專利名稱：二硫鍵穩(wěn)定的功能性可溶mhc ii類異二聚體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二硫鍵穩(wěn)定的重組MHC II類分子。
背景技術(shù)：
主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子為脊椎動物免疫系統(tǒng)的主要組成部分，存在于所有有核細(xì)胞表面。MHC有兩種主要的形式，S卩MHC I類和MHCII類。重要的是，兩種類型都與蛋白質(zhì)水解加工的肽形成稱為T細(xì)胞表位的功能性復(fù)合體，這發(fā)生于表達(dá) 特定MHC的完全相同的細(xì)胞中。產(chǎn)生的肽/MHC(pMHC)復(fù)合體隨后作為跨膜復(fù)合體存在于細(xì)胞表面上一該現(xiàn)象稱之為抗原遞呈。然后細(xì)胞表面-結(jié)合的PMHC可以與其同源部分(cognatepartner)——T細(xì)胞受體(TCR)相互作用，所述T細(xì)胞受體存在于T淋巴細(xì)胞的表面。
鑒于其在適應(yīng)性免疫中的重要作用，基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)對在細(xì)胞和分子水平上理解PMHC-TCR的相互作用很感興趣，從而獲得兩種分子的重組類型。也日益認(rèn)識到，能否獲得這種重組分子對能研究和理解系統(tǒng)生物，以及對開發(fā)新的治療和診斷是非常關(guān)鍵的。許多重大的醫(yī)學(xué)疾病需要進(jìn)行治療干預(yù)(therapeutic interventions),以調(diào)節(jié)病人免疫系統(tǒng)的活動。在如自身免疫性疾病和過敏癥中，需要抑制過于活躍的免疫系統(tǒng)和慢性炎癥。相反，免疫刺激是與感染和癌癥有關(guān)的途徑，以將免疫細(xì)胞激活并靶向于癌細(xì)胞。此外，移植接受者通常需要免疫抑制。同時，這也導(dǎo)致了大量免疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生，目前是一個數(shù)十億美元的產(chǎn)業(yè)。理解這些疾病中的免疫成分和篩選新的治療方法的關(guān)鍵是抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞間的相互作用，或者更具體地是MHC I型和II型分子與TCR間的相互作用。II型MHC特異性的與外源衍生肽結(jié)合，并將它們遞呈給CD4+T輔助細(xì)胞(TH細(xì)胞)。然后所述TH細(xì)胞被活化并成為分泌各種細(xì)胞因子的效應(yīng)細(xì)胞。這些細(xì)胞因子大量地活化參與處理威脅的其它免疫細(xì)胞。該系統(tǒng)的故障會導(dǎo)致諸如自身免疫性疾病或者使癌細(xì)胞生存和分裂。因此，自身免疫性疾病的特征是與MHC密切相關(guān)和靶器官T細(xì)胞浸潤(infiltration)。用于免疫調(diào)節(jié)劑篩選的平臺需要穩(wěn)定的、完全功能性的可溶性MHCII類分子。重要的是，目前可溶MHC II類分子的制備由于嚴(yán)重的問題而受阻，即缺乏分子穩(wěn)定性。在過去的幾年里，制備四聚體的可溶MHC I類分子的能力(四聚體技術(shù))已經(jīng)使基礎(chǔ)和應(yīng)用免疫學(xué)發(fā)生了變革(Constantin et al. ,2002, Biological Research forNursing,4 :115-127)。原因是，無論是就抗原而目還是就T細(xì)胞反應(yīng)而目，四聚體技術(shù)已大幅提高了以特定方式追蹤免疫反應(yīng)過程的能力，這主要通過流式細(xì)胞術(shù)來評估。這種能力也帶來了對免疫系統(tǒng)更深入的了解且確實(shí)可能帶來了新的診斷工具。到目前為止，四聚體試劑在很大程度上限于MHC I類分子，因?yàn)殛P(guān)于重組MHC I類制備的大多數(shù)技術(shù)問題似乎已經(jīng)得到解決。事實(shí)上，就MHC II類分子而言，已經(jīng)證明了這個任務(wù)更具顯著的挑戰(zhàn)性。因此，目前MHC II類四聚體制備的常規(guī)方法沒有可用的，雖然在文獻(xiàn)和商用試劑中都出現(xiàn)了獨(dú)立的例子(Vollers, S. and Stern, L. , 2008, Immunology123 :305-313)。在MHC II類四聚體可獲得的少量實(shí)例中，它們被廣泛地使用，并已對了解疾病的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響。因此，鑒于成功制備重組MHC I類產(chǎn)物已經(jīng)顯示的影響，可以看出無論在學(xué)術(shù)上還是商業(yè)上都存在強(qiáng)烈而清晰的動力，以在新的MHC II類生產(chǎn)道路中投入更多的努力。然而，鑒于迄今為止遇到的問題，成功是不確定的。由于部分不明的原因，已經(jīng)證明了MHC II類分子制備成可溶形式的穩(wěn)定重組分子尤其困難。天然分子是非共價(jià)的跨膜異質(zhì)二聚體，包括α-和0-鏈，0-鏈和β_鏈都具有跨膜區(qū)且屬于免疫球蛋白(Ig)超家族。各鏈的細(xì)胞外部分包括由兩個結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域由大約90個氨基酸殘基組成，其中兩個膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域，α I和β I結(jié)構(gòu)域形成對T細(xì)胞表位的肽結(jié)合性能所必需的格狀的α / β結(jié)構(gòu)(inter-latticed α / β structure)。兩個膜近端結(jié)構(gòu)域，α2和β 2結(jié)構(gòu)域，均形成離散的Ig結(jié)構(gòu)域。在α鏈和β鏈中，均有約20個氨基酸殘基的一段跨越細(xì)胞膜且在膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)存在相當(dāng)短的肽段。α鏈和β鏈的二聚作用被認(rèn)為是由以下原因產(chǎn)生⑴跨膜片段，(ii)肽結(jié)合以及(iii)在膜中發(fā)現(xiàn)的推定的附屬成分。因此，一旦脫離其天然環(huán)境并作為可溶性分子制備，MHC II類分子經(jīng)常受到內(nèi)在低穩(wěn)定性和非常低的生產(chǎn)水平的制約。此外，必須進(jìn)行廣泛的和資源高要求情況依賴性的優(yōu)化?！ご送?，鑒于二聚作用的上述要求，在任何非天然環(huán)境下的MHC II類分子制備的通用方法還不明朗，即在除與天然表達(dá)MHC II類分子的細(xì)胞的細(xì)胞膜相關(guān)制備以外的任何環(huán)境下，如其它生物實(shí)體、細(xì)胞或微粒(particles)表面上顯示的非水溶性分子制備，如通過融合成病毒衣殼蛋白的方式在曬菌體表面表達(dá)的非水溶性分子。因此，目前還不存在可制備穩(wěn)定MHC II類異二聚體的通用方法。然而，已進(jìn)行了大量的研究，所有的研究都代表了特定案例成功的例子，這相當(dāng)反映了任務(wù)的復(fù)雜性。這些例子是(i)真核細(xì)胞表面上的膜結(jié)合MHC II類異二聚體通過利用脂質(zhì)系鏈(lipid tether)(GPI 錨定)的異位表達(dá)，參見 Wettstein et al.，1991，J. of Exp. Medicine, 174 :219-228 ；
