專利名稱：色桿菌生物活性成份與代謝物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了用于防治有害生物的源自色桿菌屬(Chromobacterium)的生物活性成分和代謝物，特別是Chromobacterium substugae培養(yǎng)物，以及它們用于防治有害生物(pest)的方法。
背景技術(shù)：
天然產(chǎn)物是由微生物、植物和其它生物產(chǎn)生的物質(zhì)。微生物天然產(chǎn)物提供了豐富的化學(xué)多樣性來源，并且將天然產(chǎn)物用于醫(yī)藥目的已有悠久的歷史。雖然著重于用于人類治療的天然產(chǎn)物(其中50%以上來自天然產(chǎn)物)，但僅有11%的農(nóng)藥來自天然來源。然而，天然產(chǎn)物農(nóng)藥可能在傳統(tǒng)農(nóng)場和有機農(nóng)場中發(fā)揮防治有害生物的重要作用。微生物(細菌、放線菌和真菌)產(chǎn)生的次生代謝 物提供新化合物，其可單獨使用或與已知化合物聯(lián)合使用，以有效防治昆蟲類有害生物并減少產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險。有許多公知的成功用作農(nóng)業(yè)殺蟲劑的微生物天然產(chǎn)物的實例(Thompson等人，2000;Arena等人，1995;Krieg等人1983)。微生物農(nóng)藥的開發(fā)始于純培養(yǎng)物中微生物的分離。然后，使用體外試驗、體內(nèi)試驗或在溫室或田野中的中試規(guī)模試驗有效進行波譜篩選。同時，對微生物產(chǎn)生的活性化合物進行分離和鑒定。對于微生物農(nóng)藥的商品化，需通過在工業(yè)規(guī)模下發(fā)酵以經(jīng)濟地生產(chǎn)微生物，并與生物相容且批準(zhǔn)的添加劑配制以提高藥效并將在田野條件下的施用容易性和儲存穩(wěn)定性增至最大。隨著農(nóng)民期待擴大他們的殺蟲劑范圍并隨著在市場上出現(xiàn)新的微生物產(chǎn)品，在新舊殺蟲劑間存在各種相互作用的可能性。目前經(jīng)常使用2種或更多種殺蟲劑的組合，將其同時或按序施加到單一作物上。為解決這些問題，科學(xué)家已使用外用和飼喂的方法來檢驗油類農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥對有害生物和益蟲的相互作用(例如參見 Chalvet-Monfray, Sabatier 等人；Meunier, Carubel 等人 1999 ；Hummelbrunner 和 Isman2001 ；ffirth, Jiannino 等人 2004 ；Farenhorst, Knols 等人 2010 ；Shapiro-1lan, Cottrell等人2011等)。但目前尚未對所有的相互作用進行研究。色桿菌屬β -色桿菌菌株(即Chromobacterium substugae)對許多昆蟲表現(xiàn)出殺蟲活性(Martin, Blackburn 等人 2004 ；Martin2004 ；Martin, Gundersen-Rindal 等人 2007 ；Martin, Hirose 等人 2007;Martin, Shropshire 等人 2007)。作用模式表現(xiàn)為拒食素和毒素活性的結(jié)合，在亞致死劑量下觀察到飼喂抑制(feeding inhibition)(Martin, Gundersen-Rindal 等人 2007)。具體而言，已發(fā)現(xiàn) Chromobacterium substugae有效防治科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarse decemlineata)成蟲、西部玉米根蟲(Diabrotica virgifera)成蟲、南方玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata)成蟲和幼蟲、小蜂房甲蟲(Aethina tumida)幼蟲、小菜蛾(Plutella xyllostella)幼蟲、甘薯粉風(fēng)(Bernisia tabaci)成蟲和幼蟲以及南綠椿象(Nezara viridula)成蟲。自Martin及其同事發(fā)現(xiàn)Chromobacterium substugae以來，至少已分離和表征出三個色桿菌的新物種；Young等人(2008)自臺灣泉水樣本中分離出一個新的色桿菌物種(C.aquaticum),而Kampfer等人(2009)也自馬來西亞收集的環(huán)境樣本中分離出二個物種(C.piscinae 和 C.pseudovioIaceum)。色桿菌屬的次生代謝物在所有已知的色桿菌物種中，對于紫色色桿菌(C.violaceum)有最多的研究，關(guān)于色桿菌產(chǎn)生的次生代謝物的公布信息僅基于對紫色色桿菌的研究。Durdn和Menck(2001)已就紫色色桿菌(來自土壤和水中的革蘭陰性腐生生物)的藥理和工業(yè)前景發(fā)表了綜述。此物種通常被認為對人類無致病性，但作為機會致病菌，其偶而在人類和動物中成為敗血癥和致命感染的病原體。已知紫色色桿菌產(chǎn)生一種紫色色素(紫色桿菌素)，其是通過在氧的存在下使2個L-色氨酸分子稠和而生成(Hoshino等人，1987;Ryan和Drennan; 2009)。