專利名稱：：在絲狀真菌中產(chǎn)生c4二羧酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在絲狀真菌中改善C4二羧酸(例如蘋果酸)的產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
：有機酸在多種工業(yè)中具有悠久歷史的商業(yè)使用。舉例而言，有機酸用于食品和飼料工業(yè)(檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸)，作為用于產(chǎn)生多種聚合物的單體(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸)，作為金屬螯合劑(葡糖酸)和作為“綠色”溶劑(乙酸)(Sauer等，2008，TrendsinBiotechnology26:100-108)。有機酸自身可為商業(yè)產(chǎn)品或其可為用于制造其他化學(xué)品的化學(xué)構(gòu)件(buildingblock)。除了專門應(yīng)用之外,長久以來公認C4二羧酸亦可充當構(gòu)件化合物以供產(chǎn)生大體積的工業(yè)化學(xué)品，如1，4-丁二醇，四氫呋喃和Y-丁內(nèi)酯。由于石油衍生構(gòu)件的高成本，通過傳統(tǒng)石油化學(xué)途徑產(chǎn)生這些大體積工業(yè)化學(xué)品的成本顯著增加。有機酸在商業(yè)上是通過從石油衍生原料的化學(xué)合成(例如，延胡索酸、蘋果酸、丙烯酸和己二酸)或通過微生物發(fā)酵(例如檸檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)產(chǎn)生的。一些有機酸如延胡索酸和蘋果酸亦可通過微生物發(fā)酵來產(chǎn)生，但由于更低的生產(chǎn)成本，目前在商業(yè)上仍通過化學(xué)合成從石油化學(xué)原料產(chǎn)生。然而，石油衍生構(gòu)件化學(xué)品的成本的日益升高，地緣政治的不穩(wěn)定性對原油價格的影響，以及對實施利用來源于可再生資源的原料的制造工藝的期望，刺激了通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生有機酸和其他化學(xué)品中的重建的興趣。雖然現(xiàn)在通過化學(xué)合成從石油化學(xué)原料商業(yè)性產(chǎn)生蘋果酸，其亦可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生。蘋果酸已在基因工程改造的酵母(釀酒酵母(Saccharomycescerevisia))(Zelle等,2008,Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的絲狀真菌如曲霉屬菌種(Aspergillusspp.)(美國專利號3,063,910;Bercovitz等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中以高水平產(chǎn)生。Abe等(美國專利號3，063，910)和Bercovitz等(1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)報道了在幾種曲霉屬菌種中高水平的蘋果酸產(chǎn)生。而且，Battat等(1991,Biotechnol.Bioengineering,37:1108-1116)報道了在優(yōu)化條件下在攪拌的發(fā)酵罐中由黃曲霉(Aspergillusflavus)產(chǎn)生了高至113g/L的蘋果酸。在W02010/003728中描述了在酵母中通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生二羧酸。亦在W02009/011974和W02009/155382中描述了通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生蘋果酸。通過對曲霉屬(Aspergillus)進行遺傳工程改造改善蘋果酸產(chǎn)生會使得能夠通過發(fā)酵經(jīng)濟地商業(yè)性生產(chǎn)蘋果酸。在曲霉屬菌種(Aspergillusspp.)中的蘋果酸過量產(chǎn)生在特定的培養(yǎng)條件(有氧條件和高C:N比；碳酸鈣亦作為中和劑和作為用于蘋果酸生物合成的CO2源添加)下發(fā)生。在這些條件下，通過胞質(zhì)溶膠的、還原性三羧酸(TCA)循環(huán)的溢出代謝(overflowmetabolism)導(dǎo)致增加的蘋果酸生物合成和分泌入培養(yǎng)基。已在釀酒酵母中報道了通過使用遺傳工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等，1999，F(xiàn)EMSMicrobiolLett.179:107-113)或蘋果酸脫氫酶(Pines等,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達(Zelle等，2008，見上)增加蘋果酸產(chǎn)生?；谏锘瘜W(xué)證據(jù)，提出了在黃曲霉菌株ATCC13697中，蘋果酸脫氫酶活性限制蘋果酸產(chǎn)生(Peleg等，1988，Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。2010年4月23日提交，標題為“MethodsforImprovingMalicAcidProductioninFilamentousFungi”的美國臨時申請?zhí)?1/327，224(其內(nèi)容通過提述以其整體并入本文)描述了在絲狀真菌中的蘋果酸產(chǎn)生。在本領(lǐng)域中，在曲霉屬中作為使用重組DNA技術(shù)的遺傳工程改造的結(jié)果而改善C4二羧酸產(chǎn)生如蘋果酸產(chǎn)生會是有益的。本發(fā)明提供了用于改善C4二羧酸產(chǎn)生(例如蘋果酸產(chǎn)生)的方法等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及產(chǎn)生C4二羧酸(例如蘋果酸)的方法。在一個方面，該方法包括(a)培養(yǎng)宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)，所述宿主細胞包含編碼本文中所述的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸；和(b)回收所述C4二羧酸(例如蘋果酸)。在另一個方面，該方法包括(a)將編碼本文中所述的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物；和(c)回收所述C4二羧酸(例如蘋果酸)。本發(fā)明還涉及宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞，如米曲霉(AspergiIIusoryzae)),所述宿主細胞包含本文中所述的多核苷酸,其中所述宿主細胞分泌和/或能夠分泌增加水平的C4二羧酸(例如蘋果酸)。圖1顯示p41620ssjMAT275的限制圖譜。圖2顯示pShTh60的限制圖譜。圖3顯示pSaMF37的限制圖譜。圖4顯不日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicus)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的基因組密碼子優(yōu)化的DNA序列(CO)，推導(dǎo)的氨基酸序列，和基因組野生型DNA序列(WT)(分別為SEQIDNO:1、2和3)。定義C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白術(shù)語“C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白”在本文中定義為可將蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸轉(zhuǎn)運至細胞外的二羧酸通透酶(Grobler等，1995，Yeast11:1485-1491;Camarasa等,2001,AppliedandEnvironmentalMicrobiology67:4144-4151)。用于預(yù)測線粒體輸入的蛋白及其祀向序列的計算方法由Claros和Vincens,1996，Eur.J.Biochem.241:779-786描述。所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白具有SEQIDNO:2的成熟多肽的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性(例如蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白活性)的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%,至少80%,至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%ο蘋果酸脫氫酶術(shù)語“蘋果酸脫氫酶”在本文中定義為在NADH+H+的存在下催化將草酰乙酸還原為蘋果酸和NAD+的蘋果酸NAD+氧還酶(EC1.1.1.37)。就本發(fā)明而言，根據(jù)下述步驟確定蘋果酸脫氫酶活性。測定溶液由ImM草酰乙酸，IOOmMTrispH8.0,10mMNaHCO3,5mMMgCl2,和O.1mMNADH(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)組成。將不含草酸乙酸作為底物的測定溶液作為對照運行以測量背景NADH降解率。用雙蒸水制備每種上清的1/100，1/500，1/2500和1/12500的稀釋。將測定溶液的270μI的等分試樣分配入96孔聚苯乙烯平底板。添加每種稀釋的上清的30μI樣品以起始測定。使用SPECTRAMAX340PC讀板器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)以下述設(shè)定監(jiān)測反應(yīng)340nm,動力學(xué)讀取。使用NADH的濃度系列以構(gòu)建標準曲線，并使用純化的蘋果酸脫氫酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)的稀釋系列作為陽性對照。一單位的蘋果酸脫氫酶活性等于能夠在pH8.0，25°C每分鐘將I微摩爾草酰乙酸和NADH+H+轉(zhuǎn)化為蘋果酸和NAD+的酶量。丙酮酸羧化酶術(shù)語“丙酮酸羧化酶”在本文中定義為在ATP和HC03_存在下催化將丙酮酸羧化為草酰乙酸、ADP和磷酸的丙酮酸二氧化碳連接酶(ADP-形成)(EC6.4.1.1)。就本發(fā)明而言，根據(jù)針對丙酮酸羧化酶的SIGMAQualityControlTest方法(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)的步驟確定丙酮酸羧化酶活性,只是該測定中使用的緩沖液為PH8.O的Tris緩沖液。一單位的丙酮酸羧化酶活性等于能夠在pH7.8，30°C每分鐘將I微摩爾的丙酮酸和CO2轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶量。異源多核苷酸術(shù)語“異源多核苷酸”在本文中定義為對于宿主細胞并非天然的多核苷酸；其中已對編碼區(qū)進行結(jié)構(gòu)修飾的天然多核苷酸；作為通過重組DNA技術(shù)(例如，不同的(外源)啟動子)操縱DNA的結(jié)果其表達定量改變的天然多核苷酸；或其表達通過將一個或多個(例如，兩個、幾個)額外拷貝的多核苷酸導(dǎo)入宿主細胞而定量改變的天然多核苷酸。分離的/純化的術(shù)語“分離的”和“純化的”意指從至少一種與其天然結(jié)合(associated)的成分分離的多肽或多核苷酸。舉例而言，如通過SDS-PAGE確定的,該多肽可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，至少93%純，至少95%純，至少97%純，至少98%純，或至少99%純；且如通過瓊脂糖電泳確定的，該多核苷酸可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，至少93%純，至少95%純，至少97%純，至少98%純，或至少99%純。