(ii)昆蟲細(xì)胞中MHC II類胞外結(jié)構(gòu)域(ectodomains)的表達(dá)，參見Wallny et al.,1995, Eur. J. Immunology, 25 :1262-1266 ； (iii)異源二聚作用基序的引入,如亮氨酸拉鏈、MHC II類分子C端的引入,結(jié)合昆蟲細(xì)胞生產(chǎn),參見Quarsten et al.,2001, J. Immunol.,167 :4861-4868 和 Crawford et al. ,2006, Immunological Reviews, 210 156-170 ； (iv)抗體/MHC II類嵌合體結(jié)合昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)的制備，參見Casares et al. , 1997, ProteinEngineering, 10 :1295-1301 ； (v)利用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)使得功能性pMHC三聚體通過包涵體重折疊的方法而形成，參見 Arimilli et al.，1995，J. Biol. Chem.，270 =971-977 ;或者(vi)使用截?cái)嘈图?xì)菌(truncated bacteral)產(chǎn)生的僅由al和β I結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單鏈MHCII類形式，使得功能性MHC分子通過包涵體重折疊的方法而形成,參見Burrows et al.,1999, Protein Engineering, 12 :771_778。此外，Landais et al. , 2009, J. Immunol. , 183 7949-7957描述了利用內(nèi)部人工二硫橋與外源性亮氨酸拉鏈結(jié)合以制備穩(wěn)定的小鼠I-AdOVA MHC II類四聚體的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。重要的是，盡管由于修飾，表達(dá)水平增加，顯然這些穩(wěn)定增加的分子沒有表現(xiàn)出特異性T細(xì)胞染色。

發(fā)明內(nèi)容
本文所描述的方法與現(xiàn)有技術(shù)體系相比具有顯著的優(yōu)勢，因?yàn)樗鼈儾粌H提供可以應(yīng)用于所有MHC II類分子的通用方法，還可以用于原核表達(dá)系統(tǒng)且不需要使用異源性/外源性二聚作用基序，如亮氨酸拉鏈。此外，本文描述的方法轉(zhuǎn)化為特異性T細(xì)胞染色功能的增強(qiáng)，且直接歸因于引入的修飾。然而令人驚訝的是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)確定了通用的方法，該方法可以克服或在很大程度上緩解與重組MHC II類分子相關(guān)的不穩(wěn)定性問題。該方法包括重組MHC II類分子的制備，所述重組MHC II類分子中具有α和β鏈的細(xì)胞外部分且α和β鏈異二聚體通過改造的/人工的二硫橋被穩(wěn)定，所述二硫橋利用α 2-β 2結(jié)構(gòu)域交叉區(qū)域(interface)連接該兩條鏈。二硫鍵將分子鎖定在穩(wěn)定的完整的功能性構(gòu)象中。重要的和有利的是，該用于穩(wěn)定MHC II類異二聚體的方法是通用的且不限于單一的重組形式，這樣，避免了需要進(jìn)行以上討論的廣泛的和資源高要求情況依賴性的優(yōu)化。此外，與許多現(xiàn)有的方法不同的是，考慮到原核宿主缺乏真核細(xì)胞的復(fù)雜機(jī)制，通常需要正確的二硫橋形成并因此形成功能性分子的事實(shí)，該方法可以應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)/宿主，這本身是令人驚訝的。本發(fā)明不僅解決了當(dāng)前阻礙探索和開發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑領(lǐng)域的爭議，而且也將是開發(fā)和修飾T細(xì)胞并用于治療的一個重要工具。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種重組MHC II類分子，包括·(i)MHC II類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；其中，⑴和(ii)提供了功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中⑴和(ii)通過位于所述α鏈α 2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β 2結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α2和β 2結(jié)構(gòu)域中。如上所述，蛋白質(zhì)如MHC II類分子，由一個以上的多肽組成并具有跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain),該蛋白質(zhì)很難在其天然膜的外部環(huán)境下制備,特別是以可溶的形式，因?yàn)樵谠S多情況下，除其它原因外，蛋白質(zhì)通過它的跨膜區(qū)域和可能的膜附屬成分被穩(wěn)定。這是MHC II類分子的實(shí)例且在文獻(xiàn)中已被揭示，文獻(xiàn)中MHC II類分子被報(bào)導(dǎo)是不穩(wěn)定的，不能以良好的產(chǎn)量制備或不能識別和結(jié)合肽。因此，目前發(fā)明的分子代表了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的重要進(jìn)步，因?yàn)樗鼈兪欠€(wěn)定的并可以識別并結(jié)合肽，也接受T細(xì)胞的染色。如上所述，天然MHC II類分子包括α鏈和β鏈，它們都具有跨膜區(qū)域并屬于免疫球蛋白(Ig)超家族。