紫色桿菌素的生物合成受到群體感應(yīng)(quorum-sensing)的調(diào)節(jié),所述群體感應(yīng)是一種在革蘭氏陰性菌中調(diào)節(jié)各種其它次級代謝途徑的常見機制(McClean等人，1997)。由Durdn和Menck (2001)總結(jié)的紫色色桿菌的其它已知代謝物包括氫氰酸、(高)鐵氧胺 E (ferrioxamine B)、B-丙氨酸糖肽(B-lactamic glycopeptides)SQ28, 504 和 SQ28, 546、抗生素(如 aerocyanidin、aerocavin、3, 6- 二輕基-1，2-苯異唑(3，6-dihydroxy-l, 2-1ndoxazene)和單酰胺菌素SB-26.180)和抗腫瘤縮酹酸肽FR901228。依據(jù)Durdn和Menck(2001)的綜述文章，紫色色桿菌也產(chǎn)生不尋常的糖化合物，如胞外多糖和脂多糖。線蟲和殺線蟲劑 線蟲是不分節(jié)兩側(cè)對稱的蠕蟲狀無脊椎動物，其具有體腔和完整的消化系統(tǒng)，但無呼吸和循環(huán)系統(tǒng)。其體壁由多層的角質(zhì)層、具有四條縱線的皮下組織和內(nèi)部肌肉組織組成(Chitwood，2003)。其身體大部份為消化和生殖系統(tǒng)。大部分的線蟲可自由生活，但有少數(shù)物種是動物或植物的遍在寄生蟲。根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)寄生于許多的一年生和多年生作物中，同時影響市場收率的產(chǎn)量和品質(zhì)。該屬的線蟲被認為是最具經(jīng)濟重要性的植物寄生線蟲(Whitehead, 1998)。植物寄生線蟲每年造成的作物損失估計超過1000億美元(Koenning等人1999)，超過一半是根結(jié)線蟲屬造成的。該品系的接種物來自蟲卵，其在有利條件下孵化以釋出感染性第二階段幼蟲(J2S)，所述幼蟲在土壤中遷移到宿主植物的根上。藉由根尖滲透而發(fā)生感染，然后幼蟲移至維管組織(線蟲在該處常駐)，直接自植物細胞中得到養(yǎng)分。植物因而產(chǎn)生形成蟲癭(根節(jié))的巨細胞。在整個生殖階段(reproductive life)中，雌蟲保持埋入植物組織中，只有蟲卵自根中伸出。防治根結(jié)線蟲最有效的方法是使用抑制蟲卵孵化、幼蟲活動和/或植物感染性的殺線蟲劑。因為以下環(huán)境和生理上的原因，開發(fā)化學(xué)防治植物寄生線蟲的農(nóng)藥是具有挑戰(zhàn)性的工作:1.大部份植物寄生性線蟲生活在靠近根部的土壤的狹窄區(qū)域中，從而難以遞送化學(xué)殺線蟲劑。2.線蟲的外表面是不良生化靶，無法滲透到許多有機分子中(Chitwood, 2003)。此外，口服遞送有毒化合物是幾乎不可能的，因為大多數(shù)植物寄生線蟲物種在其侵入和感染植物根系后才攝取宿主養(yǎng)分。因此，殺線蟲劑往往是具有高揮發(fā)性或具有促進它們在土壤中的流動性的其它化學(xué)和物理性質(zhì)的廣譜毒素。
在過去十年中，鹵代烴(如二溴乙烯、溴甲烷)是世界各地使用最頻繁的殺線蟲齊U。因為它們具有人體高毒性且對平流臭氧層具有有害作用，因而在蒙特利爾公約中已禁止使用這些化合物，但因為缺乏替代品，所以仍可使用溴甲烷用于防治線蟲和植物病原體。隨著有機磷的使用，氨基甲酸酯是最有效的非熏蒸類殺線蟲劑?？上У氖?，大部分氨基甲酸酯如涕滅威和殺線威等也屬劇毒物。2010年8月，涕滅威的制造商拜耳公司已同意取消在美國馬鈴薯和柑橘中的所有產(chǎn)品注冊，而在2018年8月底時，涕滅威將徹底淘汰。近日，阿維菌素(由阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)產(chǎn)生的兩種除蟲菌素的混合物)已
注冊用于殺線蟲用途(Faske和Starr, 2006)。Syngenta公司將該活性成分以八\,_丨(；丨3'1<'商
標(biāo)名投放到市場中，作為棉花和蔬菜的種子處理劑。據(jù)報導(dǎo)有些微生物植物/線蟲病原體對植物寄生線蟲具有活性(Guerena2006)。這些生物防治劑包括以下細菌:蘇云金芽孢桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)、穿刺巴氏菌(Pasteuria penetrans)和 P.usgae。Pasteuria Biosciences 已開始在美國南部使用P.usgae來防治草地線蟲(sting nematodes)。殺線蟲真菌包括木霉菌(Trichoderma harzianum)、線蟲寄生菌(Hirsutella rhossiliensis)、食線蟲真菌(H.minnesotensis)、厚垣輪枝抱菌(Verticillium chlamydosporium)、線蟲捕捉菌(Arthrobotrys dactyloides)和淡紫擬青霉(Paecilomyces lilanicus) (Prophyta 公司
的產(chǎn)品名稱為BioAetlR Melcon"')。另一種真菌撫孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)可用于商業(yè)制劑(Valent Biosciences公司的DiTem R■產(chǎn)品)。這是殺線蟲真菌，由于殺線蟲化合物而具有活性。其它市售的生物殺線蟲劑包括DenyiIP BlueGircle*(B.cepacia)、Activate^ (Bacillus chitinosporus) (Quarles, 2005)和以色列的產(chǎn)品
BioNem (Bacillus firmus)(目前由拜耳公司以種子處理劑VotiW5'銷售)(Terefe