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”意指為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，基于預(yù)測SEQIDNO:2的氨基酸I至89是信號肽的InterProScan程序(TheEuropeanBioinformaticsInstitute),所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸90至450。在另一個方面，基于預(yù)測SEQIDN0:2的氨基酸I至57是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6),所述成熟多妝是SEQIDN0:2的氨基酸58至450。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在意指為編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的成熟多肽的多核苷酸。所述成熟多肽編碼序列可來自基因組DNA(“成熟多肽基因組編碼序列”)或來自cDNA(“成熟多肽cDNA編碼序列”)。在一個方面，基于預(yù)測SEQIDNO:1的核苷酸I至267編碼信號妝的InterProScan程序(TheEuropeanBioinformaticsInstitute)，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸268至1353。在另一個方面，基于預(yù)測SEQIDNO:1的核苷酸I至171編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6),所述成熟多妝編碼序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸172至1353。序列同一性兩個氨基酸序列間或兩個核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)“序列同一性”所描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序(優(yōu)選為3.0.0版或之后的版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)確定的。所用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)O.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，Rice等,2000,見上)的Needle程序(優(yōu)選為3.O.O版或之后的版本)中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定的。所用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口總數(shù))。片段術(shù)語“片段”意指從成熟的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的多肽。在一個方面，所述片段具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性。在另一個方面，片段包含SEQIDNO:2的至少385個氨基酸殘基，例如至少405個氨基酸殘基或至少425個氨基酸殘基。亞序列術(shù)語“亞序列”意指從成熟多肽編碼序列的5'和/或3'端缺失了一個或多個(例如兩個、幾個)核苷酸的多核苷酸。在一個方面，所述亞序列編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段。在另一個方面，亞序列包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:3的至少1155個核苷酸，例如至少1215個核苷酸或至少1275個核苷酸。等位變體術(shù)語“等位變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。編碼序列術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重組多核苷酸。cDNA:術(shù)語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。在一些情況下，cDNA序列可與基因組DNA序列完全相同。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或經(jīng)修飾以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語“調(diào)控序列”意指編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的表達所必需的所有組分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可為天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可為天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并與供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞術(shù)語“宿主細胞”意指任何細胞類型，所述細胞類型對于用包含本發(fā)明的多核苷酸(例如編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸)的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語宿主細胞涵蓋親本細胞的任何后代,其由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。變體術(shù)語“變體”意指在一個或多個位置包含改變即取代、插入和/或缺失一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸殘基的，具有活性例如C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽。取代意指將占據(jù)某位置的氨基酸用不同的氨基酸替換；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在占據(jù)某位置的氨基酸的相鄰處添加一個或多個，例如1-3個氨基酸。在本文中，提及“約”某值或參數(shù)包括了涉及該值或參數(shù)本身的方面。舉例而言，提及“約X”的描述包括了“X”的方面。如用于本文中和所附權(quán)利要求中，除非上下文明確地表示相反，單數(shù)形式“一(個/種···)&)”或“所述/該(the)”包括了對復(fù)數(shù)的提及。應(yīng)理解本文中所述的發(fā)明的各方面包括了“由…組成(consisting)”和/或“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”的方面。除非另行定義或上下文明確指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的相同的含意。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了特定基因在宿主細胞如絲狀真菌例如曲霉屬(Aspergillus)中的過量表達以增強C4二羧酸(例如蘋果酸)的產(chǎn)生，其涵蓋通過C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白將C4二羧酸轉(zhuǎn)運至細胞外。在本發(fā)明中，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可為任何適于實施本發(fā)明的、所述的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是在培養(yǎng)條件下過表達，以高效價產(chǎn)生C4二羧酸的轉(zhuǎn)運蛋白。在一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生C4二羧酸(例如蘋果酸)的方法，其包括(a)培養(yǎng)宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)，所述宿主細胞包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸，其中所述宿主細胞與不具有所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞相比分泌增加水平的蘋果酸，且其中所述轉(zhuǎn)運蛋白選自(i)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(ii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件下與SEQIDNO:1或3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列雜交；(iii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少60%序列同一性；(iv)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個氨基酸(例如兩個、幾個)的取代、缺失和/或插入；和(V)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段；和(b)回收所述C4二羧酸。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于增加C4二羧酸(例如蘋果酸)產(chǎn)生的方法，該方法包括(a)將編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)，其中所述宿主細胞與不具有所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞相比分泌增加水平的蘋果酸，且其中所述轉(zhuǎn)運蛋白選自(i)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性；(ii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件下與SEQIDNO:1或3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列雜交；(iii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列具有至少60%序列同一性；(iv)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個氨基酸(例如兩個、幾個)的取代、缺失和/或插入；和(V)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物；和(c)回收所述C4二羧酸。在一些這些方面，所述C4二羧酸是蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸或延胡索酸，或其組合。在一些方面，所述C4二羧酸是蘋果酸、琥珀酸或延胡索酸，或其組合。在一些方面，所述C4二羧酸是蘋果酸或延胡索酸，或蘋果酸和延胡索酸的組合。在一些方面，所述C4二羧酸是蘋果酸。在任何這些方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性，并包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2或SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白與SEQIDNO:2的成熟多肽相差不多于十個氨基酸，例如十個氨基酸，例如不多于五個氨基酸，不多于四個氨基酸，不多于三個氨基酸，不多于兩個氨基酸，或不多于一個氨基酸，如下文對變體的討論中所述。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體，或前述的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDN0:2的氨基酸序列。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段組成。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDNO:2的成熟多肽或由SEQIDN0:2的成熟多肽組成。