各個鏈的細(xì)胞外部分包括兩個結(jié)構(gòu)域，每一個結(jié)構(gòu)域由大約90個氨基酸殘基組成，其中兩個膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域，α I和β I結(jié)構(gòu)域形成T細(xì)胞表位的肽結(jié)合性能所必需的格狀α/β結(jié)構(gòu)。兩個膜近端結(jié)構(gòu)域，α2和β 2結(jié)構(gòu)域，均形成離散的Ig結(jié)構(gòu)域。α和β鏈中，均有約20個氨基酸殘基伸出跨越細(xì)胞膜且在膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)存在相當(dāng)短的肽段。本發(fā)明的分子包括MHC II類α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分以及MHC II類β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分。MHC II類α鏈細(xì)胞外部分包括信號序列、膜遠(yuǎn)端α I結(jié)構(gòu)域和膜近端α 2結(jié)構(gòu)域(形成離散的Ig結(jié)構(gòu)域)。在跨膜結(jié)構(gòu)域和α 2結(jié)構(gòu)域之間還有間隔區(qū)域。同樣，MHC II類β鏈細(xì)胞外部分包括信號序列、膜遠(yuǎn)端β I結(jié)構(gòu)域、膜近端β 2結(jié)構(gòu)域(形成離散的Ig結(jié)構(gòu)域)和間隔區(qū)域。本文所用的術(shù)語“MHC II類α鏈細(xì)胞外部分”不包括α鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域(cytoplasmic domain)。事實(shí)上,在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，重組MHC II類分子不包括所述跨膜結(jié)構(gòu)域的任何氨基酸殘基(即由專用的跨膜外顯子編碼的氨基酸)或所述胞漿結(jié)構(gòu)域的任何氨基酸殘基。同樣，本文所用的術(shù)語“MHC II類β鏈細(xì)胞外部分”不包括β鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域。事實(shí)上，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，重組MHC II類分子不包括所述跨膜結(jié)構(gòu)域的任何氨基酸殘基(即由專用的跨膜外顯子編碼的氨基酸)或所述胞漿結(jié)構(gòu)域的任何
氣基酸殘基。本發(fā)明的重組分子中可以存在α和/或β鏈的全部所述細(xì)胞外部分(即信號肽、α I/β I結(jié)構(gòu)域、α 2/β 2結(jié)構(gòu)域和間隔區(qū)域)。然而,另外,僅α鏈和β鏈的部分細(xì)胞外部分需要存在于本發(fā)明的分子中，只要就其連接到適當(dāng)肽的能力而言重組分子仍然是有功能的(如T細(xì)胞感受器肽)，并只要所述分子包含人工的(非天然的)半胱氨酸殘基且該殘基以能被用于形成二硫鍵來發(fā)揮穩(wěn)定重組MHC II型分子的形式或構(gòu)象存在。
可以從本發(fā)明重組MHC分子的α和/或β鏈中移除信號肽，特別是如果MHC II類分子在原核細(xì)胞中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地設(shè)計(jì)并制備適量N-端氨基酸殘基被移除的這種構(gòu)建體(constructs)。還可以很容易地測試這種移除是否會對功能,如結(jié)合肽或使T細(xì)胞活化或染色的能力產(chǎn)生影響，或?qū)Ψ肿拥姆€(wěn)定性產(chǎn)生影響。間隔區(qū)域也可以被完全移除或截去，例如，如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中所示，不包括α鏈間隔區(qū)和β鏈間隔區(qū)的9個氨基酸。再者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地設(shè)計(jì)和制備適量間隔區(qū)氨基酸殘基被移除的這種構(gòu)建體。還可以測試這種移除是否會對功能，如結(jié)合肽或使T細(xì)胞活化或染色的能力產(chǎn)生影響，或?qū)Ψ肿拥姆€(wěn)定性產(chǎn)生影響。本發(fā)明優(yōu)選的分子包括α I結(jié)構(gòu)域的至少一部分和β I結(jié)構(gòu)域的至少一部分，只要這種結(jié)構(gòu)域結(jié)合肽的功能或者本文描述的其它功能(例如為了遞呈這種肽到T細(xì)胞受體(TCRs))不受影響。此外，作為整體的重組MHC II類分子無論是在連接肽的能力還是在本文敘述的其它功能上仍必須是有功能的。例如為了遞呈這種肽至T細(xì)胞受體(TCRs))。優(yōu)選具有完整或全部長度的αI和/或β I結(jié)構(gòu)域，或者具有基本上完整或基本上全部長度的αI和/或βI結(jié)構(gòu)域，其中，所述基本上完整或基本上全部長度的結(jié)構(gòu)域包括天然序列的各種突變，例如氨基酸插入、缺失或置換，這種突變不影響這種結(jié)構(gòu)域結(jié)合肽或本文敘述的其它功能，例如為了遞呈這種肽至T細(xì)胞受體(TCRs)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪個氨基酸殘基可以被突變、修飾或缺失而不影響這種功能。MHC II類分子其它保留的更好的功能是能夠使T細(xì)胞活化且能更好地使T細(xì)胞染色。因此，本發(fā)明這些優(yōu)選的分子包括α I和β I結(jié)構(gòu)域足夠的殘基，使得能夠結(jié)合肽，例如為了遞呈這種肽至T細(xì)胞受體(TCRs)，以使T細(xì)胞活化或讓T細(xì)胞染色。本發(fā)明其它優(yōu)選的分子包括α 2結(jié)構(gòu)域的至少一部分和β 2結(jié)構(gòu)域的至少一部分，只要存在用于形成二硫鍵的非天然半胱氨酸殘基。這種半胱氨酸殘基相互之間需要以適當(dāng)?shù)姆较蚝途嚯x存在，以使半胱氨酸殘基之間能夠形成二硫橋并能夠起作用以穩(wěn)定重組MHC II型分子。此外，作為整體的重組MHC II型分子無論是就連接肽的能力而言還是就本文所述的其它功能(例如為了將這種肽遞呈至T細(xì)胞受體(TCRs))而言，仍必須是有功能的。優(yōu)選具有完整或全部長度的02和/或β 2結(jié)構(gòu)域，或者具有基本上完整或基本上全部長度的α2和/或β2結(jié)構(gòu)域，其中，所述基本上完整或基本上全部長度的結(jié)構(gòu)域包括天然序列的變異，例如氨基酸插入、缺失或置換，這種變異不會影響α2和β 2結(jié)構(gòu)域間二硫鍵的形成和后續(xù)重組MHC II類分子的穩(wěn)定以及不會有害地影響α 2或β 2結(jié)構(gòu)域的折疊。