等人2009)。據(jù)假定，微生物分離物對線蟲蟲卵孵化、幼蟲活動和感染性的有害作用可歸因于這些生物體產(chǎn)生的毒素(H allman和Sikora, 1996; Marrone等人,1998; Siddiqui和 Mahmood, 1999; Saxena 等人,2000; Meyer 和 Roberts, 2002)寄生或甚至撲殺線蟲(Siddiqui 和 Mahmood, 1996; Kerry, 2001; Jaffee 和 Muldoon, 1995)、引發(fā)系統(tǒng)抵抗作用(Hasky-Gunther 等人 1998)、改變線蟲行為(Sikora 和 Hoffman-Hergarter, 1993)或干擾植物識別功能(Oostendorp和Sikora, 1990)的能力。植物殺線蟲劑如植物提取物和精油可用于防治線蟲(Kokalis-Burrelle和Rodriguez-Kabana, 2006)。Chitwood在其最近的綜述文章中總結(jié)了利用源自植物的化合物防治線蟲的選擇(Chitwood, 2002)。Siddiqui和Alam (2001)證明，用印楝樹(Azadirachta indica)和苦楝樹(Melia azadirah)的植物部分改造的盆栽土壤抑制番茄的根結(jié)線蟲產(chǎn)生。但目前在美國沒有印楝產(chǎn)品注冊用于防治線蟲?；诤碥盏脑順?Quillaja saponaria)提取物(在C_3處被三糖取代并在C-28處被寡糖取代的阜樹酸
的bidesmosidic衍生物)的來自智利的新植物產(chǎn)品(NEMA-Ql最近已經(jīng)美國環(huán)保署
注冊為有機殺線蟲劑，并由有機物質(zhì)檢查委員會(OMRI)登錄用于有機農(nóng)業(yè)。經(jīng)MontereyAgResources 市售。
通常對非宿主作物的輪作本身足以防止線蟲種群達到經(jīng)濟損害水平(Guerena2006)。信息素(allelochemicals)是影響植物環(huán)境中的生物行為的由植物產(chǎn)生的化合物。殺線蟲信息素包括polythienyls、硫配糖體(glucisonolates)、生物堿、脂質(zhì)、職類、留體、三職類和酌■類化合物(Kokalis-Burrelle 和 Rodriguez-Kabana, 2006;Chitwood, 2002)。當(dāng)成長為覆蓋作物時，來自化感植物(allelopathic plant)的生物活性化合物在生長期中滲出和/或在生物質(zhì)分解過程中釋出到土壤中。蕓苔屬作物可用于生物熏蒸，所述生物熏蒸是基于在分解土壤摻入組織(soil-1ncorporated tissue)過程中釋放殺生物揮發(fā)物的有害生物防治策略(Kirkegaard和Sarwar, 1998)。但Roubtsova等人(2007)在綠花椰菜腐敗組織對南方根結(jié)線蟲數(shù)量的影響的研究中指出為了適當(dāng)防治，需徹底混合植物組織與完全被線蟲感染的土壤體積。在農(nóng)業(yè)土壤中的線蟲防治的未來有賴于兩個因素:培育抗線蟲作物和發(fā)現(xiàn)并開發(fā)新的廣譜低毒殺線蟲劑。 研究、開發(fā)和注冊新的化學(xué)殺線蟲劑的成本非常高(超過2億美元)，從而限制了它們的開發(fā)。從1967-1997年中，在497種注冊用作農(nóng)藥的新活性成份中，只有7個注冊為殺線蟲劑(Aspelin和Grube, 1999)。除了傳統(tǒng)的化學(xué)方法外，也建議使用RNA干擾(RNAi)作為防治線蟲的方法。藉由RNAi的基因沉默作用最初被證明用于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans),而最近也被證明用于植物寄生線蟲如根結(jié)線蟲(Bakhetia等人2005)。為了降低植物寄生線蟲造成的顯著經(jīng)濟損失以及降低目前注冊用于線蟲防治的有毒化合物的使用，尋找用作生物殺線蟲劑的新的微生物株成為重要的目標(biāo)。根據(jù)Sasser和Freckman (1987年)的研究,線蟲對世界各地的主要作物造成的作物損失為8%至20%。植物寄生線蟲可導(dǎo)致相當(dāng)大的作物損失，估計全球每年損失約870億美元(Dong和Zhang, 2006)?？咕€蟲作物物種和化學(xué)殺線蟲劑是目前線蟲防治的主要選擇。諸如溴甲烷的熏蒸劑對防治土壤傳播的植物病害和線蟲非常有效，但因為對哺乳動物具有高毒性、臭氧耗減效應(yīng)和其它殘留效應(yīng)，許多國家已禁止使用溴甲烷，并經(jīng)國際協(xié)商計劃將其完全撤出市場(Oka等人，2000)?；瘜W(xué)替代品如碘甲烷、1，3-二氯丙烯和氯化苦(cholorpicrin)對哺乳動物和環(huán)境也有安全上的問題。目前正逐漸淘汰和禁用化學(xué)非熏蒸殺線蟲劑。最近，美國環(huán)保署宣布將淘汰涕滅威。發(fā)明概述本文提供新用途和新組合，具體提供包含色桿菌屬物種的菌株，特別是Chromobacterium substugae 的菌株，更特別是色桿菌新物種(Chromobacteriumsubstugae sp.Nov.)的菌株，甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株的組合物。