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸58至450或由SEQIDNO:2的氨基酸58至450組成。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDNO:2的氨基酸90至450或由SEQIDNO:2的氨基酸90至450組成。在任何這些方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由下文中在關(guān)于分離的多核苷酸的部分中所述的多核苷酸編碼。在任何這些方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDN0:1和/或SEQIDNO:3或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDNO:1或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDNO:3或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。SEQIDNO:1,SEQIDNO:3的多核苷酸，或亞序列；以及SEQIDN0:2的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，例如長度上為至少14，至少25，至少35，或至少70個核苷酸。優(yōu)選所述核酸探針是至少100個核苷酸的長度。舉例而言，所述核酸探針可為至少200個核苷酸，例如至少300個核苷酸，至少400個核苷酸，或至少500個核苷酸的長度，可使用甚至更長的探針，如至少600個核苷酸，例如至少700個核苷酸，至少800個核苷酸，或至少900個核苷酸的長度的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以供檢測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中?？蓮挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它株的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或它們的亞序列同源的克隆或DNA，所述載體材料可用于Sounthern印跡。就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:1,SEQIDNO:3或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；或前述的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個方面，核酸探針是SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2或其片段的多核苷酸。在另一個方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個方面，核酸探針是SEQIDN0:3。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍栏裥詾?0%的甲酰胺,根據(jù)標準的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在45。。(非常低嚴格性)，在50°C(低嚴格性)，在55°C(中嚴格性)，在60°C(中-高嚴格性)，在65°C(高嚴格性)，和在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA48:1390)計算的Tni低大約5至大約1(TC，在O.9MNaCl,O.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，O.5%NP_40，IXDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉，ImM憐酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在這些方法的任何方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。在這些方法的一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。在這些方法的另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%,至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。在任何這些方面，C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白為變體，其包含SEQIDN0:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入。優(yōu)選地，氨基酸改變的性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的,并且由例如H.NeuratMPR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly?；蛘?，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改善多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來確定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992，J.Mol·Biol.224:899-904；fflodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一'丨生分析來推斷，所述多肽與親本多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffIing)方法接著進行有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156；W095/17413;或W095/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、卩遼菌體展不(例如，Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837;美國專利No.5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999,NatureBiotechnologyl7:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域中的標準方法快速測序。這些方法允許快速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。在一些方面，SEQIDNO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如不多于1，2，3，4，5，6，7，8或9。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是SEQIDNO:2的片段，其中所述片段具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性。在一個方面，所述片段含有SEQIDNO:2的至少385個氨基酸殘基，例如優(yōu)選至少405個氨基酸殘基，或至少425個氨基酸殘基。所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于本發(fā)明多肽的N端或C端。通過將編碼另一個多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的調(diào)控下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術(shù)構(gòu)建,其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993,EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。融合多肽還可以包含在兩個多肽之間的切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，釋放所述兩個多肽。切割位點的實例包括，但不限于，公開于Martin等，2003，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnologyl3:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381;Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等，1995,Biotechnologyl3:982-987;Carter等，1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點。多核苷酸用于本文中提及的任何方面(例如，SEQIDNO:2用于產(chǎn)生C4二羧酸的方法，增加C4二羧酸產(chǎn)生的方法，或其宿主細胞的任何方面)的用于分離或克隆編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等,1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮牧阎辰湍笇?Schizosaccharomyces)菌株,或其他或相關(guān)生物體克隆所述多核苷酸,并且因此可為例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。在一個方面，所述分離的多核苷酸包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或由SEQIDN0:1或SEQIDN0:3組成。在另一個方面，所述分離的多核苷酸編碼包含SEQIDN0:2或由SEQIDNO:2組成的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。本發(fā)明亦涵蓋編碼包含SEQIDNO:2或由SEQIDNO:2組成的多肽的核苷酸序列(或任何其相關(guān)的方面)，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而與SEQIDN0:1或SEQIDN0:3不同。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:1的亞序列，其編碼SEQIDNO:2的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段。在另一個方面，所述分離的多核苷酸可為突變的多核苷酸，其SEQIDN0:1或SEQIDNO:3中包含或僅具有(consistof)至少一個突變，其中所述突變的核苷酸序列編碼SEQIDN0:2。在另一個方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的分離的多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。在一個方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的分離的多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDNO:1或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的分離的多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDNO:3或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，所述分離的多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1或3的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，并編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽。在一個方面，所述分離的多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，并編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽。在另一個方面，所述分離的多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，并編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的多肽。在另一個方面，所述編碼具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的分離的多核苷酸通過以下獲得(a)將DNA群體在非常低、低、中等、中等-高、高或非常高嚴格條件下與以下雜交=SEQIDN0:1或SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；和(b)分離所述雜交的多核苷酸。C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的來源所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”應(yīng)意指由多核苷酸編碼的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的多核苷酸的細胞產(chǎn)生。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至外膜。所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可為細菌C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。例如，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可以是革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)^L桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白可為真菌C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在一個方面，所述真菌C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白為酵母C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是裂殖酵母屬C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，如日本裂殖酵母C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是SEQIDN0:2的日本裂殖酵母C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是絲狀真菌C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二抱屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)^If菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。在另一個方面，所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、黃曲霉、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Asperigullusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、醬油曲霉(Aspergillussojae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白把齒菌(IrpexIacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimet1、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。亦可使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白。用于從天然生境(habitat)分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。然后可通過相似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合適探針檢測到編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)將所述序列分離或克隆(參見，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸，如編碼蘋果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)與一個或多個(例如兩個、幾個)調(diào)控序列連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達。在一個方面，所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對該多核苷酸外源的啟動子。在一個方面，編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對該多核苷酸外源的啟動子。在一個方面編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對該多核苷酸外源的啟動子?？梢杂迷S多方式操作多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可為啟動子序列，其是由用于表達編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸，如編碼蘋果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)的宿主細胞所識別的多核苷酸。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核β-內(nèi)酸胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)。另外的啟動子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其來自在曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列已由在曲霉屬(Aspergilli)中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實例包括修飾的啟動子，其來自在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列已由在構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當被轉(zhuǎn)錄時其為對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所選宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？墒褂迷谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號肽，并且指導(dǎo)多肽進入細胞的分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼序列。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的N端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸(或本文中所述的其它多核苷酸，如編碼蘋果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(例如兩個、幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的多核苷酸?？晒┻x擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來表達所述多核苷酸。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外,可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。載體可含有一個或多個(例如兩個、幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。載體可含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，400至10，000堿基對，和800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標序列具有高度序列同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點。用于酵母宿主細胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARS1,ARS4,ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于W000/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本文中所述的多核苷酸(例如編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，蘋果酸脫氫酶，和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)，所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個(例如兩個、幾個)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)本文中所述的多肽的產(chǎn)生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細胞，使所述構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，其由于在復(fù)制中發(fā)生的突變不同于親本細胞。在一些情況下，宿主細胞的選擇依賴于編碼多肽的基因及其來源。下文中所述的方面適用于宿主細胞本身，以及使用宿主細胞的方法。所述宿主細胞可為任何能夠重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的細胞，例如原核細胞或真核細胞，和/或任何能夠重組產(chǎn)生C4二羧酸(例如蘋果酸)的細胞(例如任何絲狀真菌細胞)。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585),或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見,例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tmmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孑L(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細胞的任何方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。所述宿主細胞可為真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)和所有有絲分裂抱子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見上)。所述真菌宿主細胞可為酵母細胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。所述酵母宿主細胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細胞，如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細胞。所述真菌宿主細胞可為絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文,所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。