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定可以突變、修飾或缺失哪個氨基酸殘基而不影響這種功能。α和0MHC II類鏈的各種結(jié)構(gòu)和功能的結(jié)構(gòu)域和區(qū)域的氨基酸位置是眾所周知的并在本領(lǐng)域敘述，例如Burrows et al, 1999, supra。各種結(jié)構(gòu)域的位置也如圖3所示，這些信息可以很容易地被用于設(shè)計(jì)本文敘述的本發(fā)明的重組分子(參見如圖7)。分析本發(fā)明重組分子結(jié)合肽、使T細(xì)胞活化或使T細(xì)胞染色的能力的適當(dāng)功能性測試也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，且將包括例如表面等離子體共振(SPR)技術(shù)(如Biacore)和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)(如FACS)。特別優(yōu)選使用流式細(xì)胞術(shù)，因?yàn)榱魇郊?xì)胞術(shù)可以結(jié)合活細(xì)胞使用。本文所用的術(shù)語“二硫鍵”是指任何二硫橋，如改造的或人工的二硫橋，形成于定位在MHC II類異二聚體的α鏈α 2結(jié)構(gòu)域和β鏈β 2結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基之間(即 是與鏈內(nèi)(intra-chain)截然相反的鏈間(inter-chain) 二硫鍵)。所述二硫鍵在α鏈和β鏈之間形成共價(jià)鍵且發(fā)揮著穩(wěn)定MHC II類異二聚體的作用。因此，本發(fā)明的重組分子是穩(wěn)定的，并保留了完整的功能，例如，它們保留了它們對同源T細(xì)胞受體的配體的天然特異性，并優(yōu)選保留了使T細(xì)胞活化或使T細(xì)胞染色的能力?？梢酝ㄟ^眾所周知的方法分析本發(fā)明MHC II類分子穩(wěn)定的或變得穩(wěn)定的性能，如增強(qiáng)的對熱變性的抗性(例如通過ELISA、SPR或圓二色譜法測定)。更優(yōu)選的測試為評估SDS PAGE凝膠上保留的異二聚體。在非還原條件下，SDS-PAGE凝膠上可以很容易看到完整和穩(wěn)定二硫鍵合的異二聚體，可以觀察到適當(dāng)分子量處對應(yīng)完整異二聚體的帶。合理的試驗(yàn)在實(shí)施例中顯示，參見圖5和10。這種二硫鍵形成于半胱氨酸殘基之間，通常不存在于天然MHC II類α 2和β 2結(jié)構(gòu)域中。因此，所述半胱氨酸殘基被改造或人工地引入，例如通過天然分子中適當(dāng)?shù)姆前腚装彼釟埢c(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼釟埢瑥亩沟迷讦?和β 2結(jié)構(gòu)域中新引入的半胱氨酸殘基間形成二硫鍵。該鍵也可以被描述為內(nèi)部二硫鍵。用于突變?yōu)榘腚装彼岬倪m當(dāng)殘基優(yōu)選分別具有β -碳原子，所述β -碳原子相距約6Α (O. 6nm)、7A (O. 7nm)或以下,例如在4A (O. 4nm)或5A (O. 5nm)至6.5A (O. 65nm)或Ik (O. 7nm)范圍內(nèi)，優(yōu)選在5A (O. 5nm)至6.5A (O. 65nm)范圍內(nèi)，最優(yōu)選在天然MHC II類異二聚體中的距離在4A (O. 4nm)或5A (O. 5nm)至5.6A (O. 56nm)或6A (O. 6nm)范圍內(nèi)。優(yōu)選用于突變的位點(diǎn)在物種間和特定物種的亞型(isoforms)和亞類(isotypes)間是保守的。特別地，優(yōu)選的用于突變的位點(diǎn)在小鼠和人類MHC II類序列間是保守的，或者在人類MHC II類亞類如DP、DQ和DR間或鼠亞類如I-E和I-A間是保守的。此外，或另夕卜，優(yōu)選的用于突變的位點(diǎn)通過基于晶體結(jié)構(gòu)的3D疊加(3Dsuperimposition of crystal structures)的結(jié)構(gòu)分析被鑒定。在這種方式中，α2和β 2結(jié)構(gòu)域間形成交叉區(qū)域的殘基能夠被檢測并可以選擇具有相距7Α或者以下(或任何以上所述的其它距離或范圍)的β_碳原子的側(cè)鏈以進(jìn)一步的分析或突變成半胱氨酸殘基。進(jìn)行這種結(jié)構(gòu)分析的方法是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，MHC II類分子的晶體結(jié)構(gòu)隨時能夠用于進(jìn)行這樣的分析，例如來源于RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫。進(jìn)行這樣的晶體結(jié)構(gòu)的3D疊加分析的適當(dāng)軟件或其它方法也在本領(lǐng)域可以得到，例如使用免費(fèi)的軟件如PyMOL、M0LM0L> DeepView 或?qū)ｉT的網(wǎng)站如 iSuperpose。
特別優(yōu)選半胱氨酸被引入以形成二硫鍵的位點(diǎn)對為以下中的一對或多對，即一對或多對 Pro 96a2-Ser 11902 (第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12102 (第 2 排)、Arg 94a2_Asn15102(第 3 排)、Phe 148a2-Gly 15202 (第 4 排)、Pro 96a2-Thr 10102 (第 5 排)、Pro96a2-Ser 12102 (第 6 排)、lie 106a2_Asn 15102 (第 7 排)和 Ser 95a2_Asp 12202(第 8排)。根據(jù)β碳原子的臨近將各位點(diǎn)對排列，且雖然可以使用任意一對，但優(yōu)選的是1-4或1-3排的位點(diǎn)對。氨基酸位置和位于a 2和β 2結(jié)構(gòu)域中以及如上所述的殘基對位置上的天然氨基酸的性質(zhì)適于鼠I-E亞類的MHC II類分子。氨基酸編號與成熟肽的氨基酸(即排除了信號肽的編號)相關(guān)。能夠被用來鑒定修飾的半胱氨酸殘基位置的典型參考序列為MGT數(shù)據(jù)庫中給出的I-E序列，如圖3所示(α鏈記為H-2EA*02 (SEQ ID NO 1)且β鏈記為H-2EB*01(SEQ ID NO :2))。事實(shí)上，在圖3中，第I排、第2排和第3排位置的殘基用黑色陰影標(biāo)記，且可以很容易地從圖3中確定其它排殘基的位置。因此，除非另有說明，本文所述的MHC II類氨基酸殘基的編號和性質(zhì)遵循Lefranc, M-P.，et al. , 2009 (Nuc. Acids Res. ,37 :D1006_D1012, database issue (數(shù)據(jù)庫·問題))中描述的IMGT系統(tǒng)以及從以下參考網(wǎng)站獲得的IMGT數(shù)據(jù)庫http://imRt. cines.fr http://www. imRt. org。