由此，本文提供調(diào)節(jié)植物中的線蟲侵害的方法，其包括向植物和/或其種子和/或用于使所述植物生長的基質(zhì)施用有效調(diào)節(jié)所述線蟲侵害的量的以下物質(zhì):色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株,甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的上清液、濾液和/或提取物，和/或所述上清液、濾液和/或提取物的一種或多種代謝物，以及任選存在的另一種殺線蟲物質(zhì)。本發(fā)明也提供對至少一種有害生物具有協(xié)同作用的農(nóng)藥組合，其包含作為活性成份的以下物質(zhì):(a)色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株，甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的上清液、濾液和/或提取物，和/或所述色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株，甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的上清液、濾液和/或提取物的一種或多種代謝物，和(b)另一種農(nóng)藥物質(zhì)，其中(a)和(b)以協(xié)同量存在。在一具體實施方案中，所述有害生物可以是昆蟲類有害生物，但也可以包括但不限于線蟲、植物真菌、植物病毒、植物細菌和雜草。此外，所述組合可以是組合物。所述農(nóng)藥物質(zhì)可能:(a)源自微生物；(b)是天然產(chǎn)物和/或(b)是化學(xué)農(nóng)藥，尤其是化學(xué)殺線蟲劑。具體而言，所述組合可包含色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacteriumsubstugae的菌株，更特別是色桿菌新物種的菌株,甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的上清液、濾液和/或提取物和源自微生物的農(nóng)藥物質(zhì)，所述微生物包括但不限于芽孢桿菌(Bacillus sp.)(如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)或蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克變種(Bacillusthuringiensis var.kurstaki))和多殺菌素?；蛘?所述組合可包含色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株，甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的上清液、濾液和/或提取物和源自天然產(chǎn)物如除蟲菊(pyrethrum)的農(nóng)藥物質(zhì)。或者，所述組合可包含色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株，甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的上清液、濾液和/或提取物和農(nóng)藥物質(zhì)，所述農(nóng)藥物質(zhì)是化學(xué)農(nóng)藥，特別是殺蟲劑，其中所述殺蟲劑包括但不限于除蟲菊酯、螺蟲乙酯(spirotetramet)和鄰甲酸氨 基苯甲酸胺(anthranilic diamide)。在相關(guān)方面，本文提供協(xié)同調(diào)節(jié)植物中的至少一種有害生物或有害生物物種侵害的方法，其包括向植物和/或其種子和/或用于使所述植物生長的基質(zhì)施用有效調(diào)節(jié)所述有害生物或有害生物物種侵害的量的上述組合。本文還提供可獲自或源自色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株,甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)的分離的化合物，或者能夠產(chǎn)生這些化合物的生物體，所述化合物可用于防治各種有害生物，特別是線蟲類有害生物。在一實施方案中，所述化合物具有以下特征:(a)具有農(nóng)藥活性；(b)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約840-900的分子量；(c)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0-20 分鐘；90-0%CH3CN 水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30分鐘；90%CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和210nm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約7_12分鐘；和(d)任選地可獲自色桿菌屬(Chromobacterium)物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株，甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)。在一實施方案中，所述化合物可以是肽。
