專利名稱：一種分離環(huán)磷腺苷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物分離領域，具體涉及利用一種新型吸附劑分離環(huán)磷腺苷的方法。
背景技術：
環(huán)磷腺苷，又名3’，5’ -環(huán)磷酸腺苷，簡稱cAMP，是生物體內一種重要的生理活性物質，具有調節(jié)生物體內多種酶催化反應的功能，是細胞內的第二信使。其主要的生理功能有促進心肌收縮，舒張平滑肌、擴張冠狀動脈血管、改善肝功能、促進神經再生，抑制皮膚外層上皮細胞分裂及轉化異常細胞的功能、促進呼吸鏈氧化酶的活性及改善心肌缺氧等，對人體的正常代謝起著重要作用。cAMP主要有三種生產方法，即化學合成、天然產物提取和微生物發(fā)酵。其生產過程 中的分離步驟主要應用了大孔樹脂、陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂三種吸附劑。專利(TW200922612)公開了一種以含大棗cAMP的原料制備藥物或保健食品的方法。其中大棗中cAMP主要是通過大孔樹脂0U-2和ME-2兩柱連續(xù)吸附分離獲得的，最終得到萃取物中cAMP的含量為I %，說明大孔樹脂作為吸附劑分離cAMP效率極低。而在2000年出版的《最新生化藥物制備技術》報道在化學合成的環(huán)磷腺苷結晶工藝，分離段所使用的是陽離子交換劑，吸附能力較低，分離純化效果不佳。專利(201010191525. X)提供了一種分離環(huán)磷腺苷的方法，其分離過程采用的吸附劑為陰離子交換樹脂，每克濕離子交換樹脂吸附量可達到O. 08-0. 15g環(huán)磷腺苷。該方法大大提高了吸附劑對環(huán)磷腺苷的吸附量，提高了分離效率，但此方法卻需調節(jié)環(huán)磷腺苷溶液的PH為堿性。由于環(huán)磷腺苷屬于有機弱酸，在水溶液中以cAMP和cAMP_的形式共同存在，需要調節(jié)溶液pH在6. 5-11的范圍內才能全部解離成為cAMP—。cAMP—才能與陰離子交換樹脂進行最大量的交換，達到最大吸附量。而當不調節(jié)溶液PH時，部分呈分子狀態(tài)的cAMP不能被交換到陰樹脂上，就會造成陰樹脂的吸附量降低。傳統(tǒng)離子交換樹脂再生時采用6-8BV濃度為3% _5%的酸、堿溶液作為再生劑，除此以外還需要4-5BV的水對樹脂柱進行沖洗，才能達到樹脂柱的再生完全。此傳統(tǒng)方法消耗大量的酸、堿和水，易造成環(huán)境污染和資源浪費。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種采用螯合吸附介質分離環(huán)磷腺苷的方法，有效解決了現(xiàn)有分離技術中存在的吸附劑吸附量低、洗脫及再生過程耗用大量酸、堿、水的問題。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的思路為環(huán)磷腺苷是一種有機弱酸，分子式為CltlH12N5O6P,分子中存在大量的N、O、P原子,原子上的孤對電子可與金屬尚子的空軌道相結合，形成配位鍵，從而使環(huán)磷腺苷與金屬離子間建立穩(wěn)定的螯合結構。利用此機理，本發(fā)明提供了一種新型吸附介質，即將陽離子交換樹脂經轉型處理可攜帶上金屬離子，即成為具有螯合功能的新型吸附介質，從而可以吸附環(huán)磷腺苷。新型樹脂與環(huán)磷腺苷的配位螯合過程如圖I所示。由于環(huán)磷腺苷在溶液中呈現(xiàn)不同解離狀態(tài)時，其N、O、P原子提供孤對電子的能力不會發(fā)生改變，因此，吸附劑對環(huán)磷腺苷的吸附能力不隨溶液PH發(fā)生變化。但考慮到堿性溶液中0H_與螯合樹脂上金屬離子會形成離子鍵，因此環(huán)磷腺苷體系的pH選擇為1-7。此外，堿溶液洗脫時，OH—可與樹脂上的金屬以強離子鍵結合，因此用少量低濃度堿溶液即可將配位鍵破壞，從而使環(huán)磷腺苷從樹脂上脫離。洗脫完全后用純水淋洗樹脂柱至中性，繼續(xù)采用4-5BV低濃度酸上柱后用純水淋洗至中性，即可完成吸附劑的再生。具體的技術方案如下