實(shí)施例中還提供了相關(guān)的GenBank(基因庫)收錄號。例如，H-2E (小鼠I-E)相關(guān)的收錄號為Κ00971(α-鏈)和AF050157 ( β -鏈)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，二硫鍵位于半胱氨酸殘基之間，該半胱氨酸殘基定位于小鼠I-E亞類的成熟多肽的Pro 96a2-Ser 11902 (第I排)、Ser 95a2Ser 12102(第2排)或Arg 94a2-Asn 151@2(第3排)對應(yīng)的殘基上或另外的MHC II類亞類中的相應(yīng)位置。本文提供了測定這種半胱氨酸殘基位置的參考序列。上述討論的優(yōu)選位點(diǎn)對也顯示于表2中，表2使用IFNG編號和MGT編號，即Pro96a2-Ser 11802(第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12002(第 2 排)、Arg 94a2_Asn 15002(第 3 排)、Phe 148a2-Gly 15102 (第 4 排)、Pro 96a2-Thr 10002 (第 5 排)、Pro 96a2-Ser 12002(第6排)、Ile 106a2-Asn 15002 (第 7 排)和 Ser 95a2_Asp 12102 (第 8 排)中的一對或多對。對于IFNG編號，表2的氨基酸編號對應(yīng)于生物大分子的三維結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)數(shù)據(jù)庫中的編號,檢錄號(entry number)PDB ID : 1FNG,且可以看出，這個數(shù)據(jù)庫記錄的β鏈中適當(dāng)殘基的位置比頂GT數(shù)據(jù)庫序列中的相應(yīng)殘基少一個氨基酸。因此，該命名是略有不同的。那些如表2和圖3所示的相應(yīng)殘基可以很容易地在其它小鼠亞類(如I-A亞類)或人亞類中鑒定到，例如通過使用適當(dāng)?shù)能浖鏑lustal軟件進(jìn)行比對。事實(shí)上，與小鼠I-A亞類的比對如圖3所示。此外，與人類MHC II類同種異型HLA-DP、-DQ和-DR的代表性比對如圖7所示。表2和圖3中所示的那些第1、2和3排的對應(yīng)殘基的位置用黑色陰影在圖7A中標(biāo)記為α -鏈和在圖7Β中標(biāo)記為β -鏈，且從圖7可以很容易地確定其它排殘基的位置?？梢钥闯?，表2和圖3所示的α 2和β 2位置在整個人類HLA族群(r印ertoire)中是完全保守的。因此，可以很容易地使用圖7所示的序列比對和上述信息定位在任何人類MHC II類等位基因的α2和β 2結(jié)構(gòu)域中的適當(dāng)殘基突變?yōu)榘腚装彼幔孕纬伤璧亩蜴I排列。類似的比對方法可以用來鑒定任意其它物種或亞類中的對應(yīng)殘基。
本文所討論的二硫鍵穩(wěn)定的連接與穩(wěn)定MHC II類分子的其它方法和手段如現(xiàn)有技術(shù)中的方法和手段是兼容的。例如，二硫鍵可與各種二聚作用基序如亮氨酸拉鏈基序(如 Quarsten et al. , 2001 and Crawford et al. , 2006, supra 中所述)結(jié)合使用，或者與Ig融合(與免疫球蛋白Fe片段融合,如Casares et al. , 1997, supra中所述)結(jié)合使用，且可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)本發(fā)明的分子以及編碼它們的載體。本文其它地方所述的在原核生物如細(xì)菌中表達(dá)或制備本發(fā)明的分子，宿主是優(yōu)選的，且在這樣的實(shí)施方式中，特別是在從包涵體中分離分子的實(shí)施方式中，優(yōu)選不使用亮氨酸拉鏈基序或其它二聚作用基序。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方面提供了一種能夠在細(xì)菌宿主中表達(dá)的重組MHC II類分子，該重組MHC II類分子包括(i)MHC II類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； 其中，(i)和(ii)提供了功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中(i)和(ii)通過位于所述α鏈α 2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β 2結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α2和β 2結(jié)構(gòu)域中。另一優(yōu)選方面提供了一種重組MHC II類分子，該重組MHC II類分子包括(i)MHC II類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；其中，(i)和(ii)提供了功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中(i)和(ii)通過位于所述α鏈α 2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β 2結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α2和β 2結(jié)構(gòu)域中，且進(jìn)一步地，所述重組分子不包括亮氨酸拉鏈基序。在其它實(shí)施方式中，不包括二聚作用基序。在這些實(shí)施方式中，優(yōu)選重組MHC II類分子能夠在原核生物如細(xì)菌宿主中表達(dá)。雖然本發(fā)明的二硫鍵連接可以與穩(wěn)定MHC 11類分子的其它方法和手段結(jié)合使用，所述二硫鍵可以提供穩(wěn)定MHC II類分子的獨(dú)有手段。事實(shí)上，這是優(yōu)選的實(shí)施方式。本文使用的術(shù)語“穩(wěn)定MHC II類分子的獨(dú)有手段”是指為穩(wěn)定分子提供獨(dú)有或唯一手段的二硫鍵不是特定MHC II類分子中任何天然存在或固有的穩(wěn)定性，如本發(fā)明的二硫鍵提供了穩(wěn)定MHC II類分子的獨(dú)有的或唯一的人工的或改造的或非天然的手段。因此，這種實(shí)施方式排除了本領(lǐng)域所述的其它穩(wěn)定手段的使用，如亮氨酸拉鏈或其它二聚作用基序。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，這種二硫鍵足以穩(wěn)定MHC II類分子而不需要任何額外的非天然手段的穩(wěn)定如二聚作用基序，這已在本文提供的數(shù)據(jù)中得到了很好的證明，其中該分子以穩(wěn)定和有功能的形式存在于絲狀噬菌體表面。