在一具體實施方案中，經(jīng)13C NMR測定，所述化合物具有43個碳，包括7個甲基碳、10個亞甲基碳、12個次甲基碳、6個烯屬次甲基(olefinic methines)碳和8個季碳。在一具體實施方案中，化合物“A”具有以下特征:(a)可獲自色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株,甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)；(b)對有害生物具有毒性；(c)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約840-890，更特別是 860 的分子量；(Cl)1H NMR 的 δ 值為 8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42,5.36,5.31,5.10,4.13,4.07,4.05,3.96,3.95,3.88,3.77,3.73,3.51,3.44,3.17、
2.40,2.27,2.11,2.08,2.03,2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、
1.43,1.35,1.24,1.07,1.02,0.96,0.89,0.88,0.87,0.80，并且 13CNMR 的 δ 值為 173.62、172.92,172.25,172.17,171.66,171.28,170.45,132.13,130.04,129.98,129.69,129.69、125.48,98.05,70.11,69.75,68.30,68.25,64.34,60.94,54.54,52.82,49.72,48.57、45.68,40.38,39.90,38.18,36.60,31.98,31.62,31.58,29.53,28.83,27.78,24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80 ;(e)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0-20 分鐘；90-0%CH3CN 水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30分鐘；90%CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和210nm的紫外線檢測下，其在反相 C-18HPLC 柱(Phenomenex, Luna5 μ C18 (2) 100Α, 100x4.60mm)上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約7-12分鐘，更特別為約9分鐘。具體而言，13C-NMR譜顯示了 43個碳的信號，包括7個甲基碳、10個亞甲基碳、12個次甲基碳、6個烯屬次甲基碳和8個季碳，和/或1H NMR譜顯示典型的肽的特征，顯示了 5個酰胺NH信號[δ H:8.89、8.44、8.23,8.22、7.96]、一個胺 NH2 基信號[δΗ:7.64,6.65]、6 個 α -氨基質(zhì)子[δ H:4.07,4.06,3.96,3.95、
3.88,3.72]，并且在 13C-NMR譜中，有 6 個/7 個酰胺或酯共振[δ c:173.62,172.92,172.25、
1.72.17,171.66,171.28,170.45]。在另一具體實施方案中，化合物“B”具有下列特征:(a)可獲自色桿菌屬物種的菌株(特別是Chromobacterium substugae的菌株,更特別是色桿菌新物種的菌株,甚至更特別是與美國專利7，244，607中所述的NRRL B-30655具有相同特征的色桿菌新物種的菌株)；(b)對有害生物具有毒性；(c)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約850-890，更特別是874的分子量；(d)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0-20分鐘；90_0%CH3CN水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30 分鐘；90%CH3CN 水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和210nm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱(Phenomenex, Luna5 μ C18 (2) 100Α, 100x4.60mm)上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約7_12分鐘，更特別為約9分鐘，甚至更特別為約9.54分鐘。在更具體的實施方案中，提供包括但不限于以下的化合物:(A)具有##STR001##結(jié)構(gòu)的化合物
權(quán)利要求