一種分離環(huán)磷腺苷的方法，以新型螯合吸附介質(即轉型后的陽離子交換樹脂)為吸附劑吸附溶液中的環(huán)磷腺苷，再利用堿液作為洗脫劑對吸附劑進行洗脫，收集洗脫液，使用酸液作為再生劑對吸附劑進行再生。其中，所述的新型螯合吸附介質的前體為陽離子交換樹脂，所述的陽離子交換樹脂以苯乙烯系或丙烯酸系為骨架，以磺酸基、磷酸基或羧基為功能基團；優(yōu)選以苯乙烯系為骨架，以磺酸基團為功能基團。這些陽離子交換樹脂代表性的例子有Amberlite IR_124(骨架為苯乙烯，功能基團為磺酸基)、Amberlite IR-116 (骨架為苯乙烯，功能基團為磺酸基)或Amberlite IRC-84 (骨架為丙烯酸，功能基團為羧基)。其中，所述的新型螯合吸附介質的制備方法，是以無機金屬鹽水溶液為離子轉型齊U，使其與陽離子交換樹脂接觸，將金屬離子以離子鍵與陽離子交換樹脂上的酸性功能基團結合，從而固載到陽離子交換樹脂上不會脫落，轉型后的陽離子交換樹脂的功能基團為金屬離子。其中，所述的無機金屬鹽水溶液中，金屬離子為Fe2+、Fe3+、CU2+、Zn2+或Co2+，優(yōu)選Fe3+、Cu2+或Zn2+ ;無機金屬鹽濃度為I 50g/L，優(yōu)選3_20g/L。轉型前的陽離子交換樹脂對環(huán)磷腺苷的吸附量為10-40mg/g濕樹脂，轉型后的吸附量可達到80-160mg/g濕樹脂。陽離子交換樹脂具體轉型步驟如下(I)稱取一定量陽離子交換樹脂裝柱；(2)將離子轉型劑以恒定流速流過樹脂柱，直到出口溶液濃度等于進口溶液濃度；(3)將去離子水以恒定流速流過樹脂柱，至流出液中無金屬離子；(4)用乙醇淋洗樹脂柱；(5)在30_60°C下真空干燥步驟(4)得到的樹脂，完成轉型。根據(jù)本發(fā)明提供的轉型方法，完成轉型的新型吸附劑負載的金屬離子的量為O. 05-2. OOmmol/g 樹脂。其中，環(huán)磷腺苷溶液的濃度可以為l_8g/L，上柱流速可以為O. 5_4BV/h。其中，所述的堿液為氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液，濃度為O. 01 O. 6mol/L，優(yōu)選O. 1-0. 4mol/L ;堿液用量為2 5BV，優(yōu)選3-4BV ;洗脫流速為O. 5_3BV/h。其中，所述的酸液為鹽酸或硫酸，濃度為O. 01-0. 6mol/L，優(yōu)選O. 1-0. 4mol/L ;酸液用量為2-5BV，優(yōu)選3-4BV。其中，再生前，先用去離子水淋洗吸附劑至中性，再生后，再用去離子水淋洗吸附劑至中性后重復使用吸附劑。有益效果本發(fā)明提供的方法采用新型螯合吸附介質分離環(huán)磷腺苷，與傳統(tǒng)樹脂分離環(huán)磷腺苷相比，本發(fā)明的優(yōu)點是此吸附介質可適用于任何PH1-7條件下的環(huán)磷腺苷體系，吸附量可達到80-160mg/g樹脂，環(huán)磷腺苷濃度可提高4-5倍。且此新型介質洗脫、再生過程酸、堿用量均可節(jié)約50%以上，水用量可節(jié)約20% -30%，是一種清潔環(huán)保、價格低廉、易得的吸附劑。


圖I是轉型后新型吸附劑(苯乙烯骨架、磺酸基團)對環(huán)磷腺苷的配位吸附過程圖。圖2是不同pH環(huán)磷腺苷體系下新型螯合吸附介質對環(huán)磷腺苷的吸附量。

圖3是實施例5測定的新型吸附劑吸附容量和洗脫收率的變化情況圖。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。環(huán)磷腺苷溶液的制備以下實施例所用的環(huán)磷腺苷溶液按如下方法制備得到發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖5% (g/100mL，以下相同)，K2HPO4 I %, KH2PO4 1%,MgSO4 I %，尿素0.5%，蛋白胨0.5%，同時每升培養(yǎng)基中添加O. Ig NaF、0. Ig VBl和5g次
黃嘌呤。種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，牛肉膏1%，NaClO. 3%。培養(yǎng)方法將節(jié)桿菌A302(CGMCC No. 3584)接入種子培養(yǎng)基，在30°C、240rpm下培養(yǎng)18小時。再以10% (v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以NaOH控制pH為7.0，溶氧控制為30%，400rpm、3(TC下發(fā)酵72小時。放罐時，環(huán)磷腺苷產量為3_8g/L。然后將發(fā)酵液通過離心機離心除去菌體，再將離心得到的上清液透過超濾膜去除大部分蛋白質，可得到濃度范圍在3-8g/L的環(huán)磷腺苷溶液。實施例I :稱取50g陽離子交換樹脂Amberlite IR-124裝柱，將濃度為3g/L的氯化鐵溶液以lBV/h流過樹脂柱，待流出液濃度亦為3g/L時，停止轉型。以相同流速繼續(xù)通入去離子水，至流出液中不含鐵離子。最后用乙醇淋洗樹脂柱，淋洗完成后，將樹脂至于30°C真空干燥箱內真空干燥，完成吸附劑的轉型。