該發(fā)現(xiàn)特別令人驚奇的是這樣的事實(shí)，以Ig折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Ig fold topology)構(gòu)建的改造分子在天然生物宿主中表達(dá)。在自然界只出現(xiàn)在生命的真核生物域的Ig折疊需要在天然半胱氨酸間形成保守的域內(nèi)S-S橋(Halaby，D.M.，et al.，1999，Protein Eng. ,12(7) :563)，以完成其功能的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。因此，被普遍接受的是，當(dāng)該分子在原核生物宿主中表達(dá)時，難免缺乏正確形成S-S橋所需的復(fù)雜真核細(xì)胞伴侶機(jī)制，明顯異常S-S橋的形成，會導(dǎo)致功能性表達(dá)的缺失。包括增加半胱氨酸數(shù)量的改造方法，不是說在這些系統(tǒng)中確定的形成人工S-S橋，因此，一般被認(rèn)為是無法生存的。在此，我們明確地提供了這不是事實(shí)的證據(jù)，因?yàn)楣δ苄苑肿油ㄟ^表現(xiàn)出特異性結(jié)合到同源配體(圖6和圖9)的共價(jià)二聚體的形成顯示于所示噬菌體上(圖5和

圖10)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明MHC II類分子的α和β鏈還包括鏈內(nèi)二硫鍵，如天然存在的存在于天然存在的半胱氨酸殘基之間的鏈內(nèi)二硫鍵。例如，這種天然存在的鏈內(nèi)二硫鍵可能存在于α2和β 2結(jié)構(gòu)域中，以形成這些結(jié)構(gòu)域的Ig折疊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。此外，大多數(shù)MHC II類分子在連接β_折疊層與α-螺旋部分的β I結(jié)構(gòu)域中具有域內(nèi)二硫橋。更重要的是，許多MHC II類分子在β I結(jié)構(gòu)域的折疊層中包含額外的游離半胱氨酸，它不參與任何二硫鍵的形成，但可以與新引入的非天然半胱氨酸殘基形成錯誤的二硫鍵。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，特別是在使用原核生物表達(dá)的實(shí)施方式中，剔除了該殘基，例如通過突變成保留完整結(jié)構(gòu)的其它殘基，如絲氨酸或丙氨酸。技術(shù)人員能夠很容易地在任何MHCII類等位基因中確定該半胱氨酸殘基的位置。例如，圖3Β(如SEQ ID NO 2)所示的全長MGT參考序列Η-2ΕΒ*01中的β鏈殘基38對應(yīng)的半胱氨酸，或者成熟MGT參考序列
(即無信號肽的序列)中的殘基12。其它β I結(jié)構(gòu)域半胱氨酸(形成橋的半胱氨酸)，該半胱氨酸也可以與新引入的非天然半胱氨酸殘基促進(jìn)錯誤二硫鍵形成，也可以很容易地被技術(shù)人員找到。例如，位于圖3Β (SEQ ID NO 2)所示的全長MGT參考序列Η_2ΕΒ*01中的殘基42和106，或分別是成熟IMGT參考序列(即無信號肽)的殘基16和80。在本發(fā)明替代和優(yōu)選的實(shí)施方式中，不存在一個或多個這些半胱氨酸殘基。這可以通過將適當(dāng)?shù)奶烊话腚装彼釟埢械囊粋€或多個突變?yōu)椴粎⑴c二硫鍵形成的另一種氨基酸殘基來實(shí)現(xiàn)，以防止鍵的形成。取代半胱氨酸的代表性殘基為保留分子完整結(jié)構(gòu)的，例如，保留氫鍵。上述Ser或Ala為首選的。上述一個或多個天然半胱氨酸殘基的剔除應(yīng)當(dāng)有利于防止在天然半胱氨酸殘基和本發(fā)明新改造的非天然半胱氨酸殘基之間形成錯誤的二硫鍵。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，剔除了 β I結(jié)構(gòu)域中的一個或多個天然半胱氨酸殘基。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，對應(yīng)全長參考序列H-2EB*01 (SEQ ID NO 2)位置38、42或106的半胱氨酸殘基中的一個或多個(或成熟參考序列中的相應(yīng)殘基)，或者其它MHC II類亞類中相應(yīng)位置處半胱氨酸殘基中的一個或多個被剔除。本文使用的術(shù)語“功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指本發(fā)明重組MHC II類分子中能夠與肽(如T細(xì)胞效應(yīng)器肽或抗原肽)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。這種肽結(jié)合應(yīng)當(dāng)處于能夠檢測的水平且用來檢測結(jié)合的適當(dāng)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，如表面等離子體共振(SPR)技術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)。在一些實(shí)施例中，所述肽以這樣的方式被結(jié)合，從而能夠?qū)⑺鲭倪f呈至TCR，或者至少測試所述肽是否能夠被遞呈至TCR。優(yōu)選地該肽以這樣的方式與MHC II類分子結(jié)合或聯(lián)合，從而能夠使TCR與pMHC復(fù)合體結(jié)合。更優(yōu)選地，這種與TCR的相互作用使得識別pMHC復(fù)合體的T細(xì)胞被染色或是可見。優(yōu)選地，這種肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合肽，然后開始通過TCR活化T細(xì)胞，如能夠誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞例如分泌細(xì)胞因子如IL-2，或者誘導(dǎo)細(xì)胞增殖(如通過將BrdU并入為cpm進(jìn)行測量)。這種肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常由來源于MHC II類分子α I和β I結(jié)構(gòu)域的殘基形成。本發(fā)明的MHC II類分子可以以無修飾或空載的形式提供，即沒有肽結(jié)合到上述的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即不含肽)。在這種情況下，隨后可以在體外用任何適當(dāng)?shù)碾难b載MHC II類分子。這種體外裝載優(yōu)于許多在先的MHC II類分子，為了有助于II類異二聚體的穩(wěn)定，必須附加肽而制備，如按照借助短接頭(linker)將肽制備成具有MHC β鏈的共價(jià)融合蛋白的方式制備。