所述絲狀真菌宿主細胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。所述絲狀真菌宿主細胞可為棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa>Ceriporiopsissubrufa、蟲擬臘菌(Ceriporiopsissubvermispora)>Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium>|^^|il^|Mf>Chrysosporiumqueenslandicum>熱帶金孢子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺療側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。在一個方面，所述宿主細胞是曲霉屬宿主細胞。在另一個方面，所述宿主細胞是米曲霉?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉(zhuǎn)化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.1.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,J.Bacteriol.153:163jPHinnen等，1978,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920。在一些方面，所述宿主細胞包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸，并能夠如本文中的方法所述產(chǎn)生C4二羧酸(例如蘋果酸)。在一個方面，所述宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)包含編碼本文中所述的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸，其中所述宿主細胞與不具有所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的絲狀真菌宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比分泌和/或能夠分泌增加水平的C4二羧酸(例如蘋果酸)。在一個方面，所述宿主細胞包含編碼本文中所述的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸(例如SEQIDNO:1,SEQIDNO:3或其任何所述的方面)和編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸。在本發(fā)明中，所述蘋果酸脫氫酶可為任何適于實施本發(fā)明的蘋果酸脫氫酶。具體而言，所述蘋果酸脫氫酶可為存在于宿主細胞胞質(zhì)溶膠中的酶?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的蘋果酸脫氫酶包括但不限于煙曲霉蘋果酸脫氫酶(AFUA_2G13800;Nierman等，2005，Nature438:1151-1156);構(gòu)巢曲霉蘋果酸脫氫酶(AN5031.1,AN6499.1;Sims等，2004,Mycol.Res.108:853-857);黑曲霉蘋果酸脫氫酶(Anllg07190,Anl2g00160,Anl5g00070;Pel等,2007,NatureBiotechnology25:221-231)；米曲霉NRRL3488蘋果酸脫氫酶(SEQIDNO:19的基因組DNA和SEQIDNO:20的推導(dǎo)的氛基酸序列)；Phytophthorainfestans蘋果酸脫氧酶(PITG15476.1;Calcagno等，2009，MycologicalResearch113:771-781);和釀酒酵母蘋果酸脫氧酶(Y0L126C;Minard和McAlister-Henn,1991,Mol.Cell.Biol.11:370-380;YDL078C;McAlister-Henn等，1995，JournalofBiologicalChemistry270:21220-21225)。所述蘋果酸脫氫酶可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思應(yīng)為由多核苷酸編碼的蘋果酸脫氫酶由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的多核苷酸的細胞產(chǎn)生。在一個方面，所述蘋果酸脫氫酶可為從本文中所述的微生物獲得的細菌、酵母或絲狀真菌蘋果酸脫氫酶。在另一個方面，所述蘋果酸脫氫酶為米曲霉蘋果酸脫氫酶。亦可從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物，或直接從天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述蘋果酸脫氫酶，如上文中所述。所述蘋果酸脫氫酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文中所述。在一個方面，所述蘋果酸脫氫酶是親本蘋果酸脫氫酶的變體，其包含氨基酸序列的一個或多個(例如兩個、幾個)修飾，這減少蘋果酸脫氫酶的體內(nèi)線粒體輸入。用于分離或克隆編碼蘋果酸脫氫酶的多核苷酸的技術(shù)如上文中所述。在另一個方面，所述宿主細胞包含編碼本文中所述的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸(例如SEQIDNO:1，SEQIDNO:3或其任何所述的方面)和編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。在本發(fā)明中，所述丙酮酸羧化酶可為任何適于實施本發(fā)明的丙酮酸羧化酶。具體而言，所述蘋丙酮酸羧化酶可為存在于宿主細胞胞質(zhì)溶膠中的酶?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的丙酮酸羧化酶包括但不限于棒曲霉(AspergiIIusclavatus)NRRLl丙酮酸羧化酶(XP_001271664;DirectSubmission,Submitted(26-0CT-2006),TheInstituteforGenomicResearch,9712MedicalCenterDrive,Rockville,MD20850,USA);煙曲霉Af293丙酮酸羧化酶(XP_752054;Nierman等，2005，Nature438:1151-1156);構(gòu)巢曲霉FGSCA4丙酮酸羧化酶(XP_662066;Galagan等，2005，Nature438:1105-1115);黑曲霉丙酮酸羧化酶(Anl5g02820;Pel等，2007，NatureBiotechnology25:221-231;ASPNG5061;Panneman等，(JUL-1998)提交至EMBL/GenBank/DDBJ數(shù)據(jù)庫)；土曲霉丙酮酸羧化酶(093918;DirectSubmission,Submitted(0CT-1998)TheInstituteforGenomicResearch,9712MedicalCenterDrive,Rockville,MD20850,USA);Magnaporthegrisea70_15丙酮酸羧化酶(XP_367852;DirectSubmission,Submitted(26-SEP-2005)BroadInstituteofMITandHarvard,320CharlesStreet,Cambridge,MA02142,USA)；粗糖脈抱菌0R74A丙酮酸羧化酶(XP_965636;Galagan等，2003，Nature422:859-868);米根霉(Rhizopusoryzae)丙酮酸羧化酶(R03G_06931.1);釀酒酵母丙酮酸羧化酶(NP_009777;Gaffeau等，1996，Science274:546-547);粟酒裂殖酵母丙酮酸羧化酶(NP_595900;DirectSubmission,Submitted(29-JUN-2007)EuropeanSchizosaccharomycesgenomesequencingproject,SangerInstitute,TheWellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SA);和玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)丙酮酸羧化酶(um01054;McCann和Snetselaar,2008,FungalGeneticsandBiology45:S77-S87)。所述丙酮酸羧化酶可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思應(yīng)為由多核苷酸編碼的丙酮酸羧化酶由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的多核苷酸的細胞產(chǎn)生。在一個方面，所述丙酮酸羧化酶可為從本文中所述的微生物獲得的細菌、酵母或絲狀真菌丙酮酸羧化酶。在另一個方面，所述丙酮酸羧化酶為米曲霉丙酮酸羧化酶。亦可從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物，或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品鑒定和獲得所述丙酮酸羧化酶，如上文中所述。所述丙酮酸羧化酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽，如上文中所述。所述丙酮酸羧化酶亦可為線粒體丙酮酸羧化酶的變體，使得減少進入線粒體的體內(nèi)輸入，從而增加胞質(zhì)溶膠中的丙酮酸羧化酶變體的水平。用于分離或克隆編碼丙酮酸羧化酶的多核苷酸的技術(shù)如上文中所述。在另一個方面，所述宿主細胞包含本文中所述的編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸(例如SEQIDNO:1,SEQIDNO:3或其任何所述的方面)，編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸，和編碼丙酮酸羧化酶的異源多核苷酸。可與這些宿主細胞一同使用的蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的實例可見于，例如2010年4月23日提交的標題為“MethodsforImprovingMalicAcidProductioninFilamentousFungi”的美國臨時專利申請?zhí)?1/327，224，其內(nèi)容通過提述以其整體并入本文，特別是關(guān)于本文中所述的編碼蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的多核苷酸。在任何這些方面，所述異源多核苷酸可以可操作地連接于外源啟動子，如上文中所述。在任何這些方面，宿主細胞與不具有編碼所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的編碼多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比分泌和/或能夠分泌至少25%，例如至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的C4二羧酸(例如蘋果酸)?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知方法在適于產(chǎn)生C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白、蘋果酸脫氫酶和/或丙酮酸羧化酶的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組絲狀真菌宿主細胞。舉例而言，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的搖瓶培養(yǎng)和小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)，或可從商業(yè)上可獲得的成分制備?