1.化合物，其具有以下特征:(a)具有農(nóng)藥活性；(b)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約840-900的分子量；(c)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0_20分鐘；90_0%CH3CN水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30 分鐘；90%CH3CN 水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和210nm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約7-12分鐘；和(d)任選地可獲自色桿菌屬(Chromobacterium)物種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中經(jīng)13CNMR測定，所述化合物具有43個碳，包括7個甲基碳、10個亞甲基碳、12個次甲基碳、6個烯屬次甲基碳和8個季碳。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物具有以下特征:(i)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約 840-890 的分子量；(ii) 1H NMR 的 δ 值約為 8.89,8.44,8.24,8.23、7.96,7.63,6.66,5.42,5.36,5.31,5.10,4.13,4.07,4.05,3.96,3.95,3.88,3.77,3.73、3.51,3.44,3.17,2.40,2.27,2.11,2.08,2.03,2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57,1.53,1.48,1.43,1.35,1.24,1.07,1.02,0.96,0.89,0.88,0.87,0.80 ；和(iii)13CNMR 的 δ 值約為 173.62,172.92,172.25,172.17,171.66,171.28,170.45,132.13,130.04、129.98,129.69,129.69,125.48,98.05,70.11,69.75,68.30,68.25,64.34,60.94,54.54、52.82,49.72,48.57,45.68,40.38,39.90,38.18,36.60,31.98,31.62,31.58,29.53、28.83,27.78,24.41,23.06,22.09,20.56,19.31,18.78,17.66,15.80。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物選自: (A)具有##STR001##結(jié)構(gòu)的化合物
5.組合物，其包含: (A)以下中的至少一種: (i)權(quán)利要求1的化合物； ( )具有以下特性的化合物:(a)具有農(nóng)藥性質(zhì)；(b)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約315-360的分子量；(c)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0_20分鐘；90-0%CH3CN 水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30 分鐘；90%CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和2IOnm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約8-15分鐘；和(d)任選地可獲自色桿菌屬物種；和 (B)以下中的至少一種: (i)第二物質(zhì)，其中所述第二物質(zhì)為化學(xué)農(nóng)藥或生物農(nóng)藥；和 ( )載體、稀釋劑、表面活性劑或輔劑中的至少一種。
6.獲得選自以下的化合物的方法: (i)權(quán)利要求1的化合物；和 ( )具有以下特性的化合物:(a)具有農(nóng)藥性質(zhì)；(b)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約315-360的分子量；和(c)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0_20分鐘；90-0%CH3CN 水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30 分鐘；90%CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和2IOnm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約8-15分鐘， 所述方法包括: (A)在足以產(chǎn)生所述化合物的條件下，在全細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)色桿菌屬物種的菌株； (B)從所述全細胞培養(yǎng)液中分離(A)中產(chǎn)生的所述化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中通過以下操作來分離步驟(A)中產(chǎn)生的所述化合物:(a)將所述全細胞培養(yǎng)液施加到離子交換柱、尺寸排阻柱或反相HPLC柱中的任意一種以得到柱流分；(b)測定所述柱流分的農(nóng)藥活性；和(C)濃縮(b)中的柱流分以得到分離的化合物。