體外裝載能夠產(chǎn)生真正通用的MHC II類分子，而無需為每個不同的MHC-肽復(fù)合體提供不同的表達(dá)載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，重組MHC II類分子含有與上述肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合或聯(lián)合的肽?？梢允褂萌魏芜m于與由MHC II類分子的α I和β I結(jié)構(gòu)域的殘基形成的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域相結(jié)合或聯(lián)合的肽。通常這種肽為12-25mer，且通常由α I和β I結(jié)構(gòu)域形成的凹槽兩端伸出。在天然的MHC II類分子中，該肽源于外源性抗原。在本發(fā)明中，可以使用任何這種多肽。例如，本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定的和文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的一些由MHC II類分子遞呈并引起TCR結(jié)合和T細(xì)胞活化的特異性T細(xì)胞效應(yīng)器肽，且這些肽中的任何一個可以與本發(fā)明結(jié)合使用。特別地，已經(jīng)確定了由MHC II類分子遞呈的特定肽與特定疾病存在聯(lián)系，且在本發(fā)明重組MHC II類分子與肽聯(lián)合的實(shí)施方式中，優(yōu)選疾病特異性肽。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了一些這樣的肽，而其它的在將來將被鑒定，這些肽中的任何一個均適于與所述MHC II類分子使用。與MHC II類分子肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域聯(lián)合或結(jié)合的代表性肽為已被發(fā)現(xiàn)·的由HLA-DQ2MHC II類分子遞呈且與腹腔疾病相關(guān)的人類a -II-醇溶蛋白(N-PQPELPYPOPE-C);已被發(fā)現(xiàn)的由HLA-DR4MHC II型分子遞呈且與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)相關(guān)的人類 hCkappaaa4CH48 (N-WKIDGSERQ-C);已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由 HLA-DP1MHC II類分子遞呈且與破傷風(fēng)相關(guān)的人類TTaa94Hfi7(n-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-C)；以及已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由鼠I-Ed II類分子遞呈且源自H型流感(H. influenza) (aal 10-120 N-SFERFEIFPKE-C)的禽流感膜蛋白(HA)衍生的肽。另外，可以使用其它肽，例如鑒定這些肽是否可以與肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合以及它們是否能夠使T細(xì)胞結(jié)合以及優(yōu)選通過TCR使T細(xì)胞染色或使T細(xì)胞活化。以這種方式，本發(fā)明的分子可以用于鑒定充當(dāng)T細(xì)胞表位的新的和先前未知的肽(如抗原肽)。另外，重組MHC II類分子可以與無關(guān)的或非T細(xì)胞效應(yīng)器肽(所謂的“填充”肽)聯(lián)合，所述無關(guān)的或非T細(xì)胞效應(yīng)器肽可以通過打開將其連附至MHC分子的接頭而從MHCII類分子中釋放出來，然后被參與體外肽交換反應(yīng)的T細(xì)胞效應(yīng)器肽取代?？梢砸匀魏芜m當(dāng)?shù)姆绞酱龠M(jìn)所述肽與MHC II類分子的結(jié)合或聯(lián)合。例如，可以改造本發(fā)明的構(gòu)建體，使得這種肽與MHC II類分子結(jié)合而制得(如通過在相同的構(gòu)建體上編碼它們，如編碼通過適當(dāng)?shù)慕宇^序列共價(jià)連接至PMHC II類鏈或a MHC II類鏈的肽，或者在相同宿主細(xì)胞中的不同構(gòu)建體)，從而促進(jìn)重組MHC II類分子的制備(該重組MHC II類分子可遞呈或結(jié)合或聯(lián)合被適當(dāng)?shù)腡輔助細(xì)胞識別的所述肽)。制備所述肽聯(lián)合分子的適當(dāng)方法如Kozono等1994 (Nature, 369 :151-154)所述。Kozono的方法使用18aa的殘基接頭，然而在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，更短的接頭如15aa接頭(如Gly-Ser接頭如(G4S)3)或 6、7 或 8aa 殘基接頭(如 Gly-Ser 接頭如 GSGSGS、GGSGSGS、SGSGSGS 或 SGGSGSGS)，最優(yōu)選使用6aa的殘基接頭。本發(fā)明普遍適用于任何類型的MHC II類分子，例如適用于任何物種的MHC II類分子和那個物種中MHC II類分子的任何子型(sub-type)。特別地，本文鑒定的殘基(該殘基用于突變?yōu)榉翘烊话腚装彼釟埢源偈挂粋€或多個鏈間二硫鍵的形成)為物種間保守的，從而支持了方法的普遍性。因此，本發(fā)明能夠適用于所有哺乳動物的MHC II類分子，如人類、小鼠、大鼠、豬、山羊和綿羊，特別是人類和小鼠分子。例如，本發(fā)明適用于DP、DQ和DR人類MHC II類分子(即三種在人類中鑒定的功能性MHC II類分子類型)和小鼠I-A和I-E分子(例如I-Ed和I-Ek分子，優(yōu)選I-Ed)。其它I-A和I-E分子的例子如下表所示。用常規(guī)使用的近交系小鼠(inbred mouse strain)表達(dá)MHC等位基因
權(quán)利要求