取20g轉型后的吸附劑填充樹脂柱，平衡后將濃度為4. 5g/L的環(huán)磷腺苷溶液上柱，以3. 5BV/h流過樹脂柱，吸附飽和后測定吸附量為126mg/g濕樹脂。用O. 4mol/L氫氧化鈉進行洗脫，洗脫流速lBV/h，洗脫劑用量為3BV，收集洗脫液，環(huán)磷腺苷的濃度為16. 50g/L，純度為95. 12%，收率98. 48%。實施例2 稱取50g陽離子交換樹脂Amberlite IR-116裝柱，將濃度為10g/L的氯化銅溶液以lBV/h流過樹脂柱，待流出液濃度亦為10g/L時，停止轉型。以相同流速繼續(xù)通入去離子水，至流出液中不含銅離子。最后用乙醇淋洗樹脂柱，淋洗完成后，將樹脂至于40°C真空干燥箱內真空干燥，完成吸附劑的轉型。取IOg轉型后的吸附劑填充樹脂柱，平衡后將濃度為4g/L的環(huán)磷腺苷溶液上柱，以2BV/h流過樹脂柱，吸附飽和后測定吸附量為85mg/g濕樹脂。再用O. 3mol/L氫氧化鈉進行洗脫，洗脫流速2BV/h，洗脫劑用量為4BV。收集洗脫液，環(huán)磷腺苷濃度為11. 06g/L，純度為94. 75%，收率97. 67%。實施例3 稱取50g陽離子交換樹脂Amberlite IR-116裝柱，將濃度為15g/L的氯化亞鐵溶液以lBV/h流過樹脂柱，待流出液濃度亦為15g/L時，停止轉型。以相同流速繼續(xù)通入去離子水，至流出液中不含亞鐵離子。最后用乙醇淋洗樹脂柱，淋洗完成后，將樹脂至于50°C真空干燥箱內真空干燥，完成吸附劑的轉型。取30g轉型后的吸附劑填充樹脂柱，平衡后將濃度為3g/L的環(huán)磷腺苷溶液上柱，以3. 5BV/h流過樹脂柱，吸附飽和后測定吸附量為109mg/g濕樹脂。用O. 2mol/L氫氧化鈉進行洗脫，洗脫流速2. 5BV/h，洗脫劑用量為5BV。收集洗脫液，環(huán)磷腺苷濃度為14. lg/L，純度為94. 87%，收率97. 10%。 實施例4 稱取IOOg陽離子交換樹脂Amberlite IRC-84裝柱，將濃度為8g/L的氯化鐵溶液以lBV/h流過樹脂柱，待流出液濃度亦為8g/L時，停止轉型。以相同流速繼續(xù)通入去離子水，至流出液中不含鐵離子。最后用乙醇淋洗樹脂柱，淋洗完成后，將樹脂至于40°C真空干燥箱內真空干燥，完成吸附劑的轉型。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液pH為I,上柱吸附飽和后計算吸附量。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液pH為2,上柱吸附飽和后計算吸附量。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液PH為3，上柱吸附飽和后計算吸附量。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液pH為4,上柱吸附飽和后計算吸附量。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液pH為5,上柱吸附飽和后計算吸附量。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液pH為6,上柱吸附飽和后計算吸附量。稱取IOg轉型后Amberlite IRC-84裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為3g/L并調節(jié)溶液PH為7，上柱吸附飽和后計算吸附量。由圖2可知,不同pH環(huán)磷腺苷溶液體系下,經轉型處理后的Amberlite IRC-84對環(huán)磷腺苷的飽和吸附量基本不變。說明，此螯合吸附介質適用于PH1-7條件下的環(huán)磷腺苷體系。實施例5 稱取30g陽離子交換樹脂Amberlite IR-124裝柱，將濃度為2g/L的氯化鐵溶液以lBV/h流過樹脂柱，待流出液濃度亦為2g/L時，停止轉型。以相同流速繼續(xù)通入去離子水，至流出液中不含鐵離子。最后用乙醇淋洗樹脂柱，淋洗完成后，將樹脂至于30°C真空干燥箱內真空干燥，完成吸附劑的轉型。稱取20g轉型后Amberlite IR-124裝柱，上柱環(huán)磷腺苷溶液濃度為4. 5g/L，吸附飽和后計算吸附量。之后進行再生，首先用5BV 0.4mol/LNa0H進行洗脫，洗脫完全后計算洗脫量。用3BV去離子水沖洗樹脂柱為中性，然后用4BV O. 4mol/L鹽酸浸泡6h，再用3BV去離子水沖洗樹脂柱為中性，樹脂完成再生后備用。以上述相同條件進行轉型樹脂的吸附，吸附飽和后再生，如此循環(huán)四次，比較吸附容量的變化情況，結果如圖3所示，轉型樹脂的再生效果很好，吸附容量基本不變。 