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于多肽具特異性的方法來檢測C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白、蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，如本文中所述，酶測定(enzymeassay)可用于確定蘋果酸脫氫酶變體和丙酮酸羧化酶的活性?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域中已知的方法來回收蘋果酸。參見，例如W01998/022611和美國專利號7，601，865。通過下述實施例進一步描述本發(fā)明，其不應(yīng)視為對本發(fā)明范圍的限制。實施例用作緩沖液和底物是至少試劑級的商品。菌株使用日本裂殖酵母作為C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因ssjMAT275(NCBIGeneID:7048154)的來源。使用米曲霉NRRL3488(或ATCC56747)產(chǎn)生C4二羧酸。培養(yǎng)基YEG培養(yǎng)基組成為20g葡萄糖，5g酵母提取物，和去離子水加至I升。COVE平板組成為1M蔗糖，2%C0VE鹽溶液，IOmM乙酰胺，15mMCsCl，和25g/lAgarNoble。COVE鹽溶液組成為26gKC1，26gMgSO4·7H20,76gKH2PO4,50mlCOVE痕量元素溶液，和去離子水加至I升。COVE痕量元素溶液組成為0.04gNa2B4O7·IOH2O,O.04gCuSO4·5H20，1.2gFeSO4·7Η20，0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20,IOgZnSO4·7H20和去離子水加至I升。種子培養(yǎng)基B組成為30g葡萄糖，3g細菌用蛋白胨(BactoPeptone),560mgKH2P04,560mgK2HPO4,925mgNaH2PO4·H2O,820mgNa2HPO4,75mgMgS04·7H20,75mgCaCl2*H20,0.75ml的1000X微量營養(yǎng)物溶液(MicronutrientSolution),和去離子水加至I升°酸產(chǎn)生培養(yǎng)基C組成為100g葡萄糖，80gCaC03，6g細菌用蛋白胨，150mgKH2PO4,150mgK2HPO4,IOOmgMgSO4·7H20，IOOmgCaCl2·H20，ImllOOOX微量營養(yǎng)物溶液，和去離子水加至I升。1000X微量營養(yǎng)物溶液組成為5gNaCl，5gFeSO4·7Η20，Ig檸檬酸，和去離子水加至I升。PDA平板組成為39g/l馬鈴薯右旋糖瓊脂。2XYT+amp平板組成為16g胰蛋白胨，IOg酵母提取物,5gNaCl,IOOmg氨節(jié)青霉素，15g細菌用瓊脂(Bactoagar),和去離子水加至I升。實施例1:日本裂殖酵母C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆和表達載體pSaMF37的構(gòu)對1353bpC4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因ssjMAT275進行密碼子優(yōu)化以供在米曲霉中表達和合成構(gòu)建入p41620ssjMAT275(圖1；DNA2.O,MenloPark,CA,USA)使用下示的引物069869和069870從p41620ssjMAT275擴增ssjMAT275基因。引物069869:5，-TGTGATAGAACATCGTCCATAATGTCGTCGGAGACA-3’(SEQIDNO:4)引物069870:5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTAAATCTTTTCCTCGTCCG-3’(SEQIDNO:5)PCR反應(yīng)包含10μL5X反應(yīng)緩沖液(Finnzymes,Inc.Massachusetts,USA),IμLp41620ssjMAT275模板(20ng/μL)，IμL弓丨物069869(lOOng/μL)，IμL引物069870(lOOng/μL)，IμLdNTP混合物(IOmM)，35.5μL去離子水，和O.5μLPhusionHotStartHigh-FidelityDNAPolymerase(Finnzymes,Inc.Massachusetts,USA)。擴增反應(yīng)在EPPEND0RFMASTERCYCLER(EppendorfScientificInc.ffestbury,NewYork,USA)中溫育，其程序如下1個循環(huán)在98°C進行30秒；30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進行10秒，60°C進行30秒，和72°C進行I分鐘；和一個循環(huán)，在72°C進行10分鐘。對PCR反應(yīng)物用DpnI進行限制性消化I小時以降解任何質(zhì)粒DNA模板,然后使用MinElutePCRPurificationKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化。將質(zhì)粒pShTh60(圖2;亦參見2010年4月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/327，224)用SexAI和PacI消化，然后通過TBE緩沖液(10.8g/LTris堿，5.5g/L硼酸,2mMEDTA,pH8.O)中的O.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化。然后將上述純化的PCR產(chǎn)物使用In-FusionAdvantage反應(yīng)試劑盒(Clontech,MountainView,CA,USA)插入消化的pShTh60,反應(yīng)包含2μL5X緩沖液(Clontech,MountainView,CA,USA)，0·5μL純化的PCR產(chǎn)物(170ng/μL)，1.5μL經(jīng)消化和凝膠純化的pShTh60(132ng/μL)，IμLIn-Fusion酶和5μL去離子水。將反應(yīng)在37°C溫育15分鐘然后在50°C溫育15分鐘，接著將其置于冰上5分鐘，并用40μLTE緩沖液(IOmMTris堿，ImMEDTA,ρΗ8·0)稀釋，得到pSaMF37(圖3)。將上述連接反應(yīng)物的2.5μL等分試樣根據(jù)生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入0NESH0TT0P10化感受態(tài)大腸桿菌細胞(Invitrogen,SanDiego,CA,USA)。將轉(zhuǎn)化體鋪板于2XYT+amp平板上，并在37°C溫育過夜。挑取所得的轉(zhuǎn)化體，并對其進行DNA測序以確認ssjMAT275基因整合入載體。日本裂殖酵母ssjMAT275基因經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(CO)，推導(dǎo)的氨基酸序列和野生型核苷酸序列(WT)示于圖4A和4B(分別為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDN0:3)。編碼序列為1353bp，包括終止密碼子。編碼的預(yù)測的蛋白為450個氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6),預(yù)測了57個殘基的信號肽?；谠摮绦?，預(yù)測的成熟蛋白包含393個氨基酸，具有44.1kDa的預(yù)測的分子量，和9.03的等電點pH。使用InterProScan程序(TheEuropeanBioinformaticsInstitute),預(yù)測了89個殘基的信號肽?；谠摮绦颍A(yù)測的成熟蛋白包含361個氨基酸，具有40.6kDa的預(yù)測的分子量，和8.87的等電點pH。實施例2:將pSaMF37轉(zhuǎn)化入米曲霉NRRL3488進行米曲霉NRRL3488的原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化，即，將大約2xl07個孢子接種入IOOmLYEG培養(yǎng)基，并將燒瓶在27°C以140rpm溫育16-18小時。收集菌絲體，即將培養(yǎng)物傾倒透過襯有MIRACL0TH(Calbiochem,SanDiego,CA,USA)的滅菌漏斗，并用50mL的0.7MKCl漂洗。將經(jīng)洗滌的菌絲體重懸于含有20mL原生質(zhì)體化溶液的125mL燒瓶，所述溶液包含每mLO.7MKCl(經(jīng)過濾滅菌)5mg的GLUCANEX(NovozymesA/S,BagSVffird,Denmark)和0.5mg的殼多糖酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)，并將該燒瓶在34°C以80rpm混合溫育30分鐘。將原生質(zhì)體化溶液傾倒透過襯有MIRACL0TH的滅菌漏斗，并用50mL的STC緩沖液(1M山梨醇-1OmMTris-HClpH6.5-10mMCaCl2)漂洗。將流過物在兩個50mL聚丙烯管中收集。將管在室溫在1300xg離心10分鐘。棄去上清并將原生質(zhì)體沉淀重懸于20mL的STC緩沖液。洗滌原生質(zhì)體，即進行兩輪的將沉淀重懸于20mL的STC緩沖液并在室溫在1300xg離心10分鐘。將最終沉淀重懸于2mL的STC緩沖液。對原生質(zhì)體進行計數(shù)，即移出10μI樣品并在血細胞計數(shù)器(VWR，WestChester,PA,USA)中對其進行計數(shù)。用STC緩沖液調(diào)整體積以獲得2xl07每mL的原生質(zhì)體濃度。通過用PmeI進行限制性消化制備pSaMF37以供轉(zhuǎn)化。通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳從消化的載體分離5136bp表達盒，并使用QIAQUICK⑩GelExtractionKit進行純化。準備了兩個轉(zhuǎn)化反應(yīng)。對于每個反應(yīng)，將原生質(zhì)體制備物的100μL溶液轉(zhuǎn)移至12mL聚丙烯管，對其添加5μg直鏈化的pSaMF37，250μIPEG溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG)，IOmMTris6.5，IOmMCaCl)接著進行輕柔地混合，并在37°C溫育30分鐘。將每個轉(zhuǎn)化物用9mL的STC緩沖液稀釋，接著將三個不同的3mL等分試樣鋪板于COVE平板上。然后將每個平板在34°C溫育7-10日。將二十個SaMF37轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至單個COVE平板，并在34°C溫育5日。通過將孢子收集于O.1%TWEEN80來制備孢子儲液。儲藏培養(yǎng)物，即，制備每個的甘油儲液(800μI孢子儲液，200μ10.1%TWEEN80)并凍結(jié)于-80°C。實施例3:在搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生蘋果酸將來自如上所述的轉(zhuǎn)化體和作為對照的米曲霉NRRL3488的孢子鋪板于單個COVE平板，并允許其在34°C進行5至7日的孢子形成。在O.1%TWEENSO中收集孢子，并使用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)。在含有IOOml的種子培養(yǎng)基B的250ml燒瓶中制備種子培養(yǎng)物，并用總共2xl08個孢子接種。將種子培養(yǎng)物在30°C以200rpm振蕩生長大約17個小時。在含有50ml的酸產(chǎn)生培養(yǎng)基C和3ml的17小時種子培養(yǎng)物的250ml不帶擋板的燒瓶中制備酸產(chǎn)生培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30°C以200rpm振蕩溫育2_10日。實施例4:搖瓶培養(yǎng)物的蘋果酸的HPLC定量對于實施例3的搖瓶培養(yǎng)物的蘋果酸的定量通過使用1200SerieSBinaryLCSystem和1200SeriesDiodeArrayDetector(DAD)(AgilentTechnologies,SantaClara,CAUSA)的反向高壓液相層析(RP-HPLC)進行。使用Aqua5μC18125A205x4.6mmID柱和AQC184x3.Omm安全保護柱(SecurityGuardCartridge)(Phenomenex,Inc.,Torranee,CA,USA)進行反向分離。