波處的吸光值，吸光值為1時， 濃度大約為109CFU/ml，將菌液用無菌液體MH培養(yǎng)基稀釋至106CFU/ml，冰上待用；在96微孔板上配制濃度梯度為 200μ g/ml、100y g/ml、50y g/ml、25y g/ml、12. 5μ g/ml、6. 25 μ g/ ml,3. 13μ g/ml、l. 56μ g/ml、0. 78μ g/ml、0. 39μ g/ml、0. 20 μ g/ml 的經 0. 22 μ m 孔徑膜過濾的hainanenin-5樣品溶液，每孔50 μ 1 ；每孔加入50 μ 1上述稀釋菌液；在恒溫振蕩器中 37°C，IOOrpm振蕩培養(yǎng)18h ；使用酶標儀測600nm吸光值或肉眼觀察；上述實驗重復3次，取平均值。由表1可見，Hainanenin-5對絕大多數測試菌株表現出非常強的抗菌活性，特別是對臨床分離的耐藥性菌株。在17種實驗檢測的菌株中，Hainanenin-5對絕大多數革蘭氏陰性細菌(包括標準菌株和臨床分離的耐藥菌株)表現出極強的抗菌活性。在全部測試的 5 株革蘭氏陽性菌(G+)菌株中，Enterococcus faecium 1299 (IS)，對 Hainanenin-5 極其敏感，最小抑菌濃度為4. 69 μ g/ml，而陽性對照氨芐青霉素對該菌的MIC卻大于100 μ g/ ml。此外，Hainanenin-5還具有較強的抗真菌活性。對Candida albicans ATCC 2002和 Slime mould 090413 (IS)的最小抑菌濃度分別為 2. 34 μ g/ml 和 9. 38 μ g/ml。表lHainanenin-5抗微生物肽的抗菌活性
權利要求
1.一種海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5，其特征在于，是一種從海南湍蛙皮膚分泌液中分離出來的C端含有七元Rana Box的環(huán)狀多肽，分子量為2337. 91道爾頓，等電點為 10. 11，多肽全序列一級結構為苯丙氨酸丙氨酸亮氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸蘇氨酸賴氨酸精氨酸亮氨酸脯氨酸絲氨酸亮氨酸苯丙氨酸半胱氨酸亮氨酸異亮氨酸蘇氨酸精氨酸賴氨酸半胱氨酸。
2.一種海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5的分離純化方法，其特征在于，電刺激海南湍蛙收集皮膚分泌液離心去除沉淀，冷凍干燥后經kphadex G-50凝膠過濾柱層析和反相高壓液相色譜后分離純化后得到。
3.一種海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5的化學合成方法，其特征在于，根據編碼海南湍蛙(Amolops hainanensis)抗菌肽Hainanenin-5成熟肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95% ；用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F-MS)測定其分子量。
4.一種海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5的基因，其特征在于，編碼海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5前體的基因由321個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為1ATGTTCACCA TGAAGAAATC CATGTTACTC CTTTTCTTCC TTGGGACCAT CAACTTATCT 61CTCTGTGAGC AACAGAGAGA TGCCGAAGAA GAAAGAAGAG ACGATGAAGA TAAAAGGGAT121GTTGAAGTGG AAAAACGATT TGCATTAGGT GCGGTTACTA AGCGTTTGCC ATCACTGTTT181TGTTTGATTA CCAGAAAATG TTGAAGCTTG AGCTGGAAAT CATCTGATGA GAAATATAAT241TTAGCTAAAT GCACATCAGA TATCTTATAA AAAATAAAAA TTCTCACATG CAAAAAAAAA301AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A編碼海南湍蛙(Amolops hainanensis)成熟肽Hainanenin-5為第139-201位核苷酸， 其氨基酸序列為=PhelAla2Leutly4Ala5Val6Thr7Lys8Arg9Leuic1ProlSeri2Leui3Wie14Cys15Leu16 Ile17Thr18Arg19Lys20Cys21 (FALGAVTKRLPSLFCLITRKC)。
5.權利要求1的海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5具有抗微生物感染的作用，能夠作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物。
6.權利要求3所述的海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5基因的應用，其特征在于， Hainanenin-5抗微生物肽具有很強的抗微生物作用，溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測。
全文摘要
一種新型海南湍蛙(Amolops hainanensis)的抗微生物肽Hainanenin-5及其基因，分離、化學合成和在生物制藥領域的應用，屬于生物醫(yī)學技術領域。Hainanenin-5是經由電刺激海南湍蛙收集皮膚分泌液離心，凍干后經凝膠過濾柱層析和RP-HPLC后純化后得到的一種C端含有七元環(huán)的小肽，分子量為2337.91，等電點10.11。其一級結構為Phe1Ala2Leu3Gly4Ala5Val6Thr7Lys8Arg9Leu10Pro11Ser12Leu13Phe14Cys15Leu16Ile17Thr18Arg19Lys20Cys21。編碼Hainanenin-5前體基因由321個核苷酸組成，其中編碼成熟肽部分的為第139-201位核苷酸。Hainanenin-5分子量小、結構簡單，僅含有一個二硫鍵，方便化學合成及基因工程制備。Hainanenin-5作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應用，具有廣譜的抗微生物活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均有活性(包括臨床分離耐藥菌株)，此外還具有溶血性低有益特點。
文檔編號C07K1/20GK102516382SQ201110441909
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權日2011年12月26日
發(fā)明者于海寧, 何偉玉, 馮菲菲, 廣慧娟, 王義鵬 申請人:大連理工大學