實施例6 與實施例2的方法相同，所不同的是，離子轉型劑以氯化鋅替代氯化鐵。實施例7 與實施例2的方法相同，所不同的是，離子轉型劑以氯化鈷替代氯化鐵。實施例8 同實施例2的方法相同，所不同的是，氯化鐵濃度為lg/L。實施例9 與實施例2的方法相同，所不同的是，氯化鐵濃度為50g/L。實施例10 與實施例2的方法相同，所不同的是，環(huán)磷腺苷溶液的濃度為lg/L，上柱流速為O. 5BV/h至吸附飽和。實施例11 與實施例2的方法相同，所不同的是，環(huán)磷腺苷溶液的濃度為8g/L，上柱流速為4BV/h至吸附飽和。實施例12 與實施例2的方法相同，所不同的是，以O. 01mol/L氫氧化鉀水溶液為洗脫劑，洗脫劑用量為5BV，洗脫流速為O. 5BV/h。實施例13 與實施例2的方法相同，所不同的是，以O. 6mol/L氫氧化鉀水溶液為洗脫劑，洗脫劑用量為2BV，洗脫流速為3BV/h。實施例14 與實施例5的方法相同，所不同的是，再生劑為硫酸，濃度為O. 01mol/L，再生劑用量為5BV。實施例15 與實施例5的方法相同，所不同的是，再生劑為硫酸，濃度為O. 6mol/L，再生劑用量為2BV。
權利要求
1.一種分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，以新型螯合吸附介質為吸附劑吸附溶液中的環(huán)磷腺苷，再利用堿液作為洗脫劑對吸附劑進行洗脫，收集洗脫液，使用酸液作為再生劑對吸附劑進行再生。
2.根據(jù)權利要求I所述的分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，所述的新型螯合吸附介質的前體樹脂為陽離子交換樹脂，以苯乙烯系或丙烯酸系為骨架，以磺酸基、磷酸基或羧基為功能基團。
3.根據(jù)權利要求2所述的分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，所述的新型螯合吸附介 質的制備，是指以無機金屬鹽水溶液為離子轉型劑，使其與陽離子交換樹脂接觸，將金屬離子固載到陽離子交換樹脂上，轉型后的陽離子交換樹脂的功能基團為金屬離子。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，所述的無機金屬鹽水溶液中，金屬離子為Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+或Co2+,無機金屬鹽濃度為I 50g/L。
5.根據(jù)權利要求I所述的分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，所述的堿液為氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液，濃度為O. Ol O. 6mol/L，堿液用量為2 5BV。
6.根據(jù)權利要求I所述的分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，所述的酸液為鹽酸或硫酸，濃度為O. 01-0. 6mol/L，酸液用量為2-5BV。
7.根據(jù)權利要求I所述的分離環(huán)磷腺苷的方法，其特征在于，再生前，先用去離子水淋洗吸附劑至中性，再生后，再用去離子水淋洗吸附劑至中性后重復使用吸附劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離環(huán)磷腺苷的方法，以新型螯合吸附介質為吸附劑吸附溶液中的環(huán)磷腺苷，再利用堿液作為洗脫劑對吸附劑進行洗脫，收集洗脫液，使用酸液作為再生劑對吸附劑進行再生。本發(fā)明提供的方法采用新型螯合吸附介質分離環(huán)磷腺苷，與傳統(tǒng)樹脂分離環(huán)磷腺苷相比，本發(fā)明的優(yōu)點是此吸附介質可適用于任何pH1-7條件下的環(huán)磷腺苷體系，吸附量可達到80-160mg/g樹脂，環(huán)磷腺苷濃度可提高4-5倍。且此新型介質洗脫、再生過程酸、堿用量均可節(jié)約50％以上，水用量可節(jié)約20％-30％，是一種清潔環(huán)保、價格低廉、易得的吸附劑。
文檔編號C07H1/06GK102617683SQ20121006826
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權日2012年2月29日
發(fā)明者吳菁嵐, 應漢杰, 楊麗, 柏建新, 謝婧婧, 錢文斌, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業(yè)大學