1.一種重組MHC II類分子，其特征在于，該重組MHC II類分子包括 (i)MHCII類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了有功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中⑴和(ii)通過位于所述α鏈的α 2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β 2結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α2和β 2結(jié)構(gòu)域中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組MHCII類分子，其中，所述重組分子不包括亮氨酸拉鏈基序。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組MHCII類分子，其中，所述二硫鍵位于位置在小鼠I-E 亞類的 Pro 96a2-Ser 11902 (第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12102 (第 2 排)或 Arg 94a2_Asn15102(第3排)的半胱氨酸殘基或其它MHC II類亞類中的相應(yīng)位置的半胱氨酸殘基之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組MHCII類分子，其中，所述二硫鍵位于位置在小鼠I-E亞類的Ser 95a2-Ser 121@2(第2排)的半胱氨酸殘基或其它MHC II類亞類中的相應(yīng)位置的半胱氨酸殘基之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，對應(yīng)參考序列H-2EB*01(SEQ ID NO :2)位置38、42或106的半胱氨酸殘基中的一個或多個，或者其它MHCII類亞類中相應(yīng)位置處的半胱氨酸殘基中的一個或多個被剔除。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述重組分子在絲狀噬菌體的表面表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組MHCII類分子，其中，所述重組分子表達(dá)為與噬菌體表面蛋白 gpIII、gpVII、gpVIII 或 gpIX 的融合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組MHCII類分子，其中，所述噬菌體表面蛋白為gpIX。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子為可溶性分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子的(i)或(ii)與免疫球蛋白的Fe部分融合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子為多聚體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子的(i)或(ii)源自小鼠或人類MHC II類分子，優(yōu)選為人類。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子由細(xì)菌宿主產(chǎn)生。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組MHCII類分子，其中，所述細(xì)菌宿主為大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌K12衍生物，更優(yōu)選具有BL21表型的大腸桿菌或其衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述二硫鍵為MHCII類分子的穩(wěn)定提供了唯一的方式。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子能夠使T細(xì)胞染色。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)所述的重組MHCII類分子，其中，所述分子進(jìn)一步包括與所述肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的肽。
18.一種能夠在原核宿主中表達(dá)的重組MHC II類分子，其特征在于，該重組MHC II類分子包括 (i)MHCII類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中⑴和(ii)通過位于所述α鏈的α2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β2結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α2和β 2結(jié)構(gòu)域中。
19.一種制備重組MHC II類分子的方法，其特征在于，該方法包括 (i)MHCII類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中⑴和(ii)通過位于所述α鏈的α2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β2結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α 2和β 2結(jié)構(gòu)域中， 所述方法包括在原核宿主中表達(dá)所述重組分子。
20.一種能夠被T細(xì)胞識別的抗原肽表位的鑒定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟將權(quán)利要求17所述的重組MHC II類分子與T細(xì)胞受體接觸，并檢測所述重組MHC II類分子與所述T細(xì)胞受體的結(jié)合。
21.—種樣品中抗原特異性T細(xì)胞的檢測方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求17所述的重組MHC II類分子與所述樣品接觸，并檢測所述重組MHCII類分子與所述T細(xì)胞的結(jié)合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述方法用于檢測樣品中的疾病特異性T細(xì)胞的存在并診斷疾病的存在或消失。
全文摘要
本發(fā)明涉及二硫鍵穩(wěn)定的重組MHC II類分子。特別地，本發(fā)明提供了一種重組MHC II類分子，該重組MHC II類分子包括(i)MHC II類分子α鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；(ii)MHC II類分子β鏈細(xì)胞外部分的全部或部分；其中，(i)和(ii)提供了功能性肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且其中(i)和(ii)通過位于所述α鏈α2結(jié)構(gòu)域和所述β鏈的β2結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基間的二硫鍵連接，其中，所述半胱氨酸殘基不存在于天然MHC II類的α2和β2結(jié)構(gòu)域中。在原核系統(tǒng)中制備這些分子的方法以及這些分子的各種用途構(gòu)成了另外的方面。
文檔編號C07K14/435GK102947330SQ201180011237
公開日2013年2月27日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者吉爾·艾吉·洛塞特, 泰耶·弗里格斯塔德, 英格·桑德萊, 比亞內(nèi)·博根 申請人:奧斯陸大學(xué)