HPLC運行緩沖液由10%甲醇(HPLC級)和90%磷酸(鹽)緩沖液(145mMpHl.5)組成。移出全培養(yǎng)樣品，并將其在HPLC運行緩沖液中以1:20稀釋。將大約270μL的每個樣品在HPLC分析之前通過0.45微米苯乙烯96孔過濾板(Millipore)進行過濾。使用10μI的注入體積以0.7ml/分鐘(等度的)流速以20°C的柱溫度和14分鐘的運行時間進行RP-HPLC。檢測設(shè)定為210nm，4nm帶寬，參照為360nm，40nm帶寬。空白時間(voidtime)確定為3.8分鐘。通過進行濃度范圍為49.2至3.93mM的系列稀釋的蘋果酸標樣的重復(fù)注入，對于蘋果酸確定了反相方法的定量能力。對于重復(fù)注入的相對標準偏差(RSD)為彡5%。蘋果酸顯示R2彡0.9999。上述18個測試的轉(zhuǎn)化體的大約一半在3日的振蕩搖瓶生長之后與作為對照的米曲霉NRRL3488的蘋果酸產(chǎn)生相比顯示蘋果酸效價(titer)的增加。六個轉(zhuǎn)化體相對于米曲霉NRRL3488顯示至少40%的增加。實施例5:轉(zhuǎn)化的米曲霉菌株的發(fā)酵將上述米曲霉轉(zhuǎn)化體和米曲霉NRRL3488對照在32°C在PDA平板上生長大約7日。將5-6ml體積的含有0.1%TWEEN80的滅菌的50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)添加至每個平板，并通過用接種環(huán)刮擦使孢子懸浮。通過移液將每個懸液轉(zhuǎn)移至50ml錐形管。對于每個管，將25ml的滅菌的磷酸鈉緩沖液添加至含有75ml的種子培養(yǎng)基的500ml不帶擋板的燒瓶，然后對其用2ml的孢子懸液接種。種子培養(yǎng)基組成為40g葡萄糖，4.Og(NH4)2SO47O.75gKH2P04,0.75gK2HPO4,0.1gMgSO4·7H20，0.1gCaCl2·2H20，0.005gFeSO4·7H20，0.005gNaCl，和去離子水加至I升。然后將燒瓶在32°C和180rpm溫育約24小時。合并種子燒瓶以供應(yīng)每罐所需的144ml接種物。通過導(dǎo)入米曲霉轉(zhuǎn)化體或米曲霉NRRL3488的合并的種子燒瓶的144ml(8%)的種子培養(yǎng)液來分別接種含有1.8升的培養(yǎng)基的三升發(fā)酵罐。培養(yǎng)基組成為120g葡萄糖，90gCaCO3,6gBacto蛋白胨，O.150gKH2PO4,0.150gK2HPO4,0.1OgMgSO4·7H20，O.1OgCaCl2-2H20，0.005gFeSO4·7Η20，0·005gNaCl，和去離子水加至I升。將發(fā)酵罐平衡于32±0.1°C并以500rpm攪拌。輸入氣流維持在lv/v/m。未使用酸或堿添加以供pH控制。每日取出樣品，并就蘋果酸產(chǎn)生進行分析。發(fā)酵在7日之后完成。實施例6:發(fā)酵的蘋果酸的HPLC定量對于實施例5的發(fā)酵的蘋果酸的定量如實施例4中所述進行。對于上述轉(zhuǎn)化體說明了在發(fā)酵過程中蘋果酸效價相對于米曲霉NRRL3488的蘋果酸產(chǎn)生的相對改變?？蛇M一步通過下述編號段落描述本發(fā)明[I]一種產(chǎn)生C4二羧酸的方法，其包括(a)培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運蛋白選自(i)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(ii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件與以下雜交SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；(iii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%,或100%序列同一性；(iv)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入；和(V)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段；和(b)回收所述C4二羧酸。[2]段[I]的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[3]段[I]或[2]的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交SEQIDN0:1或SEQIDNO:3，或它們的全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。[4]段[1]_[3]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[5]段[1]_[4]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含如下或由如下組成SEQIDNO:2。[6]段[1]_[4]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含如下或由如下組成SEQIDNO:2的成熟多肽。[7]段的方法[6]，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸58至450或SEQIDNO:2的氨基酸90至450。[8]段[1]_[4]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是SEQIDNO:2的片段，其中所述片段具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性。[9]段[1]_[4]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入。[10]段[1]_[9]任一項的方法，其中所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[11]段[1]_[10]任一項的方法，其中所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸。[12]段[11]的方法，其中所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[13]段[1]_[12]任一項的方法，其中所述宿主細胞進一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸。[14]段[13]的方法，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[15]段[1]_[14]任一項的方法，其中所述宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞。[16]段[15]的方法，其中所述宿主細胞選自枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、根霉屬(Rhizopus)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)和木霉屬(Trichoderma)細胞。[17]段[16]的方法，其中所述宿主細胞是曲霉屬宿主細胞。[18]段[17]的方法，其中所述曲霉屬宿主細胞是米曲霉宿主細胞。[19]段[1]_[18]任一項的方法，其中C4二羧酸的水平與不具有所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞相比當在相同條件下培養(yǎng)時增加至少25%，例如至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%。[20]段[1]_[19]任一項的方法，其中所述C4二羧酸選自蘋果酸，琥珀酸，草酰乙酸，丙二酸，和延胡索酸。[21]段[20]的方法，其中所述C4二羧酸是蘋果酸。[22]一種增加C4二羧酸產(chǎn)生的方法，其包括(a)將編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細胞，其中所述轉(zhuǎn)運蛋白選自(i)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(ii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交=SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；(iii)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%,或100%序列同一性；(iv)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入；和(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段；和(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的生物；和(C)回收所述C4二羧酸。[23]段[22]的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[24]段[22]或[23]的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交SEQIDN0:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。[25]段[22]-[24]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[26]段[22]-[25]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含如下或由如下組成SEQIDNO:2。[27]段[22]-[25]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含如下或由如下組成SEQIDNO:2的成熟多肽。[28]段[27]的方法，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸58至450或SEQIDNO:2的氨基酸90至450。[29]段[22]-[25]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是SEQIDN0:2的片段，其中所述片段具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性。[30]段[22]_[25]任一項的方法，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和或插入。[31]段[22]_[30]任一項的方法，其中所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[32]段[22]_[31]任一項的方法，其中所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸。[33]段[32]的方法，其中所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[34]段[22]-[33]任一項的方法，其中所述宿主細胞進一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸。[35]段[34]的方法，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[36]段[22]-[35]任一項的方法，其中所述宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞。[37]段[36]的方法，其中所述宿主細胞選自枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、FiIibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、根霉屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、檢囷屬和木霉屬細胞。[38]段[37]的方法，其中所述宿主細胞是曲霉屬宿主細胞。[39]段[38]的方法，其中所述曲霉屬宿主細胞是米曲霉宿主細胞。