8.調(diào)節(jié)植物中的有害生物侵害的方法，其包括向所述植物和/或其種子和/或用于使所述植物生長的基質(zhì)施用有效調(diào)節(jié)所述有害生物侵害的量的以下物質(zhì): (A)以下中的至少一種: (i)權(quán)利要求1的化合物； ( )具有以下特性的化合物:(a)具有農(nóng)藥性質(zhì)；(b)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約315-360的分子量；(c)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0_20分鐘；90-0%CH3CN 水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30 分鐘；90%CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和2IOnm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱上的高壓液相色譜(HPLC)保留時間為約8-15分鐘；和(d)任選地可獲自色桿菌屬物種的菌株；和 (B)任選存在的另一種農(nóng)藥物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述方法中所使用的所述化合物: (I)具有以下特性中的至少一種:(a)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定的分子量約為343 ;和(b)在所述C-18反相HPLC柱上的HPLC保留時間約為10分鐘；或 (II)具有以下特性中的至少一種:(a)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定的分子量約為327 ;和(b)在所述C-18反相HPLC柱上的HPLC保留時間約為12分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法,其中所述化合物選自chromamideA、紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素。
11.調(diào)節(jié)植物中的線蟲侵害的方法，其包括向所述植物和/或其種子和/或用于使所述植物生長的基質(zhì)施用有效調(diào)節(jié)所述線蟲侵害的量的以下物質(zhì):色桿菌屬物種的菌株的上清液、濾液和/或提取物，和/或所述上清液、濾液和/或提取物的一種或多種代謝物，以及任選存在的另一種殺線蟲物質(zhì)。
12.對至少一種有害生物具有協(xié)同作用的農(nóng)藥組合，其包含作為活性成份的以下物質(zhì):(a)色桿菌屬物種的菌株的上清液、濾液和/或提取物，和(b)另一種農(nóng)藥物質(zhì)，其中(a)和(b)以協(xié)同量存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合，其中所述有害生物為線蟲類有害生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的組合，其中所述農(nóng)藥物質(zhì):(a)源自微生物；(b)是天然產(chǎn)物或(b)是化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的組合，其中所述農(nóng)藥物質(zhì)源自微生物，并且選自芽孢桿菌(Bacillus sp.)和多殺菌素。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的組合，其中所述農(nóng)藥物質(zhì)為選自除蟲菊酯、螺蟲乙酯和鄰甲酰氨基苯甲酰胺(anthranilic diamide)的化學(xué)殺蟲劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的組合，其中所述組合為組合物。
18.協(xié)同調(diào)節(jié)植物中的至少一種有害生物株侵害的方法，其包括向所述植物和/或其種子和/或用于使所述植物生長的基質(zhì)施用有效地協(xié)同調(diào)節(jié)植物中的至少一種有害生物侵害的量的權(quán)利要求13的組合。
19.選自以下的化合物在配制用于調(diào)節(jié)植物中有害生物侵害的組合物中的用途:(i)權(quán)利要求1-4的化合物； ( )具有以下特性的化合物:(a)具有農(nóng)藥性質(zhì)；(b)經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)測定具有約315-360的分子量；(c)使用水:乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(tǒng)(0_20分鐘；90-0%CH3CN 水溶液，20-24 分鐘；100%CH3CN，24-27 分鐘；0_90%CH3CN 水溶液，27-30 分鐘；90%CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分鐘的流速和2IOnm的紫外線檢測下，其在反相C-18HPLC柱上的高壓液相色譜(HPLC) 保留時間為約8-15分鐘；和(d)任選地可獲自色桿菌屬物種。
全文摘要
本發(fā)明提供用于防治有害生物的源自色桿菌屬物種培養(yǎng)物的生物活性化合物和代謝物、包含這些化合物的組合物、獲得這些化合物的方法以及使用這些化合物和組合物來防治有害生物的方法。
文檔編號C07K7/06GK103179862SQ201180051656
公開日2013年6月26日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者R·阿索卡, 黃華章, M·科伊武寧, P·馬羅內(nèi) 申請人:馬羅內(nèi)生物創(chuàng)新公司