[40]段[22]-[39]任一項的方法，其中C4二羧酸的水平與不具有所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比增加至少25%，例如至少50%，至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%。[41]段[22]_[40]任一項的方法，其中所述C4二羧酸選自蘋果酸，琥珀酸，草酰乙酸，丙二酸，和延胡索酸。[42]段[41]的方法，其中所述C4二羧酸是蘋果酸。[43]一種宿主細胞，其包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運蛋白選自(a)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；(b)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交=SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；(c)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%,或100%序列同一性；(d)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白變體，其包含SEQIDNO:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和或插入；和(e)(a)，(b)，(c)或(d)的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段；其中所述宿主細胞與不具有所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比分泌增加水平的C4二羧酸。[44]段[43]的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[45]段[43]或[44]的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件，低-中等嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交SEQIDN0:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。[46]段[43]-[45]任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%，例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性。[47]段[43]_[46]任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含如下或由如下組成SEQIDNO:2。[48]段[43]_[46]任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含如下或由如下組成SEQIDNO:2的成熟多肽。[49]段[48]的宿主細胞，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸58至450或SEQIDNO:2的氨基酸90至450。[50]段[43]-[46]任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是SEQIDNO:2的片段，其中所述片段具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性。[51]段[43]_[46]任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是變體，其包含SEQIDN0:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和或插入。[52]段[43]-[51]任一項的宿主細胞，其中所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[53]段[43]-[52]任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸。[54]段[53]的宿主細胞，其中所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[55]段[43]-[54]任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸。[56]段[55]的宿主細胞，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。[57]段[43]-[56]任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞。[58]段[57]的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、根霉屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、檢囷屬和木霉屬細胞。[59]段[58]的宿主細胞，其中所述宿主細胞是曲霉屬宿主細胞。[60]段[59]任一項的宿主細胞，其中所述曲霉屬宿主細胞是米曲霉宿主細胞。[61]段[43]-[60]任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞與不具有所述編碼異源多核苷酸的多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比能夠分泌至少25%，例如至少50%,至少100%，至少150%，至少200%，至少300%，或至少500%的增加水平的C4二羧酸。[62]段[43]-[61]任一項的宿主細胞,其中所述C4二羧酸選自蘋果酸,琥拍酸,草酰乙酸，丙二酸，和延胡索酸。[63]段[62]的宿主細胞，其中所述C4二羧酸是蘋果酸。權(quán)利要求1.一種宿主細胞，其包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉(zhuǎn)運蛋白選自(a)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴格條件下與以下雜交SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；(c)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少65%序列同一性；(d)C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白變體，其包含SEQIDN0:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入；和(e)(a)，(b)，(c)或(d)的C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的具有C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白活性的片段；其中所述宿主細胞與不具有所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比分泌增加水平的C4二羧酸。2.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性。3.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少95%序列同一性。4.權(quán)利要求1-3任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴格條件下與以下雜交SEQIDN0:1或SEQIDNO:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。5.權(quán)利要求1-3任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴格條件下與以下雜交SEQIDN0:1或SEQIDN0:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。6.權(quán)利要求1-5任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDNO:2的成熟多肽或由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。7.權(quán)利要求1-6任一項的宿主細胞，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是氨基酸58至450多肽或SEQIDNO:2的氨基酸90至450。8.權(quán)利要求1-5任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白包含SEQIDNO:2或由SEQIDNO:2組成。9.權(quán)利要求1-8任一項的宿主細胞，其中所述編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。10.權(quán)利要求1-9任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸。11.權(quán)利要求10的宿主細胞，其中所述編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。12.權(quán)利要求1-11任一項的宿主細胞,其中所述宿主細胞進一步包含編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸。13.權(quán)利要求12的宿主細胞，其中所述編碼丙酮酸羧化酶的異源第三多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。14.權(quán)利要求1-13任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是絲狀真菌宿主細胞。15.權(quán)利要求14的宿主細胞,其中所述宿主細胞選自枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、根霉屬(Rhizopus)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)和木霉屬(Trichoderma)細胞。16.權(quán)利要求15的宿主細胞，其中所述宿主細胞是曲霉屬宿主細胞。17.權(quán)利要求16的宿主細胞，其中所述曲霉屬宿主細胞是米曲霉(Aspergillusoryzae)宿主細胞。18.權(quán)利要求1-17任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞與不具有所述編碼所述C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養(yǎng)時相比能夠分泌至少25%的增加水平的C4二羧酸。19.權(quán)利要求1-18任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸是蘋果酸。20.—種產(chǎn)生C4二羧酸的方法，其包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-19任一項的宿主細胞；和(b)回收所述C4二羧酸。.20.—種增加C4二羧酸產(chǎn)生的方法，其包括(a)將編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主細胞，得到權(quán)利要求1-19任一項的宿主細胞；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞；和(c)回收所述C4二羧酸。全文摘要本發(fā)明涉及產(chǎn)生C4二羧酸如蘋果酸的方法，其包括(a)培養(yǎng)包含編碼C4二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的多核苷酸的宿主細胞；和(b)回收所述C4二羧酸。本發(fā)明亦涉及增加C4二羧酸產(chǎn)生的方法，以及包含所述多核苷酸的宿主細胞。文檔編號C07K14/39GK103003298SQ201180033858公開日2013年3月27日申請日期2011年6月2日優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日發(fā)明者S.麥克法蘭,A.費